ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПРОТЕОЗОПЕПТОНОВ И/ИЛИ СОДЕРЖАНИЯ БЕТА-КАЗЕИНА И ПИТАТЕЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ СО СНИЖЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ БЕТА-КАЗЕИНА ПРОТЕОЗОПЕПТОНОВ Российский патент 2024 года по МПК A23J1/20 G01N33/68 A23L33/19 A23J3/10 

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения и количественного определения полученных из β-казеина протеозопептонов, таких как PP-5, PP8s и PP8f, и/или β-казеина. Настоящее изобретение также относится к питательной композиции и смеси для новорожденных со сниженным содержанием полученных из β-казеина протеозопептонов, таких как PP-5, PP8s и PP8f.

Предпосылки создания изобретения

Молоко молочных коров считается идеальным продуктом питания природного происхождения, обеспечивающим важный источник питательных веществ, включая высококачественные белки, углеводы и некоторые микроэлементы. Молочные белки преимущественно представляют собой казенны, а остальные белки относятся к группе сывороточных белков, основными представителями которых являются бета-лактоглобулин и альфа-лактальбумин. Среди казеинов β-казеин представляет собой второй по распространенности белок в коровьем молоке и имеет превосходный питательный аминокислотный баланс. Однако различные мутации в коровьем гене β-казеина привели к появлению нескольких генетических вариантов, среди которых наиболее распространены так называемые варианты А1 и А2.

Варианты А1 и А2 β-казеина отличаются в положении аминокислоты 67 секретируемого белка β-казеина, то есть в результате однонуклеотидного различия в варианте А1 β-казеина находится гистидин (His), и в варианте А2 β-казеина - пролин (Pro). Это проиллюстрировано на фиг. 1.

Вариант А2 β-казеина более схож с человеческим β-казеином с точки зрения расщепления в кишечнике. Предположительно вариант А1 β-казеина может быть связан с непереносимостью коровьего молока, и статистически значимая положительная связь между болью в области живота и консистенцией стула наблюдалась при потреблении участниками рациона питания А1, но не рациона питания А2 (Но et al, 2014).

Разница в расщеплении, наблюдаемая между вариантами А1 и А2, может быть обусловлена конкретным полиморфизмом, как описано выше. Полиморфизм приводит к ключевому конформационному изменению во вторичной структуре белка β-казеина. Желудочно-кишечное протеолитическое расщепление варианта А1 (но не А2) β-казеина приводит к образованию β-казоморфина 7 (ВСМ-7), который представляет собой экзогенный опиоидный пептид (экзорфин), который может активировать опиоидные рецепторы в организме (EFSA Scientific Report, 2009). Это проиллюстрировано на фиг. 2.

Первоначально все коровы вырабатывали молоко, содержащее только вариант А2 β-казеина, но генетическая вариация привела к получению смешанных стад. Таким образом, коровьи стада, обычно используемые для получения молока, как правило вырабатывают смесь вариантов А1 и А2 β-казеина, но с другим количеством А1 по сравнению с А2.

Показано, что протеолиз β-казеина плазмином приводит к образованию γ-казеинов и протеозопептонов (быстрый РР8, медленный РР8 и PP-5). Протеозопептоны не осаждаются казеинами в процессе подкисления или ферментативной обработки сычужным ферментом и остаются во фракции молочной сыворотки (см. Karamoko et al. 2013). Медленный PP8s и PP-5 соответствуют последовательностям 29-105/7 и 1-105/7 соответственно и оба имеют положение 67. Таким образом, продукты молочной сыворотки, полученные из молока, содержащего β-казеин А1, вероятно, будут содержать протеозопептоны типа А1. Протеозопептоны получают из одного и того же гена, и они появляются в результате эндогенных событий, поэтому их также считают протеоформами β-казеина.

Анализы нативного белка с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) или капиллярного электрофореза (КЭФ) в сочетании с УФ-детекцией позволяют эффективно разделять большинство вариантов β-казеина в пробах сырого молока (см., например, de Jong et al., 1993, Visser et al., 1995, Bonfatti et al., 2008, Poulsen et al., 2016). Однако в производимых продуктах условия технического процесса индуцируют реакции между белками и восстанавливающими сахарами (реакция Майяра), что обеспечивает выход множества протеоформ, содержащих один или более сахарных аддуктов (Fenaille et al., 2006). Вследствие этого пики белка делятся и расширяются, создавая перекрывающиеся участки, которые не позволяют выполнять анализ отдельных протеоформ с помощью УФ-детекции (Vallejo-Cordoba, 1997, Fengetal., 2017).

Известно, что человеческое грудное молоко (НВМ) содержит форму А2 человеческого бета-казеина. По определению она представляет собой золотой стандарт для питания младенцев. Таким образом, существует потребность в получении (синтетических) питательных композиций, которые оптимально имитируют композицию НВМ.

В связи с различиями, наблюдаемыми у людей, в расщеплении вариантов А1 и А2 коровьего β-казеина было бы предпочтительно иметь возможность обнаруживать и количественно определять содержание β-казеина и его протеоформ простым и эффективным способом. В настоящее время не существует простого и эффективного способа определения характеристик и количественного определения отдельных молочных белков и их протеоформ, таких как протеозопептоны, в готовых продуктах.

Кроме того, существует потребность в получении питательной композиции, которая содержит относительно низкое количество или долю β-казеина А1 или полученных из β-казеина протеозопептонов, или которая может не содержать какой-либо из его форм.

Также существует потребность в получении питательной композиции, которая содержит фракции молочной сыворотки, не содержащие или имеющие пониженное количество полученных из β-казеина протеозопептонов.

Изложение сущности изобретения

Цель настоящего изобретения относится к улучшенному способу эффективного и простого обнаружения β-казеина и его протеоформ, в частности его полученных из β-казеина протеозопептонов, а также к способу снижения содержания полученных из β-казеина протеозопептонов.

Дополнительной целью настоящего изобретения является получение питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, которая может предотвращать боль в области живота и/или улучшать ненормальную консистенцию стула у младенца.

Таким образом, один аспект изобретения относится к способу обнаружения и количественного определения полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение подлежащего анализу основанного на молоке продукта;

(ii) выполнение анализа указанного продукта методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии;

(iii) обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина в указанном продукте посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд или деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

Второй аспект изобретения относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки, как описано в настоящем документе; и

(iii) выбор указанной фракции белка молочной сыворотки, содержащей не более 10% по массе полученных из β-казеина протеозопептонов от общего количества белка в указанной фракции белка молочной сыворотки, с образованием выбранной фракции белка молочной сыворотки.

Третий аспект изобретения относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) снижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации не более 10% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки с образованием обедненной фракции белка молочной сыворотки.

Четвертый аспект изобретения относится к способу получения питательной композиции, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии

(i) получение выбранной фракции белка молочной сыворотки или обедненной фракции белка молочной сыворотки, как описано в настоящем документе;

(ii) получение указанной питательной композиции с пониженным содержанием полученных из β-казеина протеозопептонов из указанных выбранных фракций белка молочной сыворотки, указанных обедненных фракций белка молочной сыворотки или их смеси.

Пятый аспект изобретения относится к фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, полученной способом, описанным в настоящем документе.

Шестой аспект изобретения относится к питательной композиции, содержащей указанную фракцию белка молочной сыворотки, имеющую сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, полученной способом, описанным в настоящем документе.

Седьмой аспект изобретения относится к питательной композиции, описанной в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.

Восьмой аспект изобретения относится к смеси для новорожденных, описанной в настоящем документе, для применения в лечении, предотвращения и/или облегчения боли в области живота у младенца, и/или снижения дискомфорта в кишечнике у указанного младенца.

Девятый аспект изобретения относится к смеси для новорожденных, описанной в настоящем документе, для применения в лечении, предотвращения и/или облегчения непереносимости лактозы у младенца.

Десятый аспект изобретения относится к применению смеси для новорожденных, описанной в настоящем документе, для улучшения консистенции стула.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано частичное выравнивание последовательностей между последовательностью бета-казеина А2 и бета-казеина А1, относящихся к аминокислотным последовательностям 59-71. Выделена аминокислота в положении 67 для демонстрации различия между бета-казеином А1 и бета-казеином А2 в одной аминокислоте, представляющей собой His и Pro соответственно;

на фиг. 2 показано частичное выравнивание последовательностей между последовательностью бета-казеина А2 и бета-казеина А1, относящихся к аминокислотным последовательностям 59-71. Различие в одной аминокислоте между двумя бета-казеинами влияет на способность к расщеплению двух цепочек, так как бета-казеин А2 не расщепляется из-за присутствия Pro в положении 67, в то время как бета-казеин А1 расщепляется на стороне N-конца His с получением возможности образования последовательности длиной в семь аминокислот, т.е. бета-казоморфина-7 (ВСМ-7);

на фиг. 3 показаны стадии способа ЖХ-МСВР: (а) подготовка образца, (b) деконволюция спектров с моноизотопными массами для нативного β-казеина и (с) представление схемы в виде кружков и стрелок нативной области β-казеина (размеры кружков отражают интенсивности сигнала);

на фиг. 4 показаны общий идентификационный отпечаток и нативная область β-казеина. Основные молочные белки разделяли по (а) общему идентификационному отпечатку образца сырого молока. Обнаруживали различные протеоформы (b) нативного β-казеина. A1, А2 и В представляют собой генетические варианты, обозначения в надстрочной части соответствуют количеству аддуктов лактозы (L);

на фиг. 5 показаны примеры общего идентификационного отпечатка в образцах сырого молока, человеческого грудного молока, смеси для новорожденных (IF), сухого обезжиренного молока (SMP) и молочной сыворотки;

на фиг. 6 показаны схемы в виде кружков и стрелок (область нативного β-казеина) семи образцов смеси для новорожденных А2, которые либо не обрабатывали, либо обогащали 5% β-казеина А1 (5 г нативного β-казеина А1 / 100 г общего нативного β-казеина);

на фиг. 7 показано, как гликирование влияет на данные МС.(а) На схемах в виде кружков и стрелок (область нативного β-казеина) показано повышенное лактозилирование в эксперименте с гликированием в твердом состоянии. (b) Процентная доля негликированного сигнала (черный столбец), уменьшающаяся с течением времени, (с) показывает, что общий сигнал β-казеина уменьшается с увеличением гликирования и (d) имеет линейную взаимосвязь с процентной долей сигнала без гликирования. Построение графика зависимости снижения сигнала от процентной доли негликированного сигнала (е) позволила рассчитать поправочный коэффициент гликирования;

на фиг. 8 показано определение характеристик стандартного β-казеина и построение калибровочной кривой β-казеина. Анализ стандартного β-казеина показал, что около 15% общего сигнала невозможно было отнести к нативному β-казеину (а). Линейную калибровочную кривую строили с использованием нормализованного (до SMP, которое корректировали на гликирование) МС-сигнала нативного β-казеина и скорректированных количеств β-казеина (b). Эксперименты с перекрестным смешиванием между образцами обезжиренного молока А1|А1 и А2|А2 показали, что взаимосвязь оставалась линейной даже в молочной матрице (с). Во время эксперимента с перекрестным смешиванием содержание белка поддерживали на постоянном уровне;

на фиг. 9 показано количественное определение нативного β-казеина в смесях для новорожденных. β-казеин количественно определяли в семи образцах смесей для новорожденных (а), причем каждый образец анализировали пять раз в трех повторностях. Теоретические значения основаны на рецептуре и общей композиции молочного белка. Дополнительный набор смесей для новорожденных (как на основе А2, так и на основе сухого обезжиренного молока, содержащего множество генетических вариантов) анализировали в трех повторах в течение одного дня (b). Заштрихованные столбцы обозначают наиболее вероятные предположения, поскольку % молочной сыворотки этих образцов не был указан на коробках;

на фиг. 10 показан результат анализа нативных белков методом ЖХ-МСВР в различных концентратах белка молочной сыворотки (WPC). Область нативного белка обозначена кругом со сплошным периметром, и протеозопептоны β-казеина включены в область, обозначенную кругом с прерывистым периметром;

на фиг. 11 представлен крупный план области, выделенной на фиг. 10 кругом с прерывистым периметром, демонстрирующей содержание протеозопептонов. Черный цвет обозначает полученные из β-казеина А2 протеозопептоны, серый цвет обозначает полученные из β-казеина А1 протеозопептоны, а белый цвет обозначает неидентифицированные соединения;

на фиг. 12 показан результат анализа нативных белков методом ЖХ-МСВР в различных готовых продуктах с фокусировкой на области, содержащей протеозопептоны;

на фиг. 13 показана корреляция между измеренным сигналом РР5 (как для РР5 А1, так и для РР5 А2) по отношению к процентному содержанию SMP А2 в образце. Во время эксперимента с перекрестным смешиванием содержание белка поддерживали на постоянном уровне;

на фиг. 14 схематически показаны нативный β-казеин и продукты, образованные при расщеплении β-казеина. Горизонтальными стрелками показано положение триптических пептидов с общими пептидами Tot1 и Tot2, а также специфическими пептидами A1/2N, A1/2S и А1/2Т. Tot1 и Tot2 находятся на С-конце β-казеина, где последовательности А1 и А2 идентичны и отсутствуют в протеозопептонах. Пептиды A1/2N, A1/2S и А1/2Т включают в себя аминокислоту в положении 67, которая отличается у А1 и А2;

на фиг. 15 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида A1S;

на фиг. 16 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида A1N;

на фиг. 17 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида А1Т;

на фиг. 18 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида A2S;

на фиг. 19 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида A2N;

на фиг. 20 показан полученный методом ЖХ-МС результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида А2Т;

на фиг. 21 показан результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида Tot1;

на фиг. 22 показан результат расщепления трипсином различных готовых продуктов, включая сухое обезжиренное молоко и несколько смесей для новорожденных, в отношении пептида Tot2;

на фиг. 23 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида Tot1 посредством ЖХ-МС;

на фиг. 24 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида Tot2 посредством ЖХ-МС;

на фиг. 25 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида A1S посредством ЖХ-МС;

на фиг. 26 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида A1N посредством ЖХ-МС;

на фиг. 27 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида А1Т посредством ЖХ-МС;

на фиг. 28 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида A2S посредством ЖХ-МС;

на фиг. 29 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида A2N посредством ЖХ-МС;

на фиг. 30 показан результат расщепления трипсином сухого обезжиренного молока, лактозы и различных концентратов белка молочной сыворотки (WPC) с измерением количества пептида А2Т посредством ЖХ-МС.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже.

Подробное описание изобретения

Определения

До более подробного описания настоящего изобретения будут приведены определения указанных ниже терминов и условных обозначений.

Термин «ЖХ» означает «жидкостную хроматографию», которая известна специалисту в данной области. Следует подчеркнуть, что ЖХ также включает в себя ВЭЖХ, то есть высокоэффективную жидкостную хроматографию, и СВЭЖХ, то есть сверхэффективную жидкостную хроматографию.

Термин «МС» означает «масс-спектрометрию», которая известна специалисту в данной области. Следует подчеркнуть, что МС также включает в себя МСВР, т.е. масс-спектрометрию высокого разрешения.

Термин «соединения с заданными значениями масса/заряд» означает, что МС настроена на измерение соединений, имеющих только значения масса/заряд, конкретно определенные пользователем при измерении данного образца.

Термин «коровы А1/А1» означает коров с гомозиготным генотипом А1А1. Молоко, полученное от коров А1/А1, обозначают как «молоко А1».

Термин «коровы А2/А2» означает коров с гомозиготным генотипом А2А2. Молоко, полученное от коров А2/А2, обозначают как «молоко А2».

Термин «коровы А1/А2» означает коров с гетерозиготным генотипом А1А2. Молоко, полученное от коров А1/А2, обозначают как «молоко А1/А2».

Термин «молочная сыворотка А1» означает молочную сыворотку, полученную, по существу, из молока А1.

Термин «молочная сыворотка А2» означает молочную сыворотку, полученную, по существу, из молока А2.

Термин «молочная сыворотка А1/А2» означает молочную сыворотку, полученную из молока А1/А2 или из смеси молочной сыворотки А1 и молочной сыворотки А2, или полученной из смеси молока А1 и молока А2, молока А1 и молока А1/А2, молока А2 и молока А1/А2 или молока А1, молока А2 и молока А1/А2.

Термин «β-казеин А2» означает вариант А2 коровьего β-казеина, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO. 1 (секретируемая форма белка). В настоящем контексте в β-казеин А2 могут быть включены другие варианты, которые включают в себя пролин в положении 67.

Термин «β-казеин А1» означает вариант А1 коровьего β-казеина, имеющий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO. 2 (секретируемая форма белка). SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 2 отличаются друг от друга только тем, что β-казеин А1 содержит гистидин в положении 67, тогда как β-казеин А2 содержит пролин в положении 67. В настоящем контексте в β-казеин А1 могут быть включены другие варианты, которые включают в себя гистидин в положении 67.

Термин «нативный β-казеин» означает белок, который не расщепляется, за исключением удаления сигнальной последовательности, например, белок, описанный посредством SEQ ID NO. 1 и 2.

Термин «β-казоморфин 7», также описанный как «ВСМ-7», означает пептид, имеющий аминокислотную последовательность Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile.

Термин «WPC» означает «концентрат белка молочной сыворотки». В этом контексте WPC включает в себя традиционный WPC в соответствии с определением Фармакопеи США (USP), а также молочную сыворотку с пониженным содержанием лактозы и молочную сыворотку с пониженным содержанием минеральных веществ, т.е. уровень белка может составлять всего лишь 10% мас./мас.

Термин «WPI» означает «изолят сывороточного белка» и представляет собой концентрат белка молочной сыворотки с содержанием сывороточного белка в пересчете на сухое вещество не менее 90% мас./мас.

Термин «фракция белка молочной сыворотки» означает композицию, содержащую сывороточные белки, например, WPC и/или WPI.

Термин «стандартное SMP» означает «стандартное сухое обезжиренное молоко», которое получают из молока, выработанного смешанными стадами коров, и, таким образом, содержит множество вариантов β-казеина, включая β-казеин А1 и β-казеин А2.

Термин «SMP А2» означает «сухое обезжиренное молоко А2», которое содержит только β-казеин А2, но не β-казеин А1.

Термин «протеоформа» означает молекулы белков с высокой степенью родственности, происходящие из всех комбинаторных источников вариаций, которые лежат в основе получения продуктов, происходящих из одного гена. Сюда относятся продукты, отличающиеся из-за генетических вариаций, альтернативного сплайсинга РНК-транскриптов и посттрансляционных модификаций.

Термин «протеозопептон» аналогичен термину, используемому в публикации Swaisgood 1982 г., т.е. термин «протеозопептон» означает те белки/пептиды, которые остаются в растворе после нагревания молока до 95°С в течение 20 минут и последующего подкисления 12% трихлоруксусной кислотой до уровня рН 4,7.

Термин «полученные из β-казеина протеозопептоны» означает протеозопептоны, полученные только из β-казеина, такие как PP-5, быстрый PP-8 и медленный PP-8.

Термин «протеозопептон 5», «РР5» или «PP-5» означает остатки 1-105 и 1-107, полученные из β-казеина.

Термин «быстрый протеозопептон 8», «PP8f» или «быстрый РР8» означает остатки 1-28, полученные из β-казеина. Быстрый РР8 также может называться «bcas4P 1-28».

Термин «медленный протеозопептон 8», «PP8s» или «медленный РР8» означает остатки 29-105 и 29-107, полученные из β-казеина. Медленный РР8 также может называться «bcas1P 29-105» и «bcas1P 29-107».

Термин «младенец» означает ребенка в возрасте до 12 месяцев; в одном варианте осуществления изобретения термин «младенец» может быть расширен с включением детей в любом возрасте до 18 месяцев включительно или в любом возрасте до 24 месяцев включительно.

Термин «смесь для новорожденных» при использовании в данном документе означает продукт питания, который специально предназначен для употребления в пищу младенцами в течение первых месяцев жизни (например, от 0 до 12 месяцев, от 0 до 10 месяцев, от 0 до 8 месяцев, от 0 до 6 месяцев, от 0 до 4 месяцев) и который сам по себе удовлетворяет потребности в питании этой категории лиц (статья 2(c) Директивы Европейской комиссии 91/321/ЕЕС 2006/141/ЕС от 22 декабря 2006 г. о смесях для новорожденных и смесях для прикармливаемых детей). Он также относится к питательной композиции, предназначенной для младенцев, как определено в Codex Alimentarius (Codex STAN 72-1981) и Infant Specialities (включая статью Food for Special Medical Purpose). Выражение «смесь для новорожденных» охватывает как «начальную смесь для новорожденных», так и «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей».

Термин «смесь последующего уровня» или «смесь для прикармливаемых детей» означает смесь, которую дают, начиная с 6-го месяца. Она составляет главный жидкий элемент в постепенно увеличивающемся разнообразии рациона питания для данной категории лиц.

Термин «порошок» в настоящем контексте означает сухое нефасованное твердое вещество, состоящее из большого количества очень мелких частиц, которые могут свободно пересыпаться при встряхивании или наклоне. Порошок может содержать воду в количествах, не превышающих 10%, например, не превышающих 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1% или 0,5%.

Термин «питательная композиция» означает композицию, которой питается субъект. Такую питательную композицию обычно вводят перорально или внутривенно. Она может включать в себя источник липидов или жира, источник углеводов и/или источник белка. Питательная композиция настоящего изобретения может находиться в твердой форме (например, в форме порошка) или в жидком виде.

В конкретном варианте осуществления композиция настоящего изобретения представляет собой гипоаллергенную питательную композицию. Выражение «гипоаллергенная питательная композиция» означает питательную композицию, которая с малой вероятностью может вызывать аллергические реакции.

В конкретном варианте осуществления питательная композиция настоящего изобретения представляет собой «искусственную питательную композицию». Выражение «искусственная питательная композиция» означает смесь, полученную с помощью химических и/или биологических средств, которая может быть химически идентична смеси природного происхождения, присутствующей в молоке млекопитающих (т.е. искусственная питательная композиция не является грудным молоком).

Термин «бактерии-пробиотики» означает препараты из клеток микроорганизмов или компоненты клеток микроорганизмов, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или самочувствие организма-хозяина. Определение бактерий-пробиотиков приведено в публикации Salminen S et al. 1999.

Термин «пребиотик» означает избирательно ферментированный ингредиент, обеспечивающий специфические изменения как в композиции, так и/или в активности желудочно-кишечной микрофлоры, благотворно влияющие на самочувствие и здоровье организма-хозяина. Пребиотики обсуждаются в публикации Roberfroid MB 2007.

Обнаружение и/или количественное определение полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина

Изобретение относится в соответствии с первым аспектом к способу обнаружения и/или количественного определения полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение подлежащего анализу основанного на молоке продукта;

(ii) выполнение анализа указанного продукта методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии;

(iii) обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина в указанном продукте посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд или деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

Основанный на молоке продукт может быть выбран из перечня готовых продуктов, таких как смесь для новорожденных, питание для матерей, пищевые добавки для взрослых или молочные продукты, такие как молоко, сухое молоко, жидкая молочная сыворотка, порошок молочной сыворотки, казеинаты, WPC, WPI.

В одном варианте осуществления подлежащий анализу основанный на молоке продукт представляет собой смесь для новорожденных или фракцию белка молочной сыворотки.

Подлежащий анализу основанный на молоке продукт может представлять собой порошок или жидкость. В одном варианте осуществления продукт представляет собой порошок, который растворяют перед анализом продукта. Порошок предпочтительно растворяют посредством диспергирования порошка в воде. Однако порошок также можно растворять в других жидкостях, таких как восстанавливающий агент, как определено ниже, буферные растворы, такие как бикарбонат аммония, трис, цитрат натрия трехзамещенный, HEPES, ТЕАВ (бикарбонат триэтиламмония) или денатурирующие буферные растворы, как определено ниже, и их комбинации.

В одном варианте осуществления порошок растворяют в восстанавливающем агенте и буферном растворе, и необязательно последовательно добавляют денатурирующий буфер. В дополнительном варианте осуществления порошок растворяют в восстанавливающем агенте и денатурирующем буфере и необязательно последовательно добавляют буферный раствор. В еще одном дополнительном варианте осуществления порошок растворяют в буферном растворе и денатурирующем буфере и необязательно последовательно добавляют восстанавливающий агент.

В одном варианте осуществления порошки диспергируют в жидкости до концентрации не более 10% мас./об. белка, например не более 9,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 9% мас./об. белка в жидкости, например, не более 8,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 8% мас./об. белка в жидкости, например не более 7,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 7% мас./об. белка в жидкости, например не более 6,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 6% мас./об. белка в жидкости, например не более 5,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 5% мас./об. белка в жидкости, например не более 4,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 4% мас./об. белка в жидкости, например не более 3,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 3% мас./об. белка в жидкости, например не более 2,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 2% мас./об. белка в жидкости, например не более 1,5% мас./об. белка в жидкости, например не более 1% мас./об. белка в жидкости, например не более 0,5% мас./об. белка в жидкости.

После растворения образцов или в альтернативном варианте осуществления для растворения образцов их денатурируют и восстанавливают с помощью денатурирующих и восстанавливающих буферов, таких как мочевина, тиомочевина, гуанидин гидрохлорид, ДТТ, бета-меркаптоэтанол, ТСЕР.

В одном варианте осуществления образец растворяют в воде и дополнительно разбавляют в смеси цитрата натрия трехзамещенного, гуанидин гидрохлорида и ДТТ.

В другом варианте осуществления образец растворяют в трис и мочевине и разводят в бикарбонате аммония и ДТТ.

Предпочтительно образцы также очищают перед проведением анализа. Очистку можно выполнять посредством центрифугирования. Однако ее также можно выполнять посредством фильтрации.

В одном варианте осуществления подлежащий анализу продукт анализируют с использованием анализа нативного белка, при котором жидкостной хроматографии и последующей масс-спектрометрии (ЖХ-МС), например, жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения (ЖХ-МСВР), подвергают нативные белки. Использование анализа нативного белка позволяет дифференцировать различные протеоформы β-казеина и генетические варианты полноразмерного β-казеина, включая варианты А1 и А2. Таким образом, измерение нативного белка в продуктах позволяет получить полный идентификационный отпечаток белкового профиля продукта. Также с помощью способа анализа нативного белка можно дифференцировать различные генетические варианты протеозопептонов.

В другом варианте осуществления указанный продукт анализируют с помощью пептидного анализа, включающего стадию ферментативного расщепления указанного продукта перед его анализом. Таким образом, перед проведением анализа методом ЖХ-МС продукт подвергают ферментативному расщеплению, например, посредством расщепления продукта с помощью трипсина или GluC (эндопротеиназы GluC [протеазы V8 straphylococcuc aureus]).

С помощью ферментативного расщепления можно определить наличие в продукте β-казеина А1 или протеозопептонов β-казеина А1 и/или А2. Однако из-за особенностей способа, включающего расщепление белков как таковых, невозможно отличить между собой протеозопептоны и полноразмерный β-казеин, при этом можно дифференцировать только генетические варианты А1 и А2. Это можно сделать посредством обнаружения последовательностей, охватывающих аминокислоту 67, которая отличается в вариантах А1 и А2. Таким образом, не будет получен полный идентификационный отпечаток белкового профиля, но будет обнаружено наличие варианта А1 и возможных предшественников для ВСМ-7.

В дополнительном варианте осуществления указанное ферментативное расщепление выполняют посредством расщепления трипсином или расщепления с помощью GluC.

В одном варианте осуществления жидкостная хроматография представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию. В дополнительном варианте осуществления жидкостная хроматография представляет собой сверхэффективную жидкостную хроматографию. В еще одном дополнительном варианте осуществления жидкостная хроматография представляет собой наножидкостную хроматографию.

Для этого измерения можно использовать стандартные настройки для выполнения жидкостной хроматографии, известные специалисту в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления для анализа нативного белка образцы могут быть разделены на колонке С4 с использованием градиента со скоростью 0,5 мл/мин. Предпочтительно используют буфер, содержащий трифторуксусную кислоту. Однако градиент может изменяться от 0,1 мл/мин до 1 мл/мин, например, от 0,1 мл/мин до 0,5 мл/мин. В альтернативном варианте осуществления для разделения методом ЖХ можно использовать следующие буферы, такие как вода/метанол или вода/ацетонитрил, возможно, включающие муравьиную кислоту, дифторуксусную кислоту и/или трифторуксусную кислоту.

В предпочтительном варианте осуществления для пептидного анализа образцы могут быть разделены на колонке С18 с использованием градиента со скоростью 75 мкл/мин. Предпочтительно применяют буфер, содержащий муравьиную кислоту. Однако градиент может изменяться от 0,1 мкл/мин до 100 мкл/мин, например, от 0,4 мкл/мин до 85 мкл/мин. В альтернативном варианте осуществления для разделения методом ЖХ можно использовать следующие буферы, такие как вода/метанол или вода/ацетонитрил, возможно, включающие муравьиную кислоту, дифторуксусную кислоту и/или трифторуксусную кислоту.

МС-хроматограммы могут быть записаны на таких аппаратах, как Thermo Orbitrap Elite или Thermo Q-Exactive HF.

В одном варианте осуществления МС-хроматограммы регистрируют на аппарате Thermo Orbitrap Elite (температура нагревателя: 60°С, защитный газ: 20, вспомогательный газ: 5, продувочный газ: 0, напряжение распыления: 3,8 кВ, температура капилляра: 320°С, РЧ уровень S-линзы: 60%, диапазон массовых чисел от 400 до 2000 масса/заряд, разрешение 240 000, целевое значение AGC: 1е6).

В другом варианте осуществления МС-хроматограммы регистрируют на аппарате Thermo Q-Exactive HF (температура нагревателя: 100°С, защитный газ: 53, вспомогательный газ: 14, продувочный газ: 3, напряжение распыления: 3,5 кВ, температура капилляра: 320°С, РЧ уровень S-линзы: 70%, диапазон массовых чисел: от 400 до 2000 масса/заряд, разрешение: 240 000, целевое значение AGC: 1е6, максимальное IT: 200 мс).

В одном варианте осуществления указанный масс-спектрометрический анализ представляет собой масс-спектрометрический анализ высокого разрешения.

В одном варианте осуществления МСВР обнаружение предпочтительно выполняют с разрешением выше 100 000, например, от 120 000 до 240 000.

В соответствии с одним вариантом осуществления обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов выполняют посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд, как указано. При этом может быть обнаружено присутствие и количество специфических пептидных последовательностей. Это возможно, поскольку ферментативное расщепление приводит к образованию специфических пептидов в результате специфического расщепления.

В одном варианте осуществления в пептидном способе используют ненацеленный (информационно-зависимое обнаружение - DDA). В другом варианте осуществления в пептидном способе используют ненацеленный (информационно-независимое обнаружение - DIA) подход.

В дополнительном варианте осуществления в пептидном способе используют метод PRM (мониторинг параллельных реакций) или MRM (мониторинг множественных реакций). Предшественники могут быть предпочтительно выбраны по первому квадруполю и фрагментированы, и могут быть записаны данные MS2.

В одном варианте осуществления выбор предшественника может быть выполнен в соответствии со списком пептидов, представленным в SEQ ID 3-10.

В соответствии с другим вариантом осуществления данные масс-спектрометрии, полученные после измерения методом ЖХ-МС для каждого образца, подвергают деконволюции для вычисления моноизотопных масс. Таким образом, в одном варианте осуществления обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанном продукте выполняют посредством деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

Деконволюция могут выполнять с помощью доступного в продаже программного обеспечения, такого как Thermo BioPharma Finder.

В одном варианте осуществления деконволюцию выполняют с помощью алгоритма скользящих окон. В дополнительном варианте осуществления деконволюцию выполняют с помощью алгоритма фиксированных окон.

В одном предпочтительном варианте осуществления деконволюцию выполняли с помощью программного обеспечения Thermo BioPharma Finder 1.0, используя алгоритм Xtract (пороговое значение S/N: 3, пороговое значение относительной численности: 1%, коэффициент соответствия: 80%, пороговое значение остатка: 25%, перекрытия, состояния заряда: от 5 до 50, минимальная интенсивность: 1, ожидаемая ошибка интенсивности: 3, масса/заряд: от 600 до 2000, минимальное количество обнаруженных состояний заряда: 3) и скользящие окна (время: от 5 до 20 мин, ширина целевого среднего спектра: 0,1 мин, смещение целевого среднего спектра: 50%, допуск на объединение: 1,5 Да, максимальный интервал ВУ: 0,5 мин, минимальное количество обнаруженных интервалов: 3, XIC).

Моноизотопные массы после деконволюции сравнивали с базой данных белков, содержащей основные белковые компоненты молока αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, γ-CN, α-лактальбумин, β-лактоглобулин, CGMP и протеозопептоны β-казеина. Для идентификации большей части сигналов исследовали комбинаторное добавление стандартных модификаций белка (фосфорилирование, окисление, лактозилирование, гликозилирование и пироглутаминовая кислота).

Одним из способов количественного определения полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина является сравнение интенсивностей сигнала, полученных посредством измерений по стандартной кривой, полученной посредством измерений известных количеств различных протеозопептонов и/или β-казеина. Таким способом можно рассчитать и количественно определять абсолютное количество протеозопептонов и/или β-казеина в данном образце.

В альтернативном варианте осуществления интенсивность сигнала протеозопептона, представляющего интерес, может быть выражена в относительных величинах, таких как процентная доля от общего количества белка в образце или процентная доля от содержания β-казеина.

Подлежащие обнаружению и/или количественному определению соединения представляют собой полученные из β-казеина протеозопептоны и/или β-казеин. В одном варианте осуществления протеозопептоны представляют собой полученные из β-казеина А1 протеозопептоны. В дополнительном варианте осуществления полученные из β-казеина протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5. В еще одном дополнительном варианте осуществления полученные из β-казеина А1 протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5.

В одном варианте осуществления подлежащий обнаружению и/или количественному определению β-казеин представляет собой β-казеин А1.

Фракция белка молочной сыворотки со сниженным содержанием полученных из β-казеина протеозопептонов (выбранная фракция белка молочной сыворотки)

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки, как описано в настоящем документе; и

(iii) выбор указанной фракции белка молочной сыворотки, содержащей не более 10% по массе полученных из β-казеина протеозопептонов от общего количества белка в указанной фракции белка молочной сыворотки, с образованием выбранной фракции белка молочной сыворотки.

Доступные фракции белка молочной сыворотки, предназначенные для применения в готовых продуктах, таких как питательные композиции, включая смеси для новорожденных, часто содержат молочную сыворотку А1 и/или молочную сыворотку А1А2 в соответствии со стандартными способами производства. Однако ранее это не считали проблемой, например, в случае производства смеси для новорожденных А2, поскольку β-казеин А1 осаждается в процессе получения молочной сыворотки и, следовательно, не является частью фракции белка молочной сыворотки. Однако, как показано в примерах, полученные из β-казеина А1 протеозопептоны обнаруживают во фракциях белка молочной сыворотки, таких как WPC.

В одном варианте осуществления фракция белка молочной сыворотки основана на молочной сыворотке А1 и/или молочной сыворотке Al А2

Благодаря преимуществам описанного выше способа обнаружения и количественного определения вариантов β-казеина и протеоформ содержание полученных из β-казеина протеозопептонов можно легко обнаружить и количественно определить. Таким способом фракции белка молочной сыворотки можно разделить на фракции белка молочной сыворотки, содержащие различные количества протеозопептонов. Следовательно, можно выбрать фракции белка молочной сыворотки, которые содержат не более 10% по мас. протеозопептонов от общего количества белков во фракции белка молочной сыворотки.

В одном варианте осуществления содержание полученных из β-казеина протеозопептонов в выбранной фракции белка молочной сыворотки, например содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, составляет не более 9,5% по массе, например не более 9% по массе, предпочтительно не более 8,5% по массе, например не более 8% по массе, более предпочтительно не более 7,5% по массе, например не более 7% по массе, еще более предпочтительно не более 6,5% по массе, например не более 6% по массе, еще более предпочтительно не более 5,5% по массе, например не более 5% по массе, наиболее предпочтительно не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, например не более 3% по массе, предпочтительно не более 2,5% по массе, например не более 2% по массе, более предпочтительно не более 1,5% по массе, например не более 1% по массе, еще более предпочтительно не более 0,75% по массе, например не более 0,50% по массе, еще более предпочтительно не более 0,25% по массе, например не более 0,10% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

Общее количество белка во фракции белка молочной сыворотки предпочтительно измеряют с помощью анализов Кьельдаля (ISO 8968-1:2014).

В одном варианте осуществления протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5. В дополнительном варианте осуществления протеозопептоны представляют собой медленный РР8 и/или PP-5.

В одном варианте осуществления содержание медленного РР8 и/или PP-5 в выбранной фракции белка молочной сыворотки составляет не более 9,5% по массе, например не более 9% по массе, предпочтительно не более 8,5%) по массе, например не более 8% по массе, более предпочтительно не более 7,5% по массе, например не более 7% по массе, еще более предпочтительно не более 6,5% по массе, например не более 6% по массе, еще более предпочтительно не более 5,5% по массе, например не более 5% по массе, наиболее предпочтительно не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, например не более 3% по массе, предпочтительно не более 2,5% по массе, например не более 2% по массе, более предпочтительно не более 1,5% по массе, например не более 1% по массе, еще более предпочтительно не более 0,75% по массе, например не более 0,50% по массе, еще более предпочтительно не более 0,25% по массе, например не более 0,10% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

В еще одном дополнительном варианте осуществления протеозопептон представляет собой PP-5.

Фракция белка молочной сыворотки со сниженным содержанием протеозопептонов (обедненная фракция белка молочной сыворотки)

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) снижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации не более 10% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки с образованием обедненной фракции белка молочной сыворотки.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки, имеющей начальное содержание протеозопептонов;

(ii) снижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации, которая по меньшей мере в 5 раз меньше начального содержания в указанной фракции белка молочной сыворотки, с получением обедненной фракции белка молочной сыворотки, например, по меньшей мере в 8 раз меньше, например, по меньшей мере в 10 раз меньше, например, по меньшей мере в 15 раз меньше начального содержания в указанной фракции белка молочной сыворотки.

В одном варианте осуществления указанная фракция белка молочной сыворотки основана на молочной сыворотке А1 и/или молочной сыворотке A1 А2.

В качестве примера выражение «по меньшей мере в 5 раз меньше» следует понимать так, что если бы, например, начальное содержание составляло 5 мкг/мг, то снижение 5х (в пять раз) означало бы, что обедненная фракция белка молочной сыворотки содержит не более 1 мкг/мг, и аналогичным образом, если интенсивность сигнала составляет 500 000 000 для начального содержания, то интенсивность сигнала будет составлять не более 100 000 000 для обедненной фракции белка молочной сыворотки.

Снижение по меньшей мере в 5 раз, в 8 раз, в 10 раз или в 15 раз можно измерить по интенсивности сигнала, полученной способом обнаружения и количественного определения, описанным в настоящем документе.

В одном варианте осуществления фракцию белка молочной сыворотки испытывают с использованием описанного в настоящем документе способа для обнаружения и количественного определения содержания протеозопептонов, чтобы определить, необходимо ли уменьшить содержание протеозопептонов или нет перед использованием фракций белка молочной сыворотки.

Содержание полученных из β-казеина протеозопептонов во фракции белка молочной сыворотки снижают не более, чем на 10% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

Общее количество белка во фракции белка молочной сыворотки предпочтительно измеряют с помощью анализов Кьельдаля (ISO 8968-1:2014).

В одном варианте осуществления содержание протеозопептонов снижают путем гель-фильтрации. Однако содержание протеозопептонов можно также снизить с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии или разделения на мембранах.

В дополнительном варианте осуществления конечное содержание протеозопептонов в обедненной фракции белка молочной сыворотки можно обнаружить и количественно определить описанным выше способом.

В одном варианте осуществления содержание протеозопептонов в полученной из β-казеина обедненной фракции белка молочной сыворотки составляет не более 9,5% по массе, например не более 9% по массе, предпочтительно не более 8,5% по массе, например не более 8% по массе, более предпочтительно не более 7,5% по массе, например не более 7% по массе, еще более предпочтительно не более 6,5% по массе, например не более 6% по массе, еще более предпочтительно не более 5,5%» по массе, например не более 5% по массе, наиболее предпочтительно не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, например не более 3% по массе, предпочтительно не более 2,5% по массе, например не более 2% по массе, более предпочтительно не более 1,5% по массе, например не более 1% по массе, еще более предпочтительно не более 0,75% по массе, например не более 0,50% по массе, еще более предпочтительно не более 0,25% по массе, например не более 0,10% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

В одном варианте осуществления протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5.

В дополнительном варианте осуществления протеозопептоны представляют собой медленный РР8 и/или PP-5.

В одном варианте осуществления содержание медленного РР8 и/или PP-5 в обедненной фракции белка молочной сыворотки составляет не более 9,5% по массе, например не более 9% по массе, предпочтительно не более 8,5% по массе, например не более 8% по массе, более предпочтительно не более 7,5% по массе, например не более 7% по массе, еще более предпочтительно не более 6,5% по массе, например не более 6% по массе, еще более предпочтительно не более 5,5% по массе, например не более 5% по массе, наиболее предпочтительно не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, например не более 3% по массе, предпочтительно не более 2,5% по массе, например не более 2% по массе, более предпочтительно не более 1,5% по массе, например не более 1% по массе, еще более предпочтительно не более 0,75% по массе, например не более 0,50%» по массе, еще более предпочтительно не более 0,25% по массе, например не более 0,10% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

В еще одном дополнительном варианте осуществления протеозопептон представляет собой PP-5.

Питательная композиция, например, смесь для новорожденных со сниженным содержанием протеозопептонов

В четвертом аспекте изобретение относится к способу получения питательной композиции, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение выбранной фракции белка молочной сыворотки или обедненной фракции белка молочной сыворотки, как описано в настоящем документе;

(ii) получение указанной питательной композиции с пониженным содержанием протеозопептонов из указанных выбранных фракций белка молочной сыворотки, указанных обедненных фракций белка молочной сыворотки или их смеси.

В пятом аспекте изобретение относится к фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, полученной способом, описанным в настоящем документе.

В шестом аспекте изобретение относится к питательной композиции, содержащей указанную фракцию белка молочной сыворотки, имеющую сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, описанное в настоящем документе, или полученной способом, описанным в настоящем документе.

В дополнительном варианте осуществления содержание полученных из β-казеина протеозопептонов в питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, составляет не более 9% по массе от общего содержания белка в питательной композиции.

Общее количество белка во фракции белка молочной сыворотки предпочтительно измеряют с помощью анализов Кьельдаля (ISO 8968-1:2014).

В еще одном дополнительном варианте осуществления содержание полученных из β-казеина протеозопептонов в питательной композиции составляет не более 8,5% по массе, более предпочтительно не более 8% по массе, например не более 7,5% по массе, еще более предпочтительно не более 7% по массе, например не более 6,5% по массе, еще более предпочтительно не более 6% по массе, например не более 5,5% по массе, наиболее предпочтительно не более 5% по массе, например не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, более предпочтительно не более 3% по массе, например не более 2,5% по массе, еще более предпочтительно не более 2% по массе, например не более 1,5% по массе, еще более предпочтительно не более 1% по массе, например не более 0,75% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,50% по массе, например не более 0,25% по массе, например не более 0,1% по массе, например не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

Питательная композиция изобретения может быть предназначена для любого млекопитающего, такого как, например, человек, и домашних животных, таких как кошки и собаки. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающее представляет собой человека.

Примерами питательных композиций являются смеси для новорожденных, питание для матерей, пищевые добавки для взрослых или молочные продукты.

В одном варианте осуществления питательная композиция представляет собой смесь для новорожденных.

Общая композиция питательной композиции, такой как смесь для новорожденных для применения в соответствии с настоящим изобретением, может необязательно содержать вещества, которые могут оказывать благотворное воздействие, такие как бактерии-пробиотики, волокна, лактоферрин, нуклеотиды, нуклеозиды и/или т.п., в количествах, таких как те, которые обычно обнаруживают в питательных композициях для вскармливания младенцев.

Бактерии-пробиотики могут быть выбраны из группы, состоящей из лактобацилл, таких как Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus reuteri, и бифидобактерий, таких как Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve и Bifidobacterium longum.

Питательная композиция, такая как смесь для новорожденных, может необязательно дополнительно содержать пребиотики, такие как неперевариваемые углеводы, которые активируют рост бактерий-пробиотиков в кишечнике.

В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция, такая как смесь для новорожденных, содержит пребиотики, выбранные из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов (FOS), рафтилозы, инулина, рафтилина, лактулозы, олигосахаридов коровьего молока (CMOS) и галактоолигосахаридов (GOS).

Питательная композиция может также содержать все витамины и минеральные вещества, которые считаются обязательными в ежедневном рационе питания, в значимых с точки зрения питания количествах.

Таким образом, предпочтительный вариант осуществления относится к питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, дополнительно содержащей витамины.

Для некоторых витаминов и минеральных веществ установлены минимальные требования. Примеры минеральных веществ, витаминов и других питательных веществ, необязательно присутствующих в питательной композиции, включают в себя витамин А, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В12, витамин Е, витамин К, витамин С, витамин D, фолиевую кислоту, инозитол, ниацин, биотин, пантотеновую кислоту, холин, кальций, фосфор, йод, железо, магний, медь, цинк, марганец, хлорид, калий, натрий, селен, хром, молибден, таурин и L-карнитин. Минеральные вещества обычно добавляют в форме солей.

При необходимости питательная композиция, например, смесь для новорожденных, может содержать эмульгаторы и стабилизаторы, такие как соевый лецитин, сложные эфиры лимонной кислоты моно- и диглицеридов и т.п. Это особенно актуально в том случае, когда композиция представлена в жидком виде.

Предпочтительный вариант осуществления относится к питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, в которой по меньшей мере один источник углеводов выбран из группы, состоящей из лактозы, твердых веществ кукурузного сиропа, фруктозы, глюкозы, мальтодекстринов, сухих глюкозных сиропов, сахарозы, трегалозы, галактозы, мальтозы, медовых порошков, крахмала, олигосахаридов, рафтилина и рафтилозы.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, дополнительно содержащей безводный молочный жир.

Еще один предпочтительный вариант осуществления относится к питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, дополнительно содержащей длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (ДЦ-ПНЖК), такие как докозагексаеновая кислота (DHA), эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), докозапентаеновая кислота (DPA) и/или арахидоновая кислота (ARA).

Питательная композиция, такая как смесь для новорожденных, может дополнительно содержать вкусоароматические добавки, такие как, без ограничений, ванилин.

Конкретный предпочтительный вариант осуществления относится к питательной композиции, такой как смесь для новорожденных, дополнительно содержащей фруктоолигосахариды, такие как рафтилин и/или рафтилоза.

Питательная композиция, такая как смесь для новорожденных, может представлять собой жидкую смесь или порошок, подлежащий восстановлению перед применением. Предпочтительный вариант осуществления представляет собой смесь для новорожденных, представляющую собой порошок.

В предпочтительном варианте осуществления питательная композиция представляет собой жидкую композицию, приготовленную восстановлением порошка.

В настоящем изобретении дополнительно предложена питательная композиция, такая как смесь для новорожденных в соответствии с настоящим изобретением, для применения в качестве прикорма для младенцев в сочетании с человеческим грудным молоком.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления младенец находится в возрасте 0-12 месяцев, предпочтительно в возрасте 0-6 месяцев.

Терапевтические и нетерапевтические применения питательной композиции или смеси для новорожденных со сниженным содержанием протеозопептонов.

В седьмом аспекте настоящего изобретения питательную композицию, описанную в настоящем документе, могут использовать в качестве лекарственного средства.

В восьмом аспекте настоящего изобретения смесь для новорожденных, описанная в настоящем документе, относится к применению в лечении, предотвращении и/или облегчении боли в области живота у младенца.

В девятом аспекте настоящего изобретения смесь для новорожденных, описанная в настоящем документе, относится к применению в лечении, предотвращении и/или облегчении непереносимости лактозы у младенца.

Десятый аспект настоящего изобретения относится к применению смеси для новорожденных, описанной в настоящем документе, для улучшения консистенции стула.

Известно, что ВСМ-7 влияет на опиоидные рецепторы и относится к консистенции стула и боли в области живота. Таким образом, смесь для новорожденных, не содержащая или содержащая лишь очень ограниченное количество предшественников ВСМ-7, т.е. протеозопептонов PP-5 и медленных РР8, полученных из β-казеина А1, приведет к образованию меньшего количества ВСМ-7 при потреблении смеси для новорожденных и, следовательно, меньшему неблагоприятному влиянию на консистенцию стула и боль в области живота.

Кроме того, считается, что введение смеси для новорожденных, содержащей меньше молекул-предшественников ВСМ-7 и, следовательно, приводящей к образованию меньшего количества ВСМ-7, будет оказывать меньшее влияние на опиоидные рецепторы, предотвращая непереносимость лактозы в дальнейшей жизни такого младенца. Появляется все больше доказательств того, что события, происходящие на ранних этапах развития, могут провоцировать заболевание, даже если это заболевание может проявится только в дальнейшей жизни.

В этом контексте под лечением следует понимать ситуацию, в которой расстройство уже развилось, в отличие от предотвращения, которое происходит до развития расстройства. Под облегчением следует понимать ситуацию, при которой расстройство уже развилось, но подвергается такому лечению, которое не приводит к исчезновению расстройства, а просто улучшает состояние здоровья субъекта, страдающего от указанного заболевания.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, предотвращения и/или облегчения боли в области живота у младенца.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения, предотвращения и/или облегчения непереносимости лактозы у младенца.

Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам изобретения.

Все патентные и непатентные ссылки, цитируемые в настоящей заявке, полностью включены в данный документ путем ссылки.

Настоящее изобретение будет дополнительно подробно описано в представленных ниже примерах, не имеющих ограничительного характера.

Примеры

Материалы и способы Химические реагенты и образцы

Гидрохлорид гуанидина (RDD001), цитрата натрия дигидрат (S1804), DL-дитиотреитол (43819) и стандарт β-казеина (С6905) приобретали у компании Sigma-Aldrich (г. Сент-Луис, штат Мичиган, США), TFA (1.08178.0050) у компании VWR International (г. Раднор, штат Пенсильвания, США) и воду для ЖХ-МС (1.15333.1000) и ацетонитрил (1.00029.1000) у компании Merck (г. Дармштадт, Германия).

Образцы молока

Сырое молоко собирали на молочной ферме Teagasc Moorepark (Fermoy, Co., г. Корк, Ирландия) у коров, имеющих генетический профиль А1/А1, обезжиривали, пастеризовали с использованием аппарата Microthermics (UHT/HTST Electric Model 25 HV Hybrid, Liquid Technologies, г. Уэксфорд, Ирландия), выдерживали при температуре 85°С в течение 23 с с последующей 2-стадийной гомогенизацией [GEA Niro Soavi S.p.A. Тип: NS2006H (неасептическая)] при общем давлении при гомогенизации 2500 фунтов на кв. дюйм. Образец высушивали распылительной сушкой с получением образца сухого обезжиренного молока, обозначаемого как SMP А1|А1. Доступное в продаже SMP А1/А2 и А2/А2 приобретали в Европе и США, буйволиное SMP приобретали в Индии, и пастеризованное грудное молоко объединенных человеческих доноров (991-01-Р) приобретали у компании Lee Biosolutions (г. Мэриленд-Хайтс, штат Миссури, США).

Различные партии, полученные от одного или от разных производителей, пронумерованы А, В, С и т.д.

Готовые продукты и концентраты белка молочной сыворотки

Доступные в продаже порошковые смеси для новорожденных, подходящие для младенцев (0-12 месяцев) и детей (от 1 года и старше), получали от разных производителей и для разных возрастных групп.Различные образцы в экспериментах обозначали либо IF1-IF22 (см. таблицу 1), либо IFa-IFj. В связи с этим следует отметить, что IFa=IF1, IFb=IF2, IFc=IF3, IFd=IF4, IFe=IF5, IFf=IF6 и IFg=IF7.

Испытывали три различные доступные в продаже партии (обозначены А, В и С) WPC. WPC35 представляет собой концентрат белка молочной сыворотки с содержанием белка 35% мас./мас.

Испытывали две различные доступные в продаже партии WPC28 (обозначены А и В). WPC28 представляет собой деминерализованный WPC с содержанием белка 28% мас./мас.

WPC80 представляет собой доступный в продаже концентрат белка молочной сыворотки с содержанием белка 80% мас./мас., обогащенный альфа-лактальбумином.

Получение образца

Порошки диспергировали до достижения концентрации 3,5% мас./об. белка в воде с помощью мерной колбы, перемешивали в течение по меньшей мере 30 мин при комнатной температуре, денатурировали 4 объемами денатурирующего буфера (гуанидина гидрохлорид 7,5 М, цитрат натрия трехзамещенного 6,25 мМ, ДТТ 23 мМ), инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и просветляли центрифугированием при 16 000 g в течение 10 мин.

Расщепление нативных белков трипсином

Образцы порошков диспергировали до достижения концентрации 3,5% мас./об. белка в трис 50 мМ+6 М мочевины посредством смешивания на орбитальном шейкере в течение одного часа.

200 мкл образца разводили 1000 мкл бикарбоната аммония 100 мМ и встряхивали. 10 мкл ДТТ (45 мМ) добавляли к 100 мкл разбавленного раствора и инкубировали при 60°С в течение 30 минут. Затем образец охлаждали до комнатной температуры, после чего быстро вращали образец и добавляли 10 мкл йодацетамида (100 мМ). Затем образец инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего добавляли 6 мкл трипсина (0,2 мкг/мкл) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Расщепление трипсином останавливали посредством добавления 6 мкл 10% муравьиной кислоты. Расщепленный образец центрифугировали при 14 000 g в течение 10 минут, после чего переносили жидкую фазу во флакон для инъекции и определяли методом ЖХ-МС.

Анализ ЖХ-МС

Просветленные образцы анализировали методом ЖХ-МС на основе существующих способов (Bonfatti et al., 2008, Frederiksen et al., 2011).

Для анализа нативного белка образцы разделяли на колонке С4 (Acquity UPLC Protein ВЕН С4, 300 А, 1,7 мкм, 2,1 мм × 150 мм), используя следующий градиент при 0,5 мл/мин (таблица 2):

Буфер А: 0,1% трифторуксусная кислота (TFA) в воде, буфер В: 0,1% TFA в смеси ацетонитрил: вода 90:10

МС-сигнал регистрировали от 4 до 20 мин в режиме Full MS на аппарате Thermo Q-Exactive HF (температура нагревателя: 100°С, защитный газ: 53, вспомогательный газ: 14, продувочный газ: 3, напряжение распыления: 3,5 кВ, температура капилляра: 320°С, РЧ уровень S-линзы: 70%, диапазон массовых чисел: от 400 до 2000 масса/заряд, разрешение: 240 000, целевое значение AGC: 1е6, максимальное IT: 200 мс).

Для пептидного анализа, т.е. расщепления трипсином или расщепления с помощью GluC, пептиды разделяли на колонке С18 (Acquity UPLC ВЕН С18, 130 А, 1,7 мкм, 1,0 × 150 мм) с использованием следующего градиента при 75 мкл/мин (таблица 3):

МС-сигнал регистрировали от 3,5 до 35 мин в режиме PRM на аппарате Thermo Q-Exactive HF (температура нагревателя: 30°С, защитный газ: 8, вспомогательный газ: 0, продувочный газ: 0, напряжение распыления: 3,6 кВ, температура капилляра: 320°С, РЧ уровень S-линзы: 55, заряд по умолчанию: 2, разрешение MS2: 30 000, целевое значение AGC: 1е5, максимальное IT: 100 мс, изоляционное окно: 1,5 масса/заряд, изоляционное смещение: 0,5 масса/заряд).

Список включений показан в таблице 4:

Деконволюция данных

Файлы с исходными данными подвергали деконволюции с помощью программного обеспечения Thermo BioPharma Finder 1.0, используя алгоритм Xtract (пороговое значение S/N: 3, пороговое значение относительной численности: 1%, коэффициент соответствия: 80%, пороговое значение остатка: 25%, перекрытия, состояния заряда: от 5 до 50, минимальная интенсивность: 1, ожидаемая ошибка интенсивности: 3, масса/заряд: от 600 до 2000, минимальное количество обнаруженных состояний заряда: 3) и скользящие окна (время: от 5 до 20 мин, ширина целевого среднего спектра: 0,1 мин, смещение целевого среднего спектра: 50%, допуск на объединение: 1,5 Да, максимальный интервал ВУ: 0,5 мин, минимальное количество обнаруженных интервалов: 3, XIC). Моноизотопные массы, значения общей интенсивности сигнала и значения ВУ верхушки пика экспортировали в виде файлов CSV и использовали на следующих стадиях.

Эксперименты по пределу обнаружения также выполняли посредством деконволюции файлов с исходными данными с использованием фиксированного окна, центрированного вокруг пика β-казеина. Использовали следующие параметры: Пороговое значение S/N: 1, пороговое значение относительной численности: 1%, коэффициент соответствия: 25%, пороговое значение остатка: 25%, перекрытия, состояния заряда: от 12 до 30, минимальная интенсивность: 1, ожидаемая ошибка интенсивности: 3, масса/заряд: от 800 до 2000, минимальное количество обнаруженных состояний заряда: 3, время: 11-13,5 мин, пороговое значение относительной интенсивности: 1%. Моноизотопные массы и значения общей интенсивности сигнала использовали для следующих стадий. Определение протеоформ

Моноизотопные массы после деконволюции сравнивали с базой данных белков, содержащей основные белковые компоненты молока αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, γ-CN, α-лактальбумин, β-лактоглобулин, CGMP и протеозопептоны, используя разработанное компанией Nestle программное обеспечение (Protein Analyzer). Для идентификации большей части сигналов исследовали комбинаторное добавление стандартных модификаций белка (фосфорилирование, окисление, лактозилирование, гликозилирование и пироглутаминовая кислота). Неправильно определенные сигналы корректировали посредством ручной проверки. Выделяли значения общей интенсивности сигнала для соответствующих белков или протеоформ (т.е. общий β-казеин, состояния лактозилирования β-казеина, генетические варианты β-казеина и т.д.). Для ясности на фигурах подробно описаны только генетические варианты A1, А2 и В β-казеина. β-казеин I/H2 совместно элюируется с β-казеином и его объединяли с β-казеином А2. Оба варианта содержат пролин в положении 67 и принадлежат к типу А2.

Гликирование белка в твердом состоянии

Эксперимент с гликированием в твердом состоянии проводили на основе публикации Fenaille, 2003 г. (Fenaille et al., 2003). Вкратце, 45 г сухого молока инкубировали в замкнутой емкости, насыщенной карбонатом дикалия, в течение 8-10 дней до достижения влажности 5,4% (исходное значение составляло 3,8%). Девять аликвот увлажненного порошка по 2,1 г инкубировали в стеклянных пробирках объемом 25 мл при 60°С в печи в течение от 45 мин до 24 ч. Гликирование останавливали посредством переноса пробирок на лед на 5 мин. Затем добавляли 20 г воды для получения 3,5% (масс/об.) раствора белка, который перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч 30 на роликовом смесителе. Растворы хранили при 4°С в течение ночи до завершения эксперимента и перед анализом нагревали в течение 2 ч при КТ. Образцы готовили, как описано выше, за исключением того, что стадия инкубации длилась 10 мин при 60°С в термосмесителе (650 об./мин). МС-хроматограммы регистрировали на аппарате Thermo Orbitrap Elite (температура нагревателя: 60°С, защитный газ: 20, вспомогательный газ: 5, продувочный газ: 0, напряжение распыления:

3,8 кВ, температура капилляра: 320°С, РЧ уровень S-линзы: 60%, диапазон массовых чисел: от 400 до 2000 масса/заряд, разрешение: 240 000, целевое значение AGC: 1е6). Количественное определение β-казеина

Образец сухого обезжиренного молока (SMP) инъецировали множество раз в каждой аналитической серии для нормализации сигналов в ходе экспериментов.

Внешнюю калибровочную кривую строили с использованием стандарта β-казеина, скорректированного на чистоту белка (см. текст). Значения интенсивности сигналов β-казеина нормализовали по среднему сигналу β-казеина образцов SMP (скорректированному на гликирование, см. выше). Калибровочную кривую принудительно приводили к 0 (у=0,0524 ⋅ х, где х выражен в мкг инъецированного β-казеина, и у является безразмерным).

Для каждого образца значения интенсивности β-казеина сначала корректировали на гликирование и нормализовали по среднему сигналу β-казеина в образцах SMP (скорректированных на гликирование). Затем количество инъецированного β-казеина рассчитывали по внешней калибровочной кривой. Такой расчет можно проводить для общего β-казеина, для данного варианта, например, β-казеина А1, или для набора вариантов (результаты для β-казеина А2 также включают в себя родственный вариант I/H2).

Эффективность способа оценивали два оператора на семи образцах смеси для новорожденных (стадии 1-4, изготовленные с использованием сухого обезжиренного молока типа А2), используя три повторных инъекции в пять разных дней.

Пример 1. Способ ЖХ-МС, вывод данных, деконволюция и визуализация Для анализа нативных белков образцы смеси для новорожденных и сухого обезжиренного молока диспергировали в воде до достижения концентрации 3,5% (об./мас.) белка, денатурировали в 6 М гуанидине, восстанавливали с помощью ДТТ и просветляли центрифугированием. Нативные белки разделяли посредством сверхэффективной жидкостной хроматографии (СВЭЖХ) на колонке С4 с использованием градиента вода/ACN с 0,1% TFA и анализировали с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения (фиг. 3А). Для получения моноизотопных масс белков последовательно выполняют деконволюцию хроматограмм с использованием алгоритма скользящих окон и алгоритма Xtract (фиг. 3В). Наконец, протеоформы визуализируют на схемах в виде кружков и стрелок, где на оси X отложено время удерживания, на оси Y - моноизотопный размер, и площадь кружков отражает интенсивность сигнала (фиг. 3С).

Пример 2. Общий идентификационный отпечаток

На фиг. 4А показан результат реализации способа с коровьим сырым молоком и показано, где обнаружены основные молочные белки (αS1-, αS2-, β-, κ- и γ-казеин, α-lac и β-lg). Увеличение области β-казеина (фиг. 4 В) позволяет выполнить подробный анализ различных протеоформ β-казеина, включая генетические варианты и модификацию белка (индуцированные реализацией метода лактозилированные аддукты обнаруживают во всех образцах сухого обезжиренного молока). Точность масс показана в таблице 5 для образца сырого молока. Различие в 1 Да может быть обусловлено неправильно идентифицированным моноизотопным сигналом, распространяющимся в ходе деконволюции, поскольку между скользящими окнами применяют допуск на объединение 1,5 Да во избежание разделения сигналов на две массы, разнесенные на 1 Да. Способ можно применять для профилирования широкого спектра сырьевых материалов и готовых продуктов (фиг. 5). Интересно, что этим способом легко обнаруживают гликомакропептид казеина (CGMP), С-концевую часть κ-казеина, отщепляемую сычужным ферментом в процессе изготовления сыра, полипептид, который откровенно трудно обнаружить окрашиванием гелем или УФ-профилированием.

Пример 3. Обнаружение β-казеина А1 в смесях для новорожденных с β-казеином А2

Семь смесей для новорожденных с β-казеином А2 обогащали SMP А1|А1 до достижения 5% β-казеина А1 (5 г β-казеина А1 в 100 г общего β-казеина). При этой концентрации сигнал β-казеина А1 обнаруживали во всех случаях (фиг. 6). Пример 4. Количественное определение белка и гликирование

Для количественного определения белка требуется не только подходящий стандарт для построения калибровочной кривой, но и чтобы разные протеоформы демонстрировали аналогичные ответные сигналы. Это необходимо для применения калибровочной кривой к неизвестным образцам с учетом того, что стандарт и образцы, вероятно, имеют разные распределения протеоформ. В альтернативном варианте осуществления способ должен обеспечивать способ коррекции распределения протеоформ.

Чтобы проверить, влияет ли лактозилирование белка на интенсивность МС-сигнала, гликирование индуцировали в образце сухого обезжиренного молока посредством нагревания, как описано в разделе «Материалы и способы» (фиг. 7А). Увеличение содержания гликированного β-казеина (фиг. 7 В) сопровождалось уменьшением общего сигнала β-казеина (фиг. 1С). График зависимости общего сигнала β-казеина от процентного содержания негликированного сигнала β-казеина был линейным (фиг. 7D), и его преобразовывали в кратное снижение сигнала (фиг. 7Е) вида у=1/(ах+b), где а и b соответствуют 0,878 и 0,122 соответственно. Таким образом, для β-казеина поправочный коэффициент гликирования (GCF) может быть рассчитан на основании процентного содержания негликированного β-казеина (%UG_β) с использованием уравнения 1.

Умножение измеренного сигнала β-казеина на GCF приводит к получению скорректированного сигнала β-казеина (Pcas_corr), который соответствует ожидаемому сигналу, если весь β-казеин был негликированным (уравнение 2).

Пример 5. Количественное определение β-казеина

Количественное определение проводили с помощью алгоритма скользящих окон. Внешнюю калибровочную кривую строили с использованием коммерческого очищенного β-казеина. Этот стандарт также содержал αS1-казеин, κ-казеин и различные неидентифицированные пептиды и белковые фрагменты, большинство из которых соответствовали продуктам расщепления β-казеина (фиг. 8А). Доля общего сигнала, относящаяся к нативному β-казеину в семи наиболее концентрированных калибровочных образцах, достигала 85,6±0,4%, и концентрацию стандартного β-казеина корректировали с помощью этого коэффициента чистоты. Для каждой концентрации общий сигнал β-казеина нормализовали по среднему (и корректировали на гликирование) сигналу образцов SMP, которые инъецировали в одной и той же серии (и во всех последующих экспериментах по количественному определению для учета вариаций параметров МС), и нормализованные значения наносили на график в зависимости от количества β-казеина, загруженного на колонку. Калибровочная кривая (фиг. 8В) демонстрировала хорошую линейность (R²=0,996) со случайным распределением остатков. По этой калибровочной кривой можно рассчитать количество β-казеина, инъецированного в колонку (в мкг), используя уравнение 3:

где Pcas_corr,_norm представляет собой скорректированный сигнал β-казеина в образце (уравнение 2), деленный на среднее значение скорректированных сигналов образцов сухого обезжиренного молока, инъецированных в одной и той же серии (уравнение 4).

Количественное определение вариантов β-казеина в молочной матрице дополнительно оценивали посредством смешивания сухого обезжиренного молока, содержащего только вариант А1, с сухим обезжиренным молоком, содержащим только тип А2 (фиг. 8С). Ответ на β-казеин А2 показал хорошую линейность (R²=0,996), что свидетельствует о пренебрежимо малом эффекте матрицы. Измеренные и ожидаемые соотношения А1/А2 продемонстрировали очень сильную линейную зависимость (%A2_calc=1,05 ⋅ %А2_ехр, R²=0,996). Это означает, что коэффициенты ответа для обоих вариантов очень схожи, и что калибровочная кривая также подходит для количественного определения отдельных генетических вариантов. Количественное определение β-казеина в двух образцах SMP приводило к получению среднего значения 28,3 г β-казеина / 100 г белка, что соответствует значению 27%, описанному в справочнике Handbook of milk composition (Swaisgood, 1995) (таблица 6).

Пример 6. Эффективность способа (количественное определение β-казеина)

Эффективность способа оценивали на семи смесях для новорожденных, содержащих только β-казеин А2. Каждый образец готовили пять различных раз и анализировали, используя три повторных инъекции. Измеренное количество β-казеина, по существу, находилось в соответствии (83%-136%) с теоретическими значениями, рассчитанными посредством умножения содержания белка на содержание казеина и на 33%, что представляет собой общепринятую долю β-казеина в общем казеине (Swaisgood, 1995) (фиг. 9А).

Способ дополнительно испытывали на другой серии доступных в продаже смесей для новорожденных (либо на основе А2, либо изготовленных со стандартным SMP), и было показано, что результаты, по существу, соответствуют теоретическим значениям (фиг. 9В, в случае заштрихованных значений % молочной сыворотки основан на допущениях). Различия между измеренным и теоретическим содержанием β-казеина были наибольшими в образцах с наименьшим содержанием β-казеина. Это может быть связано с тем, что менее распространенные протеоформы становятся слишком схожими с шумом и не могут быть эффективно измеренными, в частности, в образцах с множеством генетических вариантов, таких как IF8 и IF13.

Пример 7. Обнаружение А1-специфичных протеозопептонов в концентрате белка молочной сыворотки с помощью анализа нативного белка

Шесть различных партий концентратов белка молочной сыворотки анализировали посредством анализа нативного белка, как описано в разделе «Способы и материалы», методом ЖХ-МСВР.

Проанализированные сырьевые материалы:

• Три партии WPC35

• Две партии WPC28

• Одна партия WPC80 (обогащенная α-lac)

На фиг. 10 представлены отдельные анализы шести различных концентратов белка молочной сыворотки.

Ни в одном из испытанных WPC не было обнаружено следов β-казеина, поскольку в пределах кружка со сплошным периметром не было обнаружено сигналов (т.е. в кружке в правом верхнем углу).

Напротив, все испытанные WPC демонстрировали наличие сигналов, соответствующих протеозопептонам, обнаруженных в виде сигналов в пределах кружка с пунктирным периметром (т.е. кружка в левом нижнем углу).

Анализ дополнительно показал, что все ингредиенты содержали CGMP (гликомакропептид казеина), который представляет собой полученный из казеина пептид, идентифицированный в нижнем левом углу каждой из диаграмм. Непосредственно под кружком с пунктирным периметром.

На фиг. 11 представлен крупный план области внутри кружка с пунктирным периметром, показанным на фиг. 10. На этом крупном плане показано, что во всех ингредиентах были обнаружены сигналы, соответствующие ожидаемым массам для широкого спектра протеозопептонов. Черный цвет обозначает полученные из β-казеина А2 протеозопептоны, серый цвет обозначает полученные из β-казеина А1 протеозопептоны, а белый цвет обозначает неидентифицированные соединения.

Некоторые из этих пептонов представляют собой: РР5 А1 1-105, РР5 А1 1-107, РР5 А2 1-105, РР5 А2 1-107, bcas1P A1 29-105 (т.е. PP8s A1 29-105), bcas1P A1 29-107 (т.е. PP8s A1 29-107), bcas1p A2 29-105 (т.е. PP8s A2 29-105) и bcas1P A2 29-107 (PP8s A2 29-107).

В испытанном WPC не обнаружили гамма-казеин.

WPC80 не содержал медленного РР8 (29-105/7). Вероятно, из-за стадии ультрафильтрации способа получения WPC80, на которой, вероятно, удаляется медленный РР8.

Как на фиг. 10, так и на фиг. 11 несколько сигналов (показаны белым) как в пределах, так и за пределами кружка с пунктирным периметром на фиг. 10 относятся к идентификации оставшихся пептидов.

Соответственно, протеозопептоны β-казеина А1 (и А2) обнаруживали во всем испытанном сырьевом материале молочной сыворотки. Таким образом, они будут присутствовать в готовых продуктах и весьма вероятно будут ответственны за сильный сигнал А1, полученный во всех испытанных готовых продуктах.

Пример 8. Обнаружение А1-специфичных протеозопептонов в готовых продуктах с помощью анализа нативного белка

Анализировали различные готовые продукты, представляющие собой различные смеси для новорожденных различных торговых марок, для обнаружения конкретных протеозопептонов. Все смеси для новорожденных считаются конечными продуктами А2.

Готовые продукты растворяли и анализировали методом ЖХ-МСВР, как описано в разделе «Материалы и способы» выше.

На фиг. 12 показано, что протеозопептоны обнаруживали во всех испытанных партиях, даже если профиль протеозопептонов различался у разных готовых продуктов.

Полученные из β-казеина А1 протеозопептоны обнаружены во всех испытанных смесях для новорожденных, даже если они основаны на молоке с β-казеином А2.

Пример 9. Количественное определение А1- и А2-специфичных протеозопептонов с помощью анализа интактного белка

Относительное количественное определение РР5 А1 и РР5 А2 в молочной матрице оценивали посредством смешивания сухого обезжиренного молока, содержащего только вариант А1, с сухим обезжиренным молоком, содержащим только тип А2 (фиг. 13). Ответы для РР5 А2 и РР5 А1 продемонстрировали хорошую зависимость от дозы с квадратичной регрессией (R²=0,999 и R²=0,995, соответственно), что свидетельствует о пренебрежимо малом влиянии матрицы. Это означает, что коэффициенты ответа для обоих вариантов очень схожи, и что калибровочная кривая также подходит для количественного определения отдельных генетических вариантов.

В заключение показано, что определенные протеозопептоны можно количественно определять с помощью анализа нативного белка даже в матрице.

Пример 10. Обнаружение А1-специфичных протеозопептонов в готовых продуктах с помощью расщепления трипсином

Различные готовые продукты представляют собой либо стандартное сухое обезжиренное молоко (т.е. стандартное SMP), сухое обезжиренное молоко, содержащее только вариант А2 β-казеина, либо различные смеси для новорожденных различных торговых марок и для различных возрастных групп. Все смеси для новорожденных считаются конечными продуктами А2.

Готовые продукты диспергировали до достижения концентрации 3,5% (мас./об.) белка в трис 50 мМ + 6 М мочевины и смешивали на орбитальном шейкере в течение одного часа. 200 мкл образца разводили 1000 мкл бикарбоната аммония 100 мМ и встряхивали. К 100 мкл разбавленного раствора добавляли 10 мкл ДТТ (45 мМ). Образцы инкубировали при 60°С в течение 30 минут, охлаждали до КТ и быстро центрифугировали для сбора образовавшихся после выпаривания капель. Добавляли 10 мкл йодацетамида 100 мМ (в бикарбонате аммония 100 мМ); образцы инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Добавляли 6 мкл трипсина 0,2 мкг/мкл и образцы инкубировали в течение ночи при 37°С. Для остановки расщепления добавляли 6 мкл 10% муравьиной кислоты, растворы центрифугировали при 14 000 g в течение 10 минут; жидкую фазу переносили во флакон для инъекций и анализировали методом ЖХ-МС, как описано в разделе «Материалы и способы» выше.

Анализ сфокусирован на обнаружении пептида A1S, т.е. А1-специфичного пептида, имеющего положение, показанное на фиг. 14. Как видно из положения пептида A1S, его можно отличить от пептида A2S, поскольку он охватывает область β-казеина, включающую аминокислоту 67.

На фиг. 15 показано, что в образцах SMP А2 не обнаружено A1S. A1S был обнаружен в одном образце SMP А2, который впоследствии оказался ошибочно содержащим β-казеин А1. Однако пептид существенно экспрессируется в стандартном SMP. Неожиданно было обнаружено, что во всех испытанных смесях для новорожденных был обнаружен сильный сигнал для пептида A1S. Аналогичные результаты были получены для пептидов A1N (фиг. 16) и А1Т (фиг. 17).

Как ожидалось, пептиды A2S (фиг. 18), A2N (фиг. 19), А2Т (фиг. 20), Tot 1 (фиг. 21) и Tot 2 (фиг. 22) демонстрировали сильные сигналы во всех испытанных областях.

Пример 11. Обнаружение А1-специфичных протеозопептонов в концентрате белка молочной сыворотки с помощью расщепления трипсином

Различные партии концентратов белка молочной сыворотки анализировали вместе с сухим обезжиренным молоком, как стандартным, так и сухим обезжиренным молоком, содержащим только вариант А2 βказеина.

Проанализированные сырьевые материалы (RM):

• Три партии WPC35

• Две партии WPC28

• Одна партия WPC80 (обогащенная α-lac)

• Два различных доступных в продаже лактозных ингредиента

Продукты растворяли и подвергали расщеплению трипсином перед анализом методом ЖХ-МС, как описано в разделе «Материалы и способы» выше.

Анализы сфокусированы на обнаружении пептидов Tot1 и Tot2, т.е. общих для β-казеина А1 и А2 пептидов, пептида A1S, т.е. А1-специфичного пептида, пептида A1N, т.е. А1-специфичного пептида, пептида А1Т, т.е. А1-специфичного пептида, пептида A2N, т.е. А2-специфичного пептида, пептида А2Т, т.е. А2-специфичного пептида, и пептида A2S, т.е. А2-специфичного пептида. Положение пептидов показано на фиг. 14.

На фиг. 23 и 24 представлены результаты, полученные при определении количества пептидов Tot1 и Tot2 соответственно. Это общий пептид (для А1 и А2), а также пептид, присутствующий только в нативном β-казеине и γ-казеине. Показано, что сигнал общего пептида β-казеина значительно снижен во всех ингредиентах молочной сыворотки и отсутствует в лактозных ингредиентах, но присутствует в SMP и SMP А2, как ожидается.

Это указывает на то, что, как ожидалось, в RM (~1%) присутствует очень малое количество нативного β-казеина или γ-казеина по сравнению с SMP даже при использовании эквивалентного содержания белка.

На фиг. 25 показаны результаты, полученные при определении количества пептида A1S. Как ожидалось, сигнал пептида A1S является самым сильным в SMP, но отсутствует в SMP А2. Кроме того, образцы лактозы не демонстрируют какого-либо сигнала. Для образцов сывороточного белка неожиданно было обнаружено, что количество составляет приблизительно четверть от количества, наблюдаемого в SMP.

Аналогичные результаты получали при испытании образцов на наличие двух других А1-специфичных пептидов A1N и А1Т (фиг. 26 и фиг. 27).

На фиг. 28 показаны результаты, полученные при определении количества A2S.

Показано, что сигнал пептида A2S (А2-специфичного) является самым сильным для SMP А2, но слабее для SMP, как ожидалось. Как ожидалось, образцы лактозы не демонстрируют какого-либо сигнала. Для образцов сывороточного белка неожиданно было обнаружено, что количество составляет приблизительно четверть от количества, наблюдаемого в SMP.

Аналогичные результаты получали при испытании образцов на наличие двух других А2-специфичных пептидов A2N и А2Т (фиг. 29 и 30).

Соответственно, на основании приведенных выше результатов можно сделать вывод о том, что во всем проанализированном RM молочной сыворотки интенсивность сигнала общего пептида β-казеина сильно снижена (~ в 100 раз) по сравнению с SMP. Кроме того, А1- и А2-специфичные пептиды снижены всего лишь в ~ 4-5 раз по сравнению с SMP. Таким образом, наблюдается селективное обогащение А1- и А2-специфичных пептидов.

Таким образом, при применении способа расщепления трипсином и определении различных пептидов будет казаться, что ингредиенты молочной сыворотки по-прежнему содержат ~ 20% фрагментов β-казеина (по сравнению с SMP), которые могут по меньшей мере частично представлять собой известные протеозопептоны, такие как РР5 и PP8s.

Пример 12. Снижение протеозопептонов во фракциях белка молочной сыворотки

Чтобы получить обедненную фракцию белка молочной сыворотки, три партии WPC35, в которых в примере 9 было обнаружено присутствие протеозопептонов, подвергали гель-фильтрации.

Три партии WPC35 дополнительно очищали посредством гель-фильтрации на колонке (550 × 22 мм) Sephadex G-75, изготовленной и уравновешенной с помощью буфера, представляющего собой летучий 0,1 М NH₄HCO₃ (рН 8,0-8,5).

0,5 г-0,7 г каждой из партий растворяли в 5-7 мл буфера (с добавлением нескольких мл 1 М NaOH для нейтрализации остаточных следов ТСА и облегчения растворения) и наносили на колонку. Скорость потока доводили до 0,5 мл/мин и собирали фракции объемом 5 мл.

Фракции анализировали способом обнаружения и количественного определения, описанным в настоящем документе, т.е. ЖХ-МСВР, в соответствии с разделом «Материалы и способы». Фракции без протеозопептонов РР5 и медленного РР8 объединяли с образованием обедненной фракции белка молочной сыворотки.

Справочная литература

Bonfatti, V. et al. J Chromatogr A, 2008; 1195(1-2): 101-106. de Jong et al. J Chromatogr A, 1993; 652(1):207-213.

EFSA Scientific Report, научный отчет EFSA, подготовленный рабочей группой DATEX, о потенциальном влиянии на здоровье b-казоморфинов и родственных пептидов. 2009; 231; 1-107.

Fenaille, F. et al. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003; 17(13):1483-1492.

Fenaille, F. et al. International Dairy Journal, 2006; 16(7):728-739.

Feng, P. et al. J AO AC Int, 2017; 100(2):510-521.

Frederiksen, P. D. et al. J Dairy Sci, 2011; 94(10):4787-4799.

Ho, S. et al. Eur. J. Clin. Nutr. 2014, 68, 994-1000.

Karamoko, G. et al. Biotechnologie, Agronomie, Societe et Environnement, 2013; 17(2):373-382.

Poulsen, N. A et al. Acta Agriculturae Scandinavica, Section A - Animal Science, 2016; 66(4): 190-198.

Roberfroid MB. J Nutr. 2007; 137: 830S.

Salminen S et al. Trend Food Sci. Technol., 1999; 10 107-110.

Swaisgood, H. E. Handbook of Milk Composition. R.G. Jensen, ed. Academic Press, San Diego 1995; 464-468.

Swaisgood. Developments in Dairy Chemistry. Fox (Ed), Proteins, vol. 1, 1982; 63-110.

Vallejo-Cordoba, B. J Capillary Electrophor, 1997; 4(5):219-224.

Visser, S. et al. J Chromatogr A, 1995; 711(1): 141-150.

Признаки изобретения

1. Способ обнаружения и/или количественного определения полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина, причем указанный способ включает следующие стадии

(i) получение подлежащего анализу основанного на молоке продукта;

(ii) выполнение анализа указанного продукта методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии;

(iii) обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина в указанном продукте посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд или деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

2. Способ по признаку 1, в котором указанные протеозопептоны представляют собой протеозопептоны, полученные из β-казеина А1.

3. Способ по признаку 2, в котором указанные полученные из β-казеина протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5, например, полученные из β-казеина А1 протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5.

4. Способ по любому из предшествующих признаков, в котором указанный продукт представляет собой смесь для новорожденных или фракция белка молочной сыворотки.

5. Способ по любому из предшествующих признаков, в котором продукт представляет собой порошок, причем указанный порошок растворяют перед анализом указанного продукта.

6. Способ по любому из предшествующих признаков, в котором указанный продукт анализируют с помощью анализа нативного белка.

7. Способ по признаку 6, в котором указанный масс-спектрометрический анализ представляет собой масс-спектрометрический анализ высокого разрешения.

8. Способ по любому из признаков 6-7, в котором обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанном продукте выполняют посредством деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

9. Способ по признаку 8, в котором указанную деконволюцию выполняют с помощью алгоритма скользящих окон.

10. Способ по любому из признаков 1-5, в котором указанный продукт анализируют с помощью пептидного анализа, включающего стадию ферментативного расщепления указанного продукта перед его анализом.

11. Способ по признаку 10, в котором указанное ферментативное расщепление выполняют посредством расщепления трипсином или расщепления с помощью GluC.

12. Способ по любому из признаков 10-11, в котором обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов выполняют посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд.

13. Способ получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки, как описано в любом из признаков 1-12; и

(iii) выбор указанной фракции белка молочной сыворотки, содержащей не более 10% по массе полученных из β-казеина протеозопептонов от общего количества белка в указанной фракции белка молочной сыворотки, с образованием выбранной фракции белка молочной сыворотки.

14. Способ получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) снижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации не более 10% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки с образованием обедненной фракции белка молочной сыворотки.

15. Способ по признаку 14, дополнительно включающий стадию до и/или после стадии (ii) обнаружения и количественного определения указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки, как описано в любом из признаков 1-12.

16. Способ по любому из признаков 14-15, в котором содержание протеозопептонов снижают посредством гель-фильтрации.

17. Способ по любому из признаков 13-16, в котором содержание полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной выбранной или обедненной фракции белка молочной сыворотки составляет не более 9,5% по массе, например не более 9% по массе, предпочтительно не более 8,5% по массе, например не более 8% по массе, более предпочтительно не более 7,5% по массе, например не более 7% по массе, еще более предпочтительно не более 6,5% по массе, например не более 6% по массе, еще более предпочтительно не более 5,5% по массе, например не более 5% по массе, наиболее предпочтительно не более 4,5% по массе, например не более 4% по массе, не более 3,5% по массе, например не более 3% по массе, предпочтительно не более 2,5% по массе, например не более 2% по массе, более предпочтительно не более 1,5% по массе, например не более 1% по массе, еще более предпочтительно не более 0,75% по массе, например не более 0,50% по массе, еще более предпочтительно не более 0,25% по массе, например не более 0,10% по массе, наиболее предпочтительно не более 0,05% по массе, например не более 0,01% по массе от общего содержания белка во фракции белка молочной сыворотки.

18. Способ по любому из признаков 13-17, в котором указанные протеозопептоны представляют собой быстрый РР8, медленный РР8 и/или PP-5.

19. Способ получения питательной композиции, имеющей сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение выбранной фракции белка молочной сыворотки или обедненной фракции белка молочной сыворотки, как описано в любом из признаков 13-18;

(ii) получение указанной питательной композиции с пониженным содержанием протеозопептонов из указанных выбранных фракций белка молочной сыворотки, указанных обедненных фракций белка молочной сыворотки или их смеси.

20. Фракция белка молочной сыворотки, имеющая сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, полученная способом по любому из признаков 14-18.

21. Питательная композиция, содержащая указанную фракцию белка молочной сыворотки, имеющую сниженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, по признаку 20 или полученную способом по признаку 19.

22. Питательная композиция по признаку 21, которая представляет собой смесь для новорожденных.

23. Питательная композиция по любому из признаков 21-22, в которой содержание указанных протеозопептонов составляет не более 9% по массе от общего содержания белка в питательной композиции.

24. Питательная композиция по любому из признаков 21-23 для применения в качестве лекарственного средства.

25. Смесь для новорожденных по любому из признаков 22-23 для применения в лечении, предотвращении и/или облегчении боли в области живота у младенца.

26. Смесь для новорожденных по любому из признаков 22-23 для применения в лечении, предотвращении и/или облегчении непереносимости лактозы у младенца.

27. Применение смеси для новорожденных по любому из признаков 22-23 для улучшения консистенции стула.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO. 1 (аминокислотная последовательность β-казеина А2):

SEQ ID NO. 2 (аминокислотная последовательность β-казеина А1):

SEQ ID NO. 3 (аминокислотная последовательность A1N): AQTQSLVYPF PGPIHN

SEQ ID NO. 4 (аминокислотная последовательность A2N): AQTQSLVYPF PGPIPN SEQ ID NO. 5 (аминокислотная последовательность Tot2): AVPYPQR

SEQ ID NO. 6 (аминокислотная последовательность A1S): IHPFAQTQSL VYPFPGPIHN

SEQ ID NO. 7 (аминокислотная последовательность AIT): IHPFAQTQSL VYPFPGPIHN SLPQNIPPLT QTPVVVPPFL QPEVMGVSK

SEQ ID NO. 8 (аминокислотная последовательность A2S): IHPFAQTQSL VYPFPGPIPN

SEQ ID NO. 9 (аминокислотная последовательность A2T): IHPFAQTQSL VYPFPGPIPN SLPQNIPPLT QTPVVVPPFL QPEVMGVSK

SEQ ID NO. 10 (аминокислотная последовательность Tot1): VLPVPQK

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Société des Produits Nestlé S.A.

<120> ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ

ПРОТЕОЗОПЕПТОНОВ И/ИЛИ СОДЕРЖАНИЯ БЕТА-КАЗЕИНА И ПИТАТЕЛЬНАЯ

КОМПОЗИЦИЯ СО СНИЖЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ БЕТА-КАЗЕИНА

ПРОТЕОЗОПЕПТОНОВ

<130> 16547

<150> EP18214628.2

<151> 2018-12-20

<160> 10

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 209

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность бета-казеина A2

<400> 1

Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys

20 25 30

Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys

35 40 45

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

50 55 60

Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser

85 90 95

Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro

100 105 110

Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr

115 120 125

Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met

130 135 140

His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln

145 150 155 160

Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

165 170 175

Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu

180 185 190

Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile

195 200 205

Val

<210> 2

<211> 209

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность бета-казеина A1

<400> 2

Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro Gly Glu Ile Val Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys

20 25 30

Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys

35 40 45

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

50 55 60

Pro Ile His Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr

65 70 75 80

Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser

85 90 95

Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys His Lys Glu Met Pro Phe Pro

100 105 110

Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr

115 120 125

Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met

130 135 140

His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro Pro Gln

145 150 155 160

Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

165 170 175

Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu

180 185 190

Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile

195 200 205

Val

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A1N

<400> 3

Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile His Asn

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A2N

<400> 4

Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly Pro Ile Pro Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность Tot2

<400> 5

Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg

1 5

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A1S

<400> 6

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ile His Asn

20

<210> 7

<211> 49

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A1T

<400> 7

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ile His Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr

20 25 30

Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser

35 40 45

Lys

<210> 8

<211> 20

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A2S

<400> 8

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ile Pro Asn

20

<210> 9

<211> 49

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность A2T

<400> 9

Ile His Pro Phe Ala Gln Thr Gln Ser Leu Val Tyr Pro Phe Pro Gly

1 5 10 15

Pro Ile Pro Asn Ser Leu Pro Gln Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Thr

20 25 30

Pro Val Val Val Pro Pro Phe Leu Gln Pro Glu Val Met Gly Val Ser

35 40 45

Lys

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Неизвестно

<220>

<223> аминокислотная последовательность Tot1

<400> 10

Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

1 5

<---

Изобретение относится к способу получения фракции белка молочной сыворотки и к питательной композиции, имеющей пониженное содержание протеозопептонов. Способ включает получение фракции белка молочной сыворотки, обнаружение и количественное определение полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции и выбор указанной фракции белка молочной сыворотки, содержащей не более 10% по массе полученных из β-казеина протеозопептонов от общего количества белка в указанной фракции. При этом обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки включают этапы: получение подлежащего анализу основанного на молоке продукта, выполнение анализа указанного продукта методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина в указанном продукте посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд m/z или деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс. Как вариант, способ получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, включает получение фракции белка молочной сыворотки и понижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов путем гель-фильтрации в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации самое большее 10% по массе от общего количества белка во фракции белка молочной сыворотки. Способ получения питательной композиции предусматривает введение в состав композиции фракции белка молочной сыворотки, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, полученной в соответствии с вышеуказанными способами. Изобретение позволяет получить питательные композиции с пониженным содержанием протеозопептонов, которые могут быть использованы для предотвращения и/или облегчения боли в области живота у младенца. 3 н.п. ф-лы, 30 ил., 6 табл., 12 пр.

1. Способ получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки; и

(iii) выбор указанной фракции белка молочной сыворотки, содержащей не более 10% по массе полученных из β-казеина протеозопептонов от общего количества белка в указанной фракции белка молочной сыворотки, с образованием выбранной фракции белка молочной сыворотки,

в котором (ii) обнаружение и количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки включают этапы:

(a) получение подлежащего анализу основанного на молоке продукта;

(b) выполнение анализа указанного продукта методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии;

(c) обнаружение и/или количественное определение указанных полученных из β-казеина протеозопептонов и/или β-казеина в указанном продукте посредством обнаружения соединений с заданными значениями масса/заряд m/z или деконволюции одного или более масс-спектров для расчета моноизотопных масс.

2. Способ получения фракции белка молочной сыворотки, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки;

(ii) понижение содержания полученных из β-казеина протеозопептонов в указанной фракции белка молочной сыворотки до концентрации самое большее 10% по массе от общего количества белка во фракции белка молочной сыворотки, с образованием фракций белка молочной сыворотки с пониженным содержанием протеозопептонов,

в котором содержание протеозопептонов понижают путем гель-фильтрации.

3. Способ получения питательной композиции, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) получение фракции белка молочной сыворотки, имеющей пониженное содержание полученных из β-казеина протеозопептонов, согласно п.1 или 2;

(ii) получение указанной питательной композиции с пониженным содержанием протеозопептонов из β-казеина из указанной фракции с пониженным содержанием белка молочной сыворотки.