ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ БЕВАЦИЗУМАБ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 C07K16/22 C07K16/24 

Область техники настоящего изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к области техники биомедицины и, в частности, относится к фармацевтическому составу, содержащему бевацизумаб.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0002] Высокоспецифические, эффективные и безопасные лекарственные препараты на основе белков (антител), особенно лекарственные средства на основе терапевтических антител, стали глобальным центром разработки лекарственных средств. Бевацизумаб (торговое наименование на китайском языке: , торговое наименование на английском языке: Avastin®) разработан компанией Roche и впервые одобрен для продажи FDA US в 2004 году для широкого применения при лечении различных злокачественных опухолей, таких как метастатический колоректальный рак, немелкоклеточный рак легкого, почечно-клеточный рак, рак яичников, рак шейки матки и глиобластома. Бевацизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1 и может специфически связываться с фактором роста эндотелия сосудов, тем самым блокируя его связывание с рецепторами (Fit-1 и KDR) на поверхности эндотелиальных клеток, предотвращая серию последующих каскадных реакций, ингибируя неогенез аномальных кровеносных сосудов, тем самым предотвращая рост и распространение опухолей и, наконец, приводя к цели устранения опухолей. Кроме того, бевацизумаб обладает высокой специфичностью и обычно не взаимодействует с другими мишенями, блокируя путь VEGF. Поскольку бевацизумаб может разрушать аномальные кровеносные сосуды и нормализовать зрелые кровеносные сосуды, его обычно используют для комбинированной химиотерапии, то есть применяют вместе с другими лекарственными средствами против опухолевых тканей. В таких терапиях бевацизумаб может эффективно помогать и усиливать терапевтический эффект других лекарственных средств (Presta L G, Chen Н, OYConnor S J, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, et al. Cancer Res 1997,57:4593-9).

[0003] В исследовании лекарственных средств на основе моноклональных антител важную роль играет изучение фармацевтического состава. Моноклональные антитела IgG1 в основном применяют в виде жидких составов для инъекции, а белок в жидких составах склонен образовывать агрегаты или частицы, которые влияют на стабильность. Поддержание хорошей физической, химической и биологической стабильности жидких составов моноклональных антител при хранении стало проблемой, которую нельзя игнорировать. Существует острая необходимость в разработке стабильных составов белков, отвечающих требованиям фармацевтической промышленности.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[0004] Задача настоящего изобретения состоит в предоставлении фармацевтического состава, содержащего бевацизумаб.

[0005] Согласно настоящему изобретению исследовали буферную систему с бевацизумабом (белок HLX04) в качестве объекта исследования посредством скрининга и оптимизации состава, а также исследовали влияния различных ионных сил, значения рН, типа стабилизатора, типов и содержания поверхностно-активных веществ и т.д. в буферной системе на стабильность белков в условиях высокотемпературного ускорения путем планирования однофакторного эксперимента. Экспериментально определяли диапазон пропорций содержания каждого компонента в составе.

[0006] Согласно настоящему изобретению объекты обнаружения, участвующие в оценке стабильности белка в составе в условиях высокотемпературного ускорения, включают внешний вид, концентрацию белка (А280), осмоляльность, чистоту (SEC-HPLC, CEX-HPLC и CE-SDS), средний размер частиц белка, PdI (DLS) и число невидимых невооруженным глазом частиц (FlowCam).

[0007] Предпочтительный фармацевтический состав согласно настоящему изобретению включает бевацизумаб, буфер, стабилизатор и поверхностно-активное вещество, где бевацизумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело при содержании предпочтительно 10-100 мг/мл, предпочтительно 10-80 мг/мл или 10-50 мг/мл и более предпочтительно 10 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл и 80 мг/мл.

[0008] Предпочтительно буфер согласно настоящему изобретению включает одну из системы гистидин-гидрохлорид гистидина, системы уксусная кислота-ацетат натрия и системы гидрохлорид гистидина-ацетат натрия, более предпочтительно буфер представляет собой буферную систему уксусная кислота-ацетат натрия или буферную систему гидрохлорид гистидина-ацетат натрия, и наиболее предпочтительно буфер представляет собой буферную систему гидрохлорид гистидина-ацетат натрия.

[0009] Значение рН фармацевтического состава предпочтительно составляет 5,0-5,6 и предпочтительно 5,3.

[0010] В буферной системе буфер на основе гистидина и гидрохлорида гистидина, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия и буфер на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия предпочтительно присутствуют при концентрации 10-30 мМ, где буфер на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия предпочтительно присутствует при концентрации 10 мМ.

[0011] Состав согласно настоящему изобретению также содержит стабилизатор для поддержания стабильности белкового лекарственного средства и поддержания функции белкового лекарственного средства без воздействия на них изменений условий (например, изменений условий замораживания, лиофилизации или других условий получения). Стабилизатор предпочтительно выбирают из одного или нескольких из сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита или глицина, и стабилизатор предпочтительно представляет собой сахарозу, трегалозу и сорбит, и более предпочтительно представляет собой сахарозу и сорбит. Содержание стабилизатора предпочтительно составляет 20-100 мг/мл, более предпочтительно 25-50 мг/мл и предпочтительно 45 мг/мл.

[0012] Поверхностно-активное вещество представляет собой обычно используемое поверхностно-активное вещество в данной области техники и предпочтительно неионное поверхностно-активное вещество. Примером поверхностно-активного вещества согласно настоящему изобретению предпочтительно является полисорбат и более предпочтительно Твин-80. Содержание поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет 0,1-0,5 мг/мл и предпочтительно 0,2 мг/мл.

[0013] Лекарственные формы фармацевтического состава представляют собой обычно используемые лекарственные формы в данной области техники, включая жидкий состав или лиофилизированный состав для инъекции. Жидкий состав для инъекции включает предпочтительно состав для подкожной инъекции, состав для внутривенной инъекции, состав для внутрибрюшинного введения, состав для внутримышечной инъекции, состав для внутривенной/подкожной инъекции или состав для интравитреальной инъекции. Жидкий состав для инъекции включает предпочтительно состав водного раствора для инъекции и состав для инъекции предварительно заполненным шприцем, предпочтительно состав водного раствора для инъекции, и состав водного раствора для инъекции можно использовать для внутривенной инъекции или интравитреальной инъекции.

[0014] Предпочтительный состав бевацизумаба определили на основе результатов однофакторного исследования, и состав является следующим: 25 мг/мл бевацизумаба, 10 мМ гидрохлорида гистидина-ацетата натрия (рН 5,3), 45 мг/мл сорбита и 0,2 мг/мл Твин-80. В соответствии с вышеуказанной пропорцией получили готовый продукт и проверили стабильность состава согласно настоящему изобретению посредством ускоренного исследования стабильности и исследования стабильности при повторном замораживании и оттаивании. Составы согласно настоящему изобретению сравнили с различными составами в тестах на стабильность. На основании анализа результатов относительно молекулярных изомеров, изомеров заряда и невидимых невооруженным глазом частиц в испытаниях высокотемпературного ускорения видно, что стабильность бевацизумаба в составе согласно настоящему изобретению значительно лучше, чем в других составах.

Краткое описание чертежей

[0015] Фиг. 1. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферных системах составов, показанных в Таблице 5, где на (А) показаны температуры Tagg на неделе 0, на (В) показаны значения KD на неделе 0, на (С) показаны средние размеры частиц и индексы полидисперсности (PDI) белка HLX04 в буферных системах на неделе 0 и после выдержки при 40°С в течение 4 недель, на (D) показан процент площади Pk 1 белка HLX04 в буферной системе на неделе 0 и после выдержки при 40°С в течение 4 недель, на (Е) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при 40°С и на (Е) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С.

[0016] Фиг. 2. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферной системе составов, показанных в Таблице 8, где на (А) показана диаграмма, показывающая сравнение термодинамической стабильности, на (В) показана тенденция изменения среднего размера частиц белка при 40°С, на (С) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при 40°С, на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С, и на (Е) показана тенденция изменения числа невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при 40°С.

[0017] Фиг. 3. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферных системах составов, показанных в Таблице 11, где на (А) показана диаграмма, показывающая сравнение термодинамической стабильности, на (В) показана тенденция изменения среднего размера частиц белка при 40°С, на (С) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при 40°С, на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С и на (Е) показана тенденция изменения числа невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при 40°С.

[0018] Фиг. 4. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферных системах составов, показанных в Таблице 14, где на (А) показана диаграмма, показывающая сравнение термодинамической стабильности, на (В) показана тенденция изменения среднего гидродинамического размера и PdI при 40°С, как измерено посредством DLS, на (С) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при 40°С, на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С и (Е) показана тенденция изменения числа невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при 40°С.

[0019] Фиг. 5. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферных системах составов, показанных в Таблице 20, где на (А) показана диаграмма, показывающая сравнение термодинамической стабильности, на (В) показана тенденция изменения среднего гидродинамического размера и PdI, как измерено посредством DLS, при 40°С, на (С) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при 40°С, на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С и на (Е) показана тенденция изменения невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при 40°С, на (F) показана тенденция изменения среднего гидродинамического размера и PdI, как измерено посредством DLS, при от -20°С до комнатной температуры, (G) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC при от -20°С до комнатной температуры, (Н) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при от -20°С до комнатной температуры, и (I) показана тенденция изменения числа невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при от -20°С до комнатной температуры.

[0020] Фиг. 6 (А), (В) и (С). Диаграммы модели оптимизации профиля привлекательности, полученные с использованием программного обеспечения JMP.

[0021] Фиг. 7. Исследование физико-химических свойств белка HLX04 в буферных системах составов, показанных в Таблице 26, на (А) показана диаграмма, показывающая сравнение термодинамической стабильности, на (В) показана тенденция изменения среднего размера частиц белка при 40°С, как измерено посредством DLS, на (С) показана тенденция изменения содержания основных пиков SEC при 40°С, на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ при 40°С и на (Е) показана тенденция изменения числа невидимых невооруженным глазом (посредством FlowCam) при 40°С.

[0022] Фиг. 8. Сравнительные диаграммы стабильности при различных концентрациях белка, на (А) показана тенденция изменения содержания агрегатов SEC, на (В) показана тенденция изменения содержания фрагментов SEC, на (С) показана тенденция изменения содержания IgG (CE-SDS невосстанавливающий) и на (D) показана тенденция изменения содержания основных пиков СЕХ.

Подробное описание вариантов осуществления

[0023] Следующие примеры предназначены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание относительно того, как реализовать и использовать настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, а также не предназначены для интерпретации, что приведенные ниже эксперименты представляют собой все реализованные эксперименты и единственные эксперименты, которые могут быть реализованы.

[0024] Все химические реагенты, использованные в примерах, представляют собой коммерчески доступные аналитические реагенты, арекомбинантное моноклональное антитело может быть моноклональным антителом, полученным любым известным способом. Следующий иллюстративный способ получения антител представлен Shanghai Henlius Biotechnology Co., Ltd., и этот иллюстративный способ не ограничивает настоящее изобретение.

[0025] Белок антитело, используемый в этом исследовании, представляет собой HLX04 (бевацизумаб), и антитело получают в соответствии с общепринятым способом, известным из уровня техники, где его последовательности легкой и тяжелой цепей являются следующими: Легкая цепь:

Тяжелая цепь:

Пример 1. Способ обнаружения

1.1. Внешний вид и видимые частицы

[0026] Внешний вид определяли визуальным осмотром. Флакон для образца протирали начисто и помещали в тестер прозрачности SC-4000A (Huanghai Medicine & Drug Testing Instruments, Shanghai) в темной комнате, интенсивность освещения доводили до 1000-1500 люкс, образец помещали на край (25 см) светонепроницаемой пластины, и цвет, прозрачность, видимые частицы и т.д. визуально оценивали на черном и белом фоне, соответственно, удерживая горлышко пенициллинового флакона для образца.

1.2. Содержание белка

[0027] Измеряли оптическую плотность образца при длине волны 280 нм и рассчитывали концентрацию белка с использованием измерителя концентрации белка Trinean Dropsensel6. Коэффициент экстинкции составил 1,60 мл*мг^-1*см^-1.

1.3. Значение рН

[0028] Брали образец (25 мкл) и определяли его значение рН с помощью многофункционального измерителя параметров Mettler Toledo, который калибровали по трем стандартным растворам (значение рН составило 4,01, 7,00 и 9,21, соответственно), так что наклон электрода находился в диапазоне 95% - 105%.

1.4. Осмоляльность

[0029] Определение проводили в соответствии с General Rule 0632 "Determination of Осмоляльность", Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015 Edition), посредством использования осмометра Advanced Osmo PRO. Брали образец (20 мкл) и два стандарта осмоляльности по 290 мОсмоль/кг, и значения осмоляльности образца и стандартов определяли криоскопическим способом.

1.5. Вязкость

[0030] Вязкость образца измеряли с использованием вискозиметра BROOKFIELD DV2T. Включали внешний котел с водяной баней, устанавливали температуру 25°С, отсасывали 0,5 мл образца и добавляли по каплям в центр чашки для образцов, скорость вращения ротора устанавливали так, чтобы момент измерения находился в пределах 40% - 60% и определяли вязкость образца.

1.6. DLS

[0031] Размер частиц и распределение частиц по размерам в образце определяли с использованием высокопроизводительного устройства динамического и статического светорассеяния DynaPro PlateReader-III. На чистом рабочем месте образец (25 мкл) отбирали и добавляли в микролунки 384-луночного планшета, а после завершения добавления планшет покрывали пленкой. Покрытый пленкой 384-луночный планшет помещали в охлаждаемую центрифугу и центрифугировали для удаления пузырьков в микролунках образца. Конкретные настройки параметров устройства показаны в Таблице 1.

1.7. Температура Tagg

[0032] Температуру агрегации образца определяли с помощью высокопроизводительного устройства динамического и статического светорассеяния DynaPro PlateReader-III. На чистом рабочем месте образец (25 мкл) отбирали и добавляли в микролунки 384-луночного планшета, а после завершения добавления планшет покрывали пленкой. Покрытый пленкой 384-луночный планшет помещали в охлаждаемую центрифугу и центрифугировали для удаления пузырьков в микролунках образца. Конкретные настройки параметров прибора показаны в Таблице 2.

1.8. DSC

[0033] Термодинамические параметры значения T_{m onset}, T_m1 и T_m2, относящиеся к конформации белка, определяли с использованием дифференциального сканирующего калориметра ТА Nano DSC. Образец белка разбавляли плацебо до концентрации 1 мг/мл, и разведенный образец белка и соответствующее плацебо соответственно помещали в 96-луночный планшет для образцов и после обработки дегазацией помещали под давление 300±50 кПа. Время предварительного уравновешивания устанавливали как 600 с, диапазон температур устанавливали как 25°С - 100°С, а скорость сканирования устанавливали как 1°С/мин. Кривые DSC для образца белка и плацебо получали, соответственно, при трехкратном сканировании для плацебо и однократном сканировании для образца белка. Модель Two State Scaled выбрана для подгонки данных.

1.9. SEC-HPLC

[0034] Обнаружение SEC-HPLC проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1260 с хроматографической колонкой TOSOH TSKgel G3000 (7,8 мМ × 300 мМ, 5 мкм). Температурой колонки была комнатная температура (без контроля температуры), температура кюветы составляла 2°С - 8°С, подвижная фаза состояла из 100 мМ дигидрофосфата натрия и 0,5% хлорида натрия, значение рН составляло 6,8, и проводили изократическое элюирование. Время элюирования составляло 30 мин, скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Длина волны обнаружения составляла 280 нм, концентрацию образца разбавляли до 1 мг/мл, объем впрыска составлял 50 мкл.

1.10. CEX-HPLC

[0035] Обнаружение CEX-HPLC проводили с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1260 с хроматографической колонкой Thermo ProPac™WCX-10 (4 мМ × 250 мМ, 10 мкм). Температура колонки составляла 35°С, температура кюветы составляла 2°С - 8°С, подвижная фаза А состояла из 50 мМ фосфатного буфера (значение рН 6,10), подвижная фаза В (значение рН 6,10) состояла из 50 мМ фосфатного буфера и 300 мМ хлорида натрия, и проводили градиентное элюирование. Градиент элюирования можно увидеть в таблице 3, а скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Длина волны обнаружения составляла 280 нм, концентрация образца разбавлена до 1 мг/мл, объем впрыска составлял 50 мкл.

1.11. CE-SDS

[0036] Определение проводили в соответствии с General Rule 3127 "Determination of Molecular Size Heterogeneities in Monoclonal Antibodies (CE-SDS method)", Pharmacopoeia of the People's Republic of China (2015 Edition). Определение проводили с помощью невосстанавливающего и восстанавливающего CE-SDS. Использовали устройство для капиллярного электрофореза Beckman Coulter РА800 plus и капилляр без покрытия общей длиной 67 см и внутренним диаметром 50 мкм. Впрыск: 5 кВ, 20,0 с, разделение: 15 кВ, 35,0 мин, и обнаружение проводили при длине волны 220 нм с помощью детектора PDA, а расчет проводили способом нормализации площади.

1.12. FlowCam

[0037] Морфологию и число невидимых невооруженным глазом частиц в образце определяли с использованием аналитического детектора частиц FlowCam 8100. Конкретные настройки параметров устройства показаны в Таблице 4.

Пример 2. Скрининговое исследование буферной системы и значения рН

[0038] Для исследования буферной системы/значения рН проводили два раунда экспериментов, и тип и диапазон значений рН буферной системы проверяли путем планирования однофакторного эксперимента.

2.1 Скрининговое исследование-I буферной системы/значения рН

2.1.1 Протокол исследования

[0039] В этом исследовании сток-раствор белка HLX04 (номер партии: AS201801), в котором Твин-20 был удален с помощью катионной хроматографии, подвергали ультрафильтрации и замене среды, а затем устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 5). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 6.

2.1.1 Результаты исследования

[0040] На неделе 0 температура Tagg относительно выше (фиг.1А), значение KD является положительным (фиг.1В), а средний размер частиц относительно меньше (фиг.1С) для белка в системах гистидин-гидрохлорид гистидина, уксусная кислота-ацетат натрия и гидрохлорид гистидина-ацетат натрия, что указывает на то, что белок проявляет лучшую конформационную и коллоидную стабильность в трех буферных системах.

[0041] После выдерживания при 40°С в течение 4 недель результаты концентраций белка и значений рН не показывают существенной разницы (таблица 7). Результаты SEC показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе имеет тенденцию к снижению (фиг.1Е), и во всех трех буферных системах цитрат-цитрат натрия, гистидин-гидрохлорид гистидина и уксусная кислота-ацетат натрия чем ниже значение рН, тем лучше стабильность. Составы ранжировали от превосходного до худшего качества как С55>А50>Н55>НА55>С60≈А55>Н60 (фиг.1Е). Результаты DLS показывают, что индексы полидисперсности (PdI) белка увеличиваются (фиг.1С), а процент Pk 1 Area hit снижается (фиг.1D) в буферных системах гистидин-гидрохлорид гистидина и дигидрофосфат натрия-динатрия гидрофосфат, что указывает на то, что образуется растворимый высокомолекулярный полимер размером менее 1 мкм. Результаты СЕХ показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе имеет тенденцию к снижению (фиг.1F), а стабильность белка в буферной системе гистидин-гидрохлорид гистидина значительно лучше, чем в других буферных системах.

2.2 Скрининговое исследование-II буферных систем/значений рН 2.2.1 Протокол исследования

[0042] Результаты скринингового исследования-I буферных систем/значений рН показывают, что в буферных системах гистидин-гидрохлорид гистидина, уксусная кислота-ацетат натрия и цитрат-цитрат натрия чем ниже значение рН, тем выше содержание основного пика SEC, а что касается белков в составах без стабилизаторов и поверхностно-активных веществ, то после выдержки в условиях исследования при температуре 40°С в течение 1 недели в каждом из составов присутствуют частицы, видимые невооруженным глазом. Поэтому в этом раунде эксперимента скрининг буферной системы дополнительно исследовали в составе с сахарозой и Твин-80 при низком рН 5,0.

[0043] В этом исследовании сток-раствор белка HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, а затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 8). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 9.

2.2.2 Результаты исследования

[0044] На неделе 0 нет существенной разницы в основных результатах физико-химического обнаружения белков в каждой буферной системе (Таблица 10), и составы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с температурами агрегации Tagg: А50≈НА50>Н50>С50 (фиг.2А) и ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии со средним размером частиц белка как А50≈НА50≈Н50>С50 (фиг.2В). Это указывает на лучшую конформационную и коллоидную стабильность белка в буферных системах уксусная кислота-ацетат натрия и гидрохлорид гистидина-ацетат натрия.

[0045] После выдерживания при 40°С в течение 4 недель нет существенной разницы в основных результатах физико-химического обнаружения (Таблица 10). Результаты SEC показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе имеет тенденцию к снижению, и составы ранжировали от превосходного до худшего качества как А50≈Н50≈НА50>С50 (фиг.2С). Результаты СЕХ показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе имеет тенденцию к снижению, и составы ранжировали от превосходного до худшего качества как Н50≈НА50>А50>С50 (фиг.2D). Составы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с невидимыми невооруженным глазом частицами согласно FlowCam как А50>Н50≈НА50>С50 (фиг.2Е).

2.2.3 Заключение исследования

[0046] Результаты этого раунда исследования показывают, что белок проявляет лучшую конформационную и коллоидную стабильность в буферных системах уксусная кислота-ацетат натрия и гидрохлорид гистидина-ацетат натрия. Результаты относительно изомеров заряда белка в буферной системе гистидин-гидрохлорид гистидина лучше, и после всестороннего рассмотрения в качестве буферной системы для белка выбрали гидрохлорид гистидина-ацетат натрия.

Пример 3. Скрининг ионной силы 3.1 Протокол исследования

[0047] В этом исследовании белок HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 11). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 12.

3.2 Результаты исследования

[0048] На неделе 0 составы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с температурой агрегации Tagg (фиг.3А) и средними размерами частиц (фиг.3В) белков в системах гидрохлорид гистидина-ацетат натрия как НА-10>НА-20>НА-30, что свидетельствует о лучшей конформационной и коллоидной стабильности белка в системе 10 мМ буфера на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия.

[0049] После выдерживания при 40°С в течение 4 недель нет существенной разницы в основных результатах физико-химического обнаружения (Таблица 13). Результаты SEC показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе имеет тенденцию к снижению (фиг.3С), и составы ранжировали от превосходного до худшего качества как НА-10>НА-20≈НА-30. Результаты СЕХ показывают, что содержание основных пиков белков в каждой буферной системе демонстрирует тенденцию к снижению, и нет существенной разницы в тенденциях к снижению (фиг.3D). Составы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с невидимыми невооруженным глазом частицами FlowCam как НА-10>НА-20≈НА-30 (фиг.3Е).

3.3 Заключение исследования

[0050] Результаты этого раунда исследований показывают, что белок проявляет лучшую конформационную и коллоидную стабильность в системе 10 мМ буфера на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия. Содержание основного пика SEC показывает более медленную тенденцию к снижению. Присутствует немного невидимым невооруженным глазом частиц согласно FlowCam.

Пример 4. Скрининг диапазона рН 4.1 Протокол исследования

[0051] В этом исследовании белок HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 14). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 15.

4.2 Результаты исследования

[0052] Белки хранили в 10 мМ системы гидрохлорид гистидина-ацетат натрия в течение 4 недель, и нет существенной разницы в физико-химических свойствах белков в буферах в диапазоне значений рН 5,0-5,6 (Таблица 16, фиг.4). Таким образом, значение диапазона рН конечного состава составляет 5,0-5,6.

Пример 5. Скрининг типа стабилизатора 5.1 Протокол исследования

[0053] В этом исследовании белок HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 17). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы подвергали исследованию и обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 18.

5.2 Результаты исследования

[0054] На неделе 0 стабилизаторы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с температурой T_agg белков в составах, содержащих различные стабилизаторы, как сахароза>трегалоза>сорбит≈маннит>глицин, и стабилизаторы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с T_{m onset} как глицин > маннит ≈ сахароза ≈ трегалоза ≈ сорбит (фиг.5 А).

[0055] После выдержки при 40°С в течение 4 недель результаты SEC показывают, что содержание основных пиков белков в составах, содержащих различные стабилизаторы, все имеют тенденцию к снижению, а образцы, содержащие глицин, демонстрируют значительно более быструю тенденцию к снижению (фиг.5С). Стабилизаторы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с результатами DLS как сорбит≈маннит>глицин>сахароза≈трегалоза (фиг.5В). Результаты СЕХ показывают, что содержание основных пиков белков в каждом из составов, содержащих различные стабилизаторы, все имеют тенденцию к снижению, а образцы, содержащие глицин, демонстрируют значительно более быструю тенденцию к снижению (фиг.5D). Результаты FlowCam показывают, что стабилизаторы ранжированы от превосходного до худшего качества в соответствии с невидимыми невооруженным глазом частицами как сорбит≈сахароза≈трегалоза>маннит≈глицин (фиг.5Е).

[0056] После 10 раундов повторных циклов замораживания и оттаивания результаты SEC показывают, что не происходит изменения содержания основных пиков белков в составах, содержащих сахарозу, трегалозу и сорбит, по сравнению с таковыми на неделе 0, а содержание основных пиков в составах, содержащих маннит или глицин, демонстрирует значительно более быструю тенденцию к снижению (фиг.5G). Стабилизаторы ранжированы от превосходного до худшего качества в соответствии с результатами DLS как сорбит>сахароза≈трегалоза>глицин≈маннит (фиг.5F). Результаты СЕХ показывают, что содержание основных пиков белков в составах, содержащих сахарозу, трегалозу и сорбит, не меняется по сравнению с таковым на неделе 0, а содержание основных пиков в составах, содержащих маннит и глицин, демонстрирует значительно более быструю тенденцию к снижению (фиг.5Н). Результаты FlowCam показывают, что стабилизаторы ранжированы от превосходного до худшего качества в соответствии с невидимыми невооруженным глазом частицами как сорбит≈сахароза≈трегалоза>маннит≈глицин (фиг.51 и Таблица 19).

[0057] Результаты этого раунда исследований показывают, что в условиях выдерживания при высокой температуре 40°С и повторного замораживания и оттаивания в составе, содержащем стабилизатор сахароза или сорбит в 10 мМ буферной системе гидрохлорид гистидина-ацетат натрия (рН 5,3), белок проявляет лучшую стабильность.

Пример 6. Скрининг стабилизатора и поверхностно-активного вещества 6.1 Протокол исследования

[0058] В этом раунде исследования три фактора, а именно тип стабилизатора, содержание стабилизатора и содержание Твин-80, выбирали с помощью программного обеспечения JMP 15, 10 экспериментальных групп (Таблица 20) получали с использованием способа поверхности отклика Бокса-Бенкена, а концентрации стабилизатора и поверхностно-активного вещества определяли с помощью ускоренных условий, таких как замораживание и оттаивание, встряхивание, освещение и высокая температура (Таблица 21).

[0059] В этом исследовании белок HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 20). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы подвергали исследованию и обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 21.

6.2 Результаты исследования

[0060] Данные обнаружения импортировали в программное обеспечение JMP 15, и каждый фактор (зависимая переменная) подвергали множественной линейной регрессии и подбору биномиального уравнения с использованием способа наименьших квадратов для получения статистически значимой (значение Р <0,1) модели (Таблица 22) со скорректированными коэффициентами детерминации (R2) выше 0,95, что указывает на то, что модель и фактическое состояние хорошо подходят, уравнение имеет хорошую точность и надежность с точки зрения значений отклика, и вместо реальных контрольных точек можно использовать регрессионную модель для анализа и прогнозирования экспериментальных результатов.

[0061] Используя программное обеспечение JMP 15 прогнозировали оптимальный состав с использованием модели максимальной привлекательности в соответствии с результатами анализа в Таблице 22. Когда в качестве стабилизатора выбран сорбит, привлекательность состава относительно выше, когда содержание сорбита составляет 4,5%, привлекательность состава является самой высокой, и по мере увеличения содержания полисорбата 80 привлекательность состава имеет тенденцию к снижению, а когда содержание полисорбата 80 находится в диапазоне 0,01%-0,03%, привлекательность состав относительно выше, и выбрано среднее значение 0,02% (см. фиг.6А, 6В и 6С).

[0062] В соответствии со скрининговым исследованием буферной системы/значения рН, скрининговым исследованием ионной силы, скрининговым исследованием типа поверхностно-активного вещества, скрининговым исследованием типа стабилизатора и скрининговым исследованием стабилизатора и поверхностно-активного вещества, состав окончательного состава является следующим: 10 мМ буферной системы гидрохлорид гистидина-ацетат натрия (рН 5,3), 45 мг/мл сорбита и 0,2 мг/мл Твин-80.

Пример 7. Сравнение выбранных составов с другими составами 7.1 Протокол исследования

[0063] В этом исследовании белок HLX04 (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 23). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 24.

7.2 Результаты исследования

[0064] На неделе 0 все белки в 3 составах все представляют собой бесцветные и слегка опалесцирующие жидкости без явных видимых частиц. Составы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с температурами агрегации Tagg как НА53>РВ62>С50 (фиг.7А) и ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии со средним размером частиц белков как НА53>С50>РВ62 (фиг.7 В), что указывает на лучшую конформационную и коллоидную стабильность белка в составе НА53.

[0065] После выдерживания при 40°С в течение 4 недель стабильность белка может сохраняться до определенной степени в 3 составах, и нет значительных изменений в основных физико-химических показателях белков (Таблица 25). Результаты SEC показывают, что содержание основных пиков белков в каждом составе имеет тенденцию к снижению (фиг.7С), и составы ранжированы от превосходного к недостаточного как НА53>С50>РВ62. Результаты СЕХ показывают, что содержания основных пиков белков в каждом составе имеют тенденцию к снижению (фиг.7D), а буферная система ранжирована от превосходной к недостаточной как НА53>С50>РВ62. Буферные системы ранжировали от превосходного до худшего качества в соответствии с невидимыми невооруженным глазом частицами согласно FlowCam как НА53>РВ62>С50 (фиг.7Е).

[0066] Согласно результатам, касающимся молекулярных изомеров, изомеров заряда и невидимых невооруженным глазом частиц в испытаниях высокотемпературного ускорения, стабильность бевацизумаба в составе согласно настоящему изобретению значительно лучше, чем стабильность бевацизумаба в существующем составе (РВ62) и других подобных составах.

Пример 8. Сравнение стабильности при различных концентрациях белка 8.1 Протокол исследования

[0067] В результате скринингового исследования состава определили следующий состав состава HLX04: 10 мМ гистидина гидрохлорида-ацетата натрия, 45 мг/мл сорбита и 0,2 мг/мл Твин-80, рН 5,3. В этом раунде исследования в условиях ускорения при высокой температуре 40°С сравнивали различия в стабильности между образцами состава HLX04 в диапазоне концентраций 10-80 мг/мл и Avastin®. Белок HLX04 РТ (номер партии: AS201901-PT) подвергали ультрафильтрации и замене среды, затем добавляли вспомогательные вещества и устанавливали концентрацию белка для получения альтернативного состава с конечной концентрацией белка приблизительно 25,0 мг/мл (Таблица 26). В боксе биобезопасности образец фильтровали с помощью одноразового стерильного фильтра 0,22 мкм, а затем 1 мл раствора белка асептически расфасовывали во пенициллиновые флаконы с объемом 2 мл. Флаконы закрывали резиновыми пробками 13 мМ, для закрытия пробок использовали алюминиево-пластиковые композитные крышки 13 мМ. Расфасованные образцы и исходное лекарственное средство (номер партии: Н0154 В14, код: Авастин) помещали в камеру с постоянной температурой и влажностью при 40°С для хранения, отбирали образцы и подвергали обнаружению в соответствии с требованиями эксперимента, указанными в Таблице 27.

8.2 Результаты исследования

[0068] В этом раунде исследования с помощью исследований высокотемпературного (40°С) ускорения сравнивали различия в стабильности между образцами состава HLX04 в диапазоне концентраций 10-80 мг/мл и Avastin®. Результаты исследования (Таблица 28) показывают, что на неделе 0 содержания агрегатов в образцах состава HLX04 в диапазоне концентраций 10-80 мг/мл составляют 2,0-2,7%, что меньше содержания агрегатов (3,6%) Авастина. После выдерживания при 40°С в течение 4 недель скорость агрегации (фиг.8А), скорость разложения (фиг.8В и 8С) и тенденция изменения изомеров заряда (фиг.8В) образцов состава HLX04 в диапазоне концентраций 10-80 мг/мл значительно ниже, чем у Авастина.

[0069] Таким образом, по сравнению с исходным лекарственным средством Авастин (60 мг/мл) состав HLX04 в диапазоне концентраций 10-80 мг/мл обладает лучшей стабильностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан фармацевтический состав для стабилизации бевацизумаба, который содержит бевацизумаб, буфер, стабилизатор и поверхностно-активное вещество. В одном из вариантов реализации состав содержит 10 мМ буфера на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия, 45 мг/мл сорбита и 0,2 мг/мл Твин-80 со значением pH 5,3. Изобретение расширяет арсенал средств для стабилизации бевацизумаба. 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 28 табл., 8 пр.

1. Фармацевтический состав для стабилизации бевацизумаба, где фармацевтический состав содержит бевацизумаб, буфер, стабилизатор и поверхностно-активное вещество, где

буфер выбран из одного или нескольких из системы гистидин-гидрохлорид гистидина, системы уксусная кислота-ацетат натрия и системы гидрохлорид гистидина-ацетат натрия,

стабилизатор выбран из одного или нескольких из сахарозы, трегалозы и сорбита, и

поверхностно-активное вещество представляет собой Твин-80 или Твин-20.

2. Фармацевтический состав по п. 1, где буфер представляет собой буфер на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия при концентрации 10-30 мМ.

3. Фармацевтический состав по п. 2, где буфер представляет собой буфер на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия при концентрации 10 мМ.

4. Фармацевтический состав по п. 1, где стабилизатор представляет собой сорбит или сахарозу при содержании 20-100 мг/мл.

5. Фармацевтический состав по п. 1, где поверхностно-активное вещество представляет собой Твин-80 при содержании 0,1 мг/мл-0,5 мг/мл.

6. Фармацевтический состав по п. 1, где значение pH фармацевтического состава составляет 5,0-5,6.

7. Фармацевтический состав по п. 1, где концентрация белка бевацизумаба составляет 10-80 мг/мл или концентрация белка бевацизумаба составляет 10-50 мг/мл.

8. Фармацевтический состав по любому из пп. 1-7, где состав содержит 10 мМ буфера на основе гидрохлорида гистидина и ацетата натрия, 45 мг/мл сорбита и 0,2 мг/мл Твин-80 со значением pH 5,3.

9. Фармацевтический состав по п. 8, где состав содержит 10 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл или 80 мг/мл бевацизумаба.

10. Фармацевтический состав по п. 1, где состав представляет собой жидкий состав или лиофилизированный состав для инъекции.