Способ определения показателя антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp. Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в практической и научно-исследовательской работе для диагностики и изучения условно-патогенных микроорганизмов рода Desulfovibrio, а именно для изучения чувствительности сульфатредуцирующих бактерий к противомикробным препаратам.

Бактерии рода Desulfovibrio - это анаэробные грамотрицательные спиральные или изогнутые подвижные палочки, продуцирующие в процессе своей жизнедеятельности сероводород (H₂S) и десульфовиридин, который при УФ-излучении флуоресцирует красным при щелочном рН и зеленым при кислотном рН [Machaca М, Bodean ML, Montana S, Garcia SD, Stecher D, Vay CA, Almuzara MN. Descripcion de un caso de sepsis abdominal роr Desulfovibrio desulfuricans [Description of a case of abdominal sepsis due to Desulfovibrio desulfuricans]. Rev Argent Microbiol. 2022 Jun 7:S0325-7541(22)00028-1. Spanish, doi: 10.1016/j.ram.2022.05.002. Epub ahead of print. PMID: 35688718; HagiyaH, KimuraK, Nishi I, Yamamoto N, Yoshida H, Akeda Y, Tomono K. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia: A case report and literature review. Anaerobe. 2018 Feb;49:112-115. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.12.013. Epub 2018 Jan 4. PMID: 29305996; Goldstein EJ, Citron DM, Peraino VA, Cross SA. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections. J Clin Microbiol. 2003 Jun;41(6):2752-4. doi: 10.1128/JCM.41.6.2752-2754.2003. PMID: 12791922; PMCID: РМС156571]. Бактерии рода Desulfovibrio spp.являются преобладающими представителями сульфатредуцирующих бактерий (СРБ), в том числе в кишечном микробиоценозе человека.

Согласно опубликованным данным, сульфатредуцирующие бактерии колонизируют придонные отложения солоноватых озер, а также желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) млекопитающих, в том числе человека [Marquis TJ, Williams VJ, Banach DB. Septic arthritis caused by Desulfovibrio desulfuricans: A case report and review of the literature. Anaerobe. 2021 Aug;70:102407. doi: 10.1016/j.anaerobe.2021.102407. Epub 2021 Jun 18. PMID: 34153468; Hagiya H, Kimura K, Nishi I, Yamamoto N, Yoshida H, Akeda Y, Tomono K. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia: A case report and literature review. Anaerobe. 2018 Feb;49:112-115. doi: 10.1016/j.anaerobe.2017.12.013. Epub 2018 Jan 4. PMID: 29305996; Carli T, Diker KS, Eyigor A. Sulphate-reducing bacteria in bovine faeces. Lett Appl Microbiol. 1995 Oct;21(4):228-9. doi: 10.1111/j.l472-765x.l995.tb01047.x. PMID: 7576512; Nasreddine R, Argudin MA, Herpol M, Miendje Deyi VY, Dauby N. First case of Desulfovibrio desulfuricans bacteraemiasuccessfully identified using MALDI-TOF MS. New Microbes New Infect. 2019 Oct 23;32:100614. doi: 10.1016/j.nmni.2019.100614. PMID: 31763046; PMCID: РМС6859274].

СРБ присутствуют в организме бессимптомно и могут быть условно-патогенными микроорганизмами, приводящими к интраабдоминальным инфекциям, бактериемии, а также вызывать обострение воспалительных болезней ЖКТ (болезнь Крона, язвенный колит, сидром разраженного кишечника), психических и когнитивных заболеваний (болезнь Паркинсона, расстройство аутистического спектра (РАС) и т.д.). В большинстве случаев при острой инфекции бактерии Desulfovibrio spp. вызывают абсцессы внутренних органов и бактериемию. Согласно модельному эксперименту на грызунах бактерии рода Desulfovibrio могут выступать одним из этиологических факторов развития железодефицитной анемии (ЖДА).

Патогенетические эффекты бактерий рода Desulfovibrio spp. на данный момент мало изучены и оптимальные алгоритмы лечения инфекций, вызванных Desulfovibrio spp., в настоящее время еще не определены. Причинами этого, в том числе, являются сложности в культивировании и идентификации культур, а также медленная скорость роста, которая осложняет рутинное исследование клинического биоматериала в лабораторной диагностике.

Согласно опубликованным данным терапия инфекций Desulfovirbrio spp.связана с применением нескольких классов антибиотиков - пенициллинов, цефалоспоринов, карбапенемов, макролидов и тетрациклинов [Machaca М, Bodean ML, Montana S, Garcia SD, Stecher D, Vay CA, Almuzara MN. Descripcion de un caso de sepsis abdominal por Desulfovibrio desulfuricans (Description of a case of abdominal sepsis due to Desulfovibrio desulfuricans). Rev Argent Microbiol. 2022 Jun 7:S0325-7541(22)00028-1. Spanish, doi: 10.1016/j.ram.2022.05.002. Epub ahead of print. PMID: 35688718; Marquis TJ, Williams VJ, Banach DB. Septic arthritis caused by Desulfovibrio desulfuricans: A case report and review of the literature. Anaerobe. 2021 Aug;70:102407. doi: 10.1016/j.anaerobe.2021.102407. Epub 2021 Jun 18. PMID: 34153468; Goldstein EJ, Citron DM, Peraino VA, Cross SA. Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections. J Clin Microbiol. 2003 Jun;41(6):2752-4. doi: 10.1128/JCM.41.6.2752-2754.2003. PMID: 12791922; PMCID: РМС156571].

Известны исследования чувствительности СРВ бактерий к различным антибиотикам in vitro при помощи метода эпсилометрии (ETEST®, bioMerieux) и метода разбавления агара. В данных исследованиях для культивирования и оценки результатов фенотипической чувствительности культур СРВ использовали агар Brucella в качестве основной среды, считывая результаты через 48 ч, и агар Уилкинса-Чалгрена, считывая результаты через 96 ч. Однако, согласно общепризнанным протоколам по изучению чувствительностимикроорганизмов к противомикробным препаратам (Antibiotic Susceptibility Testing, AST) [CLSI ISO 20776-2:2021. Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems - Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices.] Европейского комитета по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) [2. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.] и американского Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI) [CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 33th ed. CLSI supplement M100. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2023 ISBN 978-1-68440-067-6] данные исследования должны проводится на стандартизированных питательных средах «Агар Мюллера-Хинтона» для непривередливых микроорганизмов и «Агар Мюллера-Хинтона с дефибринированной лошадиной кровью и β-NAD» для привередливых микроорганизмов.

Из уровня техники известен способ определения чувствительности D. desulfuricans к антибиотикам с помощью эпсиометрического метода в агаре с добавлением бруцелл с гемином (5 мкг/мл), витамином K(1 мкг/мл) и 5% раствором крови в инкубационном режиме при 37°С в анаэробной атмосфере в течение 48 часов[Machaca М, Bodean ML, Montana S, Garcia SD, Stecher D, Vay CA, Almuzara MN. Descripcion de un caso de sepsis abdominal por Desulfovibrio desulfuricans [Description of a case of abdominal sepsis due to Desulfovibrio desulfuricans]. Rev Argent Microbiol. 2022 Jun 7:S0325-7541(22)00028-1. Spanish, doi: 10.1016/j.ram.2022.05.002. Epub ahead of print. PMID: 35688718.].

В виду того, что существующие методы определения чувствительности D. desulfuricans к антибиотикам отличает общий недостаток, который выражается в неудовлетворение двум критериям, необходимым для рутинной работы: медленная скорость роста целевой бактерии и, как следствие, низкая эффективность при изучении чувствительности к антибиотикам выделенных изолятов рода Desulfovibrio, необходимой для дальнейшего назначения антибиотикотерапии для пациентов.

Целью заявляемого решения является расширение арсенала способов изучения чувствительности бактерий рода Desulfovibrio spp. к противомикробным препаратам для последующего выбора оптимальной антибиотикотерапии.

Предлагаемый способ решает задачу повышения эффективности, упрощения и снижения трудоемкости при определении антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp.

Поставленная задача достигается за счет оптимизации порядка изучения профиля антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp., в том числе за счет применения в способе питательной среды, обеспечивающей достаточный рост бактерий и их накопление для последующего исследования.

Для этого в способе определения чувствительности изучаемой бактерии к антибактериальным препаратам последовательно проводят следующие действия: получают питательную среду для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp.; готовят суспензию бактерии плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду; готовят разведения растворов антибактериальных препаратов в упомянутой питательной среде; вносят суспензию бактерий в приготовленные разведения; инкубируют их в анаэробных условиях; проводят визуальную оценку чувствительности бактерий рода Desulfovibrio spp. к антибактериальным препаратам.

При этом питательную среду получают следующим способом: смешивают лактат натрия - 3,00 мл/л; гидролизат казеина - 0,01 г/л; кукурузный крахмал - 0,01 г/л; дегидратированный говяжий бульон - 0,15 г/л; витамин В1 - 0,10 г/л; витамин В2 - 0,15 г/л; витамин В6 - 0,30 г/л; витамин В3 - 0,75 г/л; витамин В9 - 0,05 г/л; витамин В5 - 0,35 г/л; витамин В7 - 0,19 г/л; витамин В12 - 0,10 г/л; сульфат магния - 1,00 г/л; глюкозу - 1,00 г/л; натрия хлорид - 0,10 г/л; гидрофосфат калия - 0,50 г/л; аммоний хлористый - 1,00 г/л; пиросульфит натрия - 0,50 г/л. Затем доводят общий объем полученной смеси до 1000 мл путем добавления дистиллированной воды, устанавливают рН 7,3±0,2 посредством добавления 0,1 н. раствора соляной кислоты либо 0,1 н. раствора гидроксида натрия, растворяют компоненты смеси посредством доведения ее до кипения. Затем полученную смесь остужают, смешивают с аскорбиновой кислотой - 0,10 г/л и железом сернокислым закисным - 0,50 г/л в, стерилизуют в стеклянных стерилизованных бутылках автоклавированием под давлением 1,0 атм. при температуре 120,6°С в течение 15-30 мин.

Разведения растворов антибактериальных препаратов готовят в микропробирках с 1 мл упомянутой питательной среды в следующих концентрациях антибиотиков:

- амоксициллина - 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл;

- ципрофлоксацина - 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл;

- метронидазола - 0,75 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл.

Инкубацию проводят в течение 72 часов при 34-36°С, а визуальный учет результатов роста производят по почернению питательной среды, а именно: в микропробирках с почернением разведения антибактериальных препаратов с питательной средой регистрируют результат как резистентный к данной концентрации антибиотика, а вмикропробирках, где почернения не было, результат регистрируют как чувствительный к данной концентрации антибиотика.

Перечень и концентрации антибиотиков амоксициллин, ципрофлоксацин, метронидазол - были подобраны на основании опубликованных данных, где описаны исследования по тестированию бактерий рода Desulfovibrio spp.к противомикробным препаратам и требования к значениям минимально ингибирующих концентраций, которые составляли серии двукратных разведений на основе 1 мкг/мл: 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл [The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 13.0, 2023. http://www.eucast.org.; Nakao K, Tanaka K, Ichiishi S, Mikamo H, Shibata T, Watanabe K. Susceptibilities of 23 Desulfovibrio isolates from humans. Antimicrob Agents Chemother. 2009 Dec;53(12):5308-ll. doi: 10.1128/AAC.00630-09. Epub 2009 Sep 28. PMID: 19786606; PMCID: PMC2786338; Lozniewski A, Labia R, Haristoy X, Могу F. Antimicrobial susceptibilities of clinical Desulfovibrio isolates. Antimicrob Agents Chemother. 2001 Oct;45(10):2933-5. doi: 10.1128/AAC.45.10.2933-2935.2001. PMID: 11557495; PMCID: PMC90757; MIC distributions and the setting of epidemiological cutoff (ECOFF) values. EUCAST SOP 10.2, 2 December 2021].

Заявляемое решение получено в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в рамках выполнения темы НИР «Клинико-патогенетическое обоснование и совершенствование терапевтических программ сохранения и восстановления микробиома человека при широко распространенных инфекционных заболеваний».

Сущность заявляемого решения поясняется следующими примерами.

Пример №1. Получение питательной среды для определения показателя антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp.

Для приготовления используемой в заявляемом способе питательной среды на аналитических весах произвели навеску сухих компонентов в количестве, указанном в Таблице. 1.

После чего смешали лактат натрия, гидролизат казеина, кукурузный крахмал, дегидратированный говяжий бульон, витамин В1, витамин В2, витамин В6, витамин В3, витамин В9, витамин В5, витамин В7, витамин В12, сульфат магния, глюкозу, натрия хлорид, гидрофосфат калия, аммоний хлористый, пиросульфит натрия. Затем добавили дистиллированную воду 1000 мл, установили рН 7,3 посредством добавления 0,1 н. раствора соляной кислоты.

Компоненты полученной смеси растворили, доведя ее до кипения, после чего в остывшую смесь добавили аскорбиновую кислоту, железо сернокислое закисное и перемешали.

Затем получившийся раствор разлили в стерильные стеклянные бутылки для стерилизации и провели автоклавирование под давлением 1,0 атм при температуре 120,6°С в течение 15 мин. Полученная указанным способом питательная среда прозрачная, имела желтоватый цвет. Готовая питательная среда хранилась в холодильнике при температуре +4-8°С 30 дней и использовалась по мере необходимости.

Пример 2. Определение показателя антибиотикорезистентности культуры штамма Desulfovibrio desulfuricans VKM В-1799^т.

С целью определения показателей чувствительности методом микроразведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в физиологическом растворе готовили суспензию коллекционной культуры штамма Desulfovibrio desulfuricans VKM В-1799^т плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду.

В микропробирки поместили по 1 мл питательной среды, полученной способом, описанным в примере 1, и разведения растворов следующих антибактериальных препаратов:

- амоксициллина - 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл;

- ципрофлоксацина - 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл;

- метронидазола - 0,75 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл;

- контроль - микропробирка с чистой средой, не содержащая разведений антибактериальных препаратов.

Затем в указанные микропробирки перенесли 100 мкл суспензии, содержащей культуру штамма Desulfovibrio desulfuricans VKM В-1799 т, и инкубировали культуры в течение 72 часов при 34-36°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США).

Спустя 72 часа в микропробирке с контролем произошло почернение среды, в микропробирках с разведениями антибактериальных препаратов с питательной средой: амоксициллина 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл; ципрофлоксацина 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл; метронидазола 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл, почернения среды не произошло.

Результат исследования показал, что данный штамм чувствителен к амоксициллину, ципрофлоксацину и метронидазолу в указанных концентрациях.

Пример 3. Определение показателя антибиотикорезистентности из образца биологического материала.

С целью определения показателей чувствительности методом микроразведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в физиологическом растворе готовили суспензию культуры Desulfovibrio spp. из образца кала №1 плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду. Данный биологический образец получен от пациента (мужчина, 54 года) с нарушением микрофлоры кишечника с повышенным титром условно патогенной бактерии Desulfovibrio spp.

В микропробирки поместили по 1 мл питательной среды, полученной способом, описанным в примере 1, и разведения растворов амоксициллина в концентрации 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл. Контроль - микропробирка с чистой средой, не содержащая разведений антибактериальных препаратов.

Затем в указанные микропробирки перенесли 100 мкл суспензии, содержащей культуру Desulfovibrio desulfuricans из образца кала, и инкубировали культуры в течение 72 часов при 36°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США).

Спустя 72 часа в микропробирке с контролем произошло почернение среды, в микропробирках с питательной средой и разведениями амоксициллина в концентрации 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл почернения среды не произошло.

Результат исследования показал, что данный штамм чувствителен к амоксициллину в указанных концентрациях.

Пример 4. Определение показателя антибиотикорезистентности из образца биологического материала.

С целью определения показателей чувствительности методом микроразведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в физиологическом растворе готовили суспензию культуры Desulfovibrio spp. из образца кала №2 плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду. Данный биологический образец получен от пациента (женщина, 23 года) с нарушением микрофлоры кишечника с повышенным титром условно патогенной бактерии Desulfovibrio spp.

В микропробирки поместили по 1 мл питательной среды, полученной способом, описанным в примере 1, и разведения растворов ципрофлоксацина в концентрации 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл. Контроль - микропробирка с чистой средой, не содержащая разведений антибактериальных препаратов.

Затем в указанные микропробирки перенесли 100 мкл суспензии, содержащей культуру Desulfovibrio desulfuricans из образца кала, и инкубировали культуры в течение 72 часов при 35°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США).

Спустя 72 часа в микропробирке с контролем произошло почернение среды, в микропробирках с питательной средой и разведениями ципрофлоксацина в концентрации 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл почернения среды не произошло.

Результат исследования показал, что данный штамм чувствителен к ципрофлоксацину в указанных концентрациях.

Пример 5. Определение показателя антибиотикорезистентности из образца биологического материала.

С целью определения показателей чувствительности методом микроразведений в бульоне с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) в физиологическом растворе готовили суспензию культуры Desulfovibrio spp. из образца кала №3 плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду. Данный биологический образец получен от пациента (мужчина, 40 лет) с нарушением микрофлоры кишечника с повышенным титром условно патогенной бактерии Desulfovibrio spp.

В микропробирки поместили по 1 мл питательной среды, полученной способом, описанным в примере 1, и разведения растворов метронидазола в концентрации 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл. Контроль - микропробирка с чистой средой, не содержащая разведений антибактериальных препаратов.

Затем в указанные микропробирки перенесли 100 мкл суспензии, содержащей культуру Desulfovibrio desulfuricans из образца кала, и инкубировали культуры в течение 72 часов при 34°С в анаэробных условиях при помощи анаэростата, пакетов типа Газпак производства фирмы «Oxoid» (Thermo Fisher Scientific, США).

Спустя 72 часа в микропробирке с контролем произошло почернение среды, в микропробирках с питательной средой и разведениями метронидазола в концентрации 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл почернения среды не произошло.

Результат исследования показал, что данный штамм чувствителен к метронидазолу в указанных концентрациях.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для диагностики и изучения условно-патогенных микроорганизмов рода Desulfovibrio, а именно для изучения чувствительности сульфатредуцирующих бактерий к противомикробным препаратам. Представлен способ определения показателя антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spр. Способ включает приготовление питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., приготовление суспензии бактерии Desulfovibrio spp. плотностью 1 стандарт мутности по МакФарланду, приготовление разведения растворов антибактериальных препаратов в 1 мл питательной среды, внесение 100 мкл суспензии бактерий Desulfovibrio spp. в приготовленные разведения антибактериальных препаратов с питательной средой, инкубирование полученной смеси в анаэробных условиях в течение 72 часов при 34-36°С, визуальную оценку чувствительности бактерий рода Desulfovibrio spp. к антибактериальным препаратам производят по наличию или отсутствию почернения в микропробирках, содержащих разведения антибактериальных препаратов с питательной средой для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., где наличие почернения свидетельствует о резистентности бактерий рода Desulfovibrio spp. к исследуемой концентрации антимикробных препаратов, а отсутствие почернения - оценивается как результат, чувствительный к антибактериальным препаратам. Способ обеспечивает повышение эффективности, упрощение и снижение трудоемкости при определении антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. Способ определения показателя антибиотикорезистентности бактерий рода Desulfovibrio spp., включающий приготовление питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., приготовление суспензии бактерии Desulfovibrio spp. плотностью 1 стандарт мутности но МакФарланду, приготовление разведений растворов антибактериальных препаратов в 1 мл питательной среды, внесение 100 мкл суспензии бактерий Desulfovibrio spp. в приготовленные разведения антибактериальных препаратов с упомянутой питательной средой, инкубирование полученной смеси в анаэробных условиях в течение 72 часов при 34-36°С, визуальную оценку чувствительности бактерий рода Desulfovibrio spp. к антибактериальным препаратам, при этом в качестве контроля используют микропробирку, содержащую 1 мл питательной среды для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp. без добавления разведения антимикробных препаратов, визуальную оценку чувствительности бактерий рода Desulfovibrio spp. к антибактериальным препаратам производят но наличию или отсутствию почернения в микропробирках, содержащих разведения антибактериальных препаратов с питательной средой для культивирования бактерий рода Desulfovibrio spp., где наличие почернения свидетельствует о резистентности бактерий рода Desulfovibrio spp. к исследуемой концентрации антимикробных препаратов, а отсутствие почернения оценивается как результат, чувствительный к антибактериальным препаратам, а упомянутую питательную среду получают посредством последовательного проведения следующих этапов:

(i) смешивание лактата натрия - 3.00 мл/л; гидролизата казеина - 0,01 г/л; кукурузного крахмала - 0,01 г/л; дегидратированного говяжьего бульона - 0,15 г/л; витамина В1 - 0,10 г/л; витамина В2 - 0,15 г/л; витамина В6 - 0,30 г/л; витамина В3 - 0,75 г/л; витамина В9 - 0,05 г/л; витамина В5 - 0.35 г/л; витамина В7 - 0,19 г/л; витамина B12 - 0,10 г/л; сульфата магния - 1,00 г/л; глюкозы - 1,00 г/л; натрия хлорида - 0,10 г/л; гидрофосфата калия - 0,50 г/л; аммония хлористого - 1,00 г/л; пиросульфита натрия - 0,50 г/л;

(ii) доведение общего объема полученной на этане (i) смеси до 1000 мл путем добавления дистиллированной воды;

(iii) установление pH 7,3±10,2 посредством добавления в смесь, полученную на стадии (ii), 0,1 н. раствора соляной кислоты либо 0,1 н. раствора гидроксида натрия:

(iv) растворение компонентов полученной на этапе (iii) смеси посредством доведения се до кипения;

(v) смешивание остывшей смеси, полученной на этапе (iv), с аскорбиновой кислотой - 0.10 г/л и железом сернокислым закисным - 0,50 г/л в;

(vi) стерилизация полученной на этапе (v) смеси в стеклянных стерилизованных бутылках путем автоклавирования под давлением 1,0 атм при температуре 120,6°С в течение 15-30 мин.

2. Способ по п. 1, при котором разведения растворов антибактериальных препаратов готовят в микропробирках с использованием амоксициллина, ципрофлоксацина, метронидазола в следующих концентрациях:

- амоксициллина 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл;

- ципрофлоксацина - 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл;

- метронидазола 0,75 мкг/мл, 1 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл.