МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА Suresh (CEM) ДЛЯ СОВМЕСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЦИСТ ПРОСТЕЙШИХ Blastocystis hominis И БАКТЕРИЙ Lactobacillus spp Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области экспериментальной микробиологии и паразитологии, предназначено для обеспечения совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp и может быть использовано при изучении механизмов резервации представителей кишечного микробиоценоза внутри инцистированных простейших, способствовать оптимизации микробиологического мониторинга и терапии дисбиотических процессов, бактериемий, эндогенных инфекций.

Задачей изобретения является создание модифицированной питательной среды, оптимальной для совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp, обеспечивающей получение технического результата, состоящего в успешном инцистировании простейших Blastocystis hominis с одновременным устойчивым культивированием бактерий рода Lactobacillus для последующей оценки их ассоциативного взаимодействия.

Литературные данные и результаты собственных исследований показали необходимость расширения границ понимания медико-биологической роли простейших, в частности Blastocystis hominis. Будучи сочленами одного микросимбиоценоза, они не только создают благоприятные условия для развития патологических процессов, но и выступают в роли особого резервуара, обеспечивающего длительное выживание бактерий внутри своих цист, в условии действия неблагоприятных факторов, например, при антибиотикотерапии.

Результаты изучения такого взаимодействия могут прояснить механизмы передачи инфекций, развитие рецидивных состояний патологий микробного генеза после проведения активной химиотерапии (Т.П. Егорова. 2021. Протозойно-бактериальные ассоциации кишечника у макаков резусов // Ветеринария. - 2021. - №1. - С. 33-35). Отечественными авторами показано, что существование бактерий внутри цист простейших также отражается и на усилении их вирулентности (В.И. Пушкарева. 2006. Паразитизм в простейших как стратегия существования патогенных бактерий в почвах и водоемах // Успехи современной биологии. - 2006. - Т. 126. - №4. - С. 323-333).

Изучение аспектов устойчивости к антибиотикам, токсинообразования, секреции факторов адгезии и антифагацитарной активности у ранее считавшихся непатогенных видов, приобрело особую актуальность в отношении представителей рода Lactobacillus. Это подтверждается увеличением количества работ, показывающих участие лактобацилл в возникновении таких заболеваний человека, как кариес, ревматические поражения сосудов, септицемия и инфекционный эндокардит (М.М. Соловьев, О.П. Большаков, Д.В. Галецкий. 2016 // «Гнойно-воспалительные заболевания головы и шеи», 2016).

Неизученными остаются вопросы взаимодействия цист простейших Blastocystis hominis, как часто регистрируемых участников микробного сообщества, и бактерий Lactobacillus spp, решение которых позволит дополнить представления о механизмах внутриклеточного выживания бактерий, в том числе в биотопах человека и животных.

Задачей изобретения является создание модифицированной питательной среды на основе известной среды Suresh (СЕМ) для изучения взаимодействия цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp при их совместном культивировании.

В настоящее время, для изучения биологических свойств бластоцист многими отечественными авторами активно используется среда Suresh (СЕМ).

Собственные исследования показали, что рост простейших на данной среде регистрируется через 12-24 часа после посева (Н.В. Бугеро, Н.А. Ильина, Ю.Ю. Красноперова, А.Л. Малых, И.С. Немова, А.С. Нестеров, О.Е. Фалова. 2009. Простейшие Blastocystis hominis и их воздействие на макроорганизм. СПб.: «Наука», 2009. 148 с.).

Кроме того, на данной среде длительно сохраняется жизнеспособность выросших бластоцист, а клетки достигают размеров 24,8±1,3 мкм.

Инцистирование простейших отмечается на 3-ий день культивирования, сохраняется в течение 4-х недель от момента посева, что согласуется с данными автора.

В состав среды Suresh (СЕМ), согласно автору, входят 100 мл среды Suresh (ЕМ), с петлей бактерий Proteus vulgaris (K. Suresh, G.C. Ng, N.P. Ramachandran, L.C. Ho, E.H. Yap, M.Singh. 1993. In vitro encystment and experimental infections of Blastocystis hominis II Parasitology Research. - 1993. -V. 79.-P. 456-460).

Среда для инцистирования Suresh (EM), согласно автору, содержит в г/л: 4 г NaCl, 2 г дрожжевого экстракта, 1,6 г КН₂РО₄, 3,2 г К2НРО₄. Автор доводит среду до значения рН 7,0 перед автоклавированием.

Перед использованием среды Suresh (СЕМ) и Suresh (ЕМ) разбавлялась половиной объема стерилизованной лошадиной сыворотки (К. Suresh, G.C. Ng, N.P. Ramachandran, L.C. Ho, E.H. Yap, M.Singh. 1993. In vitro encystment and experimental infections of Blastocystis hominis II Parasitology Research. -1993.-V. 79. - P. 456-460).

Попытки культивировать лактобактерии на указанной среде не привели к положительному результату ни в одном случае. Причиной, препятствующей достижению цели, являются сложные питательные потребности лактобактерий, которым не удовлетворяет среда Suresh (СЕМ), а именно, отсутствие ферментативных гидролизатов белков - мяса и казеина, сложных органических форм азота, витаминов.

Одновременно, с проведением сокультивирования указанных микроорганизмов на среде Suresh (СЕМ), были предприняты попытки достичь технического результата при использовании среды МРС-4, которая является оптимальной для инкубации лактобактерий.

Состав среды МРС-4 по данным производителя в пересчете г/л (К.В. Беспоместных. 2014. Изучение влияния состава питательной среды на изменение биохимических и морфологических свойств штаммов лактобацилл // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №6): - мясной экстракт сухой - 8,0 г, пептон ферментативный - 10,0 г, дрожжевой экстракт - 3,0 г, гидролизат казеина ферментативный - 17,5 г, печеночная вода - 100,0 мл, твин 80 - 1,0 мл, глюкоза - 2,5 г L-цистеин - 0,2 г, калия фосфат двузамещенный - 2,0 г, марганца сульфат - 0,05 г, магния сульфат -0,2 г, натрия ацетат - 5,0 г, аммония цитрат - 2,0 г, агар микробиологический - 15,0 г.

Проведенные исследования по совместной инкубации простейших В.hominis и Lactobacillus spp на среде МРС-4 не выявили инцистирования простейших на протяжении всего периода исследования (4 недели). Это можно объяснить разнообразием и высокой концентрацией питательного субстрата в среде, при которой процесс инцистирования не инициировался.

Для достижения поставленной задачи и получения технического результата среду Suresh (СЕМ) необходимо дополнительно обогатить ферментативными гидролизатами белков - мяса и казеина, сложными органическими формами азота, а также витаминами, необходимыми для нормального роста лактобактерий. Для этого необходимо подобрать оптимальные концентрации компонентов, удовлетворяющих заявленной цели.

Состав предлагаемой модифицированной питательной среды Suresh (СЕМ), для совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp, содержит в г/л дистиллированной воды: 4 г NaCl, 3,5 г дрожжевого экстракта, 1,6 г KH₂PO₄, 4,5 г K₂HPO₄, 5,0 г пептона ферментативного, 10,0 г гидролизата казеина ферментативного, 1,0 г твина-80, 0,5 г глюкозы, 0,2 г L-цистеина, 0,02 г сульфата марганца, 0,05 г сульфата магния, 1,5 г ацетата натрия, 0,5 г цитрата аммония.

Приготовление заявляемой модифицированной питательной среды Suresh (СЕМ) для совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp осуществляют следующим образом: в 1 литр дистиллированной воды последовательно вносят 4 г NaCl, 3,5 г дрожжевого экстракта, 1,6 г КН₂РО₄, 4,5 г К₂НРО₄, 5,0 г пептона ферментативного, 10,0 г гидролизата казеина ферментативного, 1,0 г твина-80, 0,5 г глюкозы, 0,2 г L-цистеина, 0,02 г сульфата марганца, 0,05 г сульфата магния, 1,5 г ацетата натрия, 0,5 г цитрата аммония. После этого, полученную смесь тщательно перемешивают, трехкратно кипятят на водяной бане по 1-2 минуте при постоянном помешивании.

Приготовленную смесь (питательную среду) охлаждают до температуры 37°С, после чего разливают в стерильные пробирки и закрывают стерильными пробками. Готовая к использованию питательная среда непрозрачная, бледно-коричневого цвета, рН среды 6,8±0,2. Анаэробные условия достигают путем наслаивания на среду 1-2 мл стерильного масла.

Для оценки эффективности предлагаемого технического результата был проведен экспериментальный посев бактерий Lactobacillus spp и простейших Blastocystis hominis на модифицированной питательной среде.

Штаммы бактерий и простейших изолировали из фекалий 358 лиц, проходящих обследование на дисбактериоз, классическими бактериологическими и паразитологическими методами. Исходная концентрация при посеве бактерий Lactobacillus spp составляла 10⁵ КОЕ/мл, вегетативных форм простейших Blastocystis hominis - 10² КОЕ/мл. Культуры микроорганизмов вносили в толщу среды бактериальной петлей. Инкубировали посев при температуре 37°С в течение 24 ч. Наблюдение проводили в течение 21 дня.

Эксперимент показал, что данный состав среды обеспечивает одновременное культивирование бактерий рода Lactobacillus и инцистирование простейших на 3-4 сутки от момента посева и стабильную динамику при совместном культивирования в течение всего срока эксперимента.

С целью создания условий, неблагоприятных для существования лактобактерий, адекватных антибактериальной терапии, во все посевы добавляли антибактериальный препарат цефазолин в концентрации 10,4 мкг/мл. Через 18 часов воздействия антибиотика, лактобактерий в посевах бактериологически не выявлялись. Количество бластоцист не изменялось.

При переносе образцов с цистами на модифицированную среду Suresh СЕМ, не содержащую цефазолин, через 8 часов был зарегистрирован рост бактерий рода Lactobacillus в количестве 0,8×10²±0,6 КОЕ/мл.

Сущность изобретения поясняется рисунками, на которых изображены:

фиг. 1 - результаты использования питательных сред с целью изучения взаимодействия цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp при совместном культивировании.

фиг. 2 - циста простейших бластоцист с находящимися внутри лактобактериями.

Полученные результаты демонстрируют взаимодействие Lactobacillus spp с цистами простейших Blastocystis hominis, способствующее выживанию бактерий при действии стрессовых факторов, а именно антибактериальных препаратов.

Состав среды достаточно прост и не требует специального оборудования и обучения персонала. Позволяет получить цисты простейших и длительно поддерживать рост бактерий.

Изобретение относится к области экспериментальной микробиологии и паразитологии, предназначено для обеспечения совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp. Может быть использовано при изучении механизмов резервации представителей кишечного микробиоценоза внутри инцистированных простейших, способствуя оптимизации микробиологического мониторинга и терапии дисбиотических процессов, бактериемий, эндогенных инфекций. Модифицированная питательная среда Suresh (СЕМ) для совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp содержит на литр дистиллированной воды: 4 г NaCl; 3,5 г дрожжевого экстракта; 1,6 г KH₂PO₄; 4,5 г K₂HPO₄; 5,0 г пептона ферментативного; 10,0 г гидролизата казеина ферментативного; 1,0 г твина-80; 0,5 г глюкозы; 0,2 г L-цистеина; 0,02 г сульфата марганца; 0,05 г сульфата магния; 1,5 г ацетата натрия; 0,5 г цитрата аммония. Питательная среда обеспечивает успешное инцистирование простейших Blastocystis hominis с одновременным устойчивым культивированием бактерий рода Lactobacillus для последующей оценки их ассоциативного взаимодействия. 2 ил.

Модифицированная питательная среда Suresh (СЕМ) для совместного культивирования цист простейших Blastocystis hominis и бактерий Lactobacillus spp, отличающаяся тем, что содержит в г/л дистиллированной воды: 4 г NaCl, 3,5 г дрожжевого экстракта, 1,6 г KH₂PO₄, 4,5 г K₂HPO₄, 5,0 г пептона ферментативного, 10,0 г гидролизата казеина ферментативного, 1,0 г твина-80, 0,5 г глюкозы, 0,2 г L-цистеина, 0,02 г сульфата марганца, 0,05 г сульфата магния, 1,5 г ацетата натрия, 0,5 г цитрата аммония.