Способ диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей, ассоциированной с контаминацией биосред никелем Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 G01N33/543 G01N30/72 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области профилактической медицины, экологии человека, педиатрии и может быть использовано для диагностики у детей спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией организма никелем.

Актуальность настоящего изобретения обусловлена большим распространением патологии позвоночника, которая, по данным статистки, встречается у трети подростков к окончанию школы. Быстрая утомляемость и боли в спине снижают возможности детей к занятию спортом, а в будущем, ограничивают выбор профессии.

Спинальная нестабильность (по МКБ-10 это заболевание классифицируется по классу М53.2) – это патологическое состояние позвоночного столба, при котором позвоночник не способен удерживаться в физиологическом положении и сохранять его как в покое, так и при движении. Чаще всего спинальная нестабильность наблюдается у детей и пожилых людей. В первом случае нестабильность обоснована бурным ростом всех тканей организма, во втором – возрастной слабостью мышц и связок.

Спинальная нестабильность может проявляться смещением позвонков без нарушения их целостности и деформацией, предполагающей разрушение позвонка. Часто этому сопутствуют неврологическая симптоматика, ограничения подвижности, боль. В детском возрасте патология способна привести к возникновению острой кривошеи.

Из уровня техники известен способ диагностики патологии верхнешейного отдела позвоночника с помощью функционального рентгенологического исследования. При этом требуются специальные укладки. Чаще всего применяют рентгенографию в боковой и трансоральной проекциях. (Селиванов В.П, Никитин В.Н. Диагностика и лечение вывихов шейных позвонков. - М.: Медицина, 1971. - 178 с.). Недостатком функциональной рентгенодиагностики являются технические сложности, а также сложности интерпретации снимков, особенно у детей младшей возрастной группы. Кроме того, некоторые структурные нарушения КВО видны на рентгенограммах в более позднем возрасте.

Известен способ диагностики функциональных блоков шейного отдела позвоночника (Патент РФ № 2086224), основанный на пальпации поперечных отростков и определении их расположения в трех плоскостях. Однако способ касается дегенеративно-дистрофических заболеваний позвоночника, что мало актуально для детского возраста. Кроме того, невозможно определять вид структурных нарушений (диспластический или травматический генез) функционального блока, а также степень выраженности нарушений.

Известен способ скрининг - диагностики тяжести родовой травмы шейного отдела позвоночника и спинного мозга у грудных детей (Патент РФ № 2195156). Проводят оценку в баллах жалоб, нарушений черепно-мозговой иннервации, неспинальных безусловных, патологических безусловных, безусловных спинальных рефлексов, тонуса мышц, активных движений в конечностях, вертебрального синдрома и по сумме баллов диагностируют степень заболевания. Способ касается, во-первых, ограниченной возрастной категории пациентов (грудные дети) и, во-вторых, только травматических повреждений КВО.

Известен способ диагностики структурной патологии кранио-вертебральной области (КВО) у детей (Патент РФ № 2359607), согласно которому исследуют в комплексе клинические признаки нарушений ОДА ребенка, анамнестические признаки и признаки сурдологического и офтальмологического статусов: возраст, головные боли, головокружения, носовые кровотечения, утомляемость, степень гестоза, угроза прерывания беременности, внутриутробные инфекции, течение родов (стремительные/затяжные), кесарево сечение, обвитие пуповиной вокруг ШОП, постнатальные травмы, недоношенность, аномалии развития органов и систем, энурез, состояние слухового анализатора, состояние зрительно анализатора, наличие кривошеи, степень тяжести кривошеи, ограничение наклонов в ШОП вправо, ограничение наклонов в ШОП влево, ограничение наклонов в ШОП вперед, ограничение наклонов в ШОП назад, ограничение поворотов в ШОП вправо, ограничение поворотов в ШОП влево, нарушение осанки в СП, степень нарушения осанки в СП, нарушение осанки во ФП, степень нарушения осанки во ФП, перекосы таза во ФП, наличие укорочения нижних конечностей, степень подвижности суставов, степень переднего приведения стоп в ходьбе, состояние поперечных сводов стоп, состояние продольных сводов стоп, положение пяточной кости, степень отклонения пяточной кости, признаки оценивают в баллах и данные фиксируют в компьютерной программе, для математической обработки данных используют решающие правила для диагностики типа структурной патологии, построенные при помощи дискриминантного анализа, при этом программа отображает на экран три ответа в табличном и графическом видах к какой из групп структурной патологии можно отнести пациента: без патологии КВО, травма КВО, дисплазия КВО, травма КВО на фоне синдрома соединительнотканной дисплазии (ССтД), травма КВО на фоне аномалии КВО и ССтД, а также числовые значения специфичности решающих правил ответов, и если все три варианта ответов совпадают, диагностируют указанный тип структурной патологии КВО, при несовпадении хотя бы одного из ответов сравнивают значения специфичности и тип структурной патологии КВО пациента определяют по наибольшему значению.

Диагностические критерии в виде гена TLR4 или гена ТР53 применяются при диагностике онкологических заболеваний (Патент РФ № 2580222; 2800534).

При выявлении предрасположенности к развитию метаболического синдрома в виде ожирения у школьников 7-10 лет используют диагностический критерий - ген ТР53 Pro72Arg (rs1042522) (Патент РФ № 2779085); при оценке влияния нитрозаминов на апоптоз у детей, проживающих в неблагоприятных условиях среды обитания, также используют диагностический критерий - ген ТР53 Pro72Arg (rs1042522) (Патент РФ № 2626516).

При реализации способа диагностики ранних проявлений респираторного аллергоза у детей в условиях избыточной контаминации алюминием (Патент РФ № 2651038), а также при установлении нарушений у детей иммунологической реактивности в условиях избыточной экспозиции стронцием (Патент РФ № 2693471) используют ген TLR4 A8595G (rs1927911).

Однако при этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в создании информативного и доказательного способа диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей, ассоциированной с контаминацией никелем.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей-школьников 8-11 лет, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, согласно которому определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют содержание никеля в крови, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина Е (IgE) к никелю, иммуноглобулина G общего (IgG), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и ионизированного кальция, а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм толл-подобного рецептора гена TLR4 и транскрипционного фактора гена ТР53 при помощи метода полимеразной цепной реакции путем исследования генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522), и при одновременном выполнении следующих условий: при превышении содержания никеля в крови ребенка в 1,2 и более раз по сравнению с нормой, равной 0,0023 мг/дм3 , при превышении не менее, чем в 1,3 раза уровня специфического IgE к никелю по сравнению с нормой, равной менее 0,1 МЕ/мл, при превышении не менее, чем в 1,1 раза уровня IgG общего по сравнению с верхней границей нормы, равной 13 мг/л, при превышении уровня ИЛ-6 по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 6 пг/мл, а также при превышении уровня ионизированного кальция по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 1,10 ммоль/дм3 , а также при наличии дикой гомозиготы AA генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) и вариантной гомозиготы GG генотипа гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) диагностируют у ребенка проявление спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией биосред никелем.

В качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Основным симптомом спинальной нестабильности является боль или дискомфорт в шее. В шейном отделе позвоночника у больных с нестабильностью в атлантоокципитальном сочленении ирритативная боль может носить периодический характер и усиливаться после физической нагрузки. Боль является причиной хронического рефлекторного напряжения шейных мышц. У детей нестабильность является причиной развития острой кривошеи. В начале заболевания имеется повышенный тонус паравертебральных мышц, который приводит к их переутомлению. В мышцах происходят нарушения микроциркуляции, развитие гипотрофии и снижение тонуса. Появляется чувство неуверенности при движениях в шее. Нарушается способность выдерживать обычную нагрузку. Возникает необходимость в средствах дополнительной иммобилизации шеи, вплоть до поддержки головы руками.

Нестабильность на нижнешейном уровне связана с врожденной неполноценностью межпозвонкового диска. Проявлением дисплазии является эксцентричное положение пульпозного ядра. При дисплазии изменение структуры коллагеновых волокон приводит к нарушению процесса гидратации ткани пульпозного ядра, что вызывает нарушение механических свойств межпозвонкового диска, снижение жесткости фиксации позвонков, нарушение соотношения между пульпозным ядром и фиброзным кольцом. Эти изменения приводят к развитию нестабильности позвоночника на уровне от С1 до С7.

Диспластические изменения могут поражать любой из элементов позвоночника. Врожденное недоразвитие сумочно-связочного аппарата формирует синдром заднего опорного комплекса, описанный А.В.Демченко у подростков. Диспластические изменения приводят к раннему развитию дегенеративного процесса в молодом возрасте с нарушением стабильности позвоночника.

На ранних стадиях развития патологии тонус околопозвоночной мускулатуры повышен. Это со временем приводит к перенапряжению и растяжению мышц. Нарушается питание мышечной ткани, развивается гипотонус и гипотрофия мышц. Движения головой вызывают дискомфорт, становится трудно удерживать голову прямо, совершать повороты, наклоны. При выраженной нестабильности слабость мышц выражена настолько, что приходится поддерживать голову рукой.

Было установлено, что заболевание «спинальная нестабильность» чаще характерно для территорий, в объектах окружающей среды которых присутствует токсикант – никель, в концентрации, превышающей допустимую норму.

Вред никеля состоит не только в том, что его количество в значительной степени превышает необходимые и очень малые дозировки. Его токсичность связана с попаданием в организм, прежде всего, его свободных ионов, имеющих положительную валентность (Ni ²⁺). Они в более высокой степени связываются тканями организма, и проявляют более высокую токсичность и канцерогенность, чем его молекулярные и комплексные соединения.

Тяжелой является общая аллергическая реакция человеческого организма на поступление в него никеля, причём металл попадает внутрь через органы дыхания, при введении различных никельсодержащих металлических имплантатов, и общий генерализованный дерматит можно расценивать как системную реакцию организма.

При длительном наблюдении рабочих – никелировщиков, отмечена экзема. По данным статистики, более 10% всех профессиональных поражений кожных покровов составляют никелевые дерматиты, а у сотрудников электролизных цехов частота никелевых поражений кожи доходит до 15%. Однако, встречаются и более редкие случаи никелевого дерматита. Например, у кассиров банков, которые по долгу службы часто считали монеты, изготовленные из сплавов этого металла, возникали симптомы контактного дерматита на пальцах.

Избыточное содержание в биосредах никеля приводит к реализации его конкурентных взаимоотношений с кальцием, в том числе содержащегося в костной ткани, что ведет к усугублению нарушений целостности костной ткани и повышение в крови ионизированного кальция.

Ген TLR4 A8595G (rs1927911) относится к классу клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов и активируют клеточный иммунный ответ. TLR4 отвечает за развитие реакций врожденного иммунитета, характеризующихся атопической (аллергической, аутоиммунной) направленностью.

TLR4 выполняют в организме важную роль, которая заключается в развитии воспалительных реакций (активации врожденного иммунитета) в ответ на попадание в организм самых различных патогенов (простейших, грибов, бактерий, вирусов). Более того, по современным представлениям распознавание патогенов посредством TLR4 является ключевым моментом в формировании второй линии защиты - адаптивного иммунитета. Также показано, что TLR4 принимают участие в нормальном функционировании кишечника, они вовлечены в развитие аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка), артритов, атеросклероза и др. В последнее время получены данные, которые показывают, что TLR4 способны активировать противоопухолевый иммунитет или, наоборот, стимулировать опухолевую прогрессию.

Ген ТР53 - наиболее часто мутирующий ген, связанный с опухолевым ростом у человека. В норме ТР53 участвует в регуляции клеточного цикла, запускает апоптоз; мутация ТР53 регистрируется практически во всех видах опухолей. [Bunz F., Hwang P.M., Torrance С.Et al. Disruption of p53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents // J. Clin. Invest-1999. - 104. - Р. 263-9].

Из известных в настоящее время полиморфизмов гена ТР53 функционально значимым считается экзонный полиморфизм Arg72Pro (rs 1042522). Данный полиморфизм обусловлен трансверсией гуанина на цитозин в 72-м кодоне 4-го экзона, что ведет к трансляции функционально и биохимически измененного белка р53 [Мухаммадиева Г.Ф.. Бакиров А.Б., Каримова Л.К., Валеева Э.Т. Анализ ассоциаций полиморфных локусов гена-супрессора опухолевого роста ТР53 со злокачественными новообразованиями у работающих в условиях производства стекловолокна / Гигиена и Санитария. №4. 2014. - С. 59-61].

Белок р53 - один из важнейших регуляторов клеточного цикла. Белок p53 специфически связывается с ДНК и активирует экспрессию генов. При неблагоприятной информации о состоянии генома p53 блокирует клеточный цикл до тех пор, пока нарушения не будут устранены. При серьезных нарушениях ДНК белок p53 инициирует апоптоз. Мутация p53 – отсутствие сдерживающего фактора, при которой поврежденные клетки бесконтрольно размножаются.

Как было установлено, формирование спинальной нестабильности у детей сопровождается избыточными концентрациями в крови никеля Ni(II), вытесняющего кальций (при содержании никеля в крови более 0,0023 мг/дм³), а также Ni(II) стимулирует врожденный иммунитет посредством прямого связывания с человеческим Toll-подобным рецептором 4 (hTLR4).

При его избытке в крови в случае A-аллеля гена толл-подобного рецептора 4 (TLR4) rs1927911 формируется воспаление (с развитием дисплазии или дегенерации костной ткани), активность которого не отменяется контроллером - транскрипционным фактором p53 (ген ТР53 rs1042522), в условиях G-аллеля гена ТР53 (мутация Pro72Arg C/G) ввиду его низкой экспрессии.

А клетки межпозвоночного диска сами экспрессируют ген TLR4 и реагируют на активацию гена TLR4 путем усиления скоординированного набора воспалительных цитокинов, которые в свою очередь стимулируют выработку ИЛ-6.

Проведены исследования по выявлению мутации (полиморфизма) генов: толл-подобного рецептора 4 (TLR4) rs1927911, выявление мутации A8595G; транскрипционного белка p53, ген ТР53 rs1042522, выявление мутации Pro72Arg C/G.

Генетический профиль детей со спинальной нестабильностью (избыточная контаминация никелем - 0,0069±0,0009мг/л, при этом контрольная группа – дети без спинальной нестабильности, отличались умеренной контаминацией никелем - 0,0031±0,0008мг/л, при норме 0,00202-0,0023мг/л), отличается повышенной частотой A-аллеля гена толл-подобного рецептора 4 (TLR4) rs1927911, A8595G (мультипликативная модель: OR (отношение шансов)=2,22; 95%CI (доверительный интервал) =1,03-4,79, p (вероятность)=0,039); и соответствующего AA генотипа гена (p=0,0046; OR=3,69; 95%CI=1,37-9,94; уровень относительного риска (RR) превышает допустимый (т.е. более 1,0) - RR=1,23; 95%CI=1,00-1,51); а также повышенной частотой G-аллеля гена транскрипционного фактора ТР53 rs1042522 С/G (мультипликативная модель: OR=4,15; 95%CI=2,03-8,49, p=0,0001) и соответствующего GG генотипа гена (p=0,0001; OR=4,19; 95%CI=1,47-11,94; RR=1,16; 95%CI=1,03-1,79), что соотносится с выявленной повышенной экспрессией IgE к никелю 0,31±0,04МЕ/мл (норма менее 0,1; контроль 0,082±0,033мг/л) и избыточным уровнем IgG общего, ИЛ-6 и ионизированного кальция.

В качестве критериев реализации предрасположенности к развитию деформирующей спинальной нестабильности (М53.2 по МКБ-10) у детей в условиях контаминации биосред никелем рекомендуется использовать генотипы генов-кандидатов:

генотип АА толл-подобного рецептора 4 (TLR4) rs1927911, A8595G (дикая гомозигота),

генотип GG гена транскрипционного фактора p53 rs1042522, Pro72Arg C/G (вариантная гомозигота).

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия (при определении наличия гена) и крови, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта – никеля, именно в крови, обусловлено тем, что кровь является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Именно благодаря расширению информационных показателей и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния никеля на риск проявления спинальной нестабильности у детей, ассоциированной с контаминацией биосред никелем.

Клиническая значимость предлагаемых диагностических показателей доказана методом корреляционно-регрессионного анализа, а также доказана дополнительная информационная связь изменений указанных совокупных критериев с превышением в крови над нормой содержания никеля, что делает предлагаемый способ точным и достоверным.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности всех операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:

1. Проводят отбор группы детей-школьников 8-11 лет одной этнической популяции, проживающих на неблагополучной по условиям проживания территории с повышенным содержанием в атмосфере воздуха никеля. Затем проводят отбор пробы крови для определения содержания никеля, а также уровня IgЕ к никелю, IgG общего, ИЛ-6 и ионизированного кальция. Указанные показатели определяют:

- содержание никеля - методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на масс-спектрометре Agilent 7500сх («Agilent Technologies Inc.», США) в соответствии c методическими указаниями МУК 4.1.3230-14;

- уровень IgЕ к никелю и IgG общего - методом иммуноферментного анализа. В качестве физиологического диапазона содержания IgЕ к никелю и IgG общего был принят диапазон, равный менее 0,1 МЕ/мл и 10-13 мг/л соответственно (Н.Тиц,2003).

- уровень ИЛ-6 – методом иммуноферментного анализа. В качестве нормы был принят диапазон, равный 0-6 пг/мл (Н.Тиц,2003).

- уровень ионизированного кальция – метод - ион-селективного электрода. В качестве нормы был принят диапазон, равный 1,0-1,10 ммоль/дм³ (Н.Тиц, 2003).

2. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5 %-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт : ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов TLR4 A8595G (rs1927911) и ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522).

Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TLR4 A8595G (rs1927911) и ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) (использованы наборы реагентов для определения полиморфизма генов TLR4 A8595G (rs1927911) и ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) (ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап – активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95 °C; 2 этап – установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап – рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95 °С), отжиг праймеров (20 с при 60 °С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72 °С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC – для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM – для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние генов TLR4 и ТР53 в исследуемом участке ДНК TLR4 A8595G (rs1927911) и в исследуемом участке ДНК гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное – в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное – в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливаются следующие генотипы:

- для гена TLR4 A8595G (rs1927911): АА – дикий гомозиготный, АG - гетерозиготный, GG - вариантный гомозиготный генотип;

- для гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522): GG - вариантный гомозиготный, СG - гетерозиготный, СС - дикий гомозиготный.

3. И при одновременном выполнении следующих условий: при превышении содержания никеля в крови ребенка в 1,2 и более раз по сравнению с нормой, равной 0,0020-0,0023 мг/дм³, при превышении уровня специфического IgE к никелю по сравнению с нормой, равной менее 0,1 МЕ/мл, не менее, чем в 1,3 раза, при превышении уровня IgG общего по сравнению с верхней границей нормы, равной 13 мг/л, не менее, чем в 1,1 раза, при превышении уровня ИЛ-6 по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 6 пг/мл, а также при превышении уровня ионизированного кальция по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 1,10 ммоль/дм³, а также при наличии дикой гомозиготы АА генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) и при наличии вариантной гомозиготы GG генотипа гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522), диагностируют у ребенка проявление спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией биосред никелем.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа были сформированы две группы детей: группа наблюдения – 45 детей 8-11 лет, страдающие симптомами спинальной нестабильности; группа сравнения – 39 детей 8-12 лет, без заболевания спинальной нестабильности.

Заболевание «спинальная нестабильность» у детей группы наблюдения определяли по результатам рентгенологического исследования.

Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

У детей отбирали пробу крови для химико-аналитического анализа на содержание никеля, ИЛ-6, ионизированного Са, IgЕ к никелю и IgG общего; буккальный эпителий для генотипирования полиморфизма гена TLR4 A8595G (rs1927911) и для генотипирования полиморфизма гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) на амплификаторе CFX96 методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени.

В результате указанных исследований были получены следующие сравнительные данные, изложенные в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 приведены данные по содержанию никеля в крови детей в различных группах.

Таблица 1

Группы Группа наблюдения (n=45) Группа сравнения
(n=39) р Содержание никеля в крови, мг/ дм³ 0,0069±0,0009 0,0031±0,0008 <0,05

n – количество детей; p – достоверность.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что детей группы наблюдения значимо повышено содержание никеля в крови более, чем в 2 раза относительно группы сравнения (р<0,05).

В таблице 2 приведены данные по установлению критериев диагностики нарушения спинальной нестабильности у детей-школьников 8-11 лет в условиях влияния никеля предлагаемым способом у обследованных групп детей.

Таблица 2

№ Пациент TP53
rs1042522
С/G TLR4
rs1927911
A/G Никель в крови,
мг/ дм³ IgE к никелю, МЕ/мл Ионизированный Сa, ммоль/дм³ ИЛ-6, пг/мл IgG общий, мг/л Дети со спинальной нестабильностью (группа наблюдения) 1 Пациент, 10 лет GG AA 0,0027 0,31 1,25 8,11 16,1 2 Пациент, 9лет GG AA 0,0030 0,28 1,29 6,61 15,5 3 Пациент, 10 лет GG AA 0,0029 0,18 1,27 6,77 15,0 4 Пациент, 8 лет GG AA 0,0041 0,35 1,22 7,24 14,2 5 Пациент, 8 лет GG AA 0,0036 0,13 1,21 6,88 13,9 6 Пациент, 11 лет GG АA 0,0028 0,16 1,25 7,93 16,9 Норма 0,0020-0,0023 <0,1 1,0-1,10 0-6 10-13 Дети без спинальной нестабильности (группа сравнения) 7 Пациент, 11 лет СG АG 0,0023 0,12 1,05 3,67 13,0 8 Пациент, 8 лет СC GG 0,0020 0,01 1,00 2,15 11,6 9 Пациент, 12 лет CC АG 0,0021 0,09 1,10 4,11 11,9 10 Пациент, 10 лет GG GG 0,0021 0,04 1,09 1,99 12,1 11 Пациент, 10 лет СС GG 0,0021 0,02 1,05 2,54 10,1 12 Пациент, 8 лет СС АG 0,0020 0,04 1,08 4,77 12,0 13 Пациент, 10 лет СG АА 0,0022 0,11 1,01 5,12 12,4 Норма СG GG 0,0020-0,0023 <0,1 1,0-1,10 0-6 10-13

Примечание: 1. АА – дикий гомозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911); AG - гетерозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911); GG - вариантный гомозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911);

2. GG - вариантный гомозиготный генотип гена TP53 rs1042522; СG - гетерозиготный генотип гена TP53 (rs1042522); СС – дикий генотип гена TP53 rs1042522; );

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что у пациентов, которым поставлен диагноз «спинальная нестабильность» (примеры 1-6), выявлены одновременно следующие обстоятельства: превышение содержания никеля в крови ребенка в 1,2 – 1,8 раза по сравнению с нормой, равной 0,0020-0,0023 мг/ дм³; превышение в 1,1-1,4 раза уровня ИЛ-6 по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 6 пг/мл, превышение в 1,3-3,5 раза уровня специфического IgE к никелю по сравнению с нормой, равной менее 0,1 МЕ/мл, превышение уровня IgG общего в 1,1 – 1,3 раза по сравнению с верхней границей нормы, равной 13 мг/л, а также наличие комбинации генотипа дикой гомозиготы АА гена TLR4 (A8595G) (rs1927911) и генотипа вариантной гомозиготы GG гена TP53 (rs1042522). Доказательством тому, что у пациентов действительно имеется заболевание «спинальная нестабильность», дополнительно служат показатели по ионизированному кальцию, который был выше верхней границы нормы более, чем на 9,1% (9,1-11,7%) у всех пациентов.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам из группы пациентов с повышенным содержанием никеля в крови и наличием полиморфности гена TLR4 (A8595G) (rs1927911) в виде генотипа АА и гена TP53 (rs1042522) в виде генотипа GG.

Пример 1. Пациент, 9 лет, русский, диагноз: Спинальная нестабильность (М53.2). Определяется уровень никеля в крови в 1,3 раза выше верхней границы референтного уровня – 0,0023 мг/дм³. Определяется наличие дикого гомозиготного генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) - АА и вариантного гомозиготного генотипа гена TP53 (rs1042522) - GG. Значение содержания IgЕ к никелю: 0,28 МЕ/мл, т.е. в 2,8 раза выше верхней границы нормы. Содержание цитокина ИЛ-6 – 6,61 пг/см3, т.е. выше диапазона нормы (0-6,0 пг/см3) в 1,11 раза. Содержание IgG общего в 1,2 раза превышает верхнюю границу нормы, равную 13 мг/л. Уровень ионизированного кальция 1,29 ммоль/дм³ – в 1,2 раза выше верхней границы нормы (1,10 ммоль/дм³). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgЕ к никелю, содержания IgG общего, уровня ИЛ-6, ионизированного кальция на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем на 20% содержания никеля в крови, а также наличие дикой гомозиготы АА гена TLR4 A8595G (rs1927911) и вариантного гомозиготного полиморфизма GG гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522), кодирующих белки ответственные за аутоиммунитет и апоптоз, что указывает на реализацию нарушений иммунологической реактивности у данного пациента, формируя ассоциированное с действием никеля состояние спинальной нестабильности (М53.2).

Пример 2. Пациент, 8 лет, русский, здоров. Уровень никеля в крови 0,0020 мг/дм³соответствует референтному диапазону – 0,0020-0,0023 мг/дм³. Определяется наличие вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911) и дикого гомозиготного генотипа CC гена TP53 (rs1042522). Значение содержания IgЕ к никелю: 0,01 МЕ/мл, т.е. в 10,0 раз ниже верхней границы нормы (отсутствие сенсибилизации к никелю). Содержание цитокина ИЛ-6 – 2,15 пг/см3, т.е. в диапазоне нормы (0-6,0 пг/см3). Содержание IgG общего (11,6 г/л) соответствует границам нормы (10-13 мг/л). Уровень ионизированного кальция 1,0 ммоль/дм³ – соответствует диапазону нормы (1,0-1,10 ммоль/дм³). Таким образом, отсутствие полиморфизма гена TP53 (rs1042522) (наличие его физиологического СС генотипа) и наличие GG генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911), блокирующего реализацию атопии и аутоиммунитета, на фоне физиологического содержания в крови никеля, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgЕ к никелю, избыточного уровня IgG общего, ИЛ-6 и ионизированного кальция, то есть отсутствии негативной генетической программы и соответствие референтной концентрации никеля в крови не приводит к развитию аутоиммунных процессов и нарушений апоптоза, не меняет состояние иммунологической реактивности и не формирует у данного пациента состояние Спинальной нестабильности (М53.2).

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием заявляемых диагностических критериев по содержанию никеля в крови и вариантов дикого и вариантного гомозиготного генотипов генов TLR4 A8595G (rs1927911) и гена TP53 (rs1042522) соответственно, обеспечивается его назначение.

Предлагаемый способ позволит установить наличие ранних проявлений спинальной нестабильности у детей-школьников 8-11 лет, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, что в свою очередь позволит оптимизировать мероприятия по коррекции данного состояния у детей.

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактической медицине, экологии человека и педиатрии, и может быть использовано для диагностики проявлений спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, у детей-школьников 8-11 лет. При превышении содержания никеля в крови ребенка в 1,2 и более раз по сравнению с нормой, равной 0,0023 мг/дм³, при превышении не менее, чем в 1,3 раза уровня специфического IgE к никелю по сравнению с нормой, равной менее 0,1 МЕ/мл, при превышении не менее, чем в 1,1 раза уровня IgG общего по сравнению с верхней границей нормы, равной 13 мг/л, при превышении уровня ИЛ-6 по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 6 пг/мл, при превышении уровня ионизированного кальция по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 1,10 ммоль/дм³, а также при наличии генотипа AA гена TLR4 A8595G (rs1927911) и генотипа GG гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) диагностируют проявление спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией биосред никелем. Способ обеспечивает повышение информативности и доказательности диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей, ассоциированной с контаминацией никелем за счет одновременного определения токсикологических, лабораторных и генетических показателей. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики проявлений спинальной нестабильности у детей-школьников 8-11 лет, ассоциированной с контаминацией биосред никелем, согласно которому определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют содержание никеля в крови, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина Е (IgE) к никелю, иммуноглобулина G общего (IgG), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и ионизированного кальция, а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм толл-подобного рецептора гена TLR4 и транскрипционного фактора гена ТР53 при помощи метода полимеразной цепной реакции путем исследования генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522), и при одновременном выполнении следующих условий: при превышении содержания никеля в крови ребенка в 1,2 и более раз по сравнению с нормой, равной 0,0023 мг/дм³, при превышении не менее, чем в 1,3 раза уровня специфического IgE к никелю по сравнению с нормой, равной менее 0,1 МЕ/мл, при превышении не менее, чем в 1,1 раза уровня IgG общего по сравнению с верхней границей нормы, равной 13 мг/л, при превышении уровня ИЛ-6 по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 6 пг/мл, а также при превышении уровня ионизированного кальция по сравнению с верхней границей физиологической нормы, равной 1,10 ммоль/дм³, а также при наличии дикой гомозиготы AA генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) и вариантной гомозиготы GG генотипа гена ТР53 Pro72Arg С/G (rs1042522) диагностируют у ребенка проявление спинальной нестабильности, ассоциированной с контаминацией биосред никелем.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.