Область техники, к которой относится изобретение
[1] Настоящее изобретение относится к способу получения бифункционального белка, включающего биологически активный белок и мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21).
Уровень техники
[2] Когда животную клетку используют для продуцирования рекомбинантного белка, то может возникнуть проблема, заключающаяся в том, что специфическая область целевого белка может подвергаться клиппингу под действием протеазы, секретируемой животной клеткой (клеткой-хозяином), вызывая гетерогенность, уменьшение или инактивацию рекомбинантного белка. Кроме того, такое клиппинг экспрессированного белка также приводит к проблеме, состоящей в том, что становится трудно поддерживать однородность «от партии к партии» во время процессов получения и очистки. По этой причине необходимо поддерживать протеазы на низком уровне или подавлять протеазную активность во время продуцирования рекомбинантного белка.
[3] В качестве альтернативы для решения этой проблемы был предложен способ получения, в котором в культуральную среду добавляли ингибиторы сериновой протеазы, цистеиновой протеазы, аспаратпротеазы или аминопептидазы (такие как апротинин, бестатин, лейпептин, E-64 и пепстатин A и т. д.) (см. WO 1990-002175, ЕР 0306968 и патент США 5851800). Однако применение этих ингибиторов в промышленном производстве неэффективно за счет цитотоксичности и необходимости в дополнительных усилиях для подтверждения того, что они были полностью удалены из конечного продукта. Кроме того, среди обычных альтернатив еще не найден универсальный способ, применимый ко всем целевым белкам, продуцируемым в клетках-хозяевах.
[4] Техническая проблема
[5] Целью настоящего изобретения является обеспечение способа культивирования для получения бифункционального белка, включающего биологически активный белок и мутантный белок FGF21, который имеет улучшенные фармакокинетические параметры, высокую стабильность, меньшую вероятность агрегации с образованием комплекса и более низкий иммуногенный потенциал.
[6] Решение проблемы
[7] В соответствии с одной целью настоящего изобретения обеспечивается способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок или его производное, где способ включает культивирование клетки-хозяина млекопитающего в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок, или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций (1)-(7), приведенных ниже:
[8] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 53);
[9] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 54);
[10] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 55);
[11] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
[12] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
[13] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или более мутациями (1)-(5), приведенными выше; и
[14] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.
[15]
Преимущественные эффекты изобретения
[16] Способ получения по настоящему изобретению обеспечивает стабильную продукцию целевого белка посредством эффективного предотвращения разложения целевого белка.
[17]
Краткое описание фигур
[18] На фиг.1 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после суспензионного культивирования клеточной линии, экспрессирующей бифункциональный белок. Было установлено, что по окончании культивирования другие белки, с меньшей молекулярной массой, чем нерасщепленный бифункциональный белок, экспрессировались вместе.
[19] На фиг.2 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE в соответствии с температурными условиями хранения после определенного периода времени. Культуральный супернатант, хранившийся при 4°С или -20С, показал снижение клиппинга бифункциональных белков по сравнению с хранением при 37°С. Этот результат указывает на то, что феномен клиппинга бифункциональных белков индуцируется протеазой, происходящей из клетки-хозяина.
[20] На фиг.3 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа электрофорезом SDS-PAGE после добавления ингибиторов протеаз в культуральные супернатанты и хранения смесей в течение определенного периода времени при 37°С. Было установлено, что в основном добавление ингибитора сериновой протеазы уменьшало феномен клиппинга бифункционального белка. Этот результат указывает на то, что феномен клиппинга бифункционального белка индуцируется протеазой, происходящей из клетки-хозяина.
[21] На фиг.4 представлены результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после культивирования клеток, где в культуральную среду добавляли декстрана сульфат, и их графическое представление. Эффект снижения феномена клиппинга бифункционального белка не наблюдали при добавлении декстрана сульфата, имеющего средневесовую молекулярную массу 1,6 кДа, тогда как феномен клиппинга бифункционального белка уменьшался при добавлении декстрана сульфата, имеющего средневесовую молекулярную массу 500 кДа.
[22] На фиг.5 представлена схематическая диаграмма, показывающая результаты анализа культурального супернатанта электрофорезом SDS-PAGE после культивирования с декстраном сульфатом, имеющим различную средневесовую молекулярную массу, добавленным в культуральную среду. Когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфат, имеющий средневесовую молекулярную массу 200 кДа или выше, то феномен клиппинга бифункционального белка снижался.
[23] На фиг.6 представлены результаты анализа электрофорезом SDS-PAGE культурального супернатанта после культивирования, где в культуральную среду добавляли декстрана сульфат в различных концентрациях, и их графическое представление. Когда добавляли декстрана сульфат в концентрации 200-1000 мг/л, то феномен клиппинга бифункционального белка снижался. Кроме того, когда во время культивирования температуру изменяли до 32°С, то феномен клиппинга бифункционального белка можно было предотвращать более эффективно.
[24]
Наилучший способ осуществления изобретения
[25] В соответствии с одной целью настоящего изобретения обеспечен способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок или его производное, где способ включает культивирование клетки-хозяина млекопитающего в культуральной среде, с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок, или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций (1)-(7), приведенных ниже:
[26] (1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 53) (в дальнейшем «EIRP»);
[27] (2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 54) (в дальнейшем «TGLEAV»);
[28] (3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 55) (в дальнейшем «TGLEAN»);
[29] (4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (в дальнейшем «G170N»);
[30] (5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N (в дальнейшем «G174N»);
[31] (6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или более мутациями (1)-(5), приведенными выше (в дальнейшем «A180E»); и
[32] (7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.
[33]
[34] Мутантный белок FGF21
[35] Белок FGF21 дикого типа, гормон, который, как известно, играет важную роль в гомеостазе глюкозы и липидов, может происходить от млекопитающих, таких как люди, мыши, свиньи, обезьяны и т.д., предпочтительно от людей. Более предпочтительно белок FGF21 дикого типа может представлять собой человеческий белок FGF21 дикого типа, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.
[36] Предпочтительно, мутация, включенная в мутантные белки FGF21, может представлять любую из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N; комбинацию любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутацию EIRP; комбинацию любой из мутаций EIRP, TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N и мутацию A180E; или комбинацию любой из мутаций TGLEAV, TGLEAN, G170N и G174N, мутацию EIRP и мутацию A180E.
[37] EIRP относится к мутации, в которой LLLE, аминокислоты в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены EIRP. Кроме того, TGLEAV относится к мутации, в которой GPSQG, аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены TGLEAV. Кроме того, TGLEAN относится к мутации, в которой GPSQG, аминокислоты в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещены TGLEAN. Кроме того, G170N относится к мутации, в которой G, аминокислота в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещена N. Кроме того, G174N относится к мутации, в которой G, аминокислота в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа, замещена N.
[38] Кроме того, мутантные белки FGF21 могут иметь конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или С-конце делецированы по сравнению с белком FGF21 дикого типа. Более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-23. Еще более предпочтительно, мутантные белки FGF21 могут включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 6-23 и, также имеют конформацию, в которой 1-10 аминокислот на N-конце или С-конце делецированы по сравнению с белком FGF21 дикого типа.
[39] В бифункциональном белке аминокислотный остаток N мутантного белка FGF21, введенного мутацией, может быть гликозилирован.
[40]
[41] Биологически активный белок
[42] Биологически активный белок может быть выбран из группы, состоящей из инсулина, С-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибирующего полипептида (GIP), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, костного морфогенетического белка 6 (BMP-6), костного морфогенетического белка 9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), ирисина, фибронектина типа III, содержащего домен белка 5 (FNDC5), апелина, адипонектина, C1q и белка, связанного с фактором некроза опухолей (семейство CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинол-связывающего белка 4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина-22 (IL-22), эксендина-4 и гормона роста. Предпочтительно биологически активный белок может быть одним из белков, выбранных из GLP-1, его мутанта и эксендина-4.
[43] Белок GLP-1 представляет гормон инкретин, состоящий из 31 аминокислоты, который секретируется L-клетками в кишечном тракте, стимулированными пищей, и т. д. Например, белок GLP-1 может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29.
[44] Мутант GLP-1 может быть представлен, например, аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO: 30-33.
[45]
[46] Fc-область иммуноглобулина
[47] Как здесь используется, термин «Fc-область», «Fc-фрагмент» или «Fc» относится к белку, который включает константную область 1 тяжелой цепи (CH1), константную область 2 тяжелой цепи (CH2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) иммуноглобулина, но не включает вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область 1 легкой цепи (CL1) иммуноглобулина. Кроме того, как здесь используется, термин «мутантная Fc-область» относится к таковой, полученной заменой части аминокислот Fc-области или объединением Fc-областей разных типов.
[48] Fc-область иммуноглобулина может представлять полную Fc-область, входящую в антитело, ее фрагмент или мутантную Fc-область. Кроме того, Fc-область включает молекулу в виде мономера или мультимера и может дополнительно включать шарнирную область константной области тяжелой цепи. Мутантная Fc-область может быть модифицирована для предотвращения расщепления в шарнирной области. Кроме того, шарнирная последовательность Fc может иметь замену в некоторых аминокислотных последовательностях для снижения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Кроме того, часть аминокислотной последовательности шарнирной последовательности Fc может быть замещена для ингибирования реаранжировки Fab-области. Остаток лизина на С-конце Fc может быть удален.
[49] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может представлять любую из Fc-областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgD; или гибридную Fc-область, которая является их комбинацией. Кроме того, гибридная Fc-область может включать область IgG4 и область IgD. Кроме того, гибридная Fc-область может включать часть шарнирной последовательности и CH2 IgD Fc, а также последовательности CH2 и CH3 IgG4 Fc.
[50] Кроме того, Fc-фрагмент по настоящему изобретению может находиться в форме гликозилированной цепи дикого типа, более гликозилированной цепи, чем гликозилированная цепь дикого типа, менее гликозилированной цепи, чем гликозилированная цепь дикого типа. Увеличение, уменьшение или удаление гликозилированной цепи может быть выполнено обычным способом, известным в данной области, таким как химический метод, ферментативный метод и метод генной инженерии с использованием микроорганизмов.
[51] Предпочтительно, Fc-область иммуноглобулина может быть представлена аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 24-28.
[52]
[53] Бифункциональный белок
[54] Бифункциональный белок может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, бифункциональный белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и биологически активный белок, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Предпочтительно бифункциональный белок может включать мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу. Кроме того, бифункциональный белок может включать мутантный белок FGF21, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок GLP-1, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу.
[55]
[56] Линкер
[57] Кроме того, бифункциональный белок может дополнительно включать линкер.
[58] Бифункциональный белок может находиться в форме, в которой мутантный белок FGF21 прямо связан с N-концом или С-концом Fc-области иммуноглобулина, или мутантный белок FGF21 связан с Fc-областью иммуноглобулина через линкер.
[59] В этом случае линкер может быть связан с N-концом, C-концом или свободным радикалом Fc-фрагмента, и также может быть связан с N-концом, C-концом или свободным радикалом мутантного белка FGF21. Когда линкер представляет пептидный линкер, то соединение может находиться в любой области. Например, линкер может быть связан с C-концом Fc-области иммуноглобулина и N-концом мутантного белка FGF21 с образованием слитого белка Fc-области иммуноглобулина и мутантного белка FGF21. Кроме того, бифункциональный белок по настоящему изобретению может находиться в форме, в которой биологически активный белок связан с N-концом Fc-области иммуноглобулина слитого белка.
[60] Когда линкер и Fc-область экспрессируются по отдельности и затем соединяются, то линкер может представлять сшивающий агент, известный в данной области техники. Примеры сшивающего агента могут включать 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, имидоэфиры, включая сложный эфир N-гидроксисукцинимида, такой как 4-азидосалициловая кислота, и дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, не ограничиваясь этим.
[61] Кроме того, линкер может представлять пептид. Предпочтительно линкер может представлять пептид, состоящий из 10-30 аминокислотных остатков.
[62] Кроме того, аланин может быть дополнительно присоединен к концу линкера. Предпочтительно, линкер может представлять пептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в любой из последовательностей SEQ ID NO: 2-5.
[63] Бифункциональный белок может находиться в форме, в которой димер или мультимер мутантных белков FGF21, где один или более мутантных белков FGF21, связанных друг с другом, соединены с Fc-областью иммуноглобулина. Кроме того, бифункциональный белок может находиться в форме димера или мультимера, где две или более Fc-областей иммуноглобулина связаны, где Fc-области иммуноглобулина имеют мутантный белок FGF21, связанный с ними.
[64]
[65] Клетка-хозяин млекопитающего
[66] Клеткой-хозяином млекопитающего может быть любая клетка животного, способная экспрессировать рекомбинантный бифункциональный белок, предпочтительно клетка животного, которая позволяет легко выделить трансформированную клетку-мишень. В частности, клетки-хозяева млекопитающего могут представлять собой клетки «бессмертной» гибридомы, клетки миеломы NS/0, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (клетки CHO), клетки HeLa, клетки CAP (клетки, полученные из амниотической жидкости человека), или клетки COS.
[67]
[68] Декстрана сульфат
[69] В результате добавления ингибитора протеаз к клеточной культуре, продуцирующей бифункциональный белок по настоящему изобретению, эффект предотвращения феномена клиппинга бифункционального белка протеазой, происходящей из клетки-хозяина, был недостаточным.
[70] Декстрана сульфат может иметь средневесовую молекулярную массу от 20 до 5000 кДа. В частности, декстрана сульфат может иметь средневесовую молекулярную массу от 200 до 5000 кДа.
[71] Кроме того, культуральная среда может содержать декстрана сульфат в концентрации от 0,01 до 10 г/л. В частности, культуральная среда может содержать декстрана сульфат в концентрации от 0,1 до 10 г/л или от 0,1 до 1 г/л.
[72]
[73] Культивирование
[74] Культивирование может включать стадию первичного культивирования клетки-хозяина млекопитающего при 34-37°С в культуральной среде, с добавлением декстрана сульфата; и стадию вторичного культивирования первичной культуральной среды при температуре от 28°С до 33°С. В частности, первичное культивирование может проводиться в течение от 24 до 144 ч. Также вторичное культивирование может проводиться при температуре от 31°С до 33°С.
[75] Бифункциональный белок представляет полипептид, в котором варианты GLP-1 и FGF21, биологически активные белки, слиты с Fc-областью иммуноглобулина и экспрессируются в интактной форме при продуцировании культурой клеток животных, и проявляет активность в виде композиции для профилактики или лечения гепатита, фиброза печени и цирроза печени.
[76]
Способ по изобретению
[77] Далее будут подробно описаны примерные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на примеры. Однако эти примеры в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы во многих различных формах, и объем настоящего изобретения не следует истолковывать как ограниченный примерами, описанными здесь.
[78]
[79]
Примеры
[80] Пример получения 1. Получение клеток-хозяев для экспрессии бифункциональных белков
[81] 1-1: Получение экспрессионных векторов для экспрессии бифункциональных белков
[82] Положение, информация о последовательности, цель и ожидаемый эффект каждой мутации, введенной в белок FGF21, приведены в таблице 1 ниже (в таблице 1 N относится к гликозилированному аспарагину (N)). Кроме того, мутантные белки FGF21, включающие мутации, описанные в таблице 1, приведены в таблице 2 ниже.
[83]
добавление N-гликозилирования
добавление N-гликозилирования
добавление N-гликозилирования
[84]
[85]
[86]
[87] Последовательности мутантного белка GLP-1 показаны в таблице 3 ниже, и последовательности слитого белка Fc мутантный GLP-1 показаны в таблице 4.
[88]
[89]
[90]
[91] В таблице 4 HyFc5 представляет SEQ ID NO: 27, и HyFc40 представляет SEQ ID NO: 28.
[92] Кроме того, последовательности бифункциональных белков, включающие мутантные белки GLP-1 и мутантные белки FGF21, приведены в таблице 5 ниже. Каждый бифункциональный белок содержит мутантный белок GLP-1, Fc-область иммуноглобулина, линкер и мутантный белок FGF21, соединенные в таком порядке от N-конца к С-концу.
[93]
[94]
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 27)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 27)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 27)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(EIRP, TGLEAV)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
(SEQ ID NO: 28)
(SEQ ID NO: 4)
[95]
[96] В частности, нуклеотидные последовательности, кодирующие каждый из бифункциональных белков, были синтезированы после консультации с Bioneer Corporation (Корея) на основе аминокислотной последовательности каждого белка. Последовательности для рестриктаз NheI и NotI добавляли к 5'-концу и 3'-концу нуклеотидных последовательностей, кодирующих каждый из бифункциональных белков, и кодон инициации трансляции белка и лидерную последовательность (SEQ ID NO: 56, MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPSHA), обеспечивающую секрецию экспрессированного белка из клетки вставляли рядом с последовательностью для рестриктазы на 5'-конце. Кодон терминации вставляли за нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый из мутантных белков FGF21. Нуклеотидную последовательность, кодирующую каждый из бифункциональных белков, клонировали в пустой экспрессионный вектор pTrans с использованием двух рестриктаз NheI и NotI. Пустой экспрессионный вектор pTrans, который имеет промотор CMV, ориджин репликации, полученный из pUC, ориджин репликации, полученный из SV40, и ген резистентности к ампициллину, был приобретен у CEVEC Pharmaceuticals (Германия).
[97]
[98] 1-2: Конструирование плазмидной ДНК для экспрессии бифункциональных белков
[99] E.coli трансформировали каждым из экспрессионных векторов, сконструированных в примере получения 1-1, с целью получения большего количества плазмидной ДНК, которая будет использоваться для экспрессии. Клетки E.coli, с клеточными стенками, которые были ослаблены тепловым шоком, трансформировали каждым экспрессионным вектором, и трансформанты высевали на чашку с агаром LB для получения колоний. Полученные таким образом колонии инокулировали в среду LB, культивировали при 37°С в течение 16 ч, и каждую культуру E.coli, содержащую каждый экспрессионный вектор, получали в объеме 100 мл. Затем полученную E.coli центрифугировали для удаления культуральной среды, и затем добавляли растворы P1, P2, P3 (QIAGEN, Cat No.:12963) для разрушения клеточных стенок с получением таким образом суспензии ДНК, в которой белки и ДНК были разделены. Плазмидную ДНК выделяли из суспензии ДНК, полученной таким образом, с использованием колонки для очистки ДНК Qiagen. Элюированную плазмидную ДНК идентифицировали с использованием электрофореза в агарозном геле, и концентрацию и чистоту измеряли с помощью прибора NanoDrop (Thermo Scientific, NanoDrop Lite). Полученную таким образом ДНК использовали для экспрессии.
[100]
[101] 1-3: Получение трансформированных клеток-хозяев для экспрессии бифункциональных белков
[102] Клетки CHO DG44 (клетки яичника китайского хомячка) трансформировали каждой плазмидной ДНК, выделенной в примере получения 1-2, с использованием FreeStyleMAX (Invitrogen, Cat. No. 16447-100). Трансформированные клетки яичника китайского хомячка инокулировали в среду (CD OptiCHO, Gibco, кат. № 12681-011) и культивировали в термостате в условиях 8% CO2 и 37°С для селекции и культивирования выживших клеток с повторными пассажами. Селектированные клетки были окончательно отобраны в виде одного клона методом серийных разведений в 96-луночном планшете.
[103]
[104] Экспериментальный пример 1. Суспензионное культивирование для экспрессии бифункциональных белков и феномен разложения
[105] Клеточную линию CHO, трансформированную материалом с кодом DFD112 (SEQ ID NO: 51) из примера получения 1-3, культивировали в суспензии в среде CD OptiCHO с добавлением 8 мМ GlutaMAX (матрас с рабочим объемом 30 мл/125 мл, 37°С, 8% CO2, 120 об/мин). Затем культуральные супернатанты хранили при трех различных температурных режимах хранения (37°С, 4°С или -20°С) в течение 3 суток, и затем оценивали степень феномена протеолиза с использованием электрофореза SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия) культурального супернатанта. Результаты анализа SDS-PAGE представлены на фиг. 1 и 2.
[106] Как показано на фиг. 1, было установлено, что белки (от 85 до 110 кДа), с меньшей молекулярной массой, чем целевые белки, экспрессировались вместе с целевыми белками, которые не расщеплялись (интактные) во время культивирования клеток для продуцирования бифункциональных белков.
[107] Как показано на фиг. 2, культуральные супернатанты, хранившиеся при 4°С и -20°С, содержали меньше белков небольшого размера, где бифункциональные белки подверглись клиппингу, по сравнению с культуральным супернатантом, хранившимся при 37°С. Следовательно, было установлено, что феномен клиппинга бифункционального белка был вызван протеазами, секретируемыми из клетки-хозяина, присутствующей в культуральном супернатанте.
[108]
[109] Экспериментальный пример 2. Детектирование ингибиторов протеаз, участвующих в разложении бифункционального белка
[110] Для исследования категории протеаз, участвующих в разложении бифункциональных белков, идентифицированных в экспериментальном примере 1, в культуральные супернатанты из экспериментального примера 1 добавляли различные ингибиторы протеаз и обрабатывали в течение 3 суток при 37°С, которые затем подвергали анализу электрофорезом SDS-PAGE. Ингибиторы протеаз, использованные здесь, показаны в таблице 6, и результаты анализа SDS-PAGE приведены на фиг. 3.
[111]
[112]
[113] Как показано на фиг.3, было установлено, что феномен разложения бифункционального белка снижался в культуральных супернатантах, обработанных ингибиторами протеаз, связанных с сериновой протеазой, таких как AEBSF, антипаин, лейпептин, бензамидин HCl и апротин. Следовательно, было установлено, что феномен разложения бифункционального белка вызван протеазами, происходящими из клетки-хозяина.
[114]
[115] Пример 1. Обработка декстраном сульфатом
[116] Для ингибирования феномена клиппинга, имеющего место во время клеточного культивирования для получения бифункциональных белков, трансформированную клеточную линию CHO из примера получения 1-3 культивировали в суспензии в среде CD Dynamis (Gibco, кат. № A2661501) с добавлением 6 мМ глутамина в течение 7 суток (матрас с рабочим объемом 30 мл/125 мл, 37°С, 8% CO2, 120 об/мин). В отношении суспензионного культивирования, то в культуральную среду добавляли декстрана сульфат (средневесовая молекулярная масса: 1,6 кДа или 500 кДа) в концентрации 200 мг/л, и культивирование проводили при 32°С низкотемпературной конверсией и методом культивирования с подпиткой. После этого культуральный супернатант анализировали электрофорезом SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их представление в виде схематической диаграммы приведены на фиг. 4. На фиг. 4, w/o и дорожка 1 являются контрольными, 500 кДа и дорожка 2 являются культуральными супернатантами, обработанными декстраном сульфатом с 500 кДа, и 1,6 кДа и дорожка 3 являются культуральными супернатантами, обработанными декстраном сульфатом с 1,6 кДа.
[117] Как показано на фиг.4, было установлено, что феномен клиппинга бифункционального белка эффективно ингибировался, когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфат со средневесовой молекулярной массой 500 кДа.
[118]
[119] Пример 2. Влияние декстрана сульфата в зависимости от молекулярной массы
[120] Исследовали диапазон эффективных концентраций добавляемого декстрана сульфата, защитный эффект которого в отношении феномена клиппинга бифункционального белка во время культивирования клеток, был установлен в примере 1.
[121] В частности, культивирование проводили в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением изменения средневесовой молекулярной массы (1,6 кДа, 8 кДа или 200 кДа) и концентрации (100 мг/л, 200 мг/л или 500 мг/л) добавленного декстрана сульфата. После этого культуральный супернатант анализировали с использованием электрофореза SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их графическое представление приведены на фиг. 5.
[122] Как показано на фиг.5, феномен клиппинга бифункционального белка значительно снижался, когда в культуральную среду добавляли декстрана сульфата, имеющий молекулярную массу 200 кДа или выше, в концентрации от 100 до 500 мг/л.
[123]
[124] Пример 3. Оценка условий культивирования для предотвращения разложения бифункционального белка
[125] Исследовали условия культивирования для получения максимального эффекта предотвращения клиппинга бифункциональных белков декстраном сульфатом, идентифицированным в примерах 1 и 2.
[126] В частности, культивирование проводили в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что декстрана сульфат с 500 кДа добавляли в концентрации от 0 мг/л до 1000 мг/л. В данный пример была включена экспериментальная группа, в которой температуру культивирования изменяли на 32°С на сутки 4 культивирования (см. таблицу 7 ниже). Затем культуральный супернатант анализировали электрофорезом SDS-PAGE (4-12% бис-Трис, невосстанавливающие условия), и результаты анализа SDS-PAGE и их график представлены на фиг. 6.
[127]
[128]
[129] Как показано на фиг.6, было установлено, что культуральные супернатанты культуры с обработкой декстраном сульфатом, имеющим средневзвешенную молекулярную массу 500 кДа, показали значительно более сниженный феномен клиппинга бифункционального белка по сравнению с культуральными супернатантами культуры без обработки декстраном сульфатом. Кроме того, было установлено, что при изменении температуры во время культивирования феномен клиппинга бифункционального белка ингибировался более эффективно.
--->
<110> YUHAN CORPORATION
<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
<130> PCB802025YUH
<160> 56
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> человеческий FGF21
<400> 1
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 2
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 2
Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu
20 25 30
<210> 3
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 3
Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> линкер
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
<210> 6
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 6
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 7
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 7
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 8
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 8
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 9
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 9
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 10
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 10
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 11
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 11
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 12
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 12
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 13
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 13
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 14
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 14
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Ala Ser
180
<210> 15
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 15
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 16
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 16
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 17
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 17
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 18
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 18
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 19
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 19
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 20
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 20
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 21
<211> 182
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 21
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 22
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 22
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 23
<211> 181
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 23
His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val
1 5 10 15
Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His
20 25 30
Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser
35 40 45
Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln
50 55 60
Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg
85 90 95
Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His
100 105 110
Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro
115 120 125
Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Asn Arg Ser
165 170 175
Pro Ser Tyr Glu Ser
180
<210> 24
<211> 229
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IgG4 Fc человека
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 25
<211> 228
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант IgG4 Fc человека
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly
225
<210> 26
<211> 223
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант гибридной Fc
<400> 26
Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215 220
<210> 27
<211> 245
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная Fc5
<400> 27
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys
1 5 10 15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His
20 25 30
Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
35 40 45
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
50 55 60
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
65 70 75 80
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
85 90 95
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
100 105 110
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
115 120 125
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
130 135 140
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
145 150 155 160
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
165 170 175
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
180 185 190
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
195 200 205
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
210 215 220
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Gly Lys
245
<210> 28
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> гибридная Fc40
<400> 28
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
1 5 10 15
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
225 230
<210> 29
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP-1
<400> 29
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 30
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1
<400> 30
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 31
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1
<400> 31
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1
<400> 32
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 31
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1
<400> 33
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 276
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc5
<400> 34
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys
275
<210> 35
<211> 264
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc40
<400> 35
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
260
<210> 36
<211> 276
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5
<400> 36
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys
275
<210> 37
<211> 264
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc40
<400> 37
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
260
<210> 38
<211> 276
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5
<400> 38
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys
275
<210> 39
<211> 264
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc40
<400> 39
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
260
<210> 40
<211> 276
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридом Fc5
<400> 40
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys
275
<210> 41
<211> 264
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант GLP-1, связанный с гибридной Fc40
<400> 41
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
260
<210> 42
<211> 275
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Дулаглутид
<400> 42
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu
35 40 45
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly
275
<210> 43
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(A2G)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 43
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
450 455 460
<210> 44
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GE)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 44
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
290 295 300
Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
305 310 315 320
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
325 330 335
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
340 345 350
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
355 360 365
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
370 375 380
Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
385 390 395 400
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
405 410 415
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
420 425 430
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
435 440 445
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu
450 455 460
Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 45
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GE)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 45
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
450 455 460
<210> 46
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 46
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
290 295 300
Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
305 310 315 320
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
325 330 335
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
340 345 350
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
355 360 365
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
370 375 380
Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
385 390 395 400
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
405 410 415
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
420 425 430
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
435 440 445
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu
450 455 460
Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 47
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 47
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
450 455 460
<210> 48
<211> 473
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GEG)-HyFc5-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 48
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu
35 40 45
Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr
50 55 60
Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
65 70 75 80
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
85 90 95
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
100 105 110
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
115 120 125
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
130 135 140
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
145 150 155 160
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
165 170 175
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
180 185 190
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
195 200 205
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
210 215 220
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
225 230 235 240
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
245 250 255
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
260 265 270
Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly
290 295 300
Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr
305 310 315 320
Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala
325 330 335
Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly
340 345 350
Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg
355 360 365
Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys
370 375 380
Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser
385 390 395 400
Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His
405 410 415
Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly
420 425 430
Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro
435 440 445
Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu
450 455 460
Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
465 470
<210> 49
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV)
<400> 49
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Ala Ser
450 455 460
<210> 50
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAV, A180E)
<400> 50
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Val Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
450 455 460
<210> 51
<211> 461
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, TGLEAN, A180E)
<400> 51
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
450 455 460
<210> 52
<211> 460
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> GLP1(GEG)-HyFc40-GS3-FGF21(EIRP, G170N, A180E)
<400> 52
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35 40 45
Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
50 55 60
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
65 70 75 80
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
85 90 95
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
100 105 110
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
115 120 125
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
145 150 155 160
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
180 185 190
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
195 200 205
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
210 215 220
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu
275 280 285
Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp
290 295 300
Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val
305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe
340 345 350
Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp
355 360 365
Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn
370 375 380
Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn
385 390 395 400
Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu
405 410 415
Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu
420 425 430
Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val
435 440 445
Asn Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Glu Ser
450 455 460
<210> 53
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 53
Glu Ile Arg Pro
1
<210> 54
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 54
Thr Gly Leu Glu Ala Val
1 5
<210> 55
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариант FGF21
<400> 55
Thr Gly Leu Glu Ala Asn
1 5
<210> 56
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> производные последовательности
<400> 56
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА, ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ И ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ СЛИТЫЕ БЕЛКИ | 2017 |
|
RU2795548C2 |
| БЕЛКИ С ДВОЙНОЙ ФУНКЦИЕЙ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 2016 |
|
RU2741345C2 |
| СЛИТЫЕ С FGF21 БЕЛКИ ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 2016 |
|
RU2741087C2 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2807802C1 |
| МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ МУЛЬТИМЕРНЫЙ БИОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОЛИМЕР, ИМЕЮЩИЙ ПРОЛОНГИРОВАННУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ IN VIVO | 2020 |
|
RU2805307C1 |
| Моноклональное антитело, специфично связывающееся с эпитопом тиоредоксина-1, его получение и применение | 2018 |
|
RU2791264C2 |
| АНТИТЕЛО К РЕЦЕПТОРУ ТРОМБОЦИТАРНОГО ФАКТОРА РОСТА (PDGF) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2778023C1 |
| Новый вариант О-сукцинилгомосеринтрансферазы и способ получения О-сукцинилгомосерина с использованием этого варианта | 2018 |
|
RU2747493C1 |
| АНТИ-LILRB1 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2801535C1 |
| МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МИТОХОНДРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2811467C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным способам продукции белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки–хозяина млекопитающего. Способ включает трансформацию клетки-хозяина ДНК-вектором, экспрессирующим бифункциональный белок, и культивирование клетки-хозяина в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата. Изобретение обеспечивает стабильную продукцию целевого белка посредством эффективного предотвращения разложения целевого белка предложенным способом. 4 з.п. ф-лы, 6 ил.,7 табл., 3 пр.
1. Способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки–хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок, где способ включает культивирование клетки–хозяина млекопитающего в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок; и Fc–область иммуноглобулина, где указанный рекомбинантный бифункциональный белок содержит последовательность SEQ ID NO: 51 или состоит из нее и
где декстрана сульфат имеет среднемассовую молекулярную массу от 20 до 5000 кДа.
2. Способ по п.1, где культуральная среда содержит декстрана сульфат в концентрации от 0,01 до 10 г/л.
3. Способ по любому из пп.1, 2, где культивирование включает:
стадию первичного культивирования клетки–хозяина млекопитающего при 34–37°С в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата и
стадию вторичного культивирования первичной культуральной среды при 28–33°С.
4. Способ по п.3, где первичное культивирование проводят в течение от 24 до 144 ч.
5. Способ по п.3, где вторичное культивирование проводят при температуре от 31°С до 33°С.
| US 8557771 B2, 15.10.2013 | |||
| US 20140243503 A1, 28.08.2014 | |||
| КУЗЬМИНА Н | |||
| Е | |||
| и др | |||
| КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ ДЕКСТРАНОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИОННО-УПОРЯДОЧЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР, Журнал аналитической химии, 2014, т | |||
| Способ приготовления пищевого продукта сливкообразной консистенции | 1917 |
|
SU69A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| TOKURIKI N | |||
| et al | |||
| Stability effects of mutations and protein evolvability, Curr | |||
| Opin | |||
