Способ получения аутологичного концентрата клеток костного мозга Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 A61B5/00 C12N5/77 

Область техники

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологического препарата на основе концентрата костного мозга и может быть использован в травматологии и ортопедии, неврологии, в частности при лечении грыж и протрузии межпозвонковых дисков позвоночника, в косметологии, иммунологии и других направлениях.

Уровень техники

Известен способ выделения мононуклеарных клеток костного мозга человека, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2292895 (дата публикации: 10.02.2007, МПК: A61K35/28). По известному способу получают аспират костного мозга во время пункции гребня подвздошной кости, наслаивают его на градиент плотности (1,077 г/л), центрифугируют в течение 30 мин при скорости 400 g. Затем собирают слой мононуклеарных клеток с границы раздела фаз. При этом взятие 100 мл аспирата костного мозга проводят с 20 мл гепаринизированного физиологического раствора с концентрацией гепарина 2500 ЕД/мл. Перед наслаиванием гепаринизированный аспират костного мозга предварительно отстаивают в течение 30 мин при температуре 18-22°С, затем собирают верхние 2/3 клеточной взвеси обедненной эритроцитами, после чего эту пробу разводят в 2 раза гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД/мл. Далее, после наслаивания и центрифугирования, слой клеток, собранный с границы раздела фаз, отмывают гепаринизированным фосфатно-забуференным физиологическим раствором с концентрацией гепарина 10 ЕД/мл трехкратным центрифугированием по 10 мин при 400 g и температуре 18-22°С, после чего доводят клеточность суспензии до нужной концентрации.

Недостатком известного способа является его сложность, обусловленная необходимостью ручного сбора фракций аспирата костного мозга, получаемых в результате осаждения центрифугирования. Многостадийность известного способа неизбежно приводит к смешиванию компонентов на границах раздела на различных его стадиях. Это может отрицательно сказаться на терапевтической эффективности полученного концентрата костного мозга.

Известен способ лечения остеоартроза коленного сустава, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2685687 (дата публикации: 22.04.2019, МПК: A61M 31/00, A61K 35/28, A61P 19/02, A61B 17/34, B01D 21/26, A61M 1/34). В известном способе костномозговой концентрат перед введением фильтруют и центрифугируют, при этом аспирацию костного мозга осуществляют из внутреннего мыщелка большеберцовой кости, фильтрацию осуществляют с помощью фильтра для гемотрансфузий, а центрифугирование проводят однократно со скоростью от 3000 до 4000 оборотов в минуту.

Недостатком известно способа является разделение аспирата костного мозга на две фракции - эритроцитарный осадок и плазму костномозгового концентрата. При этом не происходит выделения обогащенной тромбоцитами плазмы, характеризующейся наибольшим содержанием мезенхимальных клеток. Это может привести к получению препарата, характеризующегося их низкой концентрацией. Помимо этого, аспират костного мозга мыщелка большеберцовой кости характеризуется относительно невысокой концентрацией мезенхимальных клеток.

Известен способ получения аутологичного концентрата клеток костного мозга для лечения воспалительно-дегенеративных заболеваний в травматологии и ортопедии, раскрытый в патенте РФ на изобретение № 2763250 (дата публикации: 28.12.2021, МПК: A61B 17/56, A61M 1/34, A61K 35/28, A61P 19/02, B01D 21/26) - прототип. Известный способ включает забор аспирата костного мозга из гребня подвздошной кости, выполнение операционного доступа в 4-5 см кзади от медиальной границы гребня подвздошной кости, проведение через доступ троакара, установленного на середине кортикальной площадки гребня подвздошной кости, забор аспирата и его центрифугирование, по завершению которого производят подсчет мезенхимальных клеток костного мозга. При этом острие троакара проводят сквозь кортикальную пластинку до ощущения провала на 35-50 мм, забор аспирата костного мозга проводят в объеме 50 мл, центрифугирование аспирата костного мозга осуществляют при скорости не более 2400 об/мин в течение не менее 20 мин, при этом концентрация мезенхимальных клеток в полученном аутологичном концентрате костного мозга составляет не менее 0,01%.

Недостаток известного способа заключается в получении аутологичного концентрата костного мозга, характеризующегося относительно невысокой концентрацией мезенхимальных клеток. Помимо прочего, это отрицательно сказывается на терапевтической эффективности полученного препарата.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача, положенная в основу настоящего изобретения, заключается в получении биологического препарата на основе концентрата костного мозга.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в увеличении терапевтической эффективности биологического препарата, полученного из аспирата костного мозга.

Дополнительный технический результат заключается в повышении концентрации мезенхимальных стволовых клеток в биологическом препарате, полученном из аспирата костного мозга.

В качестве изобретения предложен способ получения аутологичного концентрата клеток костного мозга, включающий забор аспирата костного мозга с последующим центрифугированием и выделением фракции, содержащей мезенхимальные клетки. В отличие от прототипа забор аспирата костного мозга проводят из задней подвздошной ости посредством шприца, имеющего иглу с мандреном. После этого вводят собранный аспират в рабочую камеру центрифуги и проводят его центрифугирование со скоростью от 3000 до 4000 оборотов в минуту, причем при центрифугировании просвечивают упомянутый аспират световыми пучками с различающимися длинами волн, и регистрируют на световом датчике, расположенном противоположно источникам света, прошедшие через аспират световые пучки. При этом из рабочей камеры центрифуги поочередно выводят фракцию, содержащую мезенхимальные клетки, которая представлена обогащенной тромбоцитами плазмой, обедненную тромбоцитами плазму, и эритроцитарный осадок, в зависимости от длин волн световых пучков, зарегистрированных на световом датчике. После этого обогащенную тромбоцитами плазму разбавляют избытком обедненной тромбоцитами плазмы и фильтруют полученную жидкость от посторонних включений.

Дополнительные преимущества и существенные признаки настоящего изобретения могут быть представлены в следующих частных вариантах осуществления.

В частности, забор аспирата костного мозга проводят при местной анестезии. В качестве анестезии используют 2% раствор лидокаина.

В частности, забор аспирата костного мозга проводят в объеме от 30 до 180 мл.

В частности, забор аспирата костного мозга выполняют последовательно из биопсийных точек, намеченных на задней подвздошной ости в количестве от 1 до 6.

В частности, в качестве иглы для шприца используют пункционную иглу 20G-88mm.

В частности, из рабочей камеры центрифуги выводят обедненную тромбоцитами плазму, если на световом датчике одновременно зарегистрированы пучки света с длинами волн 470 нм и 940 нм.

В частности, из рабочей камеры центрифуги выводят обогащенную тромбоцитами плазму, если на световом датчике не зарегистрирован световой пучок с длиной волны 470 нм.

В частности, из рабочей камеры центрифуги выводят эритроцитарный осадок, если на световом датчике не зарегистрирован световой пучок с длиной волны 940 нм.

В частности, обогащенную эритроцитами плазму выводят в шприц для инъекций пациенту.

В частности, обедненную тромбоцитами плазму и эритроцитарный осадок выводят в резервуар-мешки с последующей утилизацией.

Осуществление изобретения

Красный костный мозг содержит гемопоэтические и стромальные клетки. Гемопоэтические клетки за счет способности к неограниченной пролиферации и дифференцировке обеспечивают поддержание и обновление пула форменных элементов крови. Клетки стромы костного мозга представлены остеобластами, адипоцитами, эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, гладкомышечными клетками, перицитами, фибробластами стромы, создают микроокружение стволовых кроветворных клеток.

Предшественниками всех видов клеток, необходимых для образования стромы и поддержания эффективного кроветворения, являются мезенхимальные (стромальные) клетки. Мезенхимальные клетки могут быть выделены из жировой ткани, костного мозга, периферической крови, пупочного канатика, пульпы зуба, синовиальной оболочки, амниотической жидкости. В костном мозге мезенхимальные клекти присутствуют в небольшом количестве (0,001-0,01%), тем не менее он часто используется в качестве их источника. В частности, наибольшая концентрация мезенхимальных клеток в организме человека наблюдается в крыле подвздошной кости, а именно, в задней подвздошной ости, где концентрация мезенхимальных клеток в аспирате костного мозга достигает 28 КОЕ/мл.

В настоящее время существует большое количество направлений использования МСК в клинической практике, в том числе в онкогематологии. Их применение возможно при гипофункции трансплантата гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). МСК способны ускорить процесс приживления введенных ГСК и, соответственно, восстановление гемопоэза за счет создания оптимального стромального микроокружения. Благодаря своим иммуномодулирующим свойствам МСК также нашли применение в лечении реакции «трансплантат против хозяина» после пересадки аллогенных ГСК.

Начальной функцией мезенхимальных клеток является секреция факторов роста и других цитокинов (регуляция межклеточных и межсистемных взаимодействий в организме,) для стимулирования процесса пролиферации (разделение и рост клеток) и ангиогенеза (образования новых кровеносных сосудов).

Максимальная эффективность действия мезенхимальных клеток происходит при условии их изолированной высокой концентрации. Для достижения их высокой концентрации необходимо добиться выделения соответствующей фракции аспирата костного мозга путем удаления из биологического препарата фракций, включающей тромбоциты, эритроциты, ядерные клетки, гемопоэтические стволовые клетки.

Предложенный способ получения аутологичного концентрата клеток костного мозга осуществляют следующим образом.

Забор аспирата костного мозга осуществляется в условиях операционной с соблюдением мер асептики и антисептики. Пациента размещают в положении лежа на животе. Перед забором аспирата костного мозга проводят дезинфекцию места забора, местную анестезию кожи и подлежащих мягких тканей до контакта иглы с кортикальной пластинкой. В качестве анестетика используют 2% раствор лидокаина в количестве 2 мл. После введения анестезии ждут 1-2 мин, пока не будет достигнут максимальный обезболивающий эффект. Забор аспирата осуществляют пункционной иглой 20G-88мм с мандреном из биопсийных точек, намеченных в количестве от 1 до 6 на участке кожи, закрывающей заднюю подвздошную ость. Иглу погружают сквозь кортикальную пластинку кости до ощущения провала на 35-50 мм. Использование шприца, имеющего иглу с мандреном позволяет исключить попадание твердой фракции костной крошки, попадающей в аспират костного мозга при перфорации кости троакаром. Аспират костного мозга медленно набирают в шприц. Из каждой намеченной биопсийной точки в шприц попадает по 30 мл жидкости. После того, как в шприце оказывается достаточное количество аспирата костного мозга, игла удаляется и на поверхность кожи накладывается повязка.

Для выделения фракции, обогащенной мезенхимальными клетками, применяется центрифугирование, в ходе которого клетки крови и костного мозга разделяются в градиенте плотности вследствие различий в величине плавучей плотности форменных элементов крови. При центрифугировании клетки крови перемещаются в рабочей камере центрифуги до тех пор, пока не достигнут области градиента, где их плавучая плотность равна плотности среды. При этом плавучая плотность обедненной тромбоцитами плазмы меньше, поэтому данные клетки располагаются в верхних слоях центрифугата. Эритроцитарный осадок, включающий гранулоциты и эритроциты, имеет большую плавучую плотность, в процессе центрифугирования опускаются на дно емкости рабочей камеры центрифуги.

Центрифугирование всего объема взятого аспирата костного мозга осуществляется однократно на скорости 3000-4000 оборотов в минуту. Центрифугирование со скоростью менее 3000 оборотов в минуту не позволяет отделить от плазмы эритроцитарный осадок. Центрифугирование при скорости более 4000 оборотов в минуту приводит к гемолизу мезенхимальных клеток, вследствие чего снижается терапевтическая эффективность получаемого биологического препарата. Время центрифугирования зависит от объема введенного в рабочую камеру аспирата. Оптимальное время центрифугирования введенного объема аспирата обеспечивается использованием светового датчика, установленного на выходе из рабочей камеры центрифуги с возможностью регистрации световых пучков с определенными длинами волн. Компоненты костного мозга поочередно выводятся в предназначенные для них емкости в зависимости от того, поглощают они определенные световые пучки или нет, при этом указанные компоненты выводятся до тех пор, пока не будет разделен на компоненты весь объем введенного в рабочую камеру центрифуги аспирата костного мозга. Это позволяет получить более чистую и эффективно выделенную целевую фракцию, содержащую повышенную концентрацию мезенхимальных клеток, что не может быть достигнуто традиционным центрифужным механическим разделением, в результате которого различные компоненты аспирата неизбежно смешиваются.

Центрифугирование осуществляется в замкнутой системе из рабочей камеры центрифуги, соединенной герметичными трубками через распределительный клапан с шприцом для сбора целевой фракции и двух резервуар-мешков для сбора эритроцитарного осадка и обедненной тромбоцитами плазмы. Фракции, разделенные в центрифуге поочередно в зависимости от их плавучей плотности, поступают по герметичной трубке в распределительный клапан. Выделенные компоненты костного мозга по пути на распределительный клапан просвечивают световыми пучками с длинами волн 470 нм и 940 нм. Первым компонентом, который выводят из рабочей камеры центрифуги, является обедненная тромбоцитами плазма. При выводе плазмы световой датчик, расположенный напротив источников света, регистрирует прохождение обоих пучков света через движущуюся в трубке жидкость. На основе показания датчика распределительный клапан переключает трубку для вывода компонентов костного мозга на герметичную трубку, ведущую в резервуар-мешок для сбора обедненной тромбоцитами плазмы. Вторым компонентом, который выводят из рабочей камеры центрифуги, является обогащенная тромбоцитами плазма. При выводе обогащенной тромбоцитами плазмы по трубке на световом датчике не регистрируется световой пучок с длиной волны 470 нм, поскольку тромбоциты имеют свойство поглощать свет с указанной длиной волны. В этом случае распределительный клапан переключает трубку вывода компонентов костного мозга на порт, к которому подведен шприц для сбора целевой фракции. Последним компонентом, который выводят из рабочей камеры центрифуги, является эритроцитарный осадок, имеющий наибольшую плавучую плотность. При выводе эритроцитарного осадка по трубке на световом датчике не регистрируется световой пучок с длиной волны 940 нм, поскольку эритроциты имеют свойство поглощать свет с указанной длиной волны. В этом случае распределительный клапан переключает трубку вывода компонентов костного мозга на резервуар-мешок для сбора эритроцитарного осадка. В зависимости от объема аспирата костного мозга центрифугирование занимает от 15 до 20 минут.

Полученная в результате центрифугирования обогащенная тромбоцитами плазма собирается в шприц и является готовым биологическим препаратом для инъекции пациенту согласно назначению по его симптомам. При этом разделение аспирата костного мозга на три компонента позволяет получить концентрат мезенхимальных клеток, пригодный для разбавления избытком обедненной тромбоцитами плазмы. Такое разбавление необходимо для того, чтобы увеличить объем препарата и, как следствие, область его активного взаимодействия с внутренними органами пациента, в которые осуществляется введение препарата. В зависимости от объема концентрата, разбавление осуществляется в следующих примерных соотношениях: 1:3, 1:4, 1:5. Например, при получении 4 мл фракции, содержащей мезенхимальные клетки, берут обедненную тромбоцитами плазмы в объеме 12 мл. В результате разбавления жидкость представлять собой фракцию плазмы костномозгового концентрата с концентрацией, которая регулируется врачом при проведении процедуры получения аутологичного аспирата костного мозга. Необходимый конечный объем разбавленного препарата определяется врачом в зависимости от места введения препарата и показаний к применению. В свою очередь, это позволяет повысить терапевтическую эффективность препарата, так как дает возможность получить препарат с высокой концентрацией мезенхимальных клеток в требуемом для введения объеме. Разбавленный препарат подвергают фильтрации на фильтре с диаметром пор не более 3 мкм под давлением или под вакуумом. В результате фильтрации препарат очищается от посторонних включений, например, микроскопических остатков костной крошки или жира. Полученный фильтрат готов к реинфузии.

При микроскопическом увеличении в целевой фракции отмечаются вытянутые плотно прилегающие друг к другу клетки веретеновидной формы с небольшим количеством отростков.

Изучение полученной фракции конентрированного костного мозга показало, что при центрифугировании 40 мл аспирата костного мозга, содержащего мезенхимальные клетки в количестве около 28 КОЕ/мл, целевая фракция содержит мезенхимальные клетки в количестве около 843 КОЕ/мл, что говорит о кратности увеличения концентрации примерно в 30 раз.

Сравнение предложенного способа получения аутологичного концентрата клеток костного мозга с прототипом показывает следующее. Согласно прототипу центрифугирование исходного аспирата костного мозга, содержащем около 0,001% мезенхимальных клеток, приводит к получению концентрата, содержащего около 0,01%, что говорит о кратности увеличения концентрации примерно в 10 раз. Причем при разбавлении концентрата костного мозга обедненной тромбоцитарной массой, например, в соотношении 1:5 концентрация мезенхимальных клеток в препарате по-прежнему превосходит аналогичный показатель прототипа, по меньшей мере, в 2-3 раза.

Таким образом, сравнение характеристик прототипа и предложенного изобретения указывает на кратное увеличение концентрации мезенхимальных стволовых клеток в биологическим препарате после обработки аспирата костного мозга, по меньшей мере, в три раза.

Предложенное изобретение позволяет увеличить лечебный эффект концентрированного костного мозга, и как следствие, найти широкое применение в травматологии и ортопедии, платической, эстетической и ожоговой хирургии и т.д.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения аутологичного концентрата клеток костного мозга. Проводят забор аспирата костного мозга из задней подвздошной ости посредством шприца, имеющего иглу с мандреном. Вводят забранный аспират в рабочую камеру центрифуги и проводят его центрифугирование со скоростью от 3000 до 4000 оборотов в минуту, причем при центрифугировании просвечивают аспират световыми пучками с длинами волн 470 нм и 940 нм. Регистрируют на световом датчике, расположенном противоположно источникам света, прошедшие через аспират световые пучки. При этом из рабочей камеры центрифуги поочередно выводят фракцию, содержащую мезенхимальные клетки, которая представлена обогащенной тромбоцитами плазмой, обедненную тромбоцитами плазму и эритроцитарный осадок. Обогащенную тромбоцитами плазму выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике не зарегистрирован световой пучок с длиной волны 470 нм. Обедненную тромбоцитами плазму выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике одновременно зарегистрированы пучки света с длинами волн 470 нм и 940 нм. Эритроцитарный осадок выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике не зарегистрирован пучок света с длиной волны 940 нм. Затем обогащенную тромбоцитами плазму разбавляют избытком обедненной тромбоцитами плазмы и фильтруют полученную жидкость от посторонних включений. Изобретение обеспечивает увеличение терапевтической эффективности биологического препарата, полученного из аспирата костного мозга. 7 з.п. ф-лы.

1. Способ получения аутологичного концентрата клеток костного мозга, включающий забор аспирата костного мозга с последующим центрифугированием и выделением фракции, содержащей мезенхимальные клетки, отличающийся тем, что забор аспирата костного мозга проводят из задней подвздошной ости посредством шприца, имеющего иглу с мандреном, вводят упомянутый аспират в рабочую камеру центрифуги и проводят его центрифугирование со скоростью от 3000 до 4000 оборотов в минуту, причем при центрифугировании просвечивают упомянутый аспират световыми пучками с длинами волн 470 нм и 940 нм и регистрируют на световом датчике, расположенном противоположно источникам света, прошедшие через аспират световые пучки, при этом из рабочей камеры центрифуги поочередно выводят фракцию, содержащую мезенхимальные клетки, которая представлена обогащенной тромбоцитами плазмой, обедненную тромбоцитами плазму и эритроцитарный осадок, при этом обогащенную тромбоцитами плазму выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике не зарегистрирован световой пучок с длиной волны 470 нм; обедненную тромбоцитами плазму выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике одновременно зарегистрированы пучки света с длинами волн 470 нм и 940 нм; эритроцитарный осадок выводят из рабочей камеры центрифуги, если на световом датчике не зарегистрирован пучок света с длиной волны 940 нм; после чего обогащенную тромбоцитами плазму разбавляют избытком обедненной тромбоцитами плазмы и фильтруют полученную жидкость от посторонних включений.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор аспирата костного мозга проводят при местной анестезии.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве анестезии используют 2% раствор лидокаина.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор аспирата костного мозга проводят в объеме от 30 до 180 мл.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор аспирата костного мозга выполняют последовательно из биопсийных точек, намеченных на заднем гребне подвздошной ости, в количестве от 1 до 6.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве иглы для шприца используют пункционную иглу 20G-88mm.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что обогащенную эритроцитами плазму выводят в шприц для инъекций пациенту.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что неиспользованную обедненную тромбоцитами плазму и эритроцитарный осадок выводят в резервуары-мешки с последующей утилизацией.