Область техники

Настоящее изобретение имеет отношение к линиям клеток и маркерам отбора (селектируемым маркерам) для продукции белков.

Предпосылки создания изобретения

Для продуцирования рекомбинантных белков в промышленном масштабе требуется изоляция клонов, продуцирующих большие количества рекомбинантных белков. Введение гетерологичных генов в клетки-хозяева животных и скрининг на экспрессию добавленных генов является длительным и сложным процессом. Процесс включает трансфекцию и отбор клонов со стабильной длительной экспрессией, а также скрининг на клоны с высокими уровнями экспрессии соответствующего рекомбинантного белка.

При создании клонов, экспрессирующих рекомбинантный белок с экспрессионных векторов, клетки-хозяева обычно трансфицируют ДНК-вектором, кодирующим как представляющий интерес белок, так и селектируемый маркер в одном и том же векторе. Таким образом, такой экспрессионный вектор содержит селектируемый маркер, позволяющий отбирать клоны, в которых присутствует экспрессионный вектор. Такой селектируемый маркер может также приводить к коамплификации трансфицированной ДНК, что позволяет изолировать клоны-продуценты рекомбинантных белков на высоком уровне.

Большинство селектируемых маркеров представляют собой либо белок, придающий устойчивость к антибиотику или другому токсичному веществу, либо белок, необходимый для выживания клеток. В данной области техники известно несколько таких селектируемых маркеров, в том числе, например, G418, гигромицин, пуромицин, зеомицин, дигидрофолатредуктаза (DHFR), глутаминсинтетаза (GS) и гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HPRT). В частности, GS широко используется в качестве селектируемого маркера в области промышленной продукции рекомбинантных белков в эукариотических клетках. Ген GS делает возможным синтез глутамина, необходимого для роста клеток, и ингибируется MSX (L-метионина сульфоксимином). В присутствии MSX выживают только клетки, экспрессирующие большее количество GS. После соответствующего скрининга можно отобрать клетки, продуцирующие экзогенные белки.

В предыдущей заявке WO2016/062837 авторы настоящего изобретения разработали экспрессионную систему, основанную на использовании дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH) в качестве селектируемого маркера. DHODH представляет собой фермент, необходимый для синтеза пиримидина. Следовательно, соединения, которые ингибируют DHODH, подавляют синтез ДНК и, следовательно, пролиферацию клеток. Таким образом, этот маркер отбора включает экспрессионный вектор, кодирующий DHODH, используемый в сочетании с ингибитором DHODH, таким как лефлуномид и терифлуномид.

Однако большинство ингибиторов, используемых с указанными выше маркерами отбора, являются токсичными. В случае маркера отбора DHODH, терифлуномид является, например, мощным иммуносупрессором, и обработка им, особенно в больших масштабах, может быть проблематичной из соображений безопасности. В случае маркера отбора GS, MSX вызывает судороги в высоких дозах и, таким образом, может также вызвать проблемы при обработке им. В случае маркера отбора DHFR, метотрексат, как известно, проявляет гемопоэтическую и пищеварительную токсичность, что также вызывает проблемы при обработке им.

Соответственно, существует потребность в экспрессионных системах, в которых отбор клона, продуцирующего представляющий интерес белок, можно проводить без добавления сложного при обработке соединения.

Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность.

Краткое изложение сущности настоящего изобретения

Настоящее изобретение является результатом разработки авторами настоящего изобретения линии клеток, в случае которой клетки, продуцирующие представляющий интерес белок, могут быть отобраны в среде, лишенной уридина, благодаря частичной или полной инактивации гена DHODH в указанной линии клеток. Эту линию клеток, в которой ген DHODH частично или полностью инактивирован, выращивают, как правило, в среде, дополненной уридином, но при трансфекции экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую DHODH млекопитающего, в частности, кодирующую мутированную DHODH млекопитающего, и экспрессионную кассету для экспрессии представляющего интерес белка, культуральную среду, как правило, заменяют культуральной средой, лишенной уридина, тем самым отбирая клетки, продуцирующие представляющий интерес белок.

Такая экспрессионная система особенно выгодна, поскольку в результате избегания использования ингибиторов в качестве селекционного давления она увеличивает жизнеспособность продуцирующих клеток. Авторы настоящего изобретения, кроме того, продемонстрировали, что это снижение токсичности связано с высокой продуктивностью.

Таким образом, настоящее изобретение имеет отношение к линии клеток, содержащей эндогенный ген дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH), который частично или полностью инактивирован.

В конкретном варианте осуществления указанная линия клеток представляет собой линию клеток яичника китайского хомячка (СНО).

В более конкретном варианте осуществления линия клеток получена путем

a) инактивации эндогенного гена DHODH в клетке, в частности, с помощью метода редактирования генов, такого как метод с использованием системы CRISPR-Cas9, и

b) культивирования клетки в культуральной среде, содержащей уридин, в условиях, подходящих для создания линии клеток, в которой эндогенный ген DHODH частично или полностью инактивирован.

В конкретном варианте осуществления все аллели эндогенного гена DHODH указанной линии клеток частично или полностью инактивированы.

В дальнейшем варианте осуществления указанная линия клеток содержит, кроме того, экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенную DHODH млекопитающего, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка, причем указанная экзогенная DHODH включает последовательность, идентичную на по крайней мере 60% последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности SEQ ID NO:4.

В его конкретном варианте осуществления указанная нуклеотидная последовательность включает последовательность SEQ ID NO: 1 или последовательность SEQ ID NO:3.

В его другом конкретном варианте осуществления указанный рекомбинантный белок представляет собой моноклональное антитело.

В его еще одном конкретном варианте осуществления указанный вектор содержит первую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования легкой цепи антитела, и вторую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования тяжелой цепи антитела.

Другим объектом настоящего изобретения является экспрессионная система, включающая:

(i) линию клеток, содержащую эндогенный ген дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH), который частично или полностью инактивирован, как определено выше, и

(ii) экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенную DHODH млекопитающего, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка, причем указанная экзогенная DHODH включает последовательность, идентичную на по крайней мере 60% последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности SEQ ID NO:4.

В конкретном варианте осуществления указанная нуклеотидная последовательность включает последовательность SEQ ID NO:1 или последовательность SEQ ID NO:3.

В другом конкретном варианте осуществления указанный рекомбинантный белок представляет собой моноклональное антитело.

В еще одном конкретном варианте осуществления указанный вектор содержит первую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования легкой цепи антитела, и вторую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования тяжелой цепи антитела.

Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к (i) линии клеток, определенной выше, или экспрессионной системе, определенной выше, и (ii) культуральной среды, лишенной уридина.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу продуцирования рекомбинантного белка in vitro, включающему стадии:

А a1) предоставления линии клеток, определенной выше, содержащей, кроме того, экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую экзогенную DHODH млекопитающего, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка, причем указанная экзогенная DHODH включает последовательность, идентичную на по крайней мере 60% последовательности SEQ ID NO:2 или последовательности SEQ ID NO:4;

или

а2) предоставления линии клеток, определенной выше, и

а2') введения экспрессионного вектора, определенного выше, в линию клеток, предоставленную на стадии а2);

или

a3) предоставления линии клеток, содержащей эндогенный ген DHODH,

a3') частичной или полной инактивации эндогенного гена DHODH в линии клеток, предоставленной на стадии a3), и

a3”) введения экспрессионного вектора, определенного выше, в линию клеток, содержащую частично или полностью инактивированный эндогенный ген DHODH, полученный на стадии а3');

B) культивирования указанной линии клеток в условиях, подходящих для продукции рекомбинантного белка; и

C) выделения и/или очистки указанного рекомбинантного белка.

В конкретном варианте осуществления стадию B) указанного способа проводят в культуральной среде, лишенной уридина.

В другом конкретном варианте осуществления указанный способ включает, кроме того, стадию D) составления указанного рекомбинантного белка в фармацевтическую композицию.

Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к применению линии клеток, определенной выше, экспрессионной системы, определенной выше, или набора, определенного выше, для продуцирования рекомбинантного белка.

В конкретном варианте осуществления линию клеток, экспрессионную систему или набор используют в сочетании с культуральной средой, лишенной уридина.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана геномная структура гена DHODH человека, зарегистрированная под идентификатором гена: 100756632, доступным 21 декабря 2018 г. в Genbank NCBI.

На фиг. 2 показано совмещение последовательности №1 экзона 2 DHODH. PAM: последовательность примыкающего к протоспейсеру мотива (TGG).

На фиг. 3 показан скрининг различных клонов KO (с нокаутом по) DHODH на продукцию антител в присутствии различных концентраций терифлуномида в качестве селективного агента.

На фиг. 4 показано количество продуцируемого белка в мг/мл, используя различные варианты DHODH в качестве маркеров отбора.

На фиг. 5 показана продукция липазы в день 14, используя DHODH G202A человека или GS человека в качестве селектируемого маркера и DHODH KO или клетки CHO дикого типа.

На фиг. 6 показана продукция моноклональных антител, mAb-B, в день 14, используя DHODH G202A человека или GS человека в качестве селектируемого маркера и DHODH KO или клетки CHO дикого типа.

На фиг. 7 показана продукция биспецифических антител в день 14, используя DHODH G202A человека и/или GS человека в качестве селектируемого маркера и DHODH KO или клетки CHO дикого типа.

На фиг. 8 показана продукция триспецифических антител в день 14, используя DHODH G202A человека и GS человека в качестве селектируемых маркеров и DHODH KO или клетки CHO дикого типа.

Подробное описание настоящего изобретения

Дигидрооротатдегидрогеназа

Используемый здесь термин «дигидрооротатдегидрогеназа» или «DHODH» относится к полипептиду, способному катализировать превращение дигидрооротата (4,5-дигидрооротовой кислоты или 2,6-диоксо-1,3-диазинан-4-карбоновой кислоты) в оротат (оротовую кислоту или 1,2,3,6-тетрагидро-2,6-диоксо-4-пиримидинкарбоновую кислоту), как представлено следующей реакцией:

(S)-дигидрооротат+O₂ ↔ оротат+H₂O₂

Такой полипептид классифицируется под номером 1.3.3.1 Комиссии по ферментам (ЕС). Полипептиды, способные катализировать вышеупомянутую выше реакцию, проявляют «активность DHODH».

Вышеупомянутая реакция является четвертой стадией синтеза de novo уридинмонофосфата (rUMP), необходимого для синтеза ДНК и РНК. Таким образом, ингибирование или инактивация DHODH имеет эффект ингибирования синтеза ДНК и РНК и, следовательно, ингибирует пролиферацию клеток.

Линия клеток

Настоящее изобретение имеет отношение к линии клеток, содержащей эндогенной ген дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH), который частично или полностью инактивирован.

Линия клеток представляет собой линию эукариотических клеток, например линию клеток млекопитающих, такую как линия клеток яичника китайского хомячка (СНО), линия клеток обезьяны или линия клеток человека.

В конкретном варианте осуществления линия клеток представляет собой линию клеток CHO.

Линии клеток СНО обычно используются для промышленной продукции белков, и специалистам в данной области техники известно множество линий клеток СНО. Например, такие линии клеток CHO включают линии, которые общедоступны из Американской коллекции типовых культур, такие как линия клеток CHO-K1 (номер в АТСС: CCL-61), линия клеток CHO-S (продаваемая, например, Invitrogen и Gibco), линия клеток CHO DP-12 (с номерами в ATCC: CRL-12444 и 12445) и линия клеток CHO 1-15 (с номером в ATCC: CRL-9606). Другой линией клеток, подходящей для промышленной продукции белков, является линия клеток CHO 9E4. Линия клеток 9E4 была получена из клона линии клеток CHO-K1 посредством процесса клонирования потомства одной клетки. Получение линии клеток 9E4 более подробно представлено в примере 1. Линия клеток CHO-K1 была получена Puck в 1957 г. и депонирована в АТСС под номером CCL-61.

Клетки человека, такие как клетки HEK293 (с номером в ATCC: CRL-1573), HKB11 (с номером в ATCC: CRL-12568), PER-C6 (Crucell), HT1080 (с номером в ATCC: CRL-121), Jurkat, Daudi, Raji и CAP (с номером в ATCC: CRL-1098), также могут использоваться для продукции белков, чтобы получить встречающийся в природе профиль гликозилирования рекомбинантных белков человека.

В одном варианте осуществления линия клеток способна расти в бессывороточной среде (например, в среде определенного химического состава) и/или в суспензии. Такая линия клеток может быть легко получена специалистами в данной области техники путем адаптации родительской линии клеток к росту в бессывороточной среде и/или в суспензии (например, путем клонирования потомства одной клетки, путем постепенной адаптации и/или путем процесса «выдерживания в условиях голодания и спасения»).

Линия клеток по настоящему изобретению представляет собой линию клеток, содержащую эндогенной ген дегидрооротатдегидрогеназы (DHODH), который частично или полностью инактивирован.

Под «эндогенным геном DHODH» здесь подразумевается ген DHODH, обычно присутствующий в указанной конкретной клетке на конкретной стадии развития при определенных условиях окружающей среды.

«Эндогенный ген DHODH» отличается от «экзогенного гена DHODH», определенного ниже, тем, что указанный экзогенный ген DHODH предоставляется экспрессионным вектором, определенным ниже, который может присутствовать в линии клеток по настоящему изобретению, если указанный экспрессионный вектор был введен в указанную линию клеток.

Как будет понятно специалисту, эндогенный ген DHODH будет зависеть от линии клеток. Например, в линии клеток СНО эндогенный ген DHODH представляет собой ген DHODH китайского хомячка; в линии клеток человека эндогенный ген DHODH представляет собой ген DHODH человека.

Как правило, DHODH китайского хомячка дикого типа относится к последовательности, включающей или состоящей из SEQ ID NO:2, а также к ее вариантам, проявляющим активность DHODH. Такие варианты могут, например, соответствовать вариантам, которые встречаются в природе у видов хомяков (таким как аллельные варианты или варианты сплайсинга).

Как правило, DHODH человека дикого типа относится к последовательности, включающей или состоящей из SEQ ID NO:4, а также к ее вариантам, проявляющим активность DHODH. Такие варианты могут, например, соответствовать вариантам, которые встречаются в природе у вида человека (например, аллельным вариантам или вариантам сплайсинга).

Используемый здесь термин «ген» включает область ДНК, кодирующую продукт гена, а также все области ДНК, которые регулируют продукцию продукта гена, независимо от того, примыкают ли такие регуляторные последовательности к кодирующим и/или транскрибируемым последовательностям. Соответственно, ген включает промоторные последовательности, терминаторы, регулирующие трансляцию последовательности, такие как сайты связывания рибосом и внутренние участки посадки рибосом, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, граничные элементы, начала репликации, сайты прикрепления к матриксу и локус-контрольные области (регуляторные дальнодействующие области).

«Инактивация» гена относится к любому снижению экспрессии гена по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа. Инактивация гена может быть полной (полной инактивацией или нокаутом) или частичной (например, гипоморфным геном (мутантным геном), уровень экспрессии с которого ниже нормального, или продуктом мутантного гена, который демонстрирует частичное снижение активности, на которую он влияет).

В конкретном варианте осуществления все аллели эндогенного гена DHODH частично или полностью инактивированы.

В конкретном варианте осуществления указанный эндогенный ген DHODH является полностью инактивированным.

В более конкретном варианте осуществления все аллели эндогенного гена DHODH являются полностью инактивированными.

В конкретном варианте осуществления эндогенный ген DHODH инактивирован методом с использованием системы CRISPR-Cas9, описанного в Aga et al. (2015) BMC Proceedings 9(suppl 9):P2.

Как хорошо известно специалисту, система CRISPR-Cas9 представляет собой прокариотическую систему адаптивного иммунного ответа, в которой используются некодирующие РНК, чтобы направлять нуклеазу Cas9 на вызов сайт-специфического расщепления ДНК. Репарация этого повреждения ДНК осуществляется с помощью клеточных механизмов репарации ДНК, либо через путь репарации ДНК посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), либо через путь гомологически направленной репарации (HDR). Для создания нарушений генов одиночная направляющая РНК (gRNA), состоящая из последовательности crRNA, специфической для ДНК-мишени, и последовательности tracrRNA, которая взаимодействует с белком Cas9, связывается с рекомбинантной формой белка Cas9, обладающей ДНК-эндонуклеазной активностью. Полученный комплекс вызовет мишень-специфическое расщепление двухцепочечной ДНК. Репарация сайта расщепления будет осуществляться путем репарации ДНК посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), подверженного ошибкам процесса, который может приводить к вставкам/делециям (INDEL), которые могут нарушать функцию гена.

В конкретном варианте осуществления по крайней мере один экзон гена DHODH намечен на инактивацию, в частности, с помощью метода редактирования генов, такого как метод с использованием системы CRIPR-Cas9. В более конкретном варианте осуществления часть гена DHODH, кодирующая N-концевую часть белка DHODH, намечена на инактивацию, в частности, с помощью метода редактирования гена, такого как метод с использованием системы CRISPR-Cas9. В еще одном варианте осуществления второй экзон гена DHODH намечен на инактивацию, в частности, с помощью метода редактирования генов, такого как метод с использованием системы CRISPR-Cas9.

В одном варианте осуществления 20-нуклеотидная последовательность с последовательностью CAAGGATGATGGCTGCATCC (SEQ ID NO:23) или с последовательностью GGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO:5) или любая последовательность, совместимая с нокаутом гена DHODH без уменьшения продолжительности существования CHO, используется в качестве соответствующего фрагмента ДНК для создания gRNA, которая нацелена на второй экзон гена DHODH. Эту gRNA, как правило, получают с использованием олигонуклеотидов с последовательностью CACCGCACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO:6) и AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC (SEQ ID NO:7) или с использованием олигонуклеотидов последовательности GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (SEQ ID NO:24) и CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (SEQ ID NO:25), обычно клонируют в уникальный рестрикционный сайт плазмиды, такой как сайт для BaeI плазмиды pCM3561 (превращенной в источник прибыли Invitrogen), так что клонированная последовательность ДНК находится под контролем промотора U6, и, как только указанная плазмида вводится в клетку, она транскрибируется в одну транскрипционную единицу, содержащую crRNA, слитую с tracrRNA, при этом часть crRNA является специфической для второго экзона гена DHODH, а часть tracrRNA распознается ферментом Cas9.

С целью идентификации линии клеток, инактивированной по гену DHODH, отдельные клетки, как правило, изолируют путем предельного разведения в планшетах с лунками, и после достижения соответствующего слияния, например 90% слияния, клетки разделяют на по крайней мере 2 условия, такие как одно в культуральной среде, дополненной уридином, а другое в культуральной среде, лишенной уридина. Представляющие интерес клоны, как правило, представляют собой клоны, чувствительные к недостатку уридина.

После изоляции эти представляющие интерес клетки можно культивировать в культуральной среде, содержащей пиримидиновое основание, в частности, в культуральной среде, содержащей уридин.

Под «пиримидиновым основанием» здесь подразумевается пиримидин как таковой и различные производные пиримидина, имеющие пиримидиновое ядро в качестве остова. Примеры таких пиримидиновых оснований включают вещества, имеющие отношение к урацилсодержащим компонентам нуклеиновых кислот, такие как урацил, уридин, уридинфосфаты, в частности уридинмонофосфат (UMP), уридиндифосфат (UDP) и уридинтрифосфат (UTP), дезоксиуридин, дезоксиуридинфосфаты, в частности, дезоксиуридинмонофосфат (dUMP), дезоксиуридиндифосфат (dUDP) и дезоксиуридинтрифосфат (dUTP); вещества, имеющие отношение к цитозинсодержащим компонентам нуклеиновых кислот, такие как цитозин, цитидин, цитидинфосфаты, в частности, цитидинмонофосфат (CMP), цитидиндифосфат (CDP), цитидинтрифосфат (CTP), дезоксицитидин, 2'-дезоксицитидин, дезоксицитидинфосфаты, в частности, дезоксицитидинмонофосфат (dCMP), дезоксицитидиндифосфат (dCDP) и дезоксицитидинтрифосфат (dCTP); тимин, тимидин, тимидинфосфаты, в частности тимидинмонофосфат (TMP), тимидиндифосфат (TDP) и тимидинтрифосфат (TTP), дезокситимидин, дезокситимидинфосфаты, в частности, дезокситимидинмонофосфат (dTMP), дезокситимидиндифосфат (dTTP) и дезокситимидинтрифосфат (dTTP) и оротат.

В конкретном варианте осуществления указанное пиримидиновое основание представляет собой уридин.

Под «уридином» здесь подразумевается нуклеозид следующей формулы:

Под «культуральной средой, лишенной уридина», подразумевается любая основная культуральная среда, подходящая для выращивания конкретной линии клеток, причем указанная среда содержит менее 1 мМ уридина, в частности указанная среда не содержит какой-либо уридин.

Под «культуральной средой, содержащей уридин» подразумевается любая основная культуральная среда, подходящая для выращивания конкретной линии клеток, причем указанная среда содержит, кроме того, от 1 до 25 мМ уридина, в частности от 5 до 10 мМ уридина.

Под «основной культуральной средой» здесь подразумевается среда без добавок, которая подходит для воздействия на клетки, например, клетки СНО. Как будет понятно специалисту, используемая основная культуральная среда будет зависеть от типа используемых клеток. Примеры основной культуральной среды включают среду CDCHO, среду OPTiCHO^TM, среду Fecto CHO^TM, среду FortiCHO^TM, среду ExpiCHO^TM, среду Ex-Cell^TM, среду ActiPRO^TM, среду MAM PF77^TM и среду PowerCHO^TM.

В конкретном варианте осуществления в основную культуральную среду дополнительно добавляют глутамин, обычно от 4 до 6 мМ глутамина.

Соответственно, в конкретном варианте осуществления линию клеток по настоящему изобретению создают путем

а) инактивации эндогенного гена DHODH в клетке, в частности, с помощью метода редактирования генов, такого как метод с использованием системы CRISPR-Cas9, и

b) культивирования клетки в культуральной среде, содержащей уридин, в условиях, подходящих для создания линии клеток, в которой эндогенный ген DHODH частично или полностью инактивирован.

Создание линии клеток СНО, содержащей эндогенный ген DHODH, который полностью или частично инактивирован с помощью подхода с использованием системы CRISPR-Cas9, подробнее проиллюстрировано в примерах 2 и 3.

Создание линии клеток, такой как линия клеток СНО, содержащей эндогенный ген DHODH, который полностью или частично инактивирован, можно осуществить с помощью ряда других методов молекулярной биологии, известных в данной области техники. Например, другие методы редактирования генов, применимые для создания линии клеток, содержащей эндогенный ген DHODH, который полностью или частично инактивирован, включают использование нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN) или эффекторных нуклеаз типа фактора транскрипции (TALEN). Метод с использованием системы ркомбинации Cre/Lox также может использоваться для нокаута одной или более или всех аллелей гена DHODH.

В конкретном варианте осуществления линия клеток по настоящему изобретению содержит, кроме того, экспрессионный вектор, определенный ниже в разделе «Экспрессионный вектор».

Указанный экспрессионный вектор может быть введен в линию клеток любым подходящим способом, хорошо известным специалисту, например путем трансфекции, в частности, путем электропорации или химической трансфекции, или трансдукции.

В конкретном варианте осуществления указанная линия клеток по настоящему изобретению может содержать, кроме того, дополнительный экспрессионный вектор, содержащий маркер отбора, отличный от экспрессионного вектора по настоящему изобретению, как правило, дополнительный экспрессионный вектор, содержащий последовательность, кодирующую глутаминсинтетазу.

Экзогенная DHODH

DHODH, кодируемая экспрессионным вектором, используемым в настоящем изобретении, (далее называемая «экзогенной DHODH»), может включать или состоять из последовательности, идентичной на по крайней мере 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% или 100% SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4. Она также может включать или состоять из фрагмента из по крайней мере 100, 150, 200, 250, 300 или 350 следующих друг за другом аминокислот SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4 при условии, что белок сохраняет активность DHODH.

В некоторых вариантах осуществления экзогенная DHODH в соответствии с настоящим изобретением включает или состоит из последовательности, идентичной на по крайней мере 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%; 92%; 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% или 100% как последовательности SEQ ID NO:2, так и последовательности SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления экзогенная DHODH в соответствии с настоящим изобретением представляет собой DHODH человека, т.е. DHODH человеческого происхождения.

Используемый здесь термин «DHODH человека» относится к белку с последовательностью, включающей или состоящей из SEQ ID NO:4, а также к его вариантам, проявляющим активность DHODH. Такие варианты могут, например, соответствовать вариантам, которые встречаются в природе у вида человека, (например, аллельным вариантам или вариантам сплайсинга). Альтернативно, такие варианты могут соответствовать вариантам, полученным с помощью генной инженерии. В одном варианте осуществления такие варианты отличаются от последовательности SEQ ID NO:4 только наличием самое большее 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18,17,16,15,14,13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 изменения аминокислоты по сравнению с SEQ ID NO:4 (при этом указанные изменения включают замены, вставки и делеции).

В конкретном варианте осуществления указанная DHODH человека представляет собой вариант, содержащий мутацию G202A по сравнению с последовательностью дикого типа, обычно белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26 или состоящий из нее.

В некоторых вариантах осуществления экзогенная DHODH представляет собой DHODH хомяка, т.е. DHODH хомячкового происхождения. DHODH хомяка может быть, например, DHODH китайского хомячка (Cetulus griseus).

Используемый здесь термин «DHODH китайского хомячка» относится к последовательности, включающей или состоящей из SEQ ID NO:2, а также к ее вариантам, проявляющим активность DHODH. Такие варианты могут, например, соответствовать вариантам, которые встречаются в природе у вида хомяков, (например, аллельным вариантам или вариантам сплайсинга). Альтернативно, такие варианты могут соответствовать вариантам, полученным с помощью генной инженерии. В одном варианте осуществления такие варианты отличаются от последовательности SEQ ID NO:2 только наличием самое большее 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 изменения аминокислоты по сравнению с SEQ ID NO:2 (при этом указанные изменения включают замены, вставки и делеции).

В другом варианте осуществления вариант DHODH будет обладать активностью DHODH, необязательно, таким же уровнем активности, что и белок дикого типа, или 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%. 130%, 140% или более от уровня активности белка дикого типа.

Под полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, идентичную на по крайней мере, например, на 95% запрашиваемой аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, подразумевается, что аминокислотная последовательность рассматриваемого полипептида идентична запрашиваемой последовательности, за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, идентичную на по крайней мере 95% запрашиваемой аминокислотной последовательности, до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности могут быть вставлены, делетированы или заменены другой аминокислотой.

Идентичность последовательности может быть определена по всей длине вариантной последовательности, по всей длине эталонной последовательности или по обоим параметрам. Например, процент идентичности может быть рассчитан с использованием глобального совмещения (т.е. две последовательности сравниваются по всей их длине). Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области техники. Программа «Needle», в которой используется алгоритм для глобального совмещения Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453), чтобы найти оптимальное совмещение (включая разрывы) двух последовательностей с учетом всей их длины, может, например, использоваться при выполнении глобального совмещения. Эта программа «Needle», например, доступна на всемирном веб-сайте ebi.ac.uk. Процент идентичности в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно рассчитывается, используя программу EMBOSS::needle (global) с использованием параметра «Gap Open» (штрафа за открытие разрыва), равного 10,0, параметра «Gap Extend» (штрафа за удлинение разрыва), равного 0,5, и матрицы замен Blosum62.

Варианты эталонной последовательности могут содержать мутации, такие как делеции, вставки и/или замены, по сравнению с эталонной последовательностью. В случае замен замена предпочтительно соответствует консервативной замене, как указано в таблице ниже.

Консервативные замены Тип аминокислоты Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp Аминокислоты с алифатическими гидрофобными боковыми цепями Ser, Tyr, Asn, Gln, Cys Аминокислоты с незаряженными, но полярными боковыми цепями Asp, Glu Аминокислоты с кислотными боковыми цепями Lys, Arg, His Аминокислоты с основными боковыми цепями Gly Нейтральная боковая цепь

Экспрессионный вектор

Экспрессионный вектор используемый в контексте настоящего изобретения, подходит для продуцирования рекомбинантного белка и содержит последовательность, кодирующую дигидрооротатдегидрогеназу (DHODH).

Экспрессионный вектор предпочтительно представляет собой ДНК-вектор.

Экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, содержит последовательность, кодирующую экзогенную DHODH, определенную выше в разделе «Экзогенная DHODH».

В конкретном варианте осуществления линия клеток, в которую должен быть введен экспрессионный вектор, представляет собой линию клеток CHO, и экзогенная DHODH имеет гетерологичное происхождение (т.е. экзогенная DHODH не является DHODH хомяка).

Последовательность, кодирующая такую экзогенную DHODH, может быть встречающейся в природе нуклеотидной последовательностью. Альтернативно, триплетные кодоны последовательности, кодирующей такую DHODH, могут быть смещены для экспрессии в клетках СНО. Программное обеспечение и алгоритмы для смещения кодонов в последовательности для получения оптимальной экспрессии известны в данной области техники и включают, например, алгоритм, описанный в Raab et al. (2010) Syst Synth Biol. 4:215-225. Этот алгоритм не только обеспечивает наилучшие доступные кодоны для экспрессии, но также учитывает содержание GC и отсутствие нежелательных мотивов ДНК.

Например, последовательность, кодирующая экзогенную DHODH, может включать или состоять из последовательности, идентичной на по крайней мере 60%, 62%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности SEQ ID NO:3 (т.е. последовательности, кодирующей DHODH человека с SEQ ID NO:4, которая была разработана для оптимальной экспрессии в клетках CHO) и/или последовательности SEQ ID NO:1 (т.е. последовательности, кодирующей DHODH хомяка с SEQ ID NO:2, которая была разработана для оптимальной экспрессии в клетках CHO).

В одном варианте осуществления последовательность, кодирующая экзогенную DHODH, включает или состоит из последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.

В экспрессионном векторе, используемом в контексте настоящего изобретения, последовательность, кодирующая экзогенную DHODH, определенную выше, может быть помещена под контроль любого промотора, известного специалистам в данной области техники.

Например, последовательность, кодирующая экзогенную DHODH, определенную выше, может, например, быть помещена под контроль промотора, подходящего для управления экспрессией DHODH, например промотора обезьяньего вакуолизирующего вируса 40 (SV40) (например, позднего или раннего промотора SV40), промотора CMV, промотора фактора 1 элонгации, промотора GAPDH, промотора RPL37, промотора актина. Ранний промотор SV40 описан, например, в Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310 и в Moreau et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:6047-6068. В частности, указанный промотор SV40 является полноразмерным промотором. Указанный промотор SV40 может также иметь начало репликации, содержащее повтор из 72 пар оснований.

В некоторых вариантах осуществления указанный промотор SV40 не является промотором SV40, из которого были удалены положения с 128 по 270, т.е. указанный промотор SV40 не является промотором SV40, описанным в патенте Кореи с № 10-0267720, и трансформирующим трансформант E. coli, депонированный в Gene Bank, Institute of Bioengineering, KIST, 17 декабря 1997 г. под номером депонирования: KCTC 8860 P.

В других вариантах осуществления последовательность, кодирующая экзогенную DHODH, определенную выше, не находится под контролем промотора SV40.

Экспрессионные векторы, подходящие для продукции рекомбинантных белков, известны специалистам в данной области техники. Такие векторы, как правило, соответствуют экспрессионным векторам, которые содержат начало репликации и по крайней мере одну экспрессионную кассету, обеспечивающую клонирование и экспрессию рекомбинантного белка, продукция которого желательна. Экспрессионная кассета, как правило, содержит 5'-нетранслируемую область (включающую или состоящую из промотора и, необязательно, энхансерной последовательности), один или более сайтов рестрикции, позволяющих клонировать последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, 3'-нетранслируемую область (например, сигнал (поли)А) и, необязательно, один или более интронов. Промоторная последовательность может соответствовать любому сильному промотору, хорошо известному в данной области техники, такому как, например, промотор CMV человека. Необязательно, экспрессионные векторы, используемые в контексте настоящего изобретения, содержат прокариотическое начало репликации (например, прокариотический репликон, такой как ColE1 в E. coli) и по крайней мере ген маркера отбора прокариот, также известный как прокариотический селектируемый маркер, так что эти векторы делают возможной репликацию в прокариотических клетках. Клетки, которые реплицируют векторы, также экспрессируют ген маркера отбора прокариот и, следовательно, могут быть идентифицированы и отобраны. Гены селективных в случае прокариот маркеров хорошо известны специалисту в данной области. Примерами генов маркеров отбора прокариот являются, например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, придающий устойчивость к антибиотикам (например, последовательность, кодирующая белок, придающий устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, бластицидину или канамицину).

Рекомбинантный белок может соответствовать любому белку, который представляет интерес для специалистов в данной области техники.

Используемый здесь термин «белок», как подразумевается, охватывает пептиды (т.е. аминокислотные цепи из менее 50 аминокислот), полипептиды (т.е. аминокислотные цепи из не менее 50 аминокислот), мономерные белки (т.е. белки, состоящие из одной аминокислотной цепи) и мультимерные белки (т.е. белки, состоящие из двух или более аминокислотных цепей, такие как, например, моноклональные антитела).

Экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, включает, как правило, ряд экспрессионных кассет, который идентичен ряду различных аминокислотных цепей, составляющих белок (например, одну экспрессионную кассету в случае мономерного белка или гомодимерного белка, две в случае гетеродимерного белка или моноклонального антитела и т.д.).

Альтернативно, экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, может содержать только одну экспрессионную кассету, даже когда желательна продукция гетеродимерного белка или моноклонального антитела. В таком случае последовательность(и), кодирующая другую аминокислотную цепь(и) белка, присутствует(ют) в отдельном экспрессионном векторе, который котрансфицируется вместе с экспрессионным вектором в соответствии с настоящим изобретением в линию клеток-хозяев, в частности, в линию клеток CHO.

В этом случае дополнительные отдельные экспрессионные векторы могут содержать маркеры отбора, отличные от маркера отбора DHODH, описанного здесь, такие как DHFR, GS или HPRT.

В одном варианте осуществления экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, может быть лишен экспрессионной кассеты. В таком случае экспрессионная кассета(ы), подходящая для экспрессии рекомбинантного белка, присутствует(ют) в отдельном векторе, который котрансфицируется вместе с экспрессионным вектором в соответствии с настоящим изобретением в линию клеток-хозяев, в частности, в линию клеток с инактивированным DHODH по настоящему изобретению, конкретнее, в линию клеток CHO с инактивированным DHODH по настоящему изобретению.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, содержит:

- последовательность, кодирующую экзогенную DHODH, определенную выше, помещенную под контроль раннего промотора SV40;

- первую экспрессионную кассету, в которой последовательность, кодирующая легкую цепь антитела, помещена под контролем промотора CMV;

- вторую экспрессионную кассету, в которой последовательность, кодирующая тяжелую цепь антитела, помещена под контролем промотора CMV;

- прокариотическое начало репликации; и

- селектируемый маркер для применения в прокариотических клетках, а именно последовательность, кодирующую белок, придающий устойчивость к ампициллину, помещенный под контроль своего природного промотора.

На протяжении настоящего описания термин «рекомбинантный белок» относится к любому рекомбинантному белку, продукция которого желательно. Он может, например, соответствовать терапевтическому и/или профилактическому белку, т.е. белку, предназначенному для применения в качестве лекарственного средства (в том числе вакцины). В конкретном варианте осуществления рекомбинантный белок, продукция которого желательна, не является DHODH. В другом конкретном варианте осуществления рекомбинантный белок, продукция которого желательно, представляет собой антитело, например моноклональное антитело. В еще одном конкретном варианте осуществления рекомбинантный белок, продукция которого желательна, представляет собой антигенный белок.

Термин «антитело» используется здесь в самом широком смысле и, в частности, охватывает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела) любого изотипа, такого как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (в том числе биспецифические и триспецифические антитела), фрагменты антител (такие как, например, Fv, scFv, dsFab, Fab' или F(ab)-фрагменты, однодоменные антитела и их фрагменты, а также слитые белки, содержащие фрагмент антитела. Антитело, реагирующее со специфическим антигеном, может создано с помощью рекомбинантных методов, таких как отбор из библиотек рекомбинантных антител в фаге или аналогичных векторах, или путем иммунизации животного антигеном или кодирующей антиген нуклеиновой кислотой.

«Моноклональное антитело», как здесь используется, представляет собой антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. антитела, образующие эту популяцию, являются по существу идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Эти антитела направлены против одного эпитопа (или одной группы эпитопов в случае полиспецифических моноклональных антител) и поэтому обладают высокой специфичностью.

Типичное моноклональное антитело состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, соединенных дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область. Каждая вариабельная область содержит три сегмента, называемых «определяющими комплементарность участками» («CDR») или «гипервариабельными участками», которые в основном отвечают за связывание с эпитопом антигена. Их обычно называют CDR1, CDR2 и CDR3, с нумерацией последовательно от N-конца (смотрите Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991). Более высококонсервативные части вариабельных областей называются «каркасными областями».

Моноклональное антитело может, например, представлять собой мышиное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или полностью человеческое антитело.

Моноклональное антитело может быть моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим антителом.

Когда рекомбинантный белок, продукция которого желательна, представляет собой моноклональное антитело, экспрессионный вектор в соответствии с настоящим изобретением может содержать первую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования легкой цепи антитела, и вторую экспрессионную кассету, подходящую для клонирования тяжелой цепи антитела.

В конкретном варианте осуществления каждая из указанных первой и второй экспрессионных кассет содержит промотор цитомегаловируса (CMV), например промотор CMV из CMV человека или мыши. Конкретнее, указанные первая и вторая экспрессионные кассеты могут содержать:

- немедленный ранний промотор-энхансера CMV (например, тот, который имеет последовательность, описанную в Teschendorf et al. (2002) Anticancer Res. 22:3325-3330); или

- область промотора/энхансера IE2 из CMV мыши (например, имеющую последовательность, описанную в Chatellard et al. (2007) Biotechnol Bioeng. 96:106-117); или

- регуляторный элемент hCMV-MIE (например, имеющий последовательность, описанную в WO 89/01036).

Термин «антигенный белок» используется здесь в самом широком смысле и охватывает любой белок, способный вызывать иммунный ответ, либо отдельно, либо в сочетании с адъювантом. Он может быть предназначен для применения либо в профилактической вакцине, либо в терапевтической вакцине. В конкретном варианте осуществления антигенный белок представляет собой вакцинный белок, т.е. белок, предназначенный для применения в профилактической вакцине.

Экспрессионный вектор либо может содержать по крайней мере одну последовательность, кодирующую представляющий интерес рекомбинантный белок (например, одну последовательность, кодирующую мономерный белок, одну последовательность, кодирующую цепь антитела, или две последовательности, кодирующие легкую цепь антитела и тяжелую цепь антитела, соответственно), либо он может быть пустым (т.е. лишенным такой последовательности, кодирующей представляющий интерес рекомбинантный белок).

Экспрессионная система, наборы, способы и применения

Настоящим изобретением предоставляется экспрессионная система, включающая:

(i) линию клеток, определенную в разделе «Линия клеток» выше, содержащую эндогенный ген DHODH, который частично или полностью инактивирован, как определено в разделе «Линия клеток» выше, и

(ii) экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше.

Экспрессионная система по настоящему изобретению может, кроме того, включать дополнительные отдельные экспрессионные векторы, каждый из которых содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую маркер отбора, отличный от DHODH, такой как DHFR, GS или HPRT, и по крайней мере одну экспрессионную кассету для экспрессии рекомбинантного белка.

Альтернативно, экспрессионная система по настоящему изобретению может, кроме того, включать дополнительные экспрессионные векторы, определенные в разделе «Экспрессионный вектор» выше.

Настоящим изобретением предоставляется набор, включающий (i) линию клеток в соответствии с настоящим изобретением, содержащую экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше, или экспрессионную систему в соответствии с настоящим изобретением и (ii) культуральную среду, лишенную уридина, определенную выше.

Набор может включать экспрессионный вектор, кодирующий экзогенную DHODH, (в экспрессионной системе), как описано выше. В таком наборе вектор предпочтительно является пустым, поскольку это позволяет клонировать белок, представляющий интерес для специалистов в данной области техники. Кроме того, экспрессионный вектор предпочтительно выделяют из линии клеток в таком наборе.

Набор включает, кроме того, культуральную среду, лишенную уридина, как определено в разделе «Линия клеток» выше.

Набор может, кроме того, включать среду, подходящую для культивирования линии клеток, среду, подходящую для трансфекции вектора в линию клеток, упаковочный материал и/или инструкции по применению экспрессионной системы.

В конкретном варианте осуществления набор не содержит ингибитор DHODH.

Примеры ингибиторов DHODH включают бицинхониновую кислоту, бреквинар (6-фтор-2-(2'-фтор-1,1’-бифенил-4-ил)-3-метил-4-хинолинкарбоновую кислоту), производные нафтохинона, такие как дихлоралли-лаусон, производные изоксазола, такие как лефлуномид (5-метил-N-[4-(трифторметил)фенил]изоксазол-4-карбоксамид) и его активный метаболит терифлуномид ((2Z)-2-циано-3-гидрокси-N-[4- (трифторметил)фенил]бут-2-енамид), хинолонкарбоновые кислоты, нафтохиноны, изоксазолы, феноксихинолины, редоксаль и производные, лаусон, лапахол, атовахон и (8-хлор-4-(2-хлор-4-фторфенокси)хинолин). Ингибитор DHODH может подавлять активность DHODH на по крайней мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или 100%.

В конкретном варианте осуществления набор не содержит терифлуномид.

В настоящем изобретении, кроме того, предусматривается применение линии клеток в соответствии с настоящим изобретением, содержащей экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше, экспрессионной системы в соответствии с настоящим изобретением или набора в соответствии с настоящим изобретением для продукции рекомбинантного белка in vitro.

В конкретном варианте осуществления указанная линия клеток, экспрессионная система или набор применяются в сочетании с культуральной средой, лишенной уридина, как определено выше, конкретнее, в отсутствие ингибитора DHODH.

Кроме того, в настоящем изобретении также предусматривается применение экспрессионной системы в соответствии с настоящим изобретением, линии клеток в соответствии с настоящим изобретением, содержащей экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше, или набора в соответствии с настоящим изобретением для изоляции клеточного клона, который продуцирует рекомбинантный белок на высоком уровне, («продуцирующих на высоком уровне клонов») in vitro, в частности, в отсутствии ингибитора DHODH.

В контексте настоящего изобретения, термин «высокий уровень рекомбинантного белка», как подразумевается, означает, что в культуральной среде концентрация рекомбинантного белка составляет по крайней мере 0,05 г/л, предпочтительно по крайней мере 0,1 г/л, еще предпочтительнее по крайней мере 0,2 г/л, более предпочтительно от 0,3 до 1 г/л. Концентрация рекомбинантного белка может быть определена с помощью способов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники, включающих, в частности, иммуноферментный анализ (ELISA), Вестерн-блоттинг, калипер-метод и диапазон концентраций очищенного белка, соответствующий рекомбинантному белку.

Настоящим изобретением, кроме того, предоставляется способ продукции рекомбинантного белка in vitro, включающий стадии:

А a1) предоставления линии клеток в соответствии с настоящим изобретением, содержащей экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше;

или

a2) предоставления линии клеток в соответствии с настоящим изобретением и

a2') введения экспрессионного вектора, определенного в разделе «Экспрессионный вектор» выше, в линию клеток, предоставленную на стадии a2);

или

a3) предоставления линии клеток, содержащей эндогенный ген DHODH,

a3') частичной или полной инактивации эндогенного гена DHODH в линии клеток, предоставленной на стадии a3), и

a3”) введения экспрессионного вектора, определенного в разделе «Экспрессионный вектор» выше, в линию клеток, содержащую частично или полностью инактивированный эндогенный ген DHODH, полученную на стадии а3');

В) культивирования указанной линии клеток в условиях, подходящих для продукции рекомбинантного белка; и

С) выделения и/или очистки указанного рекомбинантного белка.

В конкретном варианте осуществления стадия B) вышеуказанного способа проводится в культуральной среде, лишенной уридина, конкретнее также лишенной ингибитора DHODH, и, в частности, включает подстадию, заключающуюся в отборе трансфицированных клеток, которые растут, несмотря на отсутствие уридина, в частности, дополнительно в отсутствие ингибитора DHODH.

Настоящим изобретение, кроме того, предоставляется in vitro способ изоляции клеточного клона, который продуцирует рекомбинантный белок на высоком уровне, при этом указанный способ включает или состоит из следующих стадий:

А a1) предоставления линии клеток в соответствии с настоящим изобретением, содержащей экспрессионный вектор, определенный в разделе «Экспрессионный вектор» выше;

или

a2) предоставления линии клеток в соответствии с настоящим изобретением и

a2') введения экспрессионного вектора, определенного в разделе «Экспрессионный вектор» выше, в линию клеток, предоставленную на стадии a2);

или

a3) предоставления линии клеток, содержащей эндогенный ген DHODH,

a3') частичной или полной инактивация эндогенного гена DHODH в линии клеток, предоставленной на стадии a3), и

a3”) введения экспрессионного вектора, определенного в разделе «Экспрессионный вектор» выше, в линию клеток, содержащую частично или полностью инактивированный эндогенный ген DHODH, полученную на стадии а3');

В) культивирования указанной линии клеток в условиях, подходящих для продукции рекомбинантного белка; и

С) изоляции клона, который продуцирует рекомбинантный белок на высоком уровне.

В конкретном варианте осуществления стадия B) вышеуказанного способа проводится в культуральной среде, лишенной уридина, конкретнее также лишенной ингибитора DHODH, и, в частности, включает подстадию, заключающуюся в отборе трансфицированных клеток, которые растут, несмотря на отсутствие уридина, в частности, дополнительно в отсутствие ингибитора DHODH.

Указанный экспрессионный вектор может быть введен в указанную линию клеток на стадиях а2') или а3") любым способом, хорошо известным специалисту, например, путем трансфекции, в частности, путем электропорации, или химической трансфекции, или трансдукции.

Условия, подходящие для продуцирования рекомбинантных белков, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, можно использовать протоколы, описанные в разделе «Примеры».

В конкретном варианте осуществления культуральная среда, используемая на стадии B), содержит уменьшающиеся концентрации уридина. Это позволяет отбирать клоны, в которых произошла амплификация экзогенного гена DHODH векторного происхождения (и, таким образом, последовательности, кодирующей рекомбинантный белок).

Вышеупомянутые способы могут включать, кроме того, стадию составления рекомбинантного белка в фармацевтическую композицию.

По всему описанию такие термины, как «содержит (включает)», «содержащийся (включенный)» и «содержащий (включающий)», имеют значение, приписываемое им в большинстве патентных юрисдикций, предпочтительно в рассматриваемой юрисдикции; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и т.д. Такие термины, как «состоящий из», «по существу состоящий из» и «по существу состоит из», имеют значение, приписываемое им в большинстве патентных юрисдикций, предпочтительно в рассматриваемой юрисдикции; например, они подразумевают исключение всех, большинства или всех, за исключением незначительного количества других элементов, они допускают элементы, не перечисленные в явной форме, но исключают элементы, которые встречаются в предшествующем уровне техники, или которые влияют на основные или новые характеристики настоящего изобретения.

В тексте данного описания приводится несколько документов. Каждый из приведенных здесь документов (включая любую журнальную статью или реферат, опубликованную или неопубликованную заявку на патент, выданный патент, спецификации производителя, инструкции и т.д.) включен таким образом посредством ссылки. Однако нельзя допускать, что какой-либо документ, приведенный здесь, действительно является предшествующим уровнем техники относительно настоящего изобретения.

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие чертежи и примеры, которые являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Настоящее изобретение определяется формулой изобретения, которую следует интерпретировать с помощью описания и чертежей.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO: Описание 1 Последовательность кДНК, кодирующая DHODH с происхождением от китайского хомячка (Cricetulus griseus) 2 Аминокислотная последовательность DHODH с происхождением от китайского хомячка 3 Последовательность кДНК, кодирующая DHODH человеческого происхождения 4 Аминокислотная последовательность DHODH человеческого происхождения 5 Соответствующий фрагмент ДНК для создания gRNA 6 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность1) 7 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность1) 8 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность2) 9 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность2) 10 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA,(последовательность3) 11 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность3) 12 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность4) 13 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность4) 14 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность5) 15 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность5) 16 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность6) 17 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность6) 18 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность7) 19 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность7) 20 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность8) 21 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность8) 22 Последовательность гена DHODH CHO 23 Соответствующий фрагмент ДНК для создания gRNA 24 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность1’) 25 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность1’) 26 Аминокислотная последовательность DHODH G202A человека 27 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность2’) 28 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность2’) 29 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность3’) 30 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность3’) 31 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность4’) 32 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность4’) 33 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность5’) 34 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность5’) 35 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность6’) 36 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность6’) 37 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность7’) 38 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность7’) 39 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность8’) 40 Олигонуклеотид, используемый для получения gRNA, (последовательность8’) 41 Смысловой олигонуклеотид 603 42 Антисмысловой олигонуклеотид 503 43 Последовательность, включающая целевую последовательность и PAM. 44 Область смысловой последовательности экзона2 DHODH, включающая последовательность n°1 для CrispR. 45 Область антисмысловой последовательности экзона2 DHODH, включающая последовательность n°1 для CrispR.

Примеры

Пример 1: Получение линии клеток CHO 9E4

В этом примере описывается получение линии клеток CHO 9E4 из линии клеток CHO-K1, коммерчески доступной из ATCC под номером в ATCC: CCL-61.

1. Линия клеток CHO-K1

Флакон с клетками CHO-K1 (ATCC: CCL-61), замороженными в присутствии телячьей сыворотки в 1969 году, был получен из ATCC.

2. Оттаивание флакона в среде Ex-Cell™ 302 и приготовление банка CHO-LG-APF.

CHO-K1 во флаконе оттаивали непосредственно в среде Ex-Cell™ 302 (SAFC), дополненной 4 мМ глутамином, и размножали на неподвижной опоре, затем во вращающем устройстве. Полученный банк CHO-LG-APF замораживали в среде Ex-Cell™ 302 через 12 пассажей и 17,3 поколений.

3. Оттаивание банка CHO-LG-APF в среде Ex-Cell™ 302 и приготовление банка ABC-024 P22.

CHO-LG-APF во флаконе оттаивали в среде Ex-Cell™ 302 и размножали. Полученный банк ABC-024 P22 оттаивали через 18,5 поколений.

4. Адаптация банка CMV07-024 к среде CDCHO Fusion и приготовление банка ABC-003.

Банк CMV07-024 оттаивали и непосредственно адаптировали к среде Ex-cell™ CDCHO Fusion (SAFC), дополненной 4 мМ глутамином, и адаптировали на шейкере на протяжении более 12,5 поколений до замораживания банка ABC-003 в среде Ex-cell™ CDCHO Fusion.

5. Оттаивание банка ABC-003 в среде CDCHO Fusion и приготовление банка ABC-053 в среде CDCHO Fusion

ABC-003 во флаконе оттаивали в среде CDCHO Fusion, и после разведения банк ABC-53 замораживали через 4,2 поколения.

6. Оттаивание банка ABC-053 в среде CDCHO Fusion, отбор, клонирование и приготовление банка P15A11 в среде CDCHO Fusion

Банк ABC-053 оттаивали в среде Ex-cell™ CDCHO Fusion (SAFC), дополненной 4 мМ глутамином. После размножения культуры ее клонировали путем предельного разведения в планшетах, а затем размножали в среде CDCHO Fusion. Банк клона P15A11, полученный в результате этого клонирования, замораживали. Это клонирование и размножение соответствует приблизительно 94 поколениям.

7. Оттаивание банка P15A11 в среде CDCHO Fusion, адаптация банка путем прямого пассажа в CDCHO и приготовление банка CHOSP10-002 в среде CDCHO.

Банк P15A11 оттаивали в среде Ex-cell™ CDCHO Fusion (SAFC), дополненной 4 мМ глутамином, и после 2 пассажей в среде CDCHO Fusion клетки разводили в среде CDCHO. После 3 пассажей в среде CDCHO банк CHOSP10-002 замораживали через всего 15,9 поколений.

8. Оттаивание банка CHOSP10-002 в среде CDCHO, размножение, удаление масс центрифугированием и отбор путем субкультивирования без масс в 96-луночных планшетах, размножение в 6-луночных планшетах и на шейкере для приготовления банка CHOSP10-012 в среде CDCHO.

Банк CHOSP10-002 оттаивали в среде CDCHO (Invitrogen), дополненной 6 мМ глутамином, затем размножали. Культуру центрифугировали для удаления клеточных масс и продолжения культивирования только с использованием клеток, выделенных из супернатанта. На этой стадии, от оттаивания, прошло 11,3 поколения.

Эту культуру разделяли по 96-луночным планшетам по 10 клеток на лунку. Лунки с клетками, которые изолированно размножаются в суспензии, размножали в 6-луночных планшетах, затем на шейкере. До замораживания банка CHOSP10-012 прошло 23,2 дополнительных поколения.

9. Оттаивание банка CHOSP10-012, размножение и приготовление банка CHOSP11-008 (банка 9E4)

Банк CHOSP10-012 оттаивали в среде CDCHO (Invitrogen), дополненной 6 мМ глутамином, затем размножали, начиная со стадии в колбе Эрленмейера до 17-литрового биореактор.

Банк 9E4 замораживали через в общей сложности 10 поколений.

Пример 2: Получение линии клеток СНО, в которой ген DHODH является инактивированным.

A - Разработка и конструирование направляющей РНК (gRNA) для системы CRISPR-CAS9.

Для аннулирования гена DHDOH в клетках СНО авторы настоящего изобретения начали с получения последовательности гена DHODH хомячка и использования общедоступного программного обеспечения Tefor для разработки различных направляющих РНК (gRNA) для трансфекции вместе с CRISPR-Cas9 в геном CHO. Полноразмерная последовательность DHODH CHO, с интронами и экзонами, показана на фиг. 1.

Программа определила 8 последовательностей, которые могут быть нацелены на ген DHODH:

Последовательность 1

CACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO:6)

AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC (SEQ ID NO:7)

Последовательность 2

CACCGGATGCAGCCATCATCCTTGG (SEQ ID NO:8)

AAAACCCAAGGATGATGGCTGCATC (SEQ ID NO:9)

Последовательность 3

CACCGGCAGCCATCATCCTTGGGGG (SEQ ID NO:10)

AAAACCCCCCAAGGATGATGGCTGC (SEQ ID NO:11)

Последовательность 4

CACCGGCCATCATCCTTGGGGGAGG (SEQ ID NO:12)

AAAACCCTCCCCCAAGGATGATGGC (SEQ ID NO:13)

Последовательность 5

CACCGGCTATTCGCTTCACGTCCCT (SEQ ID NO:14)

AAAACAGGGACGTGAAGCGAATAGC (SEQ ID NO:15)

Последовательность 6

CACCGGCCTCTACAAACTGGGCTTT (SEQ ID NO:16)

AAAACAAAGCCCAGTTTGTAGAGGC (SEQ ID NO:17)

Последовательность 7

CACCGGGCTTTGGGTTTGTCGAGGT (SEQ ID NO:18)

AAAACACCTCGACAAACCCAAAGCC (SEQ ID NO:19)

Последовательность 8

CACCGGCTGGTCTGAGGAGCCTACA (SEQ ID NO:20)

AAAACTGTAGGCTCCTCAGACCAGC (SEQ ID NO:21)

Хотя 8 последовательностей были протестированы и клонированы, из 8 последовательностей были трансфицированы только четыре клонированных последовательности, и только одна оказалась успешной для вызова нокаута гена DHODH. Следующая последовательность из 20 нуклеотидов GGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO:5) была использована в качестве соответствующего фрагмента ДНК для создания gRNA, как показано на фиг. 2. Она нацелена на второй экзон гена DHODH. Для достижения транскрипции надлежащей gRNA, два олигонуклеотида CACCGGGATGCAGCCATCATCCTTG (олигонуклеотид 1, SEQ ID NO:6) и AAAACCAAGGATGATGGCTGCATCC (олигонуклеотид 2, SEQ ID NO:7) были синтезированы, подвергнуты отжигу и клонированы в уникальный сайт для BaeI pCM3561 (превращенной в источник прибыли Invitrogen).

Таким образом, клонированная последовательность ДНК находилась под контролем промотора U6, и после трансфекции ДНК в клетки СНО она транскрибировалась в единую транскрипционную единицу, содержащую crRNA, слитую с tracrRNA. Часть crRNA была специфической для второго экзона гена DHODH, в то время как tracrRNA распознавалась самим ферментом Cas9.

B-Подготовка материала для редактирования гена с помощью системы CRISPR-Cas9

Клетки CHO 9E4 были изолированы и отобраны из клеток CHO K-1, приобретенных в ATCC, как описано в примере 1, и выращены и сохранены в виде суспензионных культур в бессывороточной среде CDCHO с определенным химическим составом, оптимизированной для культивирования клеток яичника китайского хомячка (CHO), с добавлением 6 мМ L-глутамина при 37°C в термостате с 8% CO₂ и 80% влажностью.

10 мкг вектора для экспрессии sgRNA (pCM3561) расщепляли 1 мкл фермента BaeI при добавлении 5 единиц/мкл с 20 мкМ S-аденозилметионином (SAM) при 25°C в течение 1 часа, затем расщепленную плазмиду разделяли с помощью электрофореза, используя 1% агарозный гель. Полученный вектор для клонирования sgRNA затем извлекали с помощью набора для экстракции из геля (Qiagen Kit).

Вектор для клонирования sgRNA и отожженные направляющие олигонуклеотиды лигировали с использованием фермента ДНК-лигазы Т4 (Biolabs) и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.

5 мкл продуктов лигирования добавляли к 50 мкл компетентных клеток E. coli DH5a (Invitrogen).

Клетки и ДНК инкубировали 30 мин на льду, а затем подвергали тепловому шоку при 42°C в течение 45 с. После добавления 500 мл среды SOC, 1-часовая инкубация при 37°C (при 800 об./мин) давала бактериям время для выработки белков устойчивости к антибиотикам, кодируемых в остове плазмиды. После инкубации каждую пробирку распределяли по одной чашке со слоем LB с добавлением 100 пг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°C. Отрицательные контроли (с водой вместо вставки ДНК) использовали для оценки успеха трансформации.

Для стадии амплификации были выбраны две колонии для каждой конструкции и засеяны в 2 мл среды LB, дополненной 100 мкг/мл ампициллина, в пробирке, помещенной в термостат на ночь (при 37°C, 700 об./мин). Культуру, подвергнутую инкубации в течение ночи, собирали путем центрифугирования. Набор QIAprep Miniprep Kit™ (QIAGEN) использовали для выделения амплифицированной ДНК (элюирования в буфер EB). Затем последовательность представляющих интерес направляющих олигонуклеотидов проверяли с помощью секвенирования по Сэнгеру (смыслового и антисмыслового секвенирования, GATC Company). После проверки путем совмещения в программном обеспечении Vector NTI (Thermofisher Scientific) соответствующие колонии использовали для засева 200 мл среды LB, дополненной 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение 24 часов бактерии собирали путем центрифугирования при 6000 х g в течение 15 минут при 4°C. Набор EndoFree Plasmid Maxi Kit™ (QIAGEN) использовали для приготовления MaxiPrep. ДНК осаждали путем добавления изопропанола при комнатной температуре. После центрифугирования в течение 1 часа (при 4°C, 8000 об./мин) осадок ДНК промывали 70% этанолом, не содержащим эндотоксинов, при комнатной температуре. После короткого нового центрифугирования осадок сушили на воздухе в течение 1 ч и повторно растворяли в подходящем объеме стерильной воды, не содержащей эндотоксинов, для получения концентрации ДНК, составляющей 5 мг/мл. Устройство NanoDrop использовали для измерения концентрации ДНК.

Были получены четыре различных плазмиды, а именно плазмида pBH6840 (KO DHODH SEQ1), плазмида pBH6841 (KO DHODH SEQ4), плазмида pBH6842 (KO DHODH SEQ5) и плазмида pBH6843 (KO DHODH SEQ7). Мишень этих плазмид в гене DHODH CHO показана в последовательности SEQ ID NO:22.

Секвенирование ДНК было выполнено субподрядчиком GATC - Eurofins Genomics Company.

С-Редактирование гена с помощью системы CRISPR-Cas9

Трансфекции были выполнены путем электропорации с использованием MaxCyte STX и его протокола, определенного для CHO. Они были выполнены в процесс-компоновках OC-100 (20 миллионов клеток на трансфекцию).

За день до трансфекции клетки засевали в количестве 1,5х10⁶ клеток/мл в среду CDCHO, дополненную 6 мМ L-глутамином.

В день трансфекции клетки подсчитывали с помощью прибора ViCell (Beckman & Coulter). Необходимое количество клеток центрифугировали при 250 х g в течение 10 мин, и супернатант отбрасывали.

Для каждого условия трансфекции 20х10⁶ клеток центрифугировали 10 мин при 250 х g. Осадок ресуспендировали в 70 мкл буфера Maxcyte. Добавляли 30 мкг ДНК, и смесь (клетки, буфер и ДНК) переносили в кассету для электропорации Maxcyte емкостью 100 мкл. Используемая процесс-компоновка представляла собой процесс-компоновку OC-100, приспособленную для 100-мкл кассеты, и была выбрана оптимизированная для CHO программа.

Были осуществлены следующие трансфекции.

T1 pBH6840 KO DHODH SEQ1 T2 pBH6841 KO DHODH SEQ4 T3 pBH6842 KO DHODH SEQ5 T4 pBH6843 KO DHODH SEQ7 T5 W/O ADN H2O

После электропорации клетки были перенесены в колбы Эрленмейера с рабочим объемом=25 мл. Их помещали в термостат статического типа с температурой 37°C, 5% CO₂ на 45 мин. Затем добавляли 25 мл среды CDCHO, дополненной 6 мМ L-глутамином, для ресуспендирования клеток, и колбы Эрленмейера помещали на шейкеры на 110 об./мин при 37°C, 5% CO₂, 70% влажности.

На следующий день после электропорации по одной клетке в каждую лунку засевали путем предельного разведения из пулов, трансфицированных CH09E4, описанных выше. Приблизительно через 20 дней, когда клетки стали на приблизительно 90% сливающимися и стали выглядеть здоровыми при исследовании под микроскопом, клетки были разделены на 2 новых 96-луночных планшета с уридином или без него.

Несколько клонов было отобрано по их чувствительности к недостатку уридина. Эти клоны были адаптированы для культивирования в среде CDCHO, дополненной 6 мМ глутамином и 5 мМ уридином.

С целью подтверждения того, что редактирование гена было успешным, геномную ДНК экстрагировали из клеток клона CRISPR-Cas9 с помощью набора Qiagen DNeasy™ (Qiagen). Локус-мишень амплифицировали с помощью ПЦР, используя соответствующие праймеры для области локуса DHODH, на которую нацелена система CRISPR-Cas9, и ПЦР-продукты секвенировали с помощью NGS, используя ПЦР-фрагменты, покрывающие потенциально делетированные области.

Пример 3. Альтернативное получение линии клеток СНО, в которой ген DHODH является аннулированным.

A - Разработка и конструирование направляющей РНК (gRNA) для системы CRISPR-CAS9.

Для аннулирования гена DHDOH в клетках СНО авторы настоящего изобретения начали с получения последовательности гена DHODH хомячка и использования общедоступного программного обеспечения Tefor для разработки различных направляющих РНК (gRNA) для трансфекции вместе с CRISPR-Cas9 в геном CHO.

Программа определила 8 последовательностей, которые могут быть нацелены на ген DHODH:

Последовательность 1’

GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (SEQ ID NO:24)

CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (SEQ ID NO:25)

Последовательность 2’

GATGCAGCCATCATCCTTGGGTTTT (SEQ ID NO:27)

CCAAGGATGATGGCTGCATCCGGTG (SEQ ID NO:28)

Последовательность 3’

GCAGCCATCATCCTTGGGGGGTTTT (SEQ ID NO:29)

CCCCCAAGGATGATGGCTGCCGGTG (SEQ ID NO:30)

Последовательность 4’

GCCATCATCCTTGGGGGAGGGTTTT (SEQ ID NO:31)

CCTCCCCCAAGGATGATGGCCGGTG (SEQ ID NO:32)

Последовательность 5’

GCTATTCGCTTCACGTCCCTGTTTT (SEQ ID NO:33)

AGGGACGTGAAGCGAATAGCCGGTG (SEQ ID NO:34)

Последовательность 6’

GCCTCTACAAACTGGGCTTTGTTTT (SEQ ID NO:35)

AAAGCCCAGTTTGTAGAGGCCGGTG (SEQ ID NO:36)

Последовательность 7’

GGCTTTGGGTTTGTCGAGGTGTTTT (SEQ ID NO:37)

ACCTCGACAAACCCAAAGCCCGGTG (SEQ ID NO:38)

Последовательность 8’

GCTGGTCTGAGGAGCCTACAGTTTT (SEQ ID NO:39)

TGTAGGCTCCTCAGACCAGCCGGTG (SEQ ID NO:40)

Хотя 8 последовательностей были протестированы и клонированы, из 8 последовательностей были трансфицированы только четыре клонированных последовательности, и только одна оказалась успешной для вызова нокаута гена DHODH. Следующая последовательность из 20 нуклеотидов GGATGCAGCCATCATCCTTG (SEQ ID NO: 5) была использована в качестве соответствующего фрагмента ДНК для создания gRNA. Она нацелена на второй экзон гена DHODH. Для достижения транскрипции надлежащей gRNA, два олигонуклеотида GGATGCAGCCATCATCCTTGGTTTT (олигонуклеотид 1’, SEQ ID NO:24) и CAAGGATGATGGCTGCATCCCGGTG (олигонуклеотид 2’, SEQ ID NO:25) были синтезированы, подвергнуты отжигу и клонированы в уникальный сайт для BaeI плазмиды pCM3561 (превращенной в источник прибыли Invitrogen).