МОДУЛЯЦИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГРАНУЛ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ДНК Российский патент 2024 года по МПК C08K7/16 C12Q1/6806 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Системы, способы и композиции, предложенные в настоящем документе, относятся к полимерным гранулам, способам инкапсуляции биомолекул в полимерных гранулах и способам применения полимерных гранул для проведения анализов инкапсулированных биомолекул, включая, например, секвенирование с пространственным индексом и получение библиотеки нуклеиновых кислот.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Обнаружение специфических последовательностей нуклеиновых кислот, присутствующих в биологическом образце, используют, например, в качестве способа идентификации и классификации микроорганизмов, диагностики инфекционных заболеваний, обнаружения и описания генетических аномалий, выявления генетических изменений, связанных с различными заболеваниями, такими как рак, изучения генетической предрасположенности к тому или иному заболеванию или оценки ответов на различные формы лечения. Обнаружение нуклеотидных последовательностей в биологическом образце требует множества ферментативных реакций, чтобы в конечном итоге определить нуклеотидную последовательность или сформировать библиотеку нуклеиновых кислот.

[0003] Проведение множества ферментативных реакций в одиночной клетке не обеспечивает достаточной достоверности из-за проблем, связанных с выделением и доступом к внутриклеточным биомолекулам внутри одиночной клетки в ходе множества анализов. Многие клеточные анализы не в состоянии обеспечить выделение внутриклеточных молекул, что приводит к потере биомолекул при проведении анализа.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Некоторые варианты осуществления относятся к полимерной грануле для проведения множества реакций совместного анализа. В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула содержит предшественник гидрогелевого полимера, поперечносшивающий агент и биомолекулу, размещенную внутри полимерной гранулы, причем такая гранула содержит поры, которые обеспечивают диффузию одного или более реагентов через гранулу, которая удерживает при этом биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления гранула представляет собой пористую гидрогелевую гранулу или пористую полую гранулу. В некоторых вариантах осуществления гранула содержит множество слоев полимера, причем каждый слой отличается определенным размером пор и густотой пор. В некоторых вариантах осуществления размер пор модулируют в зависимости от изменений заряда, рН или температуры.

[0005] Некоторые варианты осуществления относятся к способу проведения множества последовательных совместных анализов биомолекулы, инкапсулированной внутри полимерной гранулы. В некоторых вариантах осуществления способ включает получение полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу, причем такая полимерная гранула содержит предшественник гидрогелевого полимера, поперечносшивающий агент и биомолекулу, размещенную внутри полимерной гранулы, причем такая гранула содержит поры, которые обеспечивают диффузию одного или более реагентов через гранулу, которая удерживает при этом биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает последовательное приведение одиночной клетки в контакт с реагентами для проведения множества последовательных совместных анализов. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает модуляцию размера пор полимерной гранулы посредством регулирования заряда, рН или температуры. В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула содержит множество полимерных слоев, и каждый полимерный слой имеет поры различных размеров. В некоторых вариантах осуществления размер пор каждого полимерного слоя модулируют определенным образом посредством изменения заряда, рН или температуры. В некоторых вариантах осуществления множество последовательных совместных анализов включают лизис, анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки ДНК, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию, выполняемую последовательно.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0006] На ФИГ. 1А представлена схема, иллюстрирующая вариант осуществления пространственного индексирования длинной ДНК при получении библиотеки в проточной кювете и посеве.

[0007] На ФИГ. 1В представлена схема, иллюстрирующая пространственное индексирование с использованием полимерных гранул, инкапсулирующих молекулы длинной ДНК. Для пространственной генерации библиотеки на поверхности проточной кюветы на полимерных гранулах могут быть использованы реагенты.

[0008] На ФИГ. 2 представлена блок-схема, описывающая способ инкапсулирования длинной ДНК внутри полимерной гранулы и получение библиотеки внутри полимерной гранулы, которая может быть объединена в кластер и секвенирована в устройстве проточной кюветы.

[0009] На ФИГ. 3 представлена схема, иллюстрирующая процесс секвенирования длинной ДНК, инкапсулированной в полимерные гранулы, включая фрагменты ДНК длиной около 100 т.п.н. (без стадии амплификации с множественным вытеснением (MDA) (панель (а)) или со стадией MDA (панель (b)) до тагментации) и фрагменты ДНК длиной около 10-20 т.п.н. (панель (с)).

[0010] На ФИГ. 4 представлен график, на котором показаны стробированные чтения данных пространственного индексирования длинной ДНК в гидрогеле из фрагмента ДНК длиной 100 т.п.н. без MDA.

[0011] На ФИГ. 5 представлен линейный график связанных чтений пространственного индексирования длинной ДНК в гидрогеле из фрагментов ДНК длиной 100 т.п.н. с MDA.

[0012] На ФИГ. 6 представлен линейный график связанных чтений пространственного индексирования длинной ДНК в гидрогеле из фрагментов ДНК длиной 10 т.п.н. с MDA.

[0013] На ФИГ. 7А и 7В представлены линейные графики пространственных чтений для длинной ДНК, инкапсулированной внутри полимерной гранулы. На ФИГ. 7А представлены данные пространственных чтений для клеток, инкапсулированных внутри полимерной гранулы, а на врезке представлена микрофотография клетки внутри полимерной гранулы. На ФИГ. 7В представлены данные пространственных чтений для фрагментов длинной ДНК, инкапсулированных внутри полимерной гранулы, а на врезке представлена микрофотография фрагментов, инкапсулированных внутри полимерной гранулы.

[0014] На ФИГ. 8 представлена микрофотография, демонстрирующая идентификацию различных видов микроорганизмов, инкапсулированных внутри полимерной гранулы. Различные виды микроорганизмов инкапсулированы внутри полимерной гранулы, и для идентификации микробов проводили чтения пространственного секвенирования.

[0015] На ФИГ. 9 представлен график, на котором показано распределение чтений штрихкода для длинной ДНК, инкапсулированной внутри полимерной гранулы.

[0016] На ФИГ. 10А представлен график, на котором показаны короткие чтения и связанные чтения для одного цикла клетки Е. coli, инкапсулированной внутри полимерной гранулы. Как показано на данной фигуре, связанные чтения охватывают участки повторов и могут улучшать сборку de novo последовательности. На ФИГ. 10В представлена микрофотография, демонстрирующая пространственные связанные чтения и промежуточные короткие чтения.

[0017] На ФИГ. 11А представлена схема, иллюстрирующая диффузию молекул в полимерную гранулу в зависимости от размера пор и густоты пор. На ФИГ. 11В представлена схема, иллюстрирующая диффузию молекул вне полимерной гранулы.

[0018] На ФИГ. 12 представлена схема, иллюстрирующая удержание библиотек нуклеиновых кислот внутри полимерной гранулы.

[0019] На ФИГ. 13А и 13В представлены графики, демонстрирующие диффузию нуклеиновой кислоты в полимерную гранулу в зависимости от размера нуклеиновой кислоты. Графики отражают проникновение коротких ампликонов (от 220 т.п.н. до 1 т.п.н.) внутрь полимерных гранул, тогда как более длинные ампликоны не диффундируют в полимерные гранулы.

[0020] На ФИГ. 14 представлены микрофотографии пористых полых гранул, демонстрирующие ПЦР-амплификацию внутри пористых полых гранул как для фрагментов ДНК из 200 пар нуклеотидов, так и из 5000 пар нуклеотидов.

[0021] На ФИГ. 15 представлена схема, на которой показаны многослойные полимерные гранулы, причем каждый слой имеет разные размеры пор, а размеры пор каждого слоя можно независимо модулировать в зависимости от условий окружающей среды.

[0022] На ФИГ. 16А-16С представлены полимерные гранулы со стабилизированной оболочкой с разрушаемым полиакриламидным ядром. На ФИГ. 16А схематически представлена структура полимерной гранулы с оболочкой из N,N'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламида (DHEBA) с акрилатом-ПЭГ и пероксидисульфатом калия (KPS). Внутри находится ядро из наполнителя, например ПЭГ или полиакриламида, смешанного с образцом (клеткой или ДНК). На ФИГ. 16В представлено формирование оболочки вокруг гранулы. На ФИГ. 16С представлены микрофотографии оболочек DHEBA с разрушаемыми полиакриламидными ядрами.

[0023] На ФИГ. 17А-17С представлены полимерные гранулы со стабилизированной оболочкой с разрушаемым агарозным ядром. На ФИГ. 17А схематически представлена структура оболочки DHEBA с ядром из агарозы в смеси с образцом (клеткой или ДНК). На ФИГ. 17В представлены микрофотографии оболочек DHEBA с агарозными ядрами. На ФИГ. 17С представлены микрофотографии плавления оболочек DHEBA с агарозными ядрами под действием температуры.

[0024] На ФИГ. 18А-18С представлено гелеобразование, инициированное флуоресценцией. Как показано на ФИГ. 18А, живые клетки контактируют с инициатором гелеобразования флуоресцеин изотиоцианатом - акрилатным полимером (FITC-AETC). Покрытые FITC-AETC и мономерами клетки облучают, что приводит образованию гелевых гранул вокруг клеток. На ФИГ. 18В представлены микрофотографии, включая микроскопию при облучении обработанных FITC-AETC клеток по сравнению с контрольными клетками, не обработанными FITC-AETC. На ФИГ. 18С представлены микрофотографии инициированного FITC гелеобразования вокруг клеток при различных условиях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0025] В приведенном ниже подробном описании содержатся ссылки на соответствующие рисунки, которые являются частью настоящего документа. В графических материалах аналогичные символы, как правило, обозначают аналогичные компоненты, если иное не следует из контекста. Предполагается, что иллюстративные варианты осуществления, описанные в подробном описании, графических материалах и пунктах формулы изобретения, не имеют ограничительного характера. Допускается использовать другие варианты осуществления и вносить другие изменения без отступления от сущности или объема заявленного объекта изобретения, представленного в настоящем документе. Следует понимать, что аспекты настоящего описания, в общем и целом представленные в настоящем документе и проиллюстрированные на фигурах, можно перераспределять, заменять, комбинировать, разделять и конструировать в широком спектре различных конфигураций, все из которых явным образом предусмотрены настоящим описанием.

[0026] Варианты осуществления относятся к композициям, системам и способам инкапсулирования биомолекул внутри полимерных гранул и проведения одного или более анализов инкапсулированных биомолекул. Полимерная гранула удерживает биомолекулы внутри гранулы, но допускает диффузию меньших по размерам молекул, например реагентов, в полимерную гранулу и из нее, удерживая при этом внутри анализируемую биомолекулу. Как описано в настоящем документе, полимерная гранула содержит поры, и размер и густоту пор модулируют для контроля размера или молекул, которые диффундируют в полимерные гранулы или из них.

[0027] В одном варианте осуществления полимерная гранула представляет собой однородную пористую матрицу гидрогеля, которая инкапсулирует или содержит одну или более биомолекул. В другом варианте осуществления полимерная гранула представляет собой полую гранулу с пористой оболочкой гидрогеля и полым внутренним пространством с биомолекулой, инкапсулированной внутри полого внутреннего пространства. В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула (как однородная пористая матрица гидрогеля, так и полая гранула) может включать в себя множество полимерных слоев, причем каждый полимерный слой представляет собой отдельную матрицу с определенными свойствами, такими как размер пор. В некоторых вариантах осуществления каждый полимерный слой контролируемо модулируют, чтобы скорректировать размер пор в каждом полимерном слое, таким образом, позволяя пользователю регулировать диффузию молекул в полимерную гранулу и из нее контролируемым поэтапным образом. В некоторых вариантах осуществления каждый полимерный слой контролируемо модулируют, изменяя условия окружающей среды, например рН, заряд или температуру, при этом такие изменения условий окружающей среды модулируют размер пор гранулы или оболочки гранулы и тем самым обеспечивают высвобождение молекул или реагентов из гранулы или их проникновение в нее контролируемым и поэтапным образом.

[0028] Описанные в настоящем документе варианты осуществления включают надежные и высокопроизводительные системы и способы проведения последовательных реакций с биомолекулой, инкапсулированной внутри полимерной гранулы. Способы и системы, описанные в настоящем документе, относятся к проведению одного или более анализов инкапсулированной биомолекулы, включая, например, лизис, анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки ДНК, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию, выполняемую последовательно.

[0029] Один вариант осуществления представляет собой способ инкапсулирования биомолекулы внутри полимерной гранулы, загрузки полимерных гранул, инкапсулирующих биомолекулу, в устройство проточной кюветы, получения библиотеки нуклеиновых кислот, нанесение подготовленной библиотеки на поверхность устройства проточной кюветы и кластеризации и секвенирования нанесенной библиотеки. В некоторых вариантах осуществления биомолекула представляет собой клетку, белок, нуклеиновую кислоту, ДНК, РНК или любое их производное или аналог.

[0030] В некоторых вариантах осуществления получение библиотеки включает в себя тагментацию ДНК, заключенной внутри полимерной гранулы. Тагментация инкапсулированной ДНК приводит к расщеплению более длинных последовательностей ДНК на более короткие фрагменты тагментации, которые затем используют для формирования кластеров ДНК на поверхности проточной кюветы. Кластер формируют из фрагментов тагментации длинной ДНК, каждый из которых можно секвенировать, например, с использованием секвенирования путем синтеза (SBS). Группа кластеров из одной молекулы длинной ДНК в настоящем документе называется «островком длинной ДНК». В некоторых вариантах осуществления в одной полимерной грануле можно инкапсулировать одну молекулу длинной ДНК или множество молекул длинной ДНК. Каждая молекула длинной ДНК образует один островок длинной ДНК. Кластеры всех островков длинной ДНК внутри одной полимерной гранулы в настоящем документе называются «кластерным облаком». Таким образом, кластерное облако представляет собой все кластеры внутри одной полимерной гранулы и может включать в себя множество островков длинной ДНК (каждый островок длинной ДНК представляет собой одну молекулу длинной ДНК), и каждый островок длинной ДНК включает в себя множество кластеров.

[0031] Гранулы могут включать в себя гидрогелевые полимеры и поперечносшивающие агенты, которые смешивают в присутствии биомолекулы, такой как нуклеиновая кислота, например длинная молекула ДНК, или источника, содержащего нуклеиновую кислоту, с последующим образованием полимерных гранул, инкапсулирующих биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления источником нуклеиновой кислоты является клетка.

[0032] В некоторых вариантах осуществления поры гранулы обеспечивают диффузию молекулы, которая меньше 1000 пар нуклеотидов, например молекулы, которая меньше 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 пар нуклеотидов или менее, или величины в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеупомянутых значений, но удерживает соединения (или не допускает диффузии соединений), превышающих указанные выше значения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полимерные гранулы удерживают (или не допускают диффузии) соединений, которые больше 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 или 5000 пар нуклеотидов или более, или величины в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений.

[0033] Некоторые варианты осуществления включают в себя способы применения гранул, инкапсулирующих биомолекулу, для проведения реакций нуклеиновых кислот, включая, например, высокопроизводительное пространственное индексирование длинных молекул ДНК. Как показано на ФИГ. 1А, можно легко построить библиотеку из длинной молекулы ДНК посредством кластеризации и посева кластеров из одной длинной молекулы ДНК в виде «кластерного пятна» на поверхности, которое можно затем прочитать и пространственно картировать. Используемый в настоящем документе термин «длинная ДНК» может включать фрагменты ДНК, содержащие более 300 пар нуклеотидов. Термин «фрагменты длинной ДНК» при использовании в настоящем документе относится к ДНК длиной более 1 т.п.н., 2,5 т.п.н., 5 т.п.н. или более, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 или 500 т.п.н. или более, включая величины в пределах диапазона, определенного любыми двумя из вышеупомянутых значений.

[0034] Некоторые варианты осуществления включают в себя способы использования одиночной гранулы для фрагментации образца генома в ряд фрагментов длинной ДНК. Затем такую одиночную гранулу можно закрепить в одном определенном местоположении в проточной кювете, где нанесены фрагменты длинной ДНК, таким образом, чтобы каждый из фрагментов длинной ДНК располагался смежно с другим фрагментом на поверхности проточной кюветы. Проточную кювету можно затем использовать в системе секвенирования нуклеотидов, такой как система ILLUMINA HISEQ, чтобы определить нуклеотидную последовательность каждого фрагмента длинной ДНК. Поскольку фрагменты ДНК расположены смежно друг с другом на поверхности проточной кюветы, система может использовать эти данные о пространственном расположении для более эффективной реконструкции конечной нуклеотидной последовательности исходной геномной ДНК. Система может депонировать смежно расположенные в пространстве чтения непосредственно из одиночных клеток, фрагментов длинной ДНК или хромосом. В некоторых вариантах осуществления для получения библиотеки способы позволяют использовать процесс с низким уровнем ввода и без ПЦР. В некоторых вариантах осуществления способы могут быть реализованы без необходимости молекулярного штрихкодирования.

[0035] Некоторые варианты осуществления относятся к способам получения полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу. В некоторых вариантах осуществления полимерную гранулу, инкапсулирующую длинную ДНК, можно использовать для обработки клеточного генома и подготовки библиотеки ДНК внутри гранулы. В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула, инкапсулирующая фрагмент длинной ДНК, инкапсулирует одиночную клетку, и ее можно использовать для обработки геномной ДНК клетки и подготовки библиотеки полной ДНК внутри гранулы.

[0036] В некоторых вариантах осуществления размер пор полимерной гранулы можно моделировать таким образом, чтобы обеспечить диффузию ферментов, химических веществ и праймеров меньшего размера (<50 п.н.), одновременно удерживая при этом более крупные нуклеиновые кислоты (>300 п.н.), так чтобы фрагменты длинной ДНК и полученная библиотека ДНК могли оставаться внутри полимерных гранул в процессе обработки. В некоторых вариантах осуществления специфические праймеры можно химически связать внутри матрицы полимерной гранулы для гибридизации и обработки специфической геномной ДНК. Затем библиотеку ДНК из одиночной клетки можно нанести на определенную область, например на поверхность проточной кюветы для посева библиотеки. В дальнейшем это приводит к формированию пространственного распределения «кластеров ДНК» в проточной кювете, которые образуются из инкапсулированных фрагментов длинной ДНК, что упрощает выравнивание чтения в процессе последующей обработки.

[0037] Используемый в настоящем документе термин «полимерная гранула» относится к пористой грануле гидрогеля или пористой полой грануле. В некоторых вариантах осуществления полимерную гранулу получают в виде пористой гранулы гидрогеля. Пористая гранула гидрогеля представляет собой гранулу, которая включает в себя пористую матрицу с относительной однородностью во всей грануле. Как описано в настоящем документе, пористая гранула гидрогеля инкапсулирует биомолекулу и включает в себя поры, которые допускают диффузию молекул в пористую гранулу гидрогеля или из нее. Поры также можно модулировать для изменения размера пор в зависимости от изменения условий окружающей среды, таких как рН, температура или заряд, таким образом, обеспечивая контролируемую диффузию молекул в пористые гранулы гидрогеля или из них. В некоторых вариантах осуществления пористая гранула гидрогеля может включать в себя один или более видов полимеров, причем каждый полимер имеет определенный размер пор и густоту пор, и каждый полимер независимым образом модулируют, чтобы обеспечить диффузию молекул разного размера в зависимости от изменения условий окружающей среды.

[0038] В некоторых вариантах осуществления полимерную гранулу получают в виде пористой полой гранулы. Пористая полая гранула представляет собой гранулу с пористой полимерной оболочкой, но с полым внутренним пространством. Как описано в настоящем документе, пористая полая гранула инкапсулирует биомолекулу внутри полого внутреннего пространства. Поры полимерной оболочки обеспечивают диффузию молекул в полое внутреннее пространство или из него, и их можно модулировать для изменения размера пор в зависимости от изменения условий окружающей среды, таких как рН, температура или заряд, таким образом, обеспечивая контролируемую диффузию молекул в полое внутреннее пространство или из него. В некоторых вариантах осуществления пористая полая гранула может включать в себя множество пористых полимерных оболочек, причем каждая оболочка имеет определенный размер пор и густоту пор, и каждую оболочку независимым образом модулируют, чтобы обеспечить диффузию молекул разного размера в зависимости от изменения условий окружающей среды. Например, как показано на ФИГ. 15, пористая полая гранула может включать в себя полое внутреннее пространство (или полое ядро) со множеством полимерных оболочек. На ФИГ. 15 представлена пористая полая гранула с тремя пористыми полимерными оболочками, которые обозначены на ФИГ. 15 как полимер 1, полимер 2 и полимер 3. Молекулы удерживаются внутри пористой полой гранулы, и модуляция первого полимера приводит к диффузии первой молекулы через полимерную оболочку. Модуляция второго полимера приводит к диффузии второй молекулы через полимерную оболочку. Специалисту в данной области будет понятно, что пример, показанный на ФИГ. 15, носит иллюстративный характер, и что для контроля диффузии молекул в пористую полую гранулу или из нее можно использовать множество пористых полимерных оболочек. Например, пористая полая гранула может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более отдельных полимерных оболочек, причем каждая полимерная оболочка отличается определенным размером пор и густотой пор, и каждая полимерная оболочка выполнена с возможностью модуляции для контроля диффузии молекулы в пористую полую гранулу или из нее.

[0039] Используемый в настоящем документе термин «реагент» описывает агент или смесь из двух или более агентов, подходящих для реакции, взаимодействия с образцом, его разбавления или добавления к образцу, и может включать в себя агенты, используемые в реакциях нуклеиновых кислот, включая, например, буферы, химические вещества, ферменты, полимеразу, праймеры с размером менее 50 пар нуклеотидов, матричные нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, метки, красители или нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления реагент включает в себя лизоцим, протеиназу К, случайные гексамеры, полимеразу (например, ДНК-полимеразу Ф29, полимеразу Taq, полимеразу Bsu), транспозазу (например, Тn5), праймеры (например, адапторные последовательности Р5 и Р7), лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы. Полимерные гранулы, инкапсулирующие биомолекулы

[0040] Один вариант осуществления включает в себя гранулу с гидрогелевым полимером и биомолекулой. Используемый в настоящем документе термин «гидрогель» относится к веществу, получающемуся при образовании поперечной сшивки органического полимера (природного или синтетического) посредством ковалентной, ионной или водородной связей, создающей трехмерную структуру открытой решетки, которая захватывает молекулы воды с образованием геля. В некоторых вариантах осуществления гидрогель может представлять собой биосовместимый гидрогель. Используемый в настоящем документе термин «биосовместимый гидрогель» относится к полимеру, образующему гель, который не является токсичным для живых клеток и обеспечивает достаточную диффузию кислорода и питательных веществ в захваченные клетки для поддержания их жизнеспособности. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевый полимер включает в себя 60 90% жидкости, такой как вода, и 10 30% полимера. В некоторых вариантах осуществления содержание воды в гидрогеле составляет около 70-80%.

[0041] Гидрогели можно получать с помощью поперечного сшивания гидрофильных биополимеров или синтетических полимеров. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления гидрогель может включать в себя поперечносшивающий агент. Используемый в настоящем документе термин «поперечносшивающий агент» относится к молекуле, которая может образовывать трехмерную сетку при реакции с соответствующими каркасными мономерами. К примерам гидрогелевых полимеров, которые могут включать в себя один или более поперечносшивающих агентов относятся, без ограничений, гиалуронаны, хитозаны, агар, гепарин, сульфат, целлюлоза, альгинаты (включая альгинатсульфат), коллаген, декстраны (включая декстрансульфат), пектин, каррагинан, полилизин, желатины (включая желатин типа А), агароза, (метил)акрилат-олиголактид-РЕО-олиголактид-(метил)акрилат, сополимеры РЕО-РРО-РЕО (Pluronics), поли(фосфазен), поли(метакрилаты), поли(М-винилпирролидон), сополимеры PL(G)A-PEO-PL(G)A, поли(этиленимин), полиэтиленгликоль (РЕО)-тиол, PEG-акрилат, малеимид (MAL), PEG/MAL, акриламид, N,N'-бис(акрилоил)цистамин, PEG, полипропиленоксид (РРО), полиакриловая кислота, поли(гидроксиэтилметакрилат) (РНЕМА), поли(метилметакрилат) (РММА), поли(М-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочная) кислота (PLA), сополимер поли(молочной) и поли(гликолевой) кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновая) кислота (PVSA), поли(L-аспарагиновая) кислота, поли(L-глутаминовая) кислота, бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, этиленгликольдиакрилат, полиметиленгликольдиакрилат, полиэтиленгликольдиакрилат, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетраакрилат или их комбинации. Таким образом, например, комбинация может включать в себя полимер и поперечносшивающий агент, например полиэтиленгликоль (PEG)-тиол/PEG-акрилат, акриламид/N,N'-бис(акрилоил)цистамин (ВАСу), PEG/полипропиленоксид (РРО) или N,N'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид (DHEBA).

[0042] В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент образует дисульфидную связь в гидрогелевом полимере, таким образом связывая гидрогелевые полимеры. В некоторых вариантах осуществления гидрогелевые полимеры образуют матрицу гидрогеля или полимерную оболочку с порами. Поры способны удерживать достаточно большие молекулы внутри полимерной гранулы, например фрагменты длинной ДНК, но позволяют малым компонентам, таким как реагенты, проходить через поры, таким образом перемещаясь внутрь полимерных гранул и наружу из них. В некоторых вариантах осуществления размер пор точно регулируют, меняя соотношение концентрации полимера и концентрации поперечносшивающего агента. В некоторых вариантах осуществления соотношение полимера и поперечносшивающего агента составляет 30:1, 25:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 или 1:30, или соотношение находится в диапазоне, определяемом любыми двумя из вышеупомянутых соотношений. В некоторых вариантах осуществления к полимерной матрице могут прививаться дополнительные функциональные группы, такие как праймер ДНК или заряженные химические группы, чтобы удовлетворять требованиям к различным вариантам применения.

[0043] Более того, в некоторых вариантах осуществления поры можно модулировать, корректировать, изменять, модифицировать, адаптировать или оптимизировать по размеру или густоте, изменяя условия окружающей среды, в которой находятся полимерные гранулы, включая изменение рН, заряда или температуры. Регулирование пор можно осуществлять контролируемым образом путем внесения добавочных изменений в окружающую среду, таким образом, создавая условия для контролируемой диффузии молекул.

[0044] Используемый в настоящем документе термин «пористость» означает фракционный объем (безразмерный) гидрогеля, который состоит из открытого пространства, например пор или других отверстий. Таким образом, пористость измеряет пустоты в материале и отражает долю объема пустот от общего объема в процентах от 0 до 100% (или от 0 до 1). Пористость гидрогеля может находиться в диапазоне от 0,5 до 0,99, от около 0,75 до около 0,99 или от около 0,8 до около 0,95.

[0045] Гидрогели могут иметь любой размер пор. Используемый в настоящем документе термин «размер пор» относится к диаметру или эффективному диаметру поперечного сечения пор. Термин «размер пор» также может относиться к среднему диаметру или среднему эффективному диаметру поперечного сечения пор по результатам измерений множества пор. Эффективный диаметр некруглого поперечного сечения равен диаметру круглого поперечного сечения с такой же площадью поперечного сечения, что и у некруглого поперечного сечения. В некоторых вариантах осуществления гидрогель может набухать при гидратации гидрогеля. В результате размеры пор могут меняться в зависимости от содержания воды в гидрогеле. В некоторых вариантах осуществления поры гидрогеля могут иметь достаточный размер, чтобы удерживать биомолекулы внутри полимерной гранулы, но пропускать реагенты, и могут быть скорректированы так, как описано в настоящем документе, чтобы молекулы могли проходить через них контролируемым образом.

[0046] В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент представляет собой обратимый поперечносшивающий агент. В некоторых вариантах осуществления обратимый поперечносшивающий агент выполнен с возможностью обратимого поперечного сшивания гидрогелевого полимера, и такие сшивки могут разрушаться под действием расщепляющего агента. В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент может разрушаться в присутствии восстановителя, за счет повышения температуры или под действием электрического поля. В некоторых вариантах осуществления обратимым поперечносшивающим агентом может быть N,N'-бис(акрилоил)цистамин, обратимый поперечносшивающий агент для полиакриламидных гелей, в котором дисульфидная связь может разрушаться в присутствии подходящего восстановителя. В некоторых вариантах осуществления взаимодействие поперечносшивающего агента с восстановителем расщепляет дисульфидные связи поперечносшивающего агента, разрушая полимерные гранулы. Полимерные гранулы разлагаются и высвобождают содержимое, например нуклеиновые кислоты, которые удерживались внутри них. В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент расщепляется при повышении температуры до более 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100°С. В некоторых вариантах осуществления поперечносшивающий агент расщепляется при взаимодействии полимерных гранул с восстановителем. В некоторых вариантах осуществления к восстановителям относятся соединения фосфина, водорастворимые фосфины, азотсодержащие фосфины и соли и их производные, дитиоэритритол (DTE), дитиотреитол (DTT) (цис- и транс-изомеры 2,3-дигидрокси-1,4-дитиолбутана соответственно), 2-меркаптоэтанол или β-меркаптоэтанол (ВМЕ), 2-меркаптоэтанол или аминоэтантиол, глутатион, тиогликолят или тиогликолевая кислота, 2,3-димеркаптопропанол, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), трис(гидроксиметил)фосфин (ТНР) или Р- [трис(гидроксиметил)фосфин]пропионовая кислота (ТНРР).

[0047] В некоторых вариантах осуществления повышение температуры для ускорения диффузии или взаимодействия с восстановителем приводит к разложению поперечносшивающего агента, высвобождая таким образом инкапсулированную биомолекулу или полученную из нее молекулу из полимерной гранулы.

[0048] В некоторых вариантах осуществления поперечное сшивание с использованием поперечносшивающего агента создает поры внутри полимерной гранулы. В некоторых вариантах осуществления размер пор в полимерных гранулах является регулируемым и выбирается таким образом, чтобы инкапсулировать биомолекулы, такие как фрагменты ДНК более около 5000 пар нуклеотидов, но позволять частицам меньшего размера, таким как реагенты, или меньшим по размерам нуклеиновым кислотам менее около 50 пар нуклеотидов, например праймерам, проходить через поры, как показано на ФИГ. 1В. В некоторых вариантах осуществления реагенты включают в себя реагенты для обработки биомолекул или полученной из них молекулы, такие как реагенты для выделения нуклеиновых кислот из клетки, для амплификации, штрихкодирования или секвенирования нуклеиновых кислот, или для получения библиотек нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления к реагентам относятся, например, лизоцим, протеиназа К, статистические гексамеры, полимераза (например, ДНК-полимераза Ф29, Taq-полимераза, Bsu-полимераза), транспозаза (например, Тn5), праймеры (например, адапторные последовательности Р5 и Р7), лигаза, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы.

[0049] В некоторых вариантах осуществления длинная ДНК включает в себя геномную ДНК, вирусные нуклеиновые кислоты, бактериальные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления полимерные гранулы включают в себя источник длинной ДНК, в том числе, например, клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой одиночную клетку, в том числе прокариотическую или эукариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой бактериальную клетку. Таким образом, как показано на ФИГ. 7А и 7В, способ можно реализовать на фрагментах длинной ДНК или на клетках, причем одно или оба из них инкапсулированы внутри полимерной гранулы.

[0050] В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула представляет собой разрушаемую полимерную гранулу с разрушаемым ядром, инкапсулированным в оболочку. Используемый в настоящем документе термин «разрушаемый» применяется в его общепринятом значении, понятном в свете описания, и относится к грануле или части гранулы, которые используют для получения или сборки гранулы, но которые могут растворяться или удаляться на более поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления разрушаемая полимерная гранула включает в себя полимерный материал, такой как агароза или полиакриламид, который находится в контакте с образцом, таким как клетка или ДНК, образуя, тем самым, полимерную гранулу. Затем полимерную гранулу можно инкапсулировать в оболочку, содержащую другой полимерный материал с отличающимися характеристиками плавления, например, в оболочку, которая включает в себя N,N'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид (DHEBA), ацилат-PEG или KPS, или их комбинацию. После инкапсуляции инкапсулированная полимерная гранула может быть помещена в условия, достаточные для удаления внутренней части гранулы, без разрушения оболочки. К таким условиям могут относиться, например, изменение температуры, рН или добавление восстановителей.

[0051] В ряде дополнительных вариантов осуществления любая из полимерных гранул, описанных в настоящем документе, может включать в себя флуоресцентный материал, связанный с полимерным материалом. К таким флуоресцентным материалам могут относиться, например, изотиоцианат флуоресцеина (FITC) или любое другое флуоресцирующее соединение, которое может быть связано с полимерным материалом, например акрилатными полимерами, с образованием флуоресцирующего полимерного материала, такого как FITC - акрилатный полимер (FITC-AETC). Флуоресцентный материал, связанный с полимерным материалом, может быть приведен в контакт с клеткой, инициируя таким образом флуоресцентное гелеобразование с образованием флуоресцентной полимерной гранулы вокруг клетки. В некоторых вариантах осуществления можно получать флуоресцентные изображения полимерных гранул с клеткой внутри без необходимости окрашивания. Способы приготовления полимерных гранул

[0052] Некоторые варианты осуществления, приведенные в настоящем документе, относятся к способам получения гранул, инкапсулирующих биомолекулы. В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула представляет собой пористую гранулу гидрогеля, как описано в настоящем документе, или пористую полую гранулу, как описано в настоящем документе.

[0053] В некоторых вариантах осуществления полимерную гранулу получают из эмульсии, получаемой на вихревой мешалке. Используемый в настоящем документе термин «эмульсия, получаемая на вихревой мешалке» относится к обработке на вихревой мешалке гидрогелевого полимера с фрагментами длинной ДНК или источником фрагментов длинной ДНК в контейнере, таком как пробирка, флакон или реакционный сосуд. Компоненты можно смешивать, например, вручную или с помощью механической вихревой мешалки или встряхивания. В некоторых вариантах осуществления смешивание вручную приводит к образованию полимерных гранул, которые инкапсулируют биомолекулы с размером 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мкм в диаметре или с размером в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления размер гранул не является однородным, а потому размер гранул включает гранулы различных диаметров.

[0054] В некоторых вариантах осуществления гранулы получают посредством формирования микрожидкостных капель. Как показано на ФИГ. 1В, формирование микрожидкостных капель включает использование микрожидкостного устройства для формирования эмульсии геля. В некоторых вариантах осуществления микрожидкостное устройство включает в себя микроканалы, выполненные с возможностью получения полимерной гранулы желаемого размера и выполненные с возможностью инкапсулирования выбранного количества биомолекулы на каждую гранулу. В некоторых вариантах осуществления микрожидкостное устройство имеет высоту 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мкм или высоту в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления микрожидкостное устройство включает в себя один или более каналов. В некоторых вариантах осуществления микрожидкостное устройство включает в себя канал для потока водной среды и канал для несмешивающейся текучей среды. В некоторых вариантах осуществления один или более каналов имеют одинаковую ширину. В некоторых вариантах осуществления один или более каналов имеют различную ширину. В некоторых вариантах осуществления ширина одного или более каналов составляет 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, ПО, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 или 150 мкм, или ширина находится в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления ширина канала водной среды составляет 75 мкм. В некоторых вариантах осуществления ширина канала несмешивающейся текучей среды составляет 78 мкм. Специалисту в данной области будет очевидно, что ширина может меняться для точной регулировки размера гранулы. Кроме размера микрожидкостного устройства и ширины каналов скорость потока канала водной среды и канала несмешивающейся текучей среды также могут влиять на размер полимерных гранул.

[0055] В некоторых вариантах осуществления скорость потока раствора в канале водной фазы составляет 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мкл/мин, или такая скорость находится в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления скорость потока раствора в канале несмешивающейся текучей среды составляет 20, 30, 50, 80, 100, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 или 400 мкл/мин, или такая скорость находится в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений. В некоторых вариантах осуществления раствор в водной фазе включает в себя гидрогелевый полимер, поперечносшивающий агент и биомолекулу, которые проходят через канал водной среды в несмешивающуюся текучую среду, такую как масло-носитель, со скоростью потока ниже скорости потока несмешивающейся текучей среды, образуя при этом капли. В некоторых вариантах осуществления несмешивающаяся текучая среда представляет собой масло, такое как минеральное масло, углеводородное масло, силиконовое масло, полидиметилсилоксановое масло, тетраметилэтилендиамин (TEMED) или их смеси. В некоторых вариантах осуществления капли гидрогеля, содержащие биомолекулу, образуются с равномерным распределением по размерам. В некоторых вариантах осуществления размер полимерных гранул точно регулируют, корректируя размер микрожидкостного устройства, размер одного или более каналов или скорость потока одного или обоих каналов водного раствора или несмешивающейся текучей среды. В некоторых вариантах осуществления полученная полимерная гранула имеет диаметр в диапазоне от 2 до 150 мкм, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мкм, или диаметр в пределах диапазона, определяемого любыми двумя из вышеупомянутых значений.

[0056] В некоторых вариантах осуществления размер и однородность полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу, можно дополнительно контролировать за счет взаимодействия гидрогелевого полимера до формирования гранулы с жидким модификатором, например со спиртом, в том числе изопропиловым спиртом.

[0057] В некоторых вариантах осуществления количество фрагментов длинной ДНК, инкапсулированных в гранулу, можно контролировать, разбавляя или концентрируя фрагменты длинной ДНК во вводимом образце. Образец, содержащий фрагменты длинной ДНК, смешивают с гидрогелевым полимером, и такой гидрогелевый полимер, содержащий фрагменты длинной ДНК, эмульгируют с помощью вихревой мешалки или переводят в микрожидкостные капли, как описано в настоящем документе.

[0058] В некоторых вариантах осуществления полимерные гранулы могут быть функционализированы и использованы для очистки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимерные гранулы могут быть функционализированы нуклеотидом. В некоторых вариантах осуществления нуклеотид представляет собой олигонуклеотид или поли-Т-нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления нуклеотид связан с полимерной гранулой, и функционализированную гранулу можно использовать для специфического захвата представляющего интерес нуклеотида.

[0059] В некоторых вариантах осуществления полимерная гранула может быть инкапсулирована полимерной оболочкой с отличными от полимерной гранулы характеристиками, например другой температурой плавления, другими размерами пор или другими характеристиками растворения. В некоторых вариантах осуществления полимерная оболочка может включать в себя DHEBA.

Способы обработки биомолекул, инкапсулированных внутри полимерных гранул

[0060] Некоторые варианты осуществления включают способы обработки биомолекул внутри гранулы, как показано на ФИГ. 2, на которой представлена блок-схема получения и обработки биомолекул внутри полимерной гранулы. На первой стадии образец ДНК, например по геномным данным, или клетку инкапсулируют внутри полимерной гранулы. В некоторых вариантах осуществления внутри полимерных гранул удерживается фрагмент длинной ДНК, а реагенты способны проходить через поры полимерных гранул. В некоторых вариантах осуществления реагенты могут включать в себя лизирующие агенты, агенты для очистки нуклеиновых кислот, тагментирующие агенты, ПЦР-агенты или другие агенты, применяемые при обработке биомолекул или полученных из них молекул. Таким образом, полимерные гранулы формируют микросреду для контролируемых реакций фрагментов длинной ДНК внутри полимерных гранул, обеспечивая барьер для прохождения реагентов внутрь и наружу полимерных гранул, одновременно удерживая фрагменты длинной ДНК внутри гранул. После инкапсуляции ДНК в гранулы начинается следующая стадия процесса, на которой образец можно загружать в проточную кювету для формирования фрагментов длинной ДНК в ходе процесса получения библиотеки.

[0061] Используемый в настоящем документе термин «тагментация» относится к модификации ДНК транспосомным комплексом, содержащим фермент транспозазу в комплексе с адаптерами, содержащими концевую последовательность транспозона. Тагментация приводит к одновременной фрагментации ДНК и лигированию адаптеров к 5'-концам обеих цепей дуплексных фрагментов. После этапа очистки для удаления фермента-транспозазы к концам адаптированных фрагментов можно добавить дополнительные последовательности, например, с помощью ПЦР, лигирования или любой другой приемлемой методики, известной специалистам в данной области.

[0062] В некоторых вариантах осуществления получение всей библиотеки ДНК можно с легкостью выполнять внутри полимерных гранул, связанных с проточной кюветой, при многократной смене реагентов с пропусканием через пористый гидрогель, при этом внутри матрицы гидрогеля удерживается геномная ДНК и продукты ее библиотеки. Гидрогель может быть устойчивым к высоким температурам вплоть до 95°С в течение нескольких часов, чтобы обеспечивать проведение различных биохимических реакций.

[0063] На следующей стадии процесса полимерную гранулу, инкапсулирующую фрагменты длинной ДНК после предшествующего получения библиотеки, обрабатывают для высвобождения, очистки и выделения фрагментов длинной ДНК из гранулы. Для этого полимерную гранулу приводят в контакт с, например, лизирующим буфером. Используемый в настоящем документе термин «лизис» означает нарушение или изменение стенки клетки или вирусной частицы, которое облегчает доступ к клеточной РНК или ДНК или их высвобождение. Ни полное разрушение, ни разрыв стенки клетки не являются обязательным требованием для лизиса. Термин «лизирующий буфер» означает буфер, который содержит по меньшей мере один лизирующий агент. К распространенным ферментативным лизирующим агентам относятся, без ограничений, лизоцим, глюколаза, зимолоза, литиказа, протеиназа К, протеиназа Е, а также вирусные эндолизины и экзолизины. Таким образом, например, лизис клеток в гранулах можно проводить путем введения в полимерные гранулы лизирующих агентов, таких как лизоцим и протеиназа К. После этого геномная ДНК из клеток будет находиться внутри гранул. В некоторых вариантах осуществления после лизиса выделенная нуклеиновая кислота удерживается внутри полимерной гранулы и может быть использована в ходе дальнейшей обработки.

[0064] Используемые в настоящем документе термины «выделенный», «выделять», «выделение», «очищенный», «очищать», «очистка» и их грамматические эквиваленты, используемые в настоящем документе, если не указано иное, относятся к снижению количества по меньшей мере одного загрязняющего вещества (такого как белковая и/или нуклеотидная последовательность) в образце или в источнике (например, клетке), из которого выделяют материал. Таким образом, очистка приводит к «обогащению», например увеличению количества нужного белка и/или нуклеотидной последовательности в образце.

[0065] В некоторых вариантах осуществления инкапсулированные нуклеиновые кислоты полностью или частично секвенируют внутри полимерных гранул. Инкапсулированные нуклеиновые кислоты можно секвенировать в соответствии с любой подходящей методикой секвенирования, такой как прямое секвенирование, включая секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования, секвенирование путем гибридизации, секвенирование через нанопоры и т.п.

[0066] Некоторые варианты осуществления, представленные в настоящем документе, относятся к секвенированию путем синтеза (SBS), которое можно использовать для фрагментов длинной ДНК. В SBS отслеживают удлинение праймера нуклеиновой кислоты вдоль матрицы нуклеиновой кислоты (например, целевой нуклеиновой кислоты или ее ампликона) для определения последовательности нуклеиотидов в матрице. Лежащим в основе химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой). В конкретном варианте осуществления SBS на основе полимеразы к праймеру добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды (посредством чего праймер удлиняется) зависимым от матрицы образом, так чтобы для определения последовательности матрицы можно было использовать обнаружение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру.

[0067] Для одной или более амплифицированных инкапсулированных нуклеиновых кислот можно использовать SBS или другую методику обнаружения, которая включает многократную доставку реагентов в циклическом режиме. Например, для запуска первого цикла SBS один или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимер азу и т.п. можно подать в или пропустить через полимерную гранулу с одной или более амплифицированных молекул нуклеиновой кислоты. Можно выявлять те сайты, где удлинение праймера приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое завершает дополнительное удлинение праймера после добавления нуклеотида к праймеру. Например, в праймер можно добавлять нуклеотидный аналог, имеющий фрагмент обратимого терминатора, так чтобы последующее удлинение не могло происходить до тех пор, пока не будет доставлен блокирующий агент для удаления фрагмента. Таким образом, для вариантов осуществления с обратимой терминацией в проточную кювету можно подавать разблокирующий реагент (до или после обнаружения). В промежутке между различными стадиями доставки можно проводить промывки. Затем цикл можно повторять n раз для удлинения праймера на n нуклеотидов, тем самым устанавливая последовательность длиной n. Примерные процедуры SBS, жидкостные системы и платформы обнаружения, которые можно без особенных усилий адаптировать для использования с ампликонами, полученными способами настоящего описания, приведены, например, в Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; патенте США №7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; патенте США №7,329,492; патенте США №7,211,414; патенте США №7,315,019; патенте США №7,405,281 и US 2008/0108082, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0068] Можно использовать и другие процедуры секвенирования, в которых применяют циклические реакции, например пиросеквенирование. В ходе пиросеквенирования обнаруживают высвобождение неорганического пирофосфата (PPi) по мере включения конкретных нуклеотидов в растущую цепь нуклеиновой кислоты (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); патент США №6,210,891; патент США №6,258,568 и патент США №6,274,320, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки). В процессе пиросеквенирования высвобождающийся PPi может обнаруживать при его немедленном превращении в аденозинтрифосфат (АТФ) под действием АТФ-сульфурилазы, а уровень образующегося АТФ можно обнаруживать по фотонам, испускаемым люциферазой. Таким образом, реакцию секвенирования можно отслеживать с помощью системы обнаружения люминесценции. Для процедур пиросеквенирования нет необходимости использовать источники возбуждающего излучения, применяемые в системах обнаружения флуоресценции. Подходящие жидкостные системы, детекторы и процедуры, которые могут быть адаптированы для применения пиросеквенирования к ампликонам, полученным в соответствии с настоящим описанием, приведены, например, в заявке на патент WIPO №PCT/US11/57111, US 2005/0191698 Al, патенте США №7,595,883 и патенте США №7,244,559, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки.

[0069] В некоторых вариантах осуществления могут использоваться способы, включающие мониторинг активности ДНК-полимер азы в реальном времени. Например, включение нуклеотидов может быть обнаружено за счет взаимодействий по механизму резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между содержащей флуорофор полимеразой и нуклеотидами с γ-фосфатной меткой или с помощью волноводов с нулевой модой (ZMW). Методики и реагенты для секвенирования на основе FRET описаны, например, в Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки.

[0070] Некоторые варианты осуществления SBS включают в себя обнаружение протона, высвобождаемого при внедрении нуклеотида в продукт удлинения. Например, для секвенирования на основе обнаружения высвобождаемых протонов можно использовать электрический детектор и связанные с этим имеющиеся на рынке методики. Примерами таких систем секвенирования являются пиросеквенирование (например, имеющаяся на рынке платформа от компании 454 Life Sciences, дочерней компании Roche), секвенирование с использованием нуклеотидов с γ-фосфатной меткой (например, имеющаяся на рынке платформа от компании Pacific Biosciences) и секвенирование с регистрацией протонов (например, имеющаяся на рынке платформа от компании Ion Torrent, дочерней компании Life Technologies) или способы и системы секвенирования, описанные в US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1 или US 2010/0282617 A1, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки. Описанные в настоящем документе способы амплификации целевых нуклеиновых кислот с использованием кинетического исключения можно с легкостью применять к субстратам, используемым для обнаружения протонов. В частности, описанные в настоящем документе способы можно применять для получения клональных популяций ампликонов, которые используют для обнаружения протонов.

[0071] Другой методикой секвенирования является секвенирование через нанопоры (см., например, Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки). В некоторых вариантах осуществления с нанопорами целевая нуклеиновая кислота или отдельные нуклеотиды удаляются при прохождении целевой нуклеиновой кислоты через нанопору. По мере прохождения нуклеиновой кислоты или нуклеотида через нанопору каждый тип нуклеотида может быть идентифицирован по результатам измерения колебаний электрической проводимости поры (патент США №7,001,792; Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), описания которых включены в настоящий документ путем ссылки).

[0072] Примеры способов экспрессии на чипах и анализа генотипирования, которые можно применять для обнаружения в соответствии с настоящим описанием, приведены в патентах США №7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 или 6,355,431 или в публикациях заявок на патент США №2005/0053980 А1; 2009/0186349 А1 или US 2005/0181440 A1, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки.

[0073] В описанных в настоящем документе способах выделения нуклеиновых кислот, амплификации и секвенирования для выделения и получения нуклеиновых кислот используют различные реагенты. К таким реагентам могут относиться, например, лизоцим, протеиназа К, статистические гексамеры, полимераза (например, ДНК-полимераза Ф29, Taq-полимераза, Bsu-полимераза), транспозаза (например, Tn5), праймеры (например, адаптерные последовательности Р5 и Р7), лигаза, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы. Такие реагенты проходят через поры полимерных гранул, тогда как биомолекула или полученная из нее молекула удерживаются внутри полимерных гранул. Преимущество способов, изложенных в настоящем документе, заключается в том, что они обеспечивают инкапсулированную микросреду для обработки нуклеиновых кислот внутри полимерной гранулы. Это обеспечивает обработку одиночной клетки для быстрой и эффективной обработки целевой нуклеиновой кислоты.

[0074] Адаптеры могут включать в себя сайты праймеров для секвенирования, сайты праймеров для амплификации и индексы. При использовании в настоящем документе термин «индекс» может включать в себя последовательность нуклеотидов, которую можно использовать в качестве молекулярного идентификатора и/или штрихкода для метки нуклеиновой кислоты и/или для идентификации источника нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления индекс можно использовать для идентификации одиночной нуклеиновой кислоты или субпопуляции нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления библиотеки нуклеиновых кислот могут быть получены внутри полимерной гранулы. В некоторых вариантах осуществления одиночная клетка, инкапсулированная внутри полимерной гранулы, может быть использована для комбинаторного индексирования одиночных клеток, например, с использованием подхода транспозиции с сохранением смежности (CPTSeq). В некоторых вариантах осуществления ДНК из одиночной клетки может быть штрихкодирована путем инкапсуляции одиночных клеток после амплификации WGA другой гранулой, несущей в себе штрихкодированные транспозоны, и с последующим растворением матрицы геля при обработке восстановителем, например, для высвобождения геномной ДНК для штрихкодирования.

[0075] Варианты осуществления способов и методик «пространственного индексирования», описанных в настоящем документе, сокращают анализ данных и упрощают процесс получения библиотеки из одиночных клеток и молекул длинной ДНК. Существующие протоколы секвенирования одиночных клеток требуют эффективного физического разделения клеток и уникального штрихкодирования каждой выделенной клетки с последующим группированием вместе всего упомянутого для проведения секвенирования. Современные протоколы синтетических длинных чтений также требуют трудоемких стадий штрихкодирования и группирования вместе всех штрихкодированных фрагментов для секвенирования с последующим проведением анализа данных для разграничения генетической информации, поступающей от каждой штрихкодированной клетки. В таких процессах возможна потеря материала, что приводит к выпадениям в последовательностях. Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, не только сокращают процесс, но и увеличивают разрешение данных для одиночных клеток. Более того, предложенные в настоящем документе варианты осуществления упрощают сборку геномов новых организмов. Варианты осуществления, описанные в настоящем документе, можно использовать для выявления редких генетических вариаций и совместных мутаций. В некоторых вариантах осуществления библиотека ДНК, удерживаемая в полимерных гранулах до высвобождения, дает возможность контролировать размер фрагментов, которые высвобождаются на поверхность, за счет контроля процесса высвобождения и состава гидрогеля.

[0076] В некоторых вариантах осуществления поверхностью является устройство проточной кюветы. В некоторых вариантах проточная кювета представляет собой специализированную проточную кювету с лунками, канавками или узором. В некоторых вариантах осуществления проточная кювета содержит структурированную поверхность. В некоторых вариантах осуществления структурированная поверхность содержит лунки. В некоторых вариантах осуществления диаметр лунок составляет от около 10 мкм до около 50 мкм, например 10 мкм, 15 мкм, 20 мкм, 25 мкм, 30 мкм, 35 мкм, 40 мкм, 45 мкм, или 50 мкм в диаметре, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из приведенных выше значений, и при этом глубина лунок составляет от около 0,5 мкм до около 1 мкм, например 0,5 мкм, 0,6 мкм, 0,7 мкм, 0,8 мкм, 0,9 мкм или 1 мкм глубиной, или в диапазоне, определяемом любыми двумя из приведенных выше значений. В некоторых вариантах осуществления лунки выполнены из гидрофобного материала. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный материал содержит аморфный фторполимер, например CYTOP, Fluopel® или Teflon®.

[0077] В некоторых вариантах осуществления библиотеку можно амплифицировать с использованием сайтов праймеров в адапторных последовательностях и секвенировать с использованием сайтов праймеров для секвенирования в адапторных последовательностях. В некоторых вариантах осуществления адапторные последовательности могут включать в себя индексы для идентификации источника нуклеиновых кислот. Эффективность последующих стадий амплификации может быть снижена из-за формирования праймер-димеров. Для повышения эффективности последующих стадий амплификации из продуктов лигирования можно удалять нелигированные одноцепочечные адаптеры.

[0078] В некоторых вариантах осуществления для определения пористости полимерных гранул можно получать модельную систему. Как показано на ФИГ. 11А и 11В, полимерная гранула может инкапсулировать соединение стрептавидина (обозначено на ФИГ. 11А и 11В как SA), удерживая соединение стрептавидина внутри гранулы. В некоторых вариантах осуществления соединение биотина, связанное с ампликоном определенного размера, смешивается с полимерной гранулой (ФИГ. 11А). Связанный с биотином ампликон достаточного размера способен диффундировать в полимерную гранулу и образовать конъюгат со стрептавидином внутри гранулы, таким образом удерживая связанный с биотином ампликон внутри гранулы. Напротив, связанный с биотином ампликон слишком большого размера не будет проходить через полимерную гранулу, и внутри гранулы не будет удерживаться никаких ампликонов. Аналогичным образом можно получать полимерную гранулу, содержащую стрептавидин, конъюгированный со связанным с ампликоном биотином, и реагенты могут проходить через нее для проведения реакции, такой как ПЦР (ФИГ. 11В). Фрагменты достаточного размера диффундируют из полимерной гранулы, тогда как слишком большие фрагменты не диффундируют через полимерную гранулу и удерживаются внутри гранулы.

Получение библиотек нуклеиновых кислот с использованием полимерных гранул

[0079] Некоторые варианты осуществления систем, способов и композиций, предложенных в настоящем документе, включают в себя способы, в которых адаптеры лигированы с целевыми нуклеиновыми кислотами. Адаптеры могут включать в себя сайты связывания праймеров для секвенирования, сайты связывания праймеров для амплификации и индексы. Например, адаптер может включать себя последовательность Р5, последовательность Р7 или их комплемент. В настоящем документе последовательность Р5 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 1 (AATGATACGGCGACCACCGA), а последовательность Р7 содержит последовательность, определенную как SEQ ID NO: 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA). В некоторых вариантах осуществления последовательность Р5 или Р7 может дополнительно включать в себя полинуклеотидный спейсер, который может иметь длину от 1 до 20, например от 1 до 15 или от 1 до 10 нуклеотидов, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления спейсер включает в себя 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой поли-Т спейсер, например 10Т спейсер. Нуклеотиды спейсера могут быть введены на 5'-концах полинуклеотидов, которые могут быть фиксированы на подходящей подложке через связь с 5'-концом полинуклеотида. Соединение может быть достигнуто за счет серосодержащего нуклеофила, такого как фосфоротиоат, на 5'-конце полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид будет включать в себя поли-Т спейсер и 5'-фосфоротиоатную группу. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления последовательность Р5 представляет собой 5'-фосфоротиоат-ТТТТТТТТТТААТОАТАСООСОАССАССОА-3' (SEQ ID NO: 3), и в некоторых вариантах осуществления последовательность Р7 представляет собой 5'-фосфоротиоат-ТТТТТТТТТТСААОСАОААОАСООСАТАСОА-3' (SEQ ID NO: 4)-

[0080] Индексы можно использовать для идентификации источника молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления адаптер может быть модифицирован во избежание образования конкатемеров, например, за счет введения блокирующих групп, которые препятствуют удлинению адаптера, на одном или обоих концах. К примерам 3'-блокирующих групп относятся 3'-спейсер СЗ, а дидеоксинуклеотид и закрепление на подложке. К примерам 5'-блокирующих групп относятся дефосфорилированный 5'-нуклеотид и закрепление на подложке.

[0081] Адаптеры включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как одноцепочечные нуклеиновые кислоты. Адаптеры могут включать в себя короткие нуклеиновые кислоты, имеющие длину менее, более или равную около 5 нуклеотидов, 10 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 30 нуклеотидов, 40 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 60 нуклеотидов, 70 нуклеотидов, 80 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или находящуюся в диапазоне между любыми двумя из вышеуказанных размеров. В некоторых вариантах осуществления адаптеры имеют достаточный размер, чтобы проходить через поры полимерных гранул. К целевым нуклеиновым кислотам относятся ДНК, например геномная или кДНК; РНК, например мРНК, сРНК или рРНК; или гибрид ДНК и РНК. Нуклеиновая кислота может быть выделена из одиночной клетки, инкапсулированной внутри полимерной гранулы. Нуклеиновая кислота может содержать фосфодиэфирные связи и может иметь другие типы каркасов, включая, например, фосфорамидные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, О-метилфосфорамидитные и пептидные каркасы и связи нуклеиновых кислот. Нуклеиновая кислота может содержать любую комбинацию дезоксирибо- и рибонуклеотидов и любую комбинацию оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин, изогуанин и аналоги оснований, такие как нитропиррол (включая 3-нитропиррол) и нитроиндол (включая 5-нитроиндол). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может включать в себя по меньшей мере одно универсальное основание. Универсальное основание может спариваться с основаниями более чем одного другого типа оснований и может использоваться, например, при включении в олигонуклеотидные праймеры или вставки, которые используют для случайной гибридизации в образцах сложных нуклеиновых кислот, таких как образцы геномной ДНК. Примером универсального основания является инозин, который может спариваться с аденином, тимином или цитозином. К другим примерам относятся гипоксантин, 5-нитроиндол, ациклический 5-нитроиндол, 4-нитропиразол, 4-нитроимидазол и 3-нитропиррол. Можно использовать универсальные основания, которые могут спариваться с основаниями по меньшей мере двух, трех, четырех или более типов.

[0082] Пример данного способа включает дефосфорилирование 5'- концов целевых нуклеиновых кислот во избежание образования конкатемеров на последующих стадиях лигирования; лигирование первых адаптеров к 3'-концам дефосфорилированных целевых молекул с помощью лигазы, причем 3'-концы первых адаптеров блокированы; повторное фосфорилирование 5'-концов лигированных целевых молекул; лигирование второго адаптера к 5'-концам дефосфорилированных целевых молекул с использованием одноцепочечной лигазы, причем 5'-концы вторых адаптеров не фосфорилированы.

[0083] Другой пример включает частичное расщепление нуклеиновой кислоты 5'-экзонуклеазой с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты с одноцепочечными 3'-липкими концами. Адаптер, содержащий блокирующую 3'-группу, может быть лигирован с 3'-концами двухцепочечной нуклеиновой кислоты с 3'-липкими концами. Двухцепочечная нуклеиновая кислота с 3'-липкими концами с лигированными адаптерами может быть дегибридизирована с образованием одноцепочечных нуклеиновых кислот. Адаптер, содержащий нефосфорилированный 5'-конец, может быть лигирован с 5'-концом одноцепочечной нуклеиновой кислоты.

[0084] Способы дефосфорилирования нуклеиновых кислот, например 5'-нуклеотида нуклеиновой кислоты, включают приведение нуклеиновой кислоты в контакт с фосфатазой. К примерам фосфатаз относятся фосфатаза кишечника теленка, щелочная фосфатаза креветки, антарктическая фосфатаза и щелочная фосфатаза APEX (Epicentre).

[0085] Способы лигирования нуклеиновых кислот включают приведение нуклеиновых кислот в контакт с лигазой. К примерам лигаз относятся Т4 РНК-лигаза 1, Т4 RPHK-лигаза 2, RtcB-лигаза, метанобактериальная РНК-лигаза и TS2126 РНК-лигаза (CIRCLIGASE).

[0086] Способы фосфорилирования нуклеиновых кислот, например 5'-нуклеотида нуклеиновой кислоты, включают приведение нуклеиновой кислоты в контакт с киназой. К примерам киназ относится Т4 полинуклеотидкиназа.

[0087] Варианты осуществления, приведенные в настоящем документе, относятся к получению библиотек нуклеиновых кислот внутри полимерной гранулы, таким образом, чтобы библиотека нуклеиновых кислот получалась в одиночном реакционном объеме.

[0088] Варианты осуществления систем и способов, предложенных в настоящем документе, включают в себя наборы, содержащие любой один или более гидрогелевых полимеров, поперечносшивающих агентов или микрожидкостных устройств для получения полимерных гранул, которые инкапсулируют биомолекулы, и дополнительно включают в себя компоненты, подходящие для обработки биомолекул или полученных из них молекул, в том числе реагенты для лизиса клеток и амплификации и секвенирования нуклеиновых кислот или для получения библиотеки нуклеиновых кислот, в том числе лизоцим, протеиназу К, статистические гексамеры, полимеразу (например, Ф29 ДНК-полимеразу, Taq-полимеразу, Bsu-полимеразу), транспозазу (например, Tn5), праймеры (например, адапторные последовательности Р5 и Р7), лигазу, катализирующие ферменты, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферные растворы или двухвалентные катионы, как описано в настоящем документе, и которые используют при соответствующей обработке биомолекул или полученных из них молекул.

[0089] Как показано на ФИГ. 12, получают полимерную гранулу, инкапсулирующую клетку. Полимерные гранулы подвергают воздействию реагентов для лизиса и тагментации клеток. Обработка полимерной гранулы детергентом, таким как SDS, приводит к фрагментации, и малые молекулы могут диффундировать из полимерной гранулы. В некоторых вариантах осуществления способность удерживать клеточные биомолекулы может быть ограничена минимальным пороговым значением, вне которого двусторонний доступ ферментов в клетки будет исключаться.

[0090] В качестве альтернативы в некоторых вариантах осуществления способы получения библиотеки применяют для увеличения физического размера геномных молекул, чтобы они удерживались внутри полимерных гранул, что превышает пороговое значение. Таким образом, как показано на ФИГ. 12, в процессе получения библиотеки гДНК меченые фрагменты гДНК удерживаются вместе за счет Tn5-связывания, что препятствует диффузии за пределы полимерных гранул. При этом после обработки SDS Tn5 высвобождается, и полученные фрагменты библиотеки могут диффундировать за пределы гранул, если их размер слишком мал. Во избежание этого для тагментации можно использовать фермент Tn5 с липкими транспозоновыми концами. Химические превращения можно проводить для липких 5'- или 3'-концов транспозона, чтобы увеличить размер элементов библиотеки или обеспечить связывание с гранулами или другими биомолекулами. Для увеличения физического размера фрагментов библиотеки можно использовать различные конфигурации и модификации транспозонов.

[0091] Например, для тагментации ДНК можно использовать транспозон с 3'-липким концом. 3'-липкий конец может служить субстратом для ферментов. Терминальную трансферазу (TdT) можно использовать для добавления определенного числа оснований независимым от матрицы образом. Например, TdT можно использовать для добавления к транспозону 100 300 оснований. Если удлинения транспозона с помощью TdT недостаточно, полученный удлиненный транспозон можно гибридизовать с олигосвязанными гранулами, находящимися в полимерных гранулах, комплементарным ампликоном или клеточной мРНК с поли-А концевым остатком. После гибридизации с олигонуклеотидом можно проводить реакцию удлинения. Например, при отжиге плазмиды оцДНК можно провести реакцию амплификации по типу катящегося кольца (RCA) для увеличения размера концов транспозона. В альтернативном варианте осуществления гибридизированные олигонуклеотиды можно лигировать с концами транспозона. Последовательное лигирование ампликонов, например при сборке циклического лигирования (CLA), можно проводить для сборки длинных фрагментов ДНК из более мелких фрагментов, способных диффундировать в полимерные гранулы.

[0092] Добавление модифицированных оснований к транспозонам также можно использовать в качестве целевых молекул для связывания дополнительных молекул. Модифицированные основания могут содержаться в транспозоне до тагментации или могут добавляться в ходе ферментативной реакции после тагментации. Например, TdT можно использовать для добавления модифицированного основного дигоксигенин-11-UTP, который впоследствии может быть связан анти-DIG антителом. К другим модификациям относятся биотин и 5mC, которые могут связываться со стрептавидином и 5mC антителами соответственно.

[0093] В некоторых вариантах осуществления одновременное индексирование фрагментов гДНК и кДНК, полученных из одной и той же полимерной гранулы, и дополнительную амплификацию элементов библиотеки можно проводить посредством амплификации по типу катящегося кольца.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение полимерных гранул

[0094] В приведенном ниже примере представлен вариант осуществления для получения полимерных гранул, инкапсулирующих фрагменты длинной ДНК с использованием устройств для формирования микрожидкостных капель.

[0095] Устройство для формирования капель использовали для получения полимерных гранул. Образцы, содержащие фрагменты длинной ДНК, смешивали с предшественником полимера и смесь загружали в резервуар для образцов в картридже. В течение 2 минут из каждого канала формировали около 50 000 полимерных гранул, содержащих длинную ДНК (8 каналов для 8 независимых обработок образца в каждом картридже). Полимерные гранулы с длинной ДНК загружали в проточную кювету, где полимерные гранулы закреплялись внутри (канал высотой 100 мкм и диаметр полимерных гранул 120 мкм) для автоматического формирования библиотеки. Ферменты и реагенты, включая ферменты и реагенты для получения библиотеки нуклеиновых кислот, вводили в проточную кювету, обеспечивали контакт с длинной ДНК, заключенной внутри полимерной гранулы, и расщепляли длинные молекулы ДНК посредством тагментации, чтобы получить библиотеку ДНК. Затем проводили посев библиотеки на поверхность проточной кюветы из гранул. В процессе посева библиотеки загружали масло для заполнения пустот между гранулами и проточную кювету нагревали для ускорения диффузии библиотеки на поверхность проточной кюветы. В присутствии масла посев каждой меченой библиотеки проходил в непосредственной близости от места расположения каждой полимерной гранулы (исходя из диаметра полимерных гранул 120 мкм, посев библиотеки ограничен областью с диаметром около 120 мкм).

[0096] В настоящем примере показано, что молекулы длинной ДНК могут загружаться и захватываться полимерными гранулами (диаметром около 120 мкм), и получение библиотеки проводят на таких молекулах длинной ДНК, заключенных внутри полимерных гранул. В результате все библиотеки ДНК из конкретной молекулы длинной ДНК хранили внутри одних и тех же полимерных гранул. Затем библиотеку высвобождали из полимерных гранул с нанесением на поверхность проточной кюветы, чтобы высеять их в виде группы на поверхности проточной кюветы. Кластеры, высвобождаемые из молекулы длинной ДНК, группировали вместе в виде «кластерного пятна» на проточной кювете. Кластеры внутри одного пятна из одиночной молекулы длинной ДНК упрощают реконструкцию генома с более высокой точностью и меньшим количеством каркасных гэпов.

Пример 2. Пространственное индексирование длинной ДНК

[0097] В приведенном ниже примере представлен вариант осуществления стробированных чтений фрагмента длинной ДНК длиной 100 т.п.н., инкапсулированного внутри полимерной гранулы с MDA или без нее.

[0098] Полимерные гранулы получали смешиванием полимера в присутствии геномной ДНК (Cornell) из около 100 т.п.н. с формированием полимерных гранул с помощью устройства для образования микрокапель. Проводили секвенирование ДНК с пространственным индексированием, помещая сформированные полимерные гранулы, инкапсулирующие фрагменты ДНК, в устройство проточной кюветы с последующим приведением проточной кюветы в контакт с реагентами. MDA не проводили. Гранулы разрушались, и в устройстве проточной кюветы формировались кластеры. Как показано на ФИГ. 5, средние кластеры на каждый островок длинной ДНК составляли около 33, средний размер островка длинной ДНК составлял 64 000 пар нуклеотидов, и на гранулу приходилось около 405 островков длинной ДНК.

[0099] Второй набор полимерных гранул получали смешиванием полимера в присутствии геномной ДНК (Cornell) из около 100 т.п.н. с формированием полимерных гранул с помощью устройства для образования микрокапель. Проводили секвенирование ДНК с пространственным индексированием, помещая сформированные полимерные гранулы, инкапсулирующие фрагменты ДНК, в устройство проточной кюветы с последующим приведением проточной кюветы в контакт с реагентами. Перед тагментацией проводили MDA. Гранулы разрушались, и в устройстве проточной кюветы формировались кластеры. Как показано на ФИГ. 6, средние кластеры на каждый островок длинной ДНК увеличивались около до 85, средний размер островка длинной ДНК составлял 58 000 пар нуклеотидов, и на гранулу приходилось около 166 островков длинной ДНК.

[0100] Третий набор полимерных гранул получали смешиванием полимера в присутствии геномной ДНК (Cornell) из около 10 т.п.н. с формированием полимерных гранул с помощью устройства для образования микрокапель. Проводили секвенирование ДНК с пространственным индексированием, помещая сформированные полимерные гранулы, инкапсулирующие фрагменты ДНК, в устройство проточной кюветы с последующим приведением проточной кюветы в контакт с реагентами. Перед тагментацией проводили MDA. Гранулы разрушались, и в устройстве проточной кюветы формировались кластеры. Как показано на ФИГ. 7, средние кластеры на каждый островок длинной ДНК составляли около 57, средний размер островка длинной ДНК составлял 10 461 пар нуклеотидов, и на гранулу приходилось около 85 островков длинной ДНК.

Пример 3. Метагеномика сложной смеси видов микроорганизмов

[0101] В следующем примере представлен вариант осуществления идентификации одноклеточных микроорганизмов, инкапсулированных в гидрогель.

[0102] Полимерные гранулы получали, как описано в настоящем документе, с использованием устройства для формирования микрожидкостных микрокапель. Полимерный материал смешивали с образцом, содержащим ряд микроорганизмов, включая L. gasseri, S. aureus, В. cereus, В. vulgatus, A. baumannii, S. agalactiae и P. acnes. Затем инкапсулированные клетки лизировали и проводили получение библиотеки, после чего полимерные гранулы разрушали и библиотеки наносили на поверхность. Как показано на ФИГ. 9, каждый микроорганизм можно было идентифицировать благодаря его пространственной компартментализации в устройстве проточной кюветы. Таким образом, инкапсулирование и последующие реакции нуклеиновых кислот обеспечивают идентификацию видов микроорганизмов на уровне штамма в сложных смесях по результатам чтений компартментализации в миниметагеномном анализе.

Пример 4. Пространственное индексирование в проточной кювете

[0103] В следующем примере представлен вариант осуществления пространственного индексирования в проточной кювете.

[0104] Устройство проточной кюветы устанавливали и промывали 200 мкл PR2 (буфер включения). Гранулы для обработки также промывали PR2. Разбавленный гидрогель получали в PR2. Нарастающее разбавление приводит к увеличению расстояния между гидрогелями. Гидрогель вносили в проточную кювету, избегая внесения пузырьков воздуха в проточную кювету. Через проточную кювету пропускали 200 мкл PR2, чтобы убедиться, что гранулы по-прежнему фиксированы для участия в процессе. Через проточную кювету пропускали 100 мкл ресуспендирующего буфера (RSB).

[0105] Смесь для тагментации получали смешением 25 мкл реагента тагментации, 23 мкл RSB и 2 мкл фермента. Смесь для тагментации вводили в узкий канал для удаления любых возможных пузырьков воздуха на входе. Затем смесь для тагментации медленно подавали на вход. Проточную кювету герметизировали и инкубировали в течение 10 мин при температуре 55°С.

[0106] Смесь останавливающего буфера готовили смешиванием 25 мкл буфера тагментации, 25 мкл RSB и 10 мкл останавливающего буфера. Смесь останавливающего буфера медленно подавали в проточную кювету без внесения пузырьков и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. После инкубирования через устройство пропускали 200 мкл PR2.

[0107] NPM получали смешиванием 175 мкл RSB и 75 мкл NPM. Смесь NPM медленно подавали в устройство проточной кюветы без внесения пузырьков воздуха и инкубировали в течение 3 минут при комнатной температуре. Через устройство проточной кюветы подавали 200 мкл масла с поверхностно-активным веществом. По микрофотографиям видно, что гидрогели были окружены смесью NPM и масла. Проточную кювету герметизировали и инкубировали в течение 3 мин при температуре 72°С, чтобы провести реакцию заполнения гэпов.

[0108] В устройство проточной кюветы вводили 20 30 мкл масла с поверхностно-активным веществом и масла с дитиотреитолом (DTT) (соотношение 29/2) и устройство герметизировали. Начальная температура процесса высвобождения составляла 90°С в течение 3 мин, 60°С в течение 5 мин, 40°С в течение 2 мин и 20°С в течение 2 мин. Проточную кювету промывали 400 мкл PR2 и 200 мкл CLM (смесь для расщепления). Проточную кювету затем промывали 400 мкл PR2. При необходимости проведения посева с Phix готовили раствор Phix с концентрацией 2-3 пМ, библиотеку Phix подавали в устройство и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Проточную кювету промывали 200 мкл PR2. Для первого удлинения подавали 100-200 мкл АМХ и инкубировали в течение 5 мин при 50°С. Проточную кювету промывали PR2 и проводили 24 или 30 циклов амплификации.

Пример 5. Одновременное индексирование фрагментов гДНК и кДНК

[0109] В следующем примере представлен вариант осуществления одновременного индексирования фрагментов гДНК и кДНК из одной и той же полимерной гранулы.

[0110] Полимерные гранулы получали в виде полых полимерных оболочек с инкапсулированной внутри клеткой. От около 25 до 50 полимерных гранул распределяли по лункам планшета для микротитрования и обрабатывали буфером для лизирования клеток, чтобы разрушить клеточную мембрану с последующей транспозицией гДНК с индексированной Y-адапторной транспозомой, образованной транспозонами, фосфорилированными на 5'-конце обеих цепочек. Вводили терминальную трансферазу (TdT) для добавления множества Т к 3'-концу, не участвующей в переносе цепочки, обеспечивая гибридизацию к хвосту поли-А мРНК.

[0111] Гэп между гДНК и не участвующей в переносе цепочкой формировали в ходе реакции заполнения и лигирования, а синтез кДНК осуществляли с помощью обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза (MMLV RT). MMLV RT также добавляла несколько дополнительных оснований dCMP к 3'-концу молекулы кДНК, основания которой спаривались с последовательностью олиго-G на 3'-конце праймера переключения матрицы (TSP). TSP удлиняли после отжига и его последовательность переносили на 3'-конец вновь синтезированной кДНК в реакции переключения матрицы. Образованный гибридный гДНК-кДНК содержал три разные общие последовательности, разделяющие части гДНК и кДНК гибридной молекулы, по одной на каждом конце и по одной в середине цепи. Такие общие последовательности использовали для получения библиотек как гДНК, так и кДНК.

[0112] В побочной реакции наблюдали удлинение мРНК и переключение матрицы на 3'-конце транспозонов, но эти превращения не влияли на результат. После обработки РНКазой Н и коротких промывок содержимое полимерных гранул денатурировали нагреванием и проводили кольцевую реакцию лигирования. В ходе данной реакции все одноцепочечные молекулы ДНК с фосфорилированным 5'-концом самолигировались в кольца, превращающиеся в матрицы для амплификации по типу катящегося кольца (RCA). Кроме гибрида гДНК-кДНК, отдельные тагментированные ДНК, а также молекулы кДНК, полученные из мРНК после отжига для высвобождения плавающих транспосом, также лигировали по кольцу и амплифицировали в реакции RCA. Длинные конкатемеры содержат множество копий исходных молекул, которые повышали чувствительность анализа и удерживались внутри полимерной гранулы.

[0113] дцДНК длиной приблизительно <1 т.п.н. может проходить через полимерные гранулы в случае полой полимерной гранулы 15% PEG-MAL. Коротко говоря, покрытые стрептавидином гранулы (приблизительно 10 мкм в диаметре) инкапсулировали внутри полимерных гранул. После этого биотинилированным ампликонам разного размера давали диффундировать внутрь полимерных гранул. Пороговое значение диффузии, определяющее отсечение по молекулярному размеру, определяли в изменяемом диапазоне размеров ампликона (например: 220 п.н. - 5000 п.н.), как показано на ФИГ. 13А-13В.

[0114] Аналогичным образом, для проверки совместимости полимеразных цепных реакций и способности к удержанию геномных продуктов была разработана модель удерживания, в которой связанные с ампликоном полимерные гранулы (с помощью химической реакции конъюгации биотин - стрептавидин) вводили внутрь полимерных гранул. Линейная амплификация таких ампликонов переменного размера на гранулах не только позволила подтвердить совместимость полимерных гранул с ПЦР, но и определила возможность удерживания амплифицированных фрагментов ДНК длиной 200 п.н. и 5 т.п.н. Продукты с 200 п.н. могут диффундировать в окружающие полимерные гранулы, тогда как продукты с 5 т.п.н. удерживаются внутри полимерных гранул (ФИГ. 14).

[0115] Помимо биомолекулярных анализов, которые могут увеличивать размер продуктов для удерживания малых молекул, полимерные гранулы могут состоять из многослойных полимеров, которые могут обеспечивать контролируемую диффузию молекул в зависимости от заряда, рН, температуры или других факторов окружающей среды (ФИГ. 15). Примеры таких систем могут включать в себя такие материалы, как ионные и неионные полимеры, в том числе альгинат, полиэтиленгликоль, N-изопропилакриламид, N,N'-диметилакриламид или другой полимер, описанный в настоящем документе.

Пример 6. Полимерные гранулы с разрушаемыми ядрами

[0116] В следующем примере представлен вариант осуществления для получения полимерных гранул с разрушаемым ядром.

[0117] Получали ядро с разрушаемым полимером с образцом внутри (клетки или ДНК). Ядро включало в себя наполнитель, например ПЭГ или полиакриламид, который смешивали с образцом с формированием полимерных гранул, как показано на ФИГ. 16А. Гранулу конденсировали с 50% изопропиловым спиртом (IPA) и смешивали с DHEBA/акриламидом с KPS/TEMED (ФИГ. 16В). В результате получали полимерную гранулу, инкапсулированную внутри оболочки DHEBA. Оболочка DHEBA нестабильна при воздействии температур, которые используют для дегибридизации и посева, что приводит к высвобождению ядра из оболочки DHEBA при высоких температурах. Кроме того, обработка полимерной гранулы DHEBA восстановителем, таким как DTT, и набухание в воде приводит к образованию оболочки DHEBA-акриламид. На ФИГ. 16С представлены микрофотографии полимерных гранул DHEBA, соответствующие схематическому изображению, приведенному на ФИГ. 16В.

[0118] Другой вариант осуществления представляет собой полимерную гранулу с оболочкой DHEBA с агарозным ядром, как показано на ФИГ. 17А. Гранулу ядра агарозы получали, следуя способу, аналогичному для гранулы ядра полиакриламида. Образец клеток или ДНК смешивали с агарозой с образованием полимерной гранулы, следуя способу, описанному в настоящем документе. Агарозные гранулы могут быть функционализированы и использованы для очистки образца, например ДНК. Полимерную гранулу обрабатывали DHEBA, инкапсулирующим внутри полимерную гранулу, как показано на ФИГ. 17В. Чтобы инициировать образование оболочки DHEBA вокруг полимерной гранулы, можно использовать УФ-излучение. На агарозное ядро воздействовали температурой или проводили его химическое расщепление для расплавления ядра с образованием полой оболочки DHEBA, как показано на ФИГ. 17С.

Пример 7. Флуоресцентное инициирование гелеобразования полимерных гранул

[0119] В приведенном ниже примере представлен вариант осуществления получения полимерных гранул с использованием способа флуоресцентного инициирования гелеобразования.

[0120] Готовили образец, например, клетки или ДНК. К образцу добавляли полимер, содержащий связанные с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) акрилатные полимеры (FITC-AETC), которые покрывали образец. Образцы, связанные с FITC-AETC, и мономеры облучали, например световым излучением, что приводило к образованию FITC-связанных клеток внутри полимерного геля, как схематически показано на ФИГ. 18А. Полученные клетки можно визуализировать без окрашивания вследствие взаимодействия FITC на клеточной поверхности, как показано на ФИГ. 18В и 18С. Для контрольных образцов без покрытия FITC-AETC возбуждения не наблюдалось. Инициированное флуоресцеином гелеобразование, описанное в настоящем документе, можно проводить в растворе. При проведении в растворе инициирование полимеризации происходит в центре капли объемного раствора. Для инициирования гелеобразования добавляли триэтаноламин (TEA) в количестве 210 мМ. Также добавляли 0,05% NaHSO₃.

[0121] В вариантах осуществления, примерах и фигурах, описанных в настоящем документе, предложены композиции, способы и системы для удерживания биомолекул в физически ограниченном пространстве в процессе от лизиса до получения библиотеки. В некоторых вариантах осуществления предложены библиотеки, полученные из одной длинной молекулы ДНК или одиночной клетки для высвобождения на поверхности проточной кюветы в ограниченном пространстве. После того как библиотека из одиночной молекулы ДНК или одиночной клетки в отдельных компартментах высвобождается на поверхность проточной ячейки, производят посев библиотеки из каждого компартмента в непосредственной близости друг к другу.

[0122] Используемый в настоящем документе термин «содержащий» представляет собой синоним терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и не исключает дополнительные неуказанные элементы или стадии способа.

[0123] В описании выше приведены несколько способов и материалов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться модификациям в части способов и материалов, а также изменениям в части способов изготовления и оборудования. Такие модификации будут очевидны специалистам в данной области после изучения настоящего описания или реализации изобретения, описанного в настоящем документе, на практике. Следовательно, не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, но предполагается, что оно охватывает все модификации и альтернативные варианты в пределах истинного объема и сущности изобретения.

[0124] Все источники, процитированные в настоящем документе, включая, без ограничений, опубликованные и неопубликованные заявки, патенты и ссылки на литературу, полностью включены в настоящий документ путем ссылки и, следовательно, являются частью настоящего описания. В тех случаях, когда публикации, патенты или заявки на патенты, включенные путем ссылки, противоречат изложению, приведенному в настоящем описании, предполагается, что настоящее описание заменяет и/или имеет приоритет над любым таким противоречащим материалом.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Illumina, Inc.

<120> МОДУЛЯЦИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГРАНУЛ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ДНК

<130> ILLINC.422WO

<150> 62/704,028

<151> 2018-10-26

<160> 4

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga 20

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 2

caagcagaag acggcatacg a 21

<210> 3

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 3

tttttttttt aatgatacgg cgaccaccga 30

<210> 4

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 4

tttttttttt caagcagaag acggcatacg a 31

Группа изобретений относится к полимерной грануле для проведения множества реакций совместного анализа, содержащей: предшественник гидрогелевого полимера; поперечносшивающий агент; и биомолекулу внутри полимерной гранулы, причем гранула представляет собой пористую полую гранулу, где гранула содержит множество слоев полимера, при этом каждый слой отличается определенным размером пор и густотой пор, обеспечивающими диффузию реагента через гранулу, которая удерживает при этом биомолекулу, также относится к способу проведения множества последовательных совместных анализов биомолекулы, инкапсулированной внутри полимерной гранулы, включающему: получение полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу; и последовательное приведение одиночной клетки в контакт с реагентами для проведения множества последовательных совместных анализов. Группа изобретений обеспечивает полимерную гранулу для быстрой и эффективной обработки за счет снижения потерь биомолекул путем удерживания их внутри гранулы, обеспечивая в то же время диффузию одного или более реагентов через гранулу. 2 н. и 30 з.п. ф-лы, 29 ил., 7 пр.

1. Полимерная гранула для проведения множества реакций совместного анализа, содержащая:

предшественник гидрогелевого полимера;

поперечносшивающий агент; и

биомолекулу внутри полимерной гранулы, причем гранула представляет собой пористую полую гранулу, где гранула содержит множество слоев полимера, при этом каждый слой отличается определенным размером пор и густотой пор, обеспечивающими диффузию реагента через гранулу, которая удерживает при этом биомолекулу.

2. Гранула по п. 1, в которой размер пор модулируют в зависимости от заряда, pH или температуры.

3. Гранула по п. 1, диаметр которой составляет от около 50 мкм до около 150 мкм.

4. Гранула по п. 1, в которой предшественник гидрогелевого полимера содержит полиэтиленгликоль (PEG)-тиол/PEG-акрилат, PEG/малеимид (PEG/MAL), акриламид/N,N’-бис(акрилоил)цистамин (BACy), N,N’-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид (DHEBA), PEG/полипропиленоксид (PPO), полиакриловую кислоту, поли(гидроксиэтилметакрилат) (PHEMA), поли(метилметакрилат) (PMMA), поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAAm), поли(молочную) кислоту (PLA), сополимер поли(молочной) и поли(гликолевой) кислот (PLGA), поликапролактон (PCL), поли(винилсульфоновую) кислоту (PVSA), поли(L-аспарагиновую) кислоту, поли(L-глутаминовую) кислоту, полилизин, агар, агарозу, альгинат, гепарин, альгинатсульфат, декстрансульфат, гиалуронан, пектин, каррагинан, желатин, хитозан, целлюлозу или коллаген.

5. Гранула по п. 1, в которой предшественник гидрогелевого полимера содержит бисакриламид, диакрилат, диаллиламин, триаллиламин, дивинилсульфон, диаллиловый эфир диэтиленгликоля, этиленгликольдиакрилат, полиметиленгликольдиакрилат, полиэтиленгликольдиакрилат, триметилопропантриметакрилат, этоксилированный триметилолтриакрилат или этоксилированный пентаэритритолтетраакрилат.

6. Гранула по п. 1, в которой биомолекулой является нуклеиновая кислота.

7. Гранула по п. 6, в которой нуклеиновая кислота представляет собой молекулу длинной ДНК из 50 000 пар нуклеотидов или более.

8. Гранула по п. 1, в которой реагент содержит ферменты, химические вещества и праймеры размером менее 50 пар нуклеотидов.

9. Гранула по п. 1, в которой реагент содержит лизоцим, протеиназу K, статистические гексамеры, полимеразу, транспозазу, праймеры, лигазу, катализирующий фермент, дезоксинуклеотидтрифосфаты, буферы или двухвалентные катионы.

10. Гранула по п. 9, в которой полимераза представляет собой ДНК-полимеразу Ф29, Taq-полимеразу или Bsu-полимеразу.

11. Гранула по п. 9, в которой транспозаза представляет собой Tn5.

12. Гранула по п. 9, в которой праймеры представляют собой адапторные последовательности P5 или адапторные последовательности P7.

13. Гранула по п. 1, дополнительно содержащая стабилизированную оболочку, которая инкапсулирует гранулу.

14. Гранула по п. 13, в которой стабилизированная оболочка содержит N,N’-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид (DHEBA), акрилат-PEG и пероксидисульфат калия (KPS).

15. Гранула по п. 1, дополнительно содержащая флуоресцентное соединение, связанное с предшественником гидрогелевого полимера.

16. Гранула по п. 15, в которой флуоресцентное соединение представляет собой изотиоцианат флуоресцеина (FITC).

17. Способ проведения множества последовательных совместных анализов биомолекулы, инкапсулированной внутри полимерной гранулы, включающий:

получение полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу по п. 1; и

последовательное приведение одиночной клетки в контакт с реагентами для проведения множества последовательных совместных анализов.

18. Способ по п. 17, дополнительно включающий модуляцию размера пор полимерной гранулы посредством регулирования заряда, pH или температуры.

19. Способ по п. 17, в котором полимерная гранула содержит множество слоев полимера, при этом каждый слой отличается определенным размером пор, и при этом размер пор каждого полимерного слоя модулируют определенным образом посредством изменения заряда, pH или температуры.

20. Способ по п. 17, в котором множество последовательных совместных анализов включают лизис, анализ ДНК, анализ РНК, анализ белков, тагментацию, амплификацию нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, получение библиотеки ДНК, анализ доступного для транспозазы хроматина с использованием секвенирования (ATAC-seq), транспозицию с сохранением смежности (CPT-seq), комбинаторное индексированное секвенирование одиночной клетки (SCI-seq) или амплификацию генома одиночной клетки или любую их комбинацию, выполняемую последовательно.

21. Способ по п. 17, в котором производят посев полимерной гранулы, инкапсулирующей биомолекулу, на твердую подложку.

22. Способ по п. 21, в котором твердая подложка представляет собой травленую поверхность, лунку, устройство проточной кюветы, микрожидкостный канал, гранулу или колонку.

23. Способ по п. 17, в котором биомолекулой является нуклеиновая кислота.

24. Способ по п. 23, в котором нуклеиновая кислота представляет собой молекулу длинной ДНК из 50000 пар нуклеотидов или более.

25. Способ по п. 17, дополнительно включающий проведение реакции амплификации нуклеиновых кислот на нуклеиновой кислоте, инкапсулированной внутри полимерной гранулы, перед выполнением реакции тагментации.

26. Способ по п. 25, в котором реакция амплификации нуклеиновых кислот включает стадию амплификации с множественным вытеснением (MDA).

27. Способ по п. 26, в котором реакция тагментации включает приведение биомолекулы в контакт со смесью транспозазы, содержащей адапторные последовательности и транспосомы.

28. Способ по п. 20, дополнительно включающий посев библиотеки ДНК на твердую подложку.

29. Способ по п. 28, в котором посев включает расщепление гранулы для высвобождения библиотеки ДНК из гранулы.

30. Способ по п. 29, в котором гранулу расщепляют путем приведения гранулы в контакт со смесью для расщепления или при нагревании гранулы до около 90 °C для высвобождения библиотеки ДНК.

31. Способ по п. 30, в котором смесь для расщепления содержит дитиотреитол (DTT), трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP) или трис(3-гидроксипропил)фосфин (THP).

32. Способ по п. 28, в котором твердой подложкой является устройство проточной кюветы.