СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ Российский патент 2023 года по МПК C07K14/435 C07K14/50 C07K14/605 C12N15/63 C12P21/02 

Область техники, к которой относится изобретение

[1] Настоящее изобретение относится к способу получения бифункционального белка, включающего биологически активный белок и мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21).

Уровень техники

[2] Когда животную клетку используют для продуцирования рекомбинантного белка, то может возникнуть проблема, заключающаяся в том, что специфическая область целевого белка может подвергаться клиппингу под действием протеазы, секретируемой животной клеткой (клеткой-хозяином), вызывая гетерогенность, уменьшение или инактивацию рекомбинантного белка. Кроме того, такое клиппинг экспрессированного белка также приводит к проблеме, состоящей в том, что становится трудно поддерживать однородность «от партии к партии» во время процессов получения и очистки. По этой причине необходимо поддерживать протеазы на низком уровне или подавлять протеазную активность во время продуцирования рекомбинантного белка.

[3] В качестве альтернативы для решения этой проблемы был предложен способ получения, в котором в культуральную среду добавляли ингибиторы сериновой протеазы, цистеиновой протеазы, аспаратпротеазы или аминопептидазы (такие как апротинин, бестатин, лейпептин, E-64 и пепстатин A и т. д.) (см. WO 1990-002175, ЕР 0306968 и патент США 5851800). Однако применение этих ингибиторов в промышленном производстве неэффективно за счет цитотоксичности и необходимости в дополнительных усилиях для подтверждения того, что они были полностью удалены из конечного продукта. Кроме того, среди обычных альтернатив еще не найден универсальный способ, применимый ко всем целевым белкам, продуцируемым в клетках-хозяевах.

[4] Техническая проблема

[5] Целью настоящего изобретения является обеспечение способа культивирования для получения бифункционального белка, включающего биологически активный белок и мутантный белок FGF21, который имеет улучшенные фармакокинетические параметры, высокую стабильность, меньшую вероятность агрегации с образованием комплекса и более низкий иммуногенный потенциал.

[6] Решение проблемы

[7] В соответствии с одной целью настоящего изобретения обеспечивается способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок или его производное, где способ включает культивирование клетки-хозяина млекопитающего в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок, или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций (1)-(7), приведенных ниже:

[8] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 53);

[9] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 54);

[10] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 55);

[11] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[12] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;

[13] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или более мутациями (1)-(5), приведенными выше; и

[14] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[15]

Преимущественные эффекты изобретения

[16] Способ получения по настоящему изобретению обеспечивает стабильную продукцию целевого белка посредством эффективного предотвращения разложения целевого белка.

[17]

Краткое описание фигур

[18] На фиг.1 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после суспензионного культивирования клеточной линии, экспрессирующей бифункциональный белок. Было установлено, что по окончании культивирования другие белки, с меньшей молекулярной массой, чем нерасщепленный бифункциональный белок, экспрессировались вместе.

[19] На фиг.2 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE в соответствии с температурными условиями хранения после определенного периода времени. Культуральный супернатант, хранившийся при 4°С или -20С, показал снижение клиппинга бифункциональных белков по сравнению с хранением при 37°С. Этот результат указывает на то, что феномен клиппинга бифункциональных белков индуцируется протеазой, происходящей из клетки-хозяина.

[20] На фиг.3 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа электрофорезом SDS-PAGE после добавления ингибиторов протеаз в культуральные супернатанты и хранения смесей в течение определенного периода времени при 37°С. Было установлено, что в основном добавление ингибитора сериновой протеазы уменьшало феномен клиппинга бифункционального белка. Этот результат указывает на то, что феномен клиппинга бифункционального белка индуцируется протеазой, происходящей из клетки-хозяина.

[21] На фиг.4 представлены результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после культивирования клеток, где в культуральную среду добавляли декстрана сульфат, и их графическое представление. Эффект снижения феномена клиппинга бифункционального белка не наблюдали при добавлении декстрана сульфата, имеющего средневесовую молекулярную массу 1,6 кДа, тогда как феномен клиппинга бифункционального белка уменьшался при добавлении декстрана сульфата, имеющего средневесовую молекулярную массу 500 кДа.

[22] На фиг.5 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после культивирования с декстраном сульфатом, имеющим различную средневесовую молекулярную массу, добавленным в культуральную среду. Когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфат, имеющий средневесовую молекулярную массу 200 кДа или выше, то феномен клиппинга бифункционального белка снижался.

[23] На фиг.6 представлены результаты анализа электрофорезом SDS-PAGE культурального супернатанта после культивирования, где в культуральную среду добавляли декстрана сульфат в различных концентрациях, и их графическое представление. Когда добавляли декстрана сульфат в концентрации 200-1000 мг/л, то феномен клиппинга бифункционального белка снижался. Кроме того, когда во время культивирования температуру изменяли до 32°С, то феномен клиппинга бифункционального белка можно было предотвращать более эффективно.

[24]

Наилучший способ осуществления изобретения

[25] В соответствии с одной целью настоящего изобретения обеспечен способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок или его производное, где способ включает культивирование клетки-хозяина млекопитающего в культуральной среде, с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок, или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций (1)-(7), приведенных ниже:

[26] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 53) (в дальнейшем «EIRP»);

[27] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 54) (в дальнейшем «TGLEAV»);

[28] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 55) (в дальнейшем «TGLEAN»);

[29] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (в дальнейшем «G170N»);

[30] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (в дальнейшем «G174N»);

[31] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или более мутациями (1)-(5), приведенными выше (в дальнейшем «A180E»); и

[32] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.

[33]

[34] Мутантный белок FGF21

[35] Белок FGF21 дикого типа, гормон, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов, может происходить от млекопитающих, таких как люди, мыши, свиньи, обезьяны и т.д., предпочтительно от людей. Более предпочтительно белок FGF21 дикого типа может представлять собой человеческий белок FGF21 дикого типа, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

[36] Предпочтительно, мутация, включенная в мутантные белки FGF21, может представлять любую из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N; комбинацию любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутацию EIRP; комбинацию любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутацию A180E; или комбинацию любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N, мутацию EIRP и мутацию A180E.

[37] EIRP относится к мутации, в которой LLLE, аминокислоты в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены EIRP. Кроме того, TGLEAV относится к мутации, в которой GPSQG, аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены TGLEAV. Кроме того, TGLEAN относится к мутации, в которой GPSQG, аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены TGLEAN. Кроме того, G170N относится к мутации, в которой G, аминокислота в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещена N. Кроме того, G174N относится к мутации, в которой G, аминокислота в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещена N.

[38] Кроме того, мутантные белки FGF21 могут иметь конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или С-конце делецированы по сравнению с белком FGF21 дикого типа. Более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-23. Еще более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-23 и, также имеют конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или С-конце делецированы по сравнению с белком FGF21 дикого типа.

[39] В бифункциональном белке аминокислотный остаток N мутантного белка FGF21, введенного мутацией, может быть гликозилирован.

[40]

[41] Биологически активный белок

[42] Биологически активный белок может быть выбран из группы, состоящей из инсулина, С-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибирующего полипептида (GIP), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, костного морфогенетического белка 6 (BMP-6), костного морфогенетического белка 9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), ирисина, фибронектина типа III, содержащего домен белка 5 (FNDC5), апелина, адипонектина, C1q и белка, связанного с фактором некроза опухолей (семейство CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинол-связывающего белка 4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина-22 (IL-22), эксендина-4 и гормона роста. Предпочтительно биологически активный белок может быть одним из белков, выбранных из GLP-1, его мутанта и эксендина-4.

[43] Белок GLP-1 представляет гормон инкретин, состоящий из 31 аминокислоты, который секретируется L-клетками в кишечном тракте, стимулированными пищей, и т. д. Например, белок GLP-1 может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29.

[44] Мутант GLP-1 может быть представлен, например, аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO: 30-33.

[45]

[46] Fc-область иммуноглобулина

[47] Как здесь используется, термин «Fc-область», «Fc-фрагмент» или «Fc» относится к белку, который включает константную область 1 тяжелой цепи (CH1), константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, но не включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Кроме того, как здесь используется, термин «мутантная Fc-область» относится к таковой, полученной заменой части аминокислот Fc-области или объединением Fc-областей разных типов.

[48] Fc-область иммуноглобулина может представлять полную Fc-область, входящую в антитело, ее фрагмент или мутантную Fc-область. Кроме того, Fc-область включает молекулу в виде мономера или мультимера и может дополнительно включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Мутантная Fc-область может быть модифицирована для предотвращения расщепления в шарнирной области. Кроме того, шарнирная последовательность Fc может иметь замену в некоторых аминокислотных последовательностях для снижения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, часть аминокислотной последовательности шарнирной последовательности Fc может быть замещена для ингибирования реаранжировки Fab-области. Остаток лизина на С-конце Fc может быть удален.

[49] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может представлять любую из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD; или гибридную Fc-область, которая является их комбинацией. Кроме того, гибридная Fc-область может включать область IgG4 и область IgD. Кроме того, гибридная Fc-область может включать часть шарнирной последовательности и CH2 IgD Fc, а также последовательности CH2 и CH3 IgG4 Fc.

[50] Кроме того, Fc-фрагмент по настоящему изобретению может находиться в форме гликозилированной цепи дикого типа, более гликозилированной цепи, чем гликозилированная цепь дикого типа, менее гликозилированной цепи, чем гликозилированная цепь дикого типа. Увеличение, уменьшение или удаление гликозилированной цепи может быть выполнено обычным способом, известным в данной области, таким как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизмов.

[51] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 24-28.

[52]

[53] Бифункциональный белок

[54] Бифункциональный белок может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, бифункциональный белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и биологически активный белок, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Предпочтительно бифункциональный белок может включать мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, бифункциональный белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок GLP-1, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу.

[55]

[56] Линкер

[57] Кроме того, бифункциональный белок может дополнительно включать линкер.

[58] Бифункциональный белок может находиться в форме, в которой мутантный белок FGF21 прямо связан с N-концом или С-концом Fc-области иммуноглобулина, или мутантный белок FGF21 связан с Fc-областью иммуноглобулина через линкер.

[59] В этом случае линкер может быть связан с N-концом, C-концом или свободным радикалом Fc-фрагмента, и также может быть связан с N-концом, C-концом или свободным радикалом мутантного белка FGF21. Когда линкер представляет пептидный линкер, то соединение может находиться в любой области. Например, линкер может быть связан с C-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21 с образованием слитого белка Fc-области иммуноглобулина и мутантного белка FGF21. Кроме того, бифункциональный белок по настоящему изобретению может находиться в форме, в которой биологически активный белок связан с N-концом Fc-области иммуноглобулина слитого белка.

[60] Когда линкер и Fc-область экспрессируются по отдельности и затем соединяются, то линкер может представлять сшивающий агент, известный в данной области техники. Примеры сшивающего агента могут включать 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, имидоэфиры, включая сложный эфир N-гидроксисукцинимида, такой как 4-азидосалициловая кислота, и дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, не ограничиваясь этим.

[61] Кроме того, линкер может представлять пептид. Предпочтительно линкер может представлять пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков.

[62] Кроме того, аланин может быть дополнительно присоединен к концу линкера. Предпочтительно, линкер может представлять пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-5.

[63] Бифункциональный белок может находиться в форме, в которой димер или мультимер мутантных белков FGF21, где один или более мутантных белков FGF21, связанных друг с другом, соединены с Fc-областью иммуноглобулина. Кроме того, бифункциональный белок может находиться в форме димера или мультимера, где две или более Fc-областей иммуноглобулина связаны, где Fc-области иммуноглобулина имеют мутантный белок FGF21, связанный с ними.

[64]

[65] Клетка-хозяин млекопитающего

[66] Клеткой-хозяином млекопитающего может быть любая клетка животного, способная экспрессировать рекомбинантный бифункциональный белок, предпочтительно клетка животного, которая позволяет легко выделить трансформированную клетку-мишень. В частности, клетки-хозяева млекопитающего могут представлять собой клетки «бессмертной» гибридомы, клетки миеломы NS/0, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO), клетки HeLa, клетки CAP (клетки, полученные из амниотической жидкости человека), или клетки COS.

[67]

[68] Декстрана сульфат

[69] В результате добавления ингибитора протеаз к клеточной культуре, продуцирующей бифункциональный белок по настоящему изобретению, эффект предотвращения феномена клиппинга бифункционального белка протеазой, происходящей из клетки-хозяина, был недостаточным.

[70] Декстрана сульфат может иметь средневесовую молекулярную массу от 20 до 5000 кДа. В частности, декстрана сульфат может иметь средневесовую молекулярную массу от 200 до 5000 кДа.

[71] Кроме того, культуральная среда может содержать декстрана сульфат в концентрации от 0,01 до 10 г/л. В частности, культуральная среда может содержать декстрана сульфат в концентрации от 0,1 до 10 г/л или от 0,1 до 1 г/л.

[72]

[73] Культивирование

[74] Культивирование может включать стадию первичного культивирования клетки-хозяина млекопитающего при 34-37°С в культуральной среде, с добавлением декстрана сульфата; и стадию вторичного культивирования первичной культуральной среды при температуре от 28°С до 33°С. В частности, первичное культивирование может проводиться в течение от 24 до 144 ч. Также вторичное культивирование может проводиться при температуре от 31°С до 33°С.

[75] Бифункциональный белок представляет полипептид, в котором варианты GLP-1 и FGF21, биологически активные белки, слиты с Fc-областью иммуноглобулина и экспрессируются в интактной форме при продуцировании культурой клеток животных, и проявляет активность в виде композиции для профилактики или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.

[76]

Способ по изобретению

[77] Далее будут подробно описаны примерные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на примеры. Однако эти примеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы во многих различных формах, и объем настоящего изобретения не следует истолковывать как ограниченный примерами, описанными здесь.

[78]

[79]

Примеры

[80] Пример получения 1. Получение клеток-хозяев для экспрессии бифункциональных белков

[81] 1-1: Получение экспрессионных векторов для экспрессии бифункциональных белков

[82] Положение, информация о последовательности, цель и ожидаемый эффект каждой мутации, введенной в белок FGF21, приведены в таблице 1 ниже (в таблице 1 N относится к гликозилированному аспарагину (N)). Кроме того, мутантные белки FGF21, включающие мутации, описанные в таблице 1, приведены в таблице 2 ниже.

[83]

Таблица 1 Последовательность Положение Исходная последовательность Мутированная последовательность Цель Предполагаемый эффект EIRP 98-101 LLLE EIRP Замена последовательностью FGF19 Повышение стабильности и улучшение фармакокинетики TGLEAV 170-174 GPSQG TGLEAV Замена последовательностью FGF19 Улучшение фармакокинетики TGLEAN 170-174 GPSQG TGLEAN Замена последовательностью FGF19, и
добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики G170N 170 G N Точечная мутация, и
добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики G174N 174 G N Точечная мутация, и
добавление N-гликозилирования Улучшение фармакокинетики A180E 180 A E Точечная мутация Улучшение фармакокинетики

[84]

[85]

Таблица 2 SEQ ID NO Последовательность мутантного белка FGF21 6 FGF21 (EIRP) 7 FGF21 (TGLEAV) 8 FGF21 (TGLEAN) 9 FGF21 (G170N) 10 FGF21 (G174N) 11 FGF21 (EIRP, TGLEAV) 12 FGF21 (EIRP, TGLEAN) 13 FGF21 (EIRP, G170N) 14 FGF21 (EIRP, G174N) 15 FGF21 (EIRP, A180E) 16 FGF21 (TGLEAV, A180E) 17 FGF21 (TGLEAN, A180E) 18 FGF21 (G170N, A180E) 19 FGF21 (G174N, A180E) 20 FGF21 (EIRP, TGLEAV, A180E) 21 FGF21 (EIRP, TGLEAN, A180E) 22 FGF21 (EIRP, G170N, A180E) 23 FGF21 (EIRP, G174N, A180E)

[86]

[87] Последовательности мутантного белка GLP-1 показаны в таблице 3 ниже, и последовательности слитого белка Fc мутантный GLP-1 показаны в таблице 4.

[88]

Таблица 3 SEQ ID NO Последовательность мутантного белка GLP-1 30 GLP-1(A2G) 31 GLP-1(GE) 32 GLP-1(GG) 33 GLP-1(GEG)

[89]

Таблица 4 SEQ ID NO слитый белок Fc мутантный GLP-1 34 DFD52: GLP1(A2G)-HyFc5 35 DFD53: GLP1(A2G)-HyFc40 36 DFD54: GLP1(GE)-HyFc5 37 DFD55: GLP1(GE)-HyFc40 38 DFD56: GLP1(GG)-HyFc5 39 DFD57: GLP1(GG)-HyFc40 40 DFD58: GLP1(GEG)-HyFc5 41 DFD59: GLP1(GEG)-HyFc40

[90]

[91] В таблице 4 HyFc5 представляет SEQ ID NO: 27, и HyFc40 представляет SEQ ID NO: 28.

[92] Кроме того, последовательности бифункциональных белков, включающие мутантные белки GLP-1 и мутантные белки FGF21, приведены в таблице 5 ниже. Каждый бифункциональный белок содержит мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина, линкер и мутантный белок FGF21, соединенные в таком порядке от N-конца к С-концу.

[93]

[94]

Таблица 5 SEQ ID NO Код вещества Последовательность мутантного белка GLP-1 Слитый носитель Последовательность линкера Изменения в последовательности FGF21 43 DFD23 GLP-1(A2G) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 44 DFD24 GLP-1(GE) hyFc5
(SEQ ID NO: 27) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 45 DFD25 GLP-1(GE) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 46 DFD26 GLP-1(GG) hyFc5
(SEQ ID NO: 27) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 47 DFD27 GLP-1(GG) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 48 DFD28 GLP-1(GEG) hyFc5
(SEQ ID NO: 27) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 49 DFD29 GLP-1(GEG) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21
(EIRP, TGLEAV) 50 DFD69 GLP-1(GEG) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E) 51 DFD112 GLP-1(GEG) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E) 52 DFD114 GLP-1(GEG) hyFc40
(SEQ ID NO: 28) GS3
(SEQ ID NO: 4) FGF21(EIRP, G170N, A180E)

[95]

[96] В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из бифункциональных белков, были синтезированы после консультации с Bioneer Corporation (Корея) на основе аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности для рестриктаз NheI и NotI добавляли к 5'-концу и 3'-концу нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из бифункциональных белков, и кодон инициации трансляции белка и лидерную последовательность (SEQ ID NO: 56, MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), обеспечивающую секрецию экспрессированного белка из клетки вставляли рядом с последовательностью для рестриктазы на 5'-конце. Кодон терминации вставляли за нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый из мутантных белков FGF21. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из бифункциональных белков, клонировали в пустой экспрессионный вектор pTrans с использованием двух рестриктаз NheI и NotI. Пустой экспрессионный вектор pTrans, который имеет промотор CMV, ориджин репликации, полученный из pUC, ориджин репликации, полученный из SV40, и ген резистентности к ампициллину, был приобретен у CEVEC Pharmaceuticals (Германия).

[97]

[98] 1-2: Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии бифункциональных белков

[99] E.coli трансформировали каждым из экспрессионных векторов, сконструированных в примере получения 1-1, с целью получения большего количества плазмидной ДНК, которая будет использоваться для экспрессии. Клетки E.coli, с клеточными стенками, которые были ослаблены тепловым шоком, трансформировали каждым экспрессионным вектором, и трансформанты высевали на чашку с агаром LB для получения колоний. Полученные таким образом колонии инокулировали в среду LB, культивировали при 37°С в течение 16 ч, и каждую культуру E.coli, содержащую каждый экспрессионный вектор, получали в объеме 100 мл. Затем полученную E.coli центрифугировали для удаления культуральной среды, и затем добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, Cat No.:12963) для разрушения клеточных стенок с получением таким образом суспензии ДНК, в которой белки и ДНК были разделены. Плазмидную ДНК выделяли из суспензии ДНК, полученной таким образом, с использованием колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК идентифицировали с использованием электрофореза в агарозном геле, и концентрацию и чистоту измеряли с помощью прибора NanoDrop (Thermo Scientific, NanoDrop Lite). Полученную таким образом ДНК использовали для экспрессии.

[100]

[101] 1-3: Получение трансформированных клеток-хозяев для экспрессии бифункциональных белков

[102] Клетки CHO DG44 (клетки яичника китайского хомячка) трансформировали каждой плазмидной ДНК, выделенной в примере получения 1-2, с использованием FreeStyleMAX (Invitrogen, Cat. No. 16447-100). Трансформированные клетки яичника китайского хомячка инокулировали в среду (CD OptiCHO, Gibco, кат. № 12681-011) и культивировали в термостате в условиях 8% CO₂ и 37°С для селекции и культивирования выживших клеток с повторными пассажами. Селектированные клетки были окончательно отобраны в виде одного клона методом серийных разведений в 96-луночном планшете.

[103]

[104] Экспериментальный пример 1. Суспензионное культивирование для экспрессии бифункциональных белков и феномен разложения

[105] Клеточную линию CHO, трансформированную материалом с кодом DFD112 (SEQ ID NO: 51) из примера получения 1-3, культивировали в суспензии в среде CD OptiCHO с добавлением 8 мМ GlutaMAX (матрас с рабочим объемом 30 мл/125 мл, 37°С, 8% CO₂, 120 об/мин). Затем культуральные супернатанты хранили при трех различных температурных режимах хранения (37°С, 4°С или -20°С) в течение 3 суток, и затем оценивали степень феномена протеолиза с использованием электрофореза SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия) культурального супернатанта. Результаты анализа SDS-PAGE представлены на фиг. 1 и 2.

[106] Как показано на фиг. 1, было установлено, что белки (от 85 до 110 кДа), с меньшей молекулярной массой, чем целевые белки, экспрессировались вместе с целевыми белками, которые не расщеплялись (интактные) во время культивирования клеток для продуцирования бифункциональных белков.

[107] Как показано на фиг. 2, культуральные супернатанты, хранившиеся при 4°С и -20°С, содержали меньше белков небольшого размера, где бифункциональные белки подверглись клиппингу, по сравнению с культуральным супернатантом, хранившимся при 37°С. Следовательно, было установлено, что феномен клиппинга бифункционального белка был вызван протеазами, секретируемыми из клетки-хозяина, присутствующей в культуральном супернатанте.

[108]

[109] Экспериментальный пример 2. Детектирование ингибиторов протеаз, участвующих в разложении бифункционального белка

[110] Для исследования категории протеаз, участвующих в разложении бифункциональных белков, идентифицированных в экспериментальном примере 1, в культуральные супернатанты из экспериментального примера 1 добавляли различные ингибиторы протеаз и обрабатывали в течение 3 суток при 37°С, которые затем подвергали анализу электрофорезом SDS-PAGE. Ингибиторы протеаз, использованные здесь, показаны в таблице 6, и результаты анализа SDS-PAGE приведены на фиг. 3.

[111]

Таблица 6 Ингибиторы протеаз Концентрация при обработке Культуральный супернатант (контроль) N/A 4-(2-Аминоэтил)бензолсульфонилфторид (AEBSF) Антипаин Бестатин E-64 Динатриевая соль ЭДТА N-этилмалеимид Лейпептин Пепстатин Фосфорамидон Бензамидин HCl ZnCl₂ Апротинин

[112]

[113] Как показано на фиг.3, было установлено, что феномен разложения бифункционального белка снижался в культуральных супернатантах, обработанных ингибиторами протеаз, связанных с сериновой протеазой, таких как AEBSF, антипаин, лейпептин, бензамидин HCl и апротин. Следовательно, было установлено, что феномен разложения бифункционального белка вызван протеазами, происходящими из клетки-хозяина.

[114]

[115] Пример 1. Обработка декстраном сульфатом

[116] Для ингибирования феномена клиппинга, имеющего место во время клеточного культивирования для получения бифункциональных белков, трансформированную клеточную линию CHO из примера получения 1-3 культивировали в суспензии в среде CD Dynamis (Gibco, кат. № A2661501) с добавлением 6 мМ глутамина в течение 7 суток (матрас с рабочим объемом 30 мл/125 мл, 37°С, 8% CO₂, 120 об/мин). В отношении суспензионного культивирования, то в культуральную среду добавляли декстрана сульфат (средневесовая молекулярная масса: 1,6 кДа или 500 кДа) в концентрации 200 мг/л, и культивирование проводили при 32°С низкотемпературной конверсией и методом культивирования с подпиткой. После этого культуральный супернатант анализировали электрофорезом SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их представление в виде схематической диаграммы приведены на фиг. 4. На фиг. 4, w/o и дорожка 1 являются контрольными, 500 кДа и дорожка 2 являются культуральными супернатантами, обработанными декстраном сульфатом с 500 кДа, и 1,6 кДа и дорожка 3 являются культуральными супернатантами, обработанными декстраном сульфатом с 1,6 кДа.

[117] Как показано на фиг.4, было установлено, что феномен клиппинга бифункционального белка эффективно ингибировался, когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфат со средневесовой молекулярной массой 500 кДа.

[118]

[119] Пример 2. Влияние декстрана сульфата в зависимости от молекулярной массы

[120] Исследовали диапазон эффективных концентраций добавляемого декстрана сульфата, защитный эффект которого в отношении феномена клиппинга бифункционального белка во время культивирования клеток, был установлен в примере 1.

[121] В частности, культивирование проводили в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением изменения средневесовой молекулярной массы (1,6 кДа, 8 кДа или 200 кДа) и концентрации (100 мг/л, 200 мг/л или 500 мг/л) добавленного декстрана сульфата. После этого культуральный супернатант анализировали с использованием электрофореза SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их графическое представление приведены на фиг. 5.

[122] Как показано на фиг.5, феномен клиппинга бифункционального белка значительно снижался, когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфата, имеющий молекулярную массу 200 кДа или выше, в концентрации от 100 до 500 мг/л.

[123]

[124] Пример 3. Оценка условий культивирования для предотвращения разложения бифункционального белка

[125] Исследовали условия культивирования для получения максимального эффекта предотвращения клиппинга бифункциональных белков декстраном сульфатом, идентифицированным в примерах 1 и 2.

[126] В частности, культивирование проводили в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что декстрана сульфат с 500 кДа добавляли в концентрации от 0 мг/л до 1000 мг/л. В данный пример была включена экспериментальная группа, в которой температуру культивирования изменяли на 32°С на сутки 4 культивирования (см. таблицу 7 ниже). Затем культуральный супернатант анализировали электрофорезом SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их график представлены на фиг. 6.

[127]

Таблица 7 Дорожка Концентрация добавленного декстрана сульфата Условия культивирования 1 0 Культивирование при 32°С в течение 3 суток после культивирования при 37°C в течение 4 суток 2 Культивирование при 37°C в течение 7 суток 3 200 мг/д Культивирование при 32°C в течение 3 суток после культивирования при 37°C в течение 4 суток 4 Культивирование при 37°C в течение 7 суток 5 600 мг/л Культивирование при 32°C в течение 3 суток после культивирования при 37°C в течение 4 суток 6 Культивирование при 37°C в течение 7 суток 7 1000 мг/л Культивирование при 32°C в течение 3 суток после культивирования при 37°C в течение 4 суток 8 Культивирование при 37°C в течение 7 суток

[128]

[129] Как показано на фиг.6, было установлено, что культуральные супернатанты культуры с обработкой декстраном сульфатом, имеющим средневзвешенную молекулярную массу 500 кДа, показали значительно более сниженный феномен клиппинга бифункционального белка по сравнению с культуральными супернатантами культуры без обработки декстраном сульфатом. Кроме того, было установлено, что при изменении температуры во время культивирования феномен клиппинга бифункционального белка ингибировался более эффективно.

--->

<110> YUHAN CORPORATION

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

<130> PCB802025YUH

<160> 56

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> человеческий FGF21

<400> 1

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 2

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 2

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu

20 25 30

<210> 3

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 3

Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala

1 5 10 15

<210> 6

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 6

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 7

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 7

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 8

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 8

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 9

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 9

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 10

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 10

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 11

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 11

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 12

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 12

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 13

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 13

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 14

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 14

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 15

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 15

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 16

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 16

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 17

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 17

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 18

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 18

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 19

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 19

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 20

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 20

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 21

<211> 182

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 21

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 22

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 22

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 23

<211> 181

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 23

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 24

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IgG4 Fc человека

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 25

<211> 228

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант IgG4 Fc человека

<400> 25

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 26

<211> 223

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант гибридной Fc

<400> 26

Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 27

<211> 245

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридная Fc5

<400> 27

Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys

1 5 10 15

Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His

20 25 30

Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

35 40 45

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

50 55 60

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

65 70 75 80

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

85 90 95

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

100 105 110

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

115 120 125

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

130 135 140

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

145 150 155 160

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

165 170 175

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

180 185 190

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

195 200 205

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

210 215 220

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

225 230 235 240

Leu Ser Leu Gly Lys

245

<210> 28

<211> 233

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридная Fc40

<400> 28

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

1 5 10 15

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

20 25 30

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

35 40 45

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

50 55 60

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

65 70 75 80

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

85 90 95

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

100 105 110

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

115 120 125

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

130 135 140

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

165 170 175

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

195 200 205

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

210 215 220

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

225 230

<210> 29

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1

<400> 29

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 30

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1

<400> 30

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 31

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1

<400> 31

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 32

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1

<400> 32

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 33

<211> 31

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1

<400> 33

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 34

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc5

<400> 34

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 35

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc40

<400> 35

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 36

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5

<400> 36

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 37

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc40

<400> 37

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 38

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5

<400> 38

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 39

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc40

<400> 39

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 40

<211> 276

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5

<400> 40

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys

275

<210> 41

<211> 264

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc40

<400> 41

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

260

<210> 42

<211> 275

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Дулаглутид

<400> 42

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly

275

<210> 43

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(A2G)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 43

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 44

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GE)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 44

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 45

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GE)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 45

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 46

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 46

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 47

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 47

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 48

<211> 473

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 48

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg

20 25 30

Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu

35 40 45

Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr

50 55 60

Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly

290 295 300

Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr

305 310 315 320

Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly

340 345 350

Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg

355 360 365

Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys

370 375 380

Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser

385 390 395 400

Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His

405 410 415

Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly

420 425 430

Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro

435 440 445

Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu

450 455 460

Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

465 470

<210> 49

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)

<400> 49

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser

450 455 460

<210> 50

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)

<400> 50

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 51

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)

<400> 51

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 52

<211> 460

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, G170N, A180E)

<400> 52

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu

20 25 30

Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys

35 40 45

Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

50 55 60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65 70 75 80

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

85 90 95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

100 105 110

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

115 120 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145 150 155 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

165 170 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

180 185 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

195 200 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

210 215 220

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

245 250 255

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu

275 280 285

Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp

290 295 300

Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val

305 310 315 320

Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe

340 345 350

Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp

355 360 365

Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn

370 375 380

Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn

385 390 395 400

Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu

405 410 415

Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu

420 425 430

Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val

435 440 445

Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

450 455 460

<210> 53

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 53

Glu Ile Arg Pro

1

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 54

Thr Gly Leu Glu Ala Val

1 5

<210> 55

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> вариант FGF21

<400> 55

Thr Gly Leu Glu Ala Asn

1 5

<210> 56

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> производные последовательности

<400> 56

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным способам продукции белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки–хозяина млекопитающего. Способ включает трансформацию клетки-хозяина ДНК-вектором, экспрессирующим бифункциональный белок, и культивирование клетки-хозяина в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата. Изобретение обеспечивает стабильную продукцию целевого белка посредством эффективного предотвращения разложения целевого белка предложенным способом. 4 з.п. ф-лы, 6 ил.,7 табл., 3 пр.

1. Способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки–хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок, где способ включает культивирование клетки–хозяина млекопитающего в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок; и Fc–область иммуноглобулина, где указанный рекомбинантный бифункциональный белок содержит последовательность SEQ ID NO: 51 или состоит из нее и

где декстрана сульфат имеет среднемассовую молекулярную массу от 20 до 5000 кДа.

2. Способ по п.1, где культуральная среда содержит декстрана сульфат в концентрации от 0,01 до 10 г/л.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где культивирование включает:

стадию первичного культивирования клетки–хозяина млекопитающего при 34–37°С в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата и

стадию вторичного культивирования первичной культуральной среды при 28–33°С.

4. Способ по п.3, где первичное культивирование проводят в течение от 24 до 144 ч.

5. Способ по п.3, где вторичное культивирование проводят при температуре от 31°С до 33°С.