BIDENS PILOSA И ЕЕ ФИТОХИМИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ДИАРЕИ Российский патент 2024 года по МПК A23K10/30 A23K50/30 A61P1/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к Bidens pilosa для применения в профилактике, облегчении и лечении диареи и более конкретно к Bidens pilosa и ее фитохимическим соединениям для применения в профилактике, облегчении и лечении диареи свиней.

Предшествующий уровень техники изобретения

Диарея и дизентерия являются самыми серьезными проблемами в свиноводстве. Они могут возникать от отъема до завершающего периода откорма. Это может стать хроническим заболеванием, которое продолжается в течение нескольких недель. Противомикробные стимуляторы роста (AGP (от англ. - antimicrobial growth promoter)) в качестве кормовых добавок доказали свою эффективность в снижении диареи свиней и улучшении показателей роста в свиноводстве. Однако известно, что AGP индуцирует у патогенов устойчивость к антибиотикам. Поэтому AGP для животных запрещен в Европейском Союзе с 2006 года.

С древних времен растения были прекрасным источником лекарств для людей и животных. Фитотерапевтический подход может уменьшить или заменить злоупотребление или неправильное использование AGP у свиней и способствовать производству мяса.

Краткое раскрытие изобретения Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к способу уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, при этом патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одного представителя, выбранного из группы, состоящей из Brachyspira spp,, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV (от англ. - porcine epidemic diarrhea virus)), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV (от англ. - transmissible gastroenteritis coronavirus)) и ротавируса (RVot англ. - rotavirus).

В одном из воплощений способ включает введение животному, нуждающемуся в этом, композиции, состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa, где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

В еще одном аспекте изобретение относится к применению композиции для уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где композиция, обладающая активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, и

дополнительно где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

В одном из воплощений применение по изобретению дополнительно включает применение указанной композиции для повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом.

В еще одном аспекте изобретение относится к лекарственному средству для лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанное лекарственное средство по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

В одном из воплощений лекарственное средство по изобретению дополнительно включает лекарственное средство для повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом.

Дополнительно еще в одном аспекте изобретение относится к способу уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника и повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, и нуждающемуся в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней, при этом композиция по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

Композиция в соответствии с настоящим изобретением также предназначена для применения в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей Bidens pilosa или активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, в изготовлении лекарственного средства для лечения, ингибирования и/или уменьшения возникновения диареи свиней, дизентерии свиней, вирусной инфекции свиней и повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней.

Кроме того, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей Bidens pilosa или активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или уменьшения возникновения дизентерии свиней, связанной с Brachyspira, и повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения диарея свиней, дизентерия свиней и вирусная инфекция свиней связаны по меньшей мере с одним представителем патогенной микробиоты кишечника, выбранным из группы, состоящей из Brachyspira., вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

Согласно одному варианту осуществления представитель патогенной микробиоты кишечника может быть выбран из Brachyspira spp.Представителем патогенной микробиоты кишечника может быть Brachyspira hyodysenteriae. Животное, нуждающееся в лечении, может представлять собой поросенка-отъемыша или подрощенного поросенка.

Согласно другому варианту осуществления активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, представляет собой полиацетиленовое соединение формулы (I):

где:

R₁ представляет собой Н или СН₃;

R₂ представляет собой моносахарид;

R₃ представляет собой Н или СОСН₂СООН;

m равно 3 или 4;

n равно 0 или 1;

о равно 1 или 2; и

р равно 1 или 2.

Согласно другому варианту осуществления активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из:

и

Bidens pilosa может находиться в порошковой форме. Композиция может находиться в форме корма, кормового материала для животного или лекарства.

Согласно другому варианту осуществления композиция находится в дозированной форме, выбранной из группы, состоящей из пероральной формы, капсулы, суппозитория и парентеральной формы.

Согласно другому варианту осуществления Bidens pilosa или активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, находится в дозировке не менее чем 1 мкг/кг массы тела животного, нуждающегося в этом.

Согласно другому варианту осуществления композиция содержит корм для животных и Bidens pilosa, варьирующую в диапазоне от 0,0005 масс./масс. % до 15 масс./масс. %.

Согласно другому варианту осуществления композиция содержит корм для животных и Bidens pilosa, варьирующую в диапазоне от 0,05 масс./масс. % до 15 масс/масс. %. Композиция может содержать корм для животных и Bidens pilosa, варьирующую в диапазоне от 0,1 масс./масс. % до 15 масс./масс. %, от 1 масс/масс. % до 15 масс/масс. % или от 1 масс./масс. % до 10 масс./масс. %.

Согласно другому варианту осуществления активное соединение, выделенное из Bidens pilosa, представляет собой цитопилоин.

Эти и другие аспекты станут очевидными из последующего раскрытия предпочтительного варианта осуществления, представленного вместе со следующими графическими материалами, хотя могут рассматриваться их варианты и модификации без отклонения от сути и объема новых концепций настоящего раскрытия.

Прилагаемые графические материалы иллюстрируют один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и вместе с письменным раскрытием служат для объяснения принципов настоящего изобретения. По возможности, одни и те же ссылочные позиции используются в графических материалах для обозначения одних и тех же или подобных элементов варианта осуществления.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана схема введения доз. Пять групп 4-недельных поросят -отъемышей, получавших корм с антибиотическим стимулятором роста (AGP), стандартный рацион (0% BP (от лат.Bidens pilosa)) и стандартный рацион, содержащий порошок В. pilosa (LBP (от англ. - low dose Bidens pilosa - низкая доза Bidens pilosa), MBP (от англ. - medium dose Bidens pilosa - средняя доза Bidens pilosa) и HBP (от англ. - high dose Bidens pilosa - высокая доза Bidens pilosa)) в течение 4 недель. LBP, MBP и HPB относятся к рациону, содержащему 1, 2, 5% порошка В. pilosa, соответственно.

На фиг. 2 показан эффект В. pilosa в отношении диареи у поросят-отъемышей. У поросят из-за естественной инфекции развивалась диарея. Возникновение диареи контролировали ежедневно в течение 28 суток. Количество поросят составляло 10 в каждой группе. Р-значения оценивали с помощью логарифмического рангового критерия Каплана-Мейера для определения разницы в результатах между контрольной (0% BP) и каждой из получавших лечение групп, и показано р менее 0,05 (*) (А). Таблица, демонстрирующая р-значения для попарных сравнений кривых без диареи (В).

На фиг. 3 показано влияние В. piolosa на кишечную патологию у свиней. (А) Окрашивание гематоксилином и эозином (Н&Е (от анл. - Hematoxylin and Eosin)) двенадцатиперстной кишки (1-й ряд), тощей кишки (2-й ряд) и подвздошной кишки (3-й ряд) свиней. (В) Отношение длины ворсинок к длине крипт двенадцатиперстной кишки (левая панель), тощей кишки (средняя панель) и подвздошной кишки (правая панель) свиньи. Применяли ANOVA (от англ. - ANalysis Of VAriance - дисперсионный анализ) для сравнения различия между контролем (0% BP) и каждой из получавших лечение групп, и показаны р менее 0,05 (*).

На фиг. 4 показано влияние В. piolosa на длину тела (4А), процент массы тела (4 В) и процентное отношение костной массы у поросят-отъемышей (4С). Пять групп 4-недельных поросят-отъемышей, получавших стандартный рацион (0% BP) и стандартный рацион, содержащий порошок В. pilosa (BP) и AGP, в течение 4 недель. Размер тела (4А), массу тела (4 В) и костную массу (4С) контролировали еженедельно в течение 4 недель. Число поросят на группу составляло 10. Применяли ANOVA для сравнения различия между контролем (0% BP) и каждой из получавших лечение групп в конце 4-ой недели лечения.

На фиг. 5 показан эффект В. piolosa в отношении процентного изменения кишечной микробиоты (пробиотиков) у поросят на стадии отъема.

На фиг. 6 показан эффект В. piolosa в отношении процентного изменения кишечной микробиоты (патогенов) у поросят на стадии отъема.

На фиг. 7 показан эффект В. piolosa в отношении дизентерии свиней у поросят на стадии выращивания/завершающего периода откорма. У поросят развивалась дизентерия свиней после заражения Brachyspira spp.Возникновение дизентерии свиней контролировали каждый день после стадии отъема до возраста 35 недель. Число поросят составляло 10 в каждой группе. Р-значения оценивали с помощью логарифмического рангового критерия Каплана-Мейера для определения различия в результатах между контрольной (0% BP) и каждой из получавшей лечение групп, и показано р менее 0,05 (*) (А). В таблице показаны р-значения для попарных сравнений кривых без дизентерии свиней (В).

Подробное раскрытие изобретения

Определения

Корм для животных относится к корму для домашнего скота и корму для домашних животных (животных-компаньонов).

Используемый в настоящем документе термин «чистое соединение» относится к соединению, характеризующемуся чистотой по меньшей мере 80% (например, 95% или 99%).

Термин «процесс лечения» или «лечение» относится к применению эффективного средства для субъекта, нуждающегося в этом, с целью излечения, облегчения, ослабления, устранения, купирования, уменьшения или профилактики заболевания, его симптомов или предрасположенности к нему.

В «Руководстве для промышленности и рецензентов по оценке безопасной начальной дозы в клинических испытаниях терапевтических средств для взрослых здоровых добровольцев», опубликованном Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США, раскрывается, что «эквивалентная доза для человека» может быть получена путем вычислений по следующей формуле:

HED - доза для животного в мг/кг × (масса животного в кг/масса человека в кг)^0,33.

Настоящее изобретение относится к средству растительного происхождения для замещения противомикробных стимуляторов роста (AGP) в кормовых добавках для свиней с целью уменьшения диареи свиней, улучшения здоровья свиней и повышения показателей роста.

Сначала получали порошок В. pilosa. Рационы животных составляли путем смешивания с разными процентами порошка В. pilosa.

Препарат Bidens pilosa. Препарат может быть получен путем смешивания измельченных растений Bidens pilosa в воде при повышенной температуре (например, при 50°С или 100°С) с образованием суспензии и сбора надосадочной жидкости суспензии. Надосадочная жидкость далее может быть экстрагирована спиртом (например, н-бутанолом) с обеспечением обогащенного препарата. Препарат Bidens pilosa (экстракт) содержит одно или несколько из полиацетиленовых соединений. Например, он содержит цитопилоин:

Полиацетиленовые соединения, раскрываемые выше, включают в себя сами соединения, а также их соли, пролекарства и сольваты, если применимо. Такие соли, например, могут быть образованы путем взаимодействия между отрицательно заряженным заместителем (например, карбоксил атом) в полиацетиленовом соединении и катионом. Подходящие катионы включают в себя без ограничения ион натрия, ион калия, ион магния, ион кальция и катион аммония (например, ион тетраметиламмония). Подобным образом, положительно заряженный заместитель (например, амино) в полиацетиленовом соединении может образовывать соль с отрицательно заряженным противоионом. Подходящие противоионы включают в себя без ограничения хлорид, бромид, йодид, сульфат, нитрат, фосфат или ацетат. Примеры пролекарств включают в себя сложные эфиры и другие фармацевтически приемлемые производные, которые при введении субъекту способны обеспечивать раскрываемые выше соединения. Сольват относится к комплексу, образованному полиацетиленовым соединением и фармацевтически приемлемым растворителем. Примеры фармацевтически приемлемых растворителей включают в себя воду, этанол, изопропанол, н-бутанол, этилацетат и уксусную кислоту.

Полиацетиленовые соединения могут содержать один или несколько центров асимметрии или неароматическую двойную связь. Таким образом, они могут существовать как рацематы и рацемические смеси, отдельные энантиомеры, индивидуальные диастереомеры, диастереомерные смеси и цис-или транс-изомерные формы. Предусматриваются все такие изомерные формы.

Полиацетиленовые соединения

Полиацетиленовые соединения (например, цитопилоин) могут быть выделены из Bidens pilosa. Цельные растения Bidens pilosa сначала измельчают, а затем перемешивают в горячей воде. После удаления нерастворимых материалов (например, путем фильтрования, декантации или центрифугирования) полученную надосадочную жидкость подвергают жидкостной хроматографии (например, жидкостной хроматографии при высоком давлении) или другим подходящим способам с получением чистых полиацетиленовых соединений. Полученные таким образом чистые соединения могут быть далее дериватизированы для обеспечения ряда других полиацетиленовых соединений в соответствии с настоящим изобретением (патент США №7763285 и Kusano et al. (патентный документ Японии №2004083463), которые включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме).

Раскрываемые выше полиацетиленовые соединения также могут быть получены традиционными способами. Ниже представлены три схемы реакций, иллюстрирующие способы синтеза полиацетиленового соединения в соответствии с настоящим изобретением.

Схема 1

Осуществляют реагирование бутан-1,2,4-триола (i) с ацетоном с образованием защищенного 1,2,4-триольного соединения (ii), которое может быть легко превращено в содержащее йод производное (iii). Затем осуществляют реагирование соединения (iii) с этинилтриметилсиланом в основных условиях (например, n-BuLi (от англ. - n-butyllithium - н-бутиллитий)) с получением (4-(2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-ил)бут-1-инил)триметилсилана (iv). Затем соединение (iv) обрабатывают кислотой (например, уксусной кислотой) с последующей реакцией соединения с 2-бромгликопиранозой с получением аддукта (v). Соединение (v) может быть далее обработано фторидом калия с получением 2-фенил-4Н-хромен-4-она (vi).

Схема 2

Осуществляют реагирование 1-бромпроп-1-ина (vii) с бромидом этинилмагния с получением пента-1,3-диина (viii), который далее превращают в гепта-1,3,5-триин (ix). Соединение (ix) может быть легко превращено в 1-йодгепта-1,3,5-триин (х) в основных условиях (например, n-BuLi) с последующим добавлением соединения йода (например, I₂).

Схема 3

На схеме 3 показана реакция соединения ацетиленового производного (vi), полученного по схеме 1, и 1-йодгепта-1,3,5-триина (х), полученного по схеме 2, с тетраиновым соединением (xi). Удаление защитных групп дает полиацетиленовое соединение 20-О-глюкопиранозилокси-1 -гидрокситридека-5,7,9,11-тетраин - соединение в соответствии с настоящим изобретением.

Синтетические химические преобразования, применимые в синтезе заявляемых соединений, раскрываются, например, в R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), а также в их последующих изданиях.

Композиция для перорального введения может находиться в любой перорально приемлемой дозированной форме, включая капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток традиционно применимые носители включают в себя лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, также добавляют смазывающие средства, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсулы применимые разбавители включают в себя лактозу и сухой кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент может быть суспендирован или растворен в масляной фазе при объединении с эмульгирующими или суспендирующими средствами. При необходимости могут быть добавлены некоторые подсластители, ароматизаторы или красители.

Растения Bidens pilosa собирали. Приблизительно 10 кг очищенных и измельченных растений целиком нагревали с обратным холодильником в 40 л воды в течение двух часов. После удаления водной фазы нерастворимые материалы снова нагревали с обратным холодильником в 25 л воды в течение двух часов.

Объединенные водные растворы (приблизительно 65 л) упаривали в вакууме с получением остатка, который затем суспендировали в 1,0 л воды и трижды экстрагировали с 1,0 л н-бутанола. Фракцию н-бутанола сначала упаривали на вакуумном роторном испарителе при пониженном давлении, а затем лиофилизировали с получением неочищенного продукта цитопилоина (37,7 г).

Неочищенный продукт затем хроматографировали на колонке с силикагелем RP-18 с градиентной системой растворителей СН₃ОН/H₂O с получением субфракций ВРВ1, ВРВ2, ВРВ3 и ВРВ4. Фракцию ВРВ3, элюируемую с помощью 70% СН₃ОН, далее фракционировали полупрепаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией ВЭЖХ с использованием системы растворителей СН₃ОН/H₂O. Получали цитопилоин и характеризовали с помощью ¹Н ядерного магнитного резонанса ЯМР и ¹³С ЯМР.

¹Н ЯМР (500 МГц, CDOD₃) δ 1,78 (2Н, q, J=6,8 Гц), 1,98 (3Н, s), 2,58 (2Н, t, J=6,8 Гц), 3,19 (1Н, dd, J=9,1, 7,8 Гц), 3,30 (1Н, гл), 3,34 (1Н, гл), 3,59 (2Н, гл), 3,65 (1Н, dd, J=12,0, 6,5 Гц), 3,75 (1Н, р, J=6,8 Гц), 3,85 (1Н, dd, J=12,0, 1,7 Гц), 4,32 (1Н, d, J=7,8 Гц); ¹³С ЯМР (125 МГц, CDOD₃) 5 3,8, 16,1, 31,4, 60,0, 60,9, 61,8, 62,4, 62,6, 64,9, 65,8, 66,2, 71,5, 75,2, 77,9, 81,6, 104,8.

Расчет процента порошка Bidens pilosa (ВРР (от англ. - Bidens pilosa powder)) осуществляли следующим образом: масса порошка Biden pZ/osa/масса порошка Biden pilosa + основного корма для цыплят = % ВРР.

От 0,0005 масс./масс. % до 15 масс./масс. % означает, что все количества в десятитысячных, тысячных, сотых, десятых и целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, количества в 0,0005%, 0,0006%, 0,0007%… 0,001%, 0,002%, 0,003%… 0,01%, 0,02%, 0,03%… 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% и 1%, 2%, 3%, 4%… 13%, 14% и 15% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения.

От 0,05 масс/масс. % до 15 масс./масс. %означает, что все количества в сотых, десятых и целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, количества в 0,05%, 0,06%, 0,07%… 0,01%, 0,02%, 0,03%… 0,1%, 0,2%, 0,3%… и 1%, 2%, 3%, 4%… 13%, 14% и 15% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения. От 0,1 масс./масс. % до 15 масс./масс. %означает, что все количества в десятых и целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, количества в 0,1%, 0,2%, 0,3%… и 1%, 2%, 3%, 4%… 13%, 14% и 15% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения. От 1 масс./масс. % до 15 масс/масс. % означает, что все количества в целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, количества в 1%, 2%, 3%, 4%… 13%, 14% и 15% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения. От 1 масс./масс. % до 10 масс/масс. % означает, что все количества в целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, количества в 1%, 2%, 3%, 4%… 8%, 9% и 10% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения. От 1 масс/масс. % до 5 масс/масс. %означает, что все количества в целых единицах в данном диапазоне конкретно раскрываются как часть настоящего изобретения. Таким образом, 1%, 1-2%, 1-3%, 1-4%, 2%, 2-3%, 2-4%, 2-5%, 3%, 3-4%, 3-5%, 4%, 4-5% и 5% единицах включены как варианты осуществления настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Без ограничения объема настоящего изобретения ниже приводятся иллюстративные инструменты, устройства, способы и связанные с ними результаты согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Следует отметить, что заголовки или подзаголовки могут быть использованы в примерах для удобства читателя, и никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения. Более того, в настоящем документе предлагаются и раскрываются определенные теории; однако они никоим образом, будь то правильные или неправильные, не должны ограничивать объем настоящего изобретения, если настоящее изобретение осуществляется на практике без учета какой-либо конкретной теории или схемы действия.

Материалы и способы

Животные, все относящиеся к животным протоколы в данном исследовании соответствовали Руководству по использованию лабораторных животных.

Новорожденных кроссбредных поросят (Duroc × Landrace × Yorkshire) выращивали в боксах для опороса с решетчатым металлическим полом со свиноматками с обеспечением дополнительного обогрева. Поросятам скалывали зубы, купировали хвосты и вводили инъекцией железо, а самцов кастрировали. Подкормку не предусматривали. После отъема через 24 дня отбирали 50 поросят с наиболее близкой массой тела (7,42 плюс/минус 0,38 кг), переводили в помещения для доращивания и распределяли по массе тела на пять групп. Каждый загон был размером 3,7×2,6 м с решетчатым металлическим полом и содержал три ниппельных поилки и две автоматических кормушки, а дополнительный обогрев обеспечивали инфракрасными нагревательными лампами.

Поросят кормили рационами на основе кукурузы, полножирной соевой муки и порошковой сыворотки с добавлением AGP или трех различных доз (высокой, средней и высокой доз) В. pliosa в течение 4 недель (фиг. 1). Питательные вещества рационов обеспечивали таким образом, чтобы они соответствовали потребностям или превышали потребности поросят-отъемышей. Корм и воду предоставляли ad libitum. Корм обеспечивали в форме муки.

Поросят взвешивали и измеряли потребление корма в загоне в начале и в дни 7, 14, 21 и 28 эксперимента. Поросят в возрасте 28 дней заражали естественной инфекцией, при которой они инфицировались патогенами, присутствующими в загонах для поросят, или Brachyspira spp.Вычисляли прибавку массы, потребление корма и отношение количества корма к привесу у поросят в загоне в каждом периоде. Оценку кала контролировали три раза в день в 08.00, 12.00 и 16.00 часов с использованием субъективной системы оценок. Кал в загоне оценивали следующим образом: 1 - тяжелая диарея; 2 - средняя диарея; 3 - мягкий кал; 4 - нормальный кал; 5 - твердый, но сухой кал (Song, Y. S., V. G. Perez, J. Е. Pettigrew, С. Martinez-Villaluenga, and E. G. de Mejia. 2010 "Fermentation of soybean meal and its inclusion in diets for newly weaned pigs reduced diarrhea and measures of immunoreactivity in the plasma" Anim. Feed Sci. Technol. 159:41-49). Для оценки кишечной патологии кишечники, удаленные из каждой получавшей обработку группы умерщвленных поросят, фиксировали формалином и заливали парафином. Предметные стекла препарата кишечника окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и исследовали под микроскопом.

Дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК бактерий кишечника, собранную из кала поросят в обрабатываемых В. pilosa и необрабатываемых группах, очищали и использовали в качестве матриц для полимеразной цепной реакции (ПЦР с праймерами 16S рРНК (от англ. - rRNA (ribosomal ribonucleic acid) - рибосомная рибонуклеиновая кислота): прямой праймер 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC (SEQ ID NO: 2), для получения библиотеки ампликонов 16S рРНК. Использовали ампликоны 16S рРНК для системы Illumine MiSeq с целью систематизации и классификации кишечной микробиоты поросят-отъемышей. Чтобы подготовить библиотеку ампликонов 16S рРНК, использовали последовательности пар праймеров для областей V3 и V4, которые создают один ампликон приблизительно 460 пар оснований. Амплифицировали области V3 и V4 и с использованием ПЦР с ограниченным циклом добавляли адаптеры секвенирования lllumina и штрих-коды с двойным индексом к целевому ампликону. С использованием полной комплементарной последовательности индексов Nextera XT можно объединять до 96 библиотек для секвенирования. При секвенировании на MiSeq с использованием парных считываний по 300 пар оснований и реагентов MiSeq V3 концы каждого считывания перекрываются с образованием высококачественных полноразмерных считываний областей V3 и V4 за один 65-часовой цикл. Результаты секвенирования ампликонов гена 16S рРНК будут проанализированы с помощью базы данных MiSeq Reporter, BaseSpace и Greengenes с целью систематизации и классификации кишечной микробиоты.

Статистический анализ

Данные анализировали с использованием программного обеспечения STATRAPHIC plus от Statistical Graphics Corp.Значения представлены как среднее плюс/минус стандартное отклонение (s.d. (от англ. - standard deviation)). Применяли анализ ANOVA и/или t-критерий Стьюдента для оценивания различий между контролем (0% BP) и получавшими обработку группами. Для анализа принимали уровень значимости 5%.

Результаты

Эффект В. pilosa в отношении диареи, связанной с кишечной патологией у поросят-отъемышей. Поросят-отъемышей распределяли в группы и кормили антибиотическим стимулятором роста (AGP), стандартным рационом (0% BP, CTL) и стандартным рационом, содержащим порошок В. pilosa (LBP (1%), MBP (2%) и HBP (5%)) в течение 4 недель (фиг. 1). Поросят инфицировали патогенами в загонах для поросят (естественной инфекцией) или Brachyspira spp.в день 28. Оценку кала этих поросят контролировали три раза в день и регистрировали состояние диареи. У ста процентов поросят-отъемышей в группе, которую кормили стандартным рационом (0% BP), наблюдали более низкие оценки, и в первую неделю у них развивалась диарея (фиг. 2). Однако рацион, содержащий AGP или В. pilosa, мог снижать число случаев диареи у поросят-отъемышей на 75% - 95% (фиг. 2). В. pilosa значительно уменьшала диарею (фиг. 2) и повышала оценку кала (таблица 1) у поросят-отъемышей, о чем свидетельствуют группы поросят, получавших высокие и средние дозы. Изучали эффект в отношении кишечной патологии в 5 группах поросят.Ворсинки и крипты в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке у контрольных поросят, которых кормили стандартным рационом (0% BP), были хуже таковых в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке у поросят, которых кормили рационом, содержащим различные дозы В. pilosa, а также AGP (фиг. ЗА). Отношение длины ворсинок к длине крипт в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке у контрольных поросят (0% BP) было ниже такового в двенадцатиперстной кишке, тощей кишке и подвздошной кишке у поросят, получавших различные дозы В. pilosa, а также AGP (фиг. ЗВ). Данные свидетельствуют о том, что В. pilosa подавляет диарею и кишечную патологию у свиней. В таблице 1 показан эффект В. pilosa в отношении улучшения оценки кала поросят-отъемышей.

В. pilosa улучшает процент прибавки массы, массы туши, костной массы и снижает FCR. Оценивали пользу В. pilosa для показателей роста поросят.Сначала контролировали прибавку массы тела и коэффициент конверсии корма (FCR (от англ. - feed conversion rate)) у поросят, которых кормили стандартным рационом или содержавшим различные дозы В. pilosa. Обнаружили, что поросята, которых кормили В. pilosa, характеризовались лучшими размером тела (фиг. 4А), прибавкой массы (фиг. 4 В), массой туши (таблица 2), длиной туши (таблица 2) и костной массой (фиг. 4С), чем поросята в получавших стандартный рацион или AGP группах. Соответственно, В. pilosa значительно снижала FCR у поросят в получавших обработку В. pilosa группах в зависимости от дозы (таблица 3). В совокупности данные продемонстрировали, что В. pilosa повышала общую массу, массу туши и костей, но снижала FCR. В таблице 2 показано, что В. pilosa улучшала качество туши поросят-отъемышей. В таблице 3 показан эффект В. pilosa в отношении снижения конверсии корма у поросят-отъемышей.

Обзор кишечной микробиоты поросят-отъемышей в получавших обработку В. pilosa или не получавших обработку группах. Анализировали эффект В. pilosa в отношении кишечных бактерий в каждой группе поросят. Выполняли анализ секвенирования следующего поколения ампликонов 16S рРНК кишечных бактерий для выявления бактериальных сообществ в кишечниках поросят-отъемышей возрастом 56 дней. Подгруппа родов бактерий Bacteroides, Megamonas, Lachnospiraceae, Lactobacillus и Ruminococcaceae была увеличенной у получавших В. pilosa поросят (фиг. 5). Сообщалось, что все вышеперечисленные роды являются полезной микробиотой. Также обнаружили, что в кишечнике поросят 10 родов бактерий, связанных с кишечной патологией, были уменьшены (фиг. 6). Эти бактерии, в том числе Butyricicoccus, Anaeroplasma, Anaerostipes, Phascolarctobacterium, Clostridium (Ruminococcaceae), Enterococcus, Acinetobacter, Campylobacteria, Escherichia!Shigella и Clostridium (Clostridiaceae), известны как условно-патогенные микроорганизмы животного происхождения, которые поражают не только домашних животных, но также вызывают проблемы со здоровьем у людей.

Эффект В. pilosa в отношении дизентерии свиней у поросят на стадии выращивания/завершающего периода откорма. Контролировали клиническое поведение поросят на стадии выращивания/завершающего периода откорма после отъема до возраста 35 недель. Всех поросят заражали Brachyspira spp.У контрольных поросят в группе, которую кормили стандартным рационом (0% BP, CTL, фиг. 7А), развивалась дизентерия свиней в первый месяц после стадии отъема. У поросят, получавших низкую дозу (LBP, фиг. 7А) и высокую дозу (НВР, фиг. 7А) В. pilosa, дизентерия свиней снижалась на 75% и 100%, соответственно (фиг. 7А). Статистический анализ этих экспериментов был выполнен и представлен на фиг. 7 В.

Эффект В. pilosa в отношении снижения присутствия вирусов и бактерий у поросят. Также изучали эффект В. pilosa в отношении числа поросят с присутствующими вирусами и патогенными бактериями после естественной инфекции на свинофермах. Семь из 7 контрольных поросят, которых кормили стандартными рационами, инфицировались вирусом эпизоотической диареи свиней (PEDV) (CTL, PEDV, таблица 4). НапротиВ. В. pilosa зависимым от дозы образом снижала присутствие PEDV у поросят, которых кормили рационом, содержащим различные дозы В. pilosa (LBP, MBP и HBP, PEDV, таблица 4). Так было в случае с коронавирусом инфекционного гастроэнтерита (TGEV, таблица 4) и ротавирусом (RV, таблица 4). Подобным образом, 7 из 7 контрольных поросят, которых кормили стандартными рационами, были положительными по С, perfringens (контроль, Clostridium perfringens, таблица 4). НапротиВ. В. pilosa зависимым от дозы образом снижала присутствие С.perfringens у поросят, которых кормили рационом, содержащим различные дозы В. pilosa (LBP, MBP и HBP, Clostridium perfringens, таблица 4). Так было в случае с энтеропатогенной Е, coli и Salmonella spp, (Е. coli и Salmonella spp,, таблица 4). К сожалению, В. hyodysenteriae обнаружить не удалось (Brachyspira hyodysenteriae, таблица 4). В целом В. pilosa уменьшала не только клинические симптомы диареи/дизентерии, но также уменьшала долю вызывающих диарею патогенов в кишечниках поросят, что позволяет предположить, что это растение не только подавляло патогенные бактерии и вирусы при состояниях диареи на стадии отъема, но также уменьшало дизентерию свиней на стадии выращивания/завершающего периода откорма.

В таблице 4 показано число поросят, у которых семь патогенов в образцах их слюны, крови и толстой кишки выявляли с помощью биочипа ДНК мультиплексной ПЦР или ELISA (от англ. - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - иммуноферментный твердофазный анализ) в последний день стадии отъема. Термин «ND» означает «невыявляемый».

Таким образом, свиней-отъемышей кормили кормовым рационом, содержащей антибиотик или В. pilosa в качестве кормовой добавки, в течение 28 дней. Анализировали прибавку массы, потребление корма, оценку кала, биохимию сыворотки крови, кишечную патологию, модуляцию кишечной микробиоты и качество туши. У животных, получавших обработку антибиотиком или В. pilosa, наблюдали уменьшение диареи. Однако от 75% до 95% поросят в получавшей обработку В. pilosa группе демонстрировали защиту, тогда как только 75% поросят в обрабатываемой антибиотиком группе были защищены. Кроме того, получавшие обработку В. pilosa животные демонстрировали лучшее преимущество в росте и лучшую оценку формы тела, чем контрольная группа и получавшая антибиотики группа. Кроме того, получавшие обработку В. pilosa животные имели более низкую частоту дизентерии и вирусных инфекций свиней, чем контрольная группа и получавшая антибиотики группа на разных стадиях роста. В заключение, В. pilosa снижает у поросят диарею и дизентерию свиней на разных стадиях.

Все ссылочные материалы, цитируемые и обсуждаемые в настоящем описании, включены в данный документ в качестве ссылки в полном своем объеме и в той же степени, как если бы каждый ссылочный материал был включен в качестве ссылки индивидуально.

Изобретения относятся к ветеринарии. Способ уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV). Способ лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa, где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV). Применение композиции для уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где композиция, обладающая активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, и дополнительно где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV). Лекарственное средство для лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанное лекарственное средство по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV). Способ уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника и повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, и нуждающемуся в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней, при этом композиция по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV). Изобретения позволяют уменьшить или заменить злоупотребление или неправильное использование противомикробных стимуляторов роста (AGP) у свиней и способствовать производству мяса. 5 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Способ уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

2. Способ по п. 1, где композиция состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного.

3. Способ лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает:

введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, состоящей из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

4. Способ по пп. 1, 2 или 3, где указанное нуждающееся в этом животное имеет диарейное заболевание, выбранное из группы, состоящей из: дизентерии свиней, эпизоотической диареи свиней, инфекционного гастроэнтерита и ротавирусной диареи; и нуждается в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где животное, нуждающееся в лечении, представляет собой поросенка-отъемыша.

6. Способ по любому из пп. 1-4, где животное, нуждающееся в лечении, представляет собой подрощенного поросенка.

7. Способ по любому из пп. 1-4, где экстракт Bidens pilosa содержит активное соединение формулы (I):

где:

R₁ представляет собой Н или СН₃;

R₂ представляет собой моносахарид;

R₃ представляет собой Н или СОСН₂СООН;

m равно 3 или 4;

n равно 0 или 1;

о равно 1 или 2; и

р равно 1 или 2.

8. Способ по п. 7, где активное соединение представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из:

9. Способ по любому из пп. 1-4, где экстракт Bidens pilosa находится в порошковой форме.

10. Способ по любому из пп. 1-4, где композиция находится в форме корма, кормового материала для животного или лекарства.

11. Способ по любому из пп. 1-4, где композиция находится в дозированной форме, выбранной из группы, состоящей из: пероральной формы, капсулы, суппозитория и парентеральной формы.

12. Способ по любому из пп. 1-4, где экстракт Bidens pilosa находится в дозировке не менее чем 1 мкг/кг массы тела животного, нуждающегося в этом.

13. Способ по любому из пп. 1-2, где экстракт Bidens pilosa варьирует в диапазоне от 0,0005 масс./масс. % до 15 масс/масс. %.

14. Способ по любому из пп. 1-2, где экстракт Bidens pilosa варьирует в диапазоне от 0,05 масс./масс. % до 15 масс/масс. %.

15. Способ по любому из пп. 1-4, где экстракт Bidens pilosa содержит цитопилоин.

16. Применение композиции для уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где композиция, обладающая активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного, и дополнительно где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

17. Применение по п. 16, которое дополнительно включает применение указанной композиции для повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом.

18. Применение по п. 16, где указанное нуждающееся в этом животное нуждается в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней.

19. Лекарственное средство для лечения связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника у животного, нуждающегося в этом, где указанное лекарственное средство по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).

20. Лекарственное средство по. 19, которое дополнительно включает лекарственное средство для повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом.

21. Способ уменьшения присутствия связанной с диареей патогенной микробиоты кишечника и повышения процентного отношения массы туши и костной массы свиней у животного, нуждающегося в этом, где указанный способ включает: введение нуждающемуся в этом животному композиции, обладающей активностью против патогенной микробиоты кишечника, связанной с диареей, и нуждающемуся в повышении процентного отношения массы туши и костной массы свиней, при этом композиция по существу состоит из терапевтически эффективного количества экстракта Bidens pilosa и кормового материала для животного,

где патогенная микробиота кишечника представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из Brachyspira, вируса эпизоотической диареи свиней (PEDV), коронавируса инфекционного гастроэнтерита (TGEV) и ротавируса (RV).