СИНХРОНИЗИРОВАННАЯ КЛАСТЕРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ БИБЛИОТЕКИ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕНОМНОЙ ДНК С СОХРАНЕННОЙ НЕПРЕРЫВНОСТЬЮ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/6844 G01N15/14 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке США №62/942,563, поданной 2 декабря 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002]Существует множество способов и сфер применения, для которых желательно создать библиотеку фрагментированных и меченных молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из молекул двухцепочечной ДНК (дцДНК). Часто целью является получение меньших молекул ДНК (например, фрагментов ДНК) из более крупных молекул дцДНК для применения в качестве темплатов в реакциях секвенирования ДНК. Темплаты могут обеспечивать получение более коротких чтений. Чтения коротких последовательности, как правило, перекрываются с рядом чтений другой короткой последовательности для обеспечения избыточного охвата различных частей общей более длинной последовательности. В ходе анализа данных перекрывающиеся последовательности из множества чтений можно использовать для объединения информации о более длинной последовательности. Таким образом, перекрывающиеся чтения коротких последовательностей можно выравнивать для реконструкции более длинных нуклеотидных последовательностей. В некоторых случаях для упрощения анализа данных можно использовать стадии предварительного секвенирования (такие как штрихкодирование конкретных молекул нуклеиновой кислоты).

ВВЕДЕНИЕ

[0003] Первый аспект, описанный в настоящем документе, представляет собой способ, включающий генерирование серии синхронизированных кластерных изображений для множества фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью из образца генома, причем каждое синхронизированное кластерное изображение в серии последовательно генерируют посредством: введения в проточную кювету соответствующего образца, включающего некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, при этом некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединены к твердой подложке или присоединены друг к другу; инициирования отсоединения некоторых из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга; амплификации некоторых фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества соответствующих матричных цепей; окрашивания соответствующих матричных цепей; и визуализации соответствующих матричных цепей.

[0004] Второй аспект, описанный в настоящем документе, представляет собой способ, включающий получение смеси, включающей множество фрагментов образца генома из библиотеки с сохраненной непрерывностью, причем множество фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединены к твердым подложкам или присоединены друг к другу; разведение смеси для получения предварительно заданного количества разведенных образцов, вводимых в проточную кювету; и генерирование синхронизированного кластерного изображения для по меньшей мере одного из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью посредством: введения в проточную кювету первого из разведенных образцов, включающих некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью; инициирования отсоединения некоторых из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга; амплификации некоторых фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества матричных цепей; окрашивания множества матричных цепей; и визуализации множества матричных цепей.

[0005] Третий аспект, описанный в настоящем документе, представляет собой систему, содержащую приемный отсек проточной кюветы; систему управления текучей средой, включающую подающие текучие среды, которые соответственно подают разведенный образец и краситель в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы; систему освещения, расположенную таким образом, чтобы освещать проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы; систему обнаружения, расположенную таким образом, чтобы захватывать изображение проточной кюветы, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы; и контроллер, находящийся в функциональной связи с системой управления текучей средой, системой освещения и системой обнаружения, причем контроллер выполнен с возможностью: инициирования введения разведенного образца в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы, посредством подающих текучих сред; инициирования введения красителя в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы, посредством подающих текучих сред, после генерирования матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, присутствующих в разведенном образце; инициирования освещения окрашенных матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, системой освещения; и инициирования визуализации освещенных окрашенных матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, системой обнаружения.

[0006] Следует понимать, что любые признаки первого способа, и/или второго способа, и/или системы, описанных в настоящем документе, могут быть скомбинированы друг с другом любым желательным способом, и/или в любой желательной конфигурации, и/или с любым из примеров, описанных в настоящем документе, для достижения преимуществ, описанных в настоящем описании, включая, например, идентификацию конкретной группы матричных цепей с использованием обработанного кластерного изображения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0007] Признаки согласно примерам настоящего описания станут очевидными после ознакомления с нижеследующим подробным описанием и графическими материалами, на которых одинаковые номера позиций соответствуют подобным, хотя, возможно, неидентичным компонентам. Для краткости изложения номера позиций или признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть описаны или могут не быть описаны применительно к другим графическим материалам, на которых они встречаются.

[0008] на Фиг. 1 представлено схематическое изображение примера способа создания примера комплекса, включающего фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью, присоединенные к твердой подложке;

[0009] на Фиг. 2A-2C представлены схематические изображения, на которых в совокупности показан другой пример способа создания другого примера комплекса, включающего фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью, присоединенные к твердой подложке;

[0010] на Фиг. 3 представлено схематичное изображение лигирования и расщепления способа, представленного на Фиг. 2A-2C, происходящих в единой однореакторной реакции;

[0011] на Фиг. 4 представлено схематическое изображение примера части процесса подготовки библиотеки, генерирующего присоединенные фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью;

[0012] на Фиг. 5A представлен вид сверху примера проточной кюветы;

[0013] на Фиг. 5B представлен увеличенный вид с частичным разрезом примера проточного канала проточной кюветы;

[0014] на Фиг. 5C представлен увеличенный вид в частичном разрезе другого примера проточного канала проточной кюветы;

[0015] на Фиг. 6A-6D представлены схематические виды нескольких стадий способа генерирования серии синхронизированных кластерных изображений;

[0016] на Фиг. 7 схематически представлены изображения (слева на Фиг. 7), полученные после выполнения генерирования кластера для разных образцов, и обработанные кластерные изображения (справа на Фиг. 7), сгенерированные для каждого из образцов;

[0017] на Фиг. 8 представлено схематическое изображение примера части процесса подготовки библиотеки, реализуемого на проточной кювете, в которой используют присоединенные фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью, показанные на Фиг. 4;

[0018] на Фиг. 9A-9С представлены схематические виды нескольких стадий способа генерирования серии синхронизированных кластерных изображений;

[0019] на Фиг. 10 представлен скриншот с оригинальной окраской, воспроизведенный в черно-белом цвете, из браузера Genomics Viewer (IGV), на котором представлены результаты для богатой AT области в гене INTS4P1 после удаления неперенесенной цепи посредством термической денатурации, а также после удаления неперенесенной цепи с использованием состояния экзонуклеазы Т7; и

[0020] на Фиг. 11 представлен график, демонстрирующий флуоресценцию (ось y, единицы флуоресценции) в зависимости от размера (ось X, пары нуклеотидов) амплифицированных с помощью ПЦР фрагментов библиотеки, сгенерированных способами, показанными на Фиг. 2A-2C и Фиг. 3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0021] Фрагменты библиотеки представляют собой части дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) сходного размера (например, < 1000 п. н.) более крупного или более длинного фрагмента ДНК. Фрагменты библиотеки могут быть объединены в данные секвенирования, если можно идентифицировать общий исходный компартмент, из которого происходит длинный фрагмент ДНК. Компартментализация различных длинных фрагментов ДНК может быть желательной для достижения содержания субгаплоидного генома внутри каждого компартмента для синтетических длинных чтений. Синтетические длинные чтения (или связанные короткие чтения) допустимы, когда множество коротких фрагментов могут быть сгруппированы вместе на основе идентификации компартмента, из которого происходит длинный фрагмент ДНК. Компартментализацию выполняют физически, например, с помощью лунок, гранул, капель или других физических компартментов.

[0022] Общим для всех данных подходов к компартментализации является принцип применения последовательности штрих-кода или индексной последовательности для идентификации компартмента, из которого происходит длинный фрагмент ДНК. Последовательность штрих-кода, присоединенная к каждому из более коротких фрагментов, может быть уникальной для конкретного длинного фрагмента ДНК и, таким образом, может способствовать маркировке различных компартментов в процессе подготовки библиотеки. Именно последовательность штрих-кода используют для группировки коротких чтений друг с другом с образованием синтетических длинных чтений на основе допущения, что все короткие чтения происходят из одного и того же компартмента.

[0023] Примеры способов, описанных в настоящем документе, позволяют выполнять компартментализацию различных фрагментов библиотеки без необходимости включения уникальной последовательности штрих-кода. В способе используют фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью и визуализацию для создания серии синхронизированных кластерных изображений. Каждое синхронизированное кластерное изображение можно использовать для идентификации образца (компартмента), из которого был сгенерирован конкретный набор матричных цепей. Более того, каждое чтение последовательности можно группировать с использованием синхронизированных кластерных изображений. Такая группировка позволяет связывать чтения и тем самым обеспечивает возможность реконструирования длинного фрагмента ДНК.

[0024] Определения

[0025] Если не указано иное, следует понимать, что термины, используемые в настоящем документе, имеют свое обычное значение в соответствующей области. Ниже приведен ряд терминов, используемых в настоящем документе, и их значения.

[0026] Используемые в настоящем документе формы единственного числа подразумевают как единственные, так и множественные формы, если из контекста явно не следует иное. Используемый в настоящем документе термин «содержащий» представляет собой синоним терминов «включая», «включающий» или «характеризуется» и является включающим или не имеющим ограничительного характера, и он не исключает дополнительных неуказанных элементов или стадий способа.

[0027] Указание в настоящем описании на «один пример», «другой пример», «пример» и т. п. означает, что конкретный элемент (например, признак, конструкция, композиция, конфигурация и/или характеристика), описанный в отношении примера, включен по меньшей мере в один пример, описанный в настоящем документе, и может присутствовать или может отсутствовать в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы любого примера можно комбинировать любым подходящим способом с разными примерами, если из контекста явно не следует иное.

[0028] Термины «по существу» и «около», используемые по всему тексту данного описания, включая формулу изобретения, используют для описания и учета небольших колебаний, например из-за вариаций при обработке. Например, эти термины могут относиться к равным ±5% или менее от указанного значения, например равным ±2% или менее от указанного значения, например равным ±1% или менее от указанного значения, например равным ±0,5% или менее от указанного значения, например равным ±0,2% или менее от указанного значения, например равным ±0,1% или менее, например равным ±0,05% или менее от указанного значения.

[0029] Адаптер. Линейная олигонуклеотидная последовательность, которая может быть слита с молекулой нуклеиновой кислоты, например, посредством лигирования или тагментации. Длины адаптеров могут находиться в диапазоне от около 10 нуклеотидов до около 100 нуклеотидов, или от около 12 нуклеотидов до около 60 нуклеотидов, или от около 15 нуклеотидов до около 50 нуклеотидов. Адаптер может включать любую комбинацию нуклеотидов и/или нуклеиновых кислот. В некоторых примерах адаптер может включать последовательность, комплементарную по меньшей мере части праймера, например праймера, включающего универсальную нуклеотидную последовательность (такую как последовательность P5 или P7). Например, адаптер на одном конце фрагмента включает последовательность, комплементарную по меньшей мере части первого праймера проточной кюветы, а адаптер на другом конце фрагмента включает последовательность, идентичную по меньшей мере части второго праймера проточной кюветы. Комплементарный адаптер может гибридизироваться с первым праймером проточной кюветы, а идентичный адаптер является темплатом для его комплементарной копии, которая может гибридизироваться со вторым праймером проточной кюветы в процессе кластеризации. В некоторых примерах адаптер может включать последовательность праймера для секвенирования или сайт связывания для секвенирования. Комбинации различных адаптеров могут быть встроены в молекулу нуклеиновой кислоты, например фрагмент ДНК.

[0030] Захватный сайт. Часть поверхности проточной кюветы физически модифицируют и/или модифицируют химическим свойством, который позволяет локализовать комплексы. В примере захватный сайт может включать захватный химический агент (т. е. материал, молекулу или функциональную группу, которая способна присоединяться, удерживаться или связываться с молекулой-мишенью (например, комплекс)). Одним примером захватного химического агента является член связывающейся пары рецептор-лиганд (например, авидин, стрептавидин, биотин, лектин, углевод, белок, связывающийся с нуклеиновой кислотой, эпитоп, антитело и т. д.), способный связываться с молекулой-мишенью (или с линкерной функциональной группой, присоединенной к молекуле-мишени). Еще одним примером захватного химического агента является химический реагент, способный образовывать электростатическое взаимодействие, водородную связь или ковалентную связь (например, по механизму тиол-дисульфидного обмена, клик-химии, реакции Дильса-Альдера и т. д.) с комплексом.

[0031] Комплекс. Носитель, такой как твердая подложка, и готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот, прикрепленные к носителю. Носитель может также включать один элемент связывающейся пары, другой элемент которой является частью захватного сайта.

[0032] Фрагмент. Участок или часть генетического материала (например, ДНК, РНК и т. д.). Фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью представляют собой более мелкие фрагменты более длинного образца нуклеиновой кислоты, который был фрагментирован, причем более мелкие фрагменты удерживаются вместе определенным образом (например, посредством гранулы, с помощью транспосомы и т. д.).

[0033] Молекула или образец нуклеиновой кислоты. Представляет собой полимерную форму нуклеотидов любой длины и может включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, их аналоги или их смеси. Термин может относиться к одноцепочечным или двухцепочечным полинуклеотидам.

[0034] Термин «матричная» молекула (или цепь) нуклеиновой кислоты может относиться к анализируемой последовательности.

[0035] Нуклеотиды в образце нуклеиновой кислоты могут включать нуклеиновые кислоты природного происхождения и их функциональные аналоги. Примеры функциональных аналогов способны гибридизироваться с нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности образом, или их можно использовать в качестве темплата для репликации конкретной нуклеотидной последовательности. Нуклеотиды природного происхождения обычно имеют каркас, содержащий фосфодиэфирные связи. Структура аналога может иметь альтернативную каркасную связь, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды природного происхождения обычно содержат сахар дезоксирибозу (например, присутствующую в ДНК) или сахар рибозу (например, присутствующую в РНК). Структура аналога может иметь альтернативную сахарную функциональную группу, в том числе любую из множества известных в данной области. Нуклеотиды могут включать природные или неприродные основания. Природная ДНК может включать один или более из аденина, тимина, цитозина и/или гуанина, а природная РНК может включать один или более из аденина, урацила, цитозина и/или гуанина. Можно использовать любое неприродное основание, такое как запертая нуклеиновая кислота (ЗНК) и мостиковая нуклеиновая кислота (МНК).

[0036] Праймер. Молекула нуклеиновой кислоты, которая может гибридизироваться с целевой последовательностью, такой как адаптер, присоединенный к фрагменту библиотеки с сохраненной непрерывностью. Например, праймер для амплификации может служить отправной точкой для амплификации темплата и генерации кластеров. В другом примере синтезированная цепь нуклеиновой кислоты (темплат) может включать сайт, с которым может гибридизироваться праймер (например, праймер для секвенирования), чтобы праймировать синтез новой цепи, комплементарной цепи синтезированной нуклеиновой кислоты. Любой праймер может включать любую комбинацию нуклеотидов или их аналогов. В некоторых примерах праймер представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид или полинуклеотид. Длина праймера может иметь любое число оснований и может включать множество нуклеотидов природного и/или искусственного происхождения. В примере праймер для секвенирования представляет собой короткую цепь, имеющую длину в диапазоне от 10 до 60 оснований или от 20 до 40 оснований.

[0037] Готовые к секвенированию фрагменты нуклеиновых кислот. Участок (например, фрагмент библиотеки с сохраненной непрерывностью) генетического материала, имеющий адаптеры на 3’- и 5’-концах. В готовом к секвенированию фрагменте нуклеиновой кислоты каждый адаптер включает известную универсальную последовательность (например, комплементарную по меньшей мере участку праймера на проточной кювете) и последовательность праймера для секвенирования. Готовый к секвенированию фрагмент нуклеиновой кислоты можно связывать посредством вставки транспозонов связывать на поверхность твердой подложки (например, гранулы) или непосредственно иммобилизовывать с помощью связывающейся пары или другого расщепляемого линкера.

[0038] Твердая подложка. Небольшой объект, имеющий форму, описываемую, например, как сфера, овал, микросфера, или другую принятую форму частиц с симметричными или несимметричными размерами. Твердая подложка может иметь присоединенную к ней библиотеку секвенирования. Примеры материалов, которые используют для твердой подложки, включают, без ограничений, стекло; пластик, такой как акрил, полистирол или сополимер стирола и другого материала, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретан или политетрафторэтилен (Teflon® производства The Chemours Co); полисахариды или сшитые полисахариды, такие как агароза или сефароза; нейлон; нитроцеллюлозу; смолу; кремнезем или материалы на основе кремнезема, включая кремний и модифицированный кремний; углеродное волокно, металл; неорганическое стекло; пучок оптических волокон или различные другие полимеры. Примеры твердых подложек включают стеклянные гранулы с контролируемыми порами, парамагнитные гранулы, золь тория, гранулы SEPHAROSE® (сшитая гранулированная форма агарозы, поставляемая компанией Cytivia), нанокристаллы и другие примеры, известные специалистам в данной области и описанные, например, в публикации Microsphere Detection Guide, Bangs Laboratories, Fishers Ind.

[0039] Транспосома. Комплекс, образованный между интегрирующим ферментом (например, интегразой или транспозазой) и перемещаемой цепью, неперемещаемой цепью или как перемещаемой, так и неперемещаемой цепями.

[0040] Фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью

[0041] В примерах, описанных в настоящем документе, фрагменты библиотеки, которые вводят в проточную ячейку, представляют собой фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью. Фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью представляют собой более мелкие части более длинного образца нуклеиновой кислоты, который был фрагментирован, причем более мелкие части определенным образом физически удерживают. В некоторых примерах, описанных в настоящем документе, непрерывность может быть сохранена с использованием твердой подложки при подготовке библиотеки. В других примерах, описанных в настоящем документе, непрерывность может быть сохранена посредством создания фрагментов, присоединенных друг к другу в процессе первоначальной подготовки библиотеки через связанные транспосомы, введения присоединенных фрагментов в проточную кювету и последующего завершения подготовки библиотеки на проточной кювете.

[0042] на Фиг. 1 изображен пример способа образования комплекса 10, включающего готовые к секвенированию фрагменты 12 нуклеиновой кислоты, включая фрагменты 14 из образца большей нуклеиновой кислоты, непрерывность которого сохраняется на твердой подложке 16.

[0043] В одном примере для образования комплекса 10, показанного на Фиг. 1, последовательность 18 адаптера связывается с твердой подложкой 16 посредством одного члена 20 связывающейся пары. В примере данная последовательность 18 адаптера может включать первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 1) и первую последовательность (P5’), которая комплементарна по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, P5) на проточной кювете (показанной на Фиг. 5A и 5B). Последовательность 18 адаптера связана с одним из членов 20 связывающейся пары (например, биотином) таким образом, что она может связываться с поверхностью твердой подложки 16 (которая включает другой член (например, авидин, стрептавидин и т. д.)) связывающейся пары.

[0044] Как показано на Фиг. 1, транспосомный комплекс 24’’ может также быть связан с твердой подложкой 16. Перед загрузкой транспосомного комплекса 24’’ на твердую подложку 16 частичный Y-адаптер 25’ может быть смешан с ферментом 32 транспозазы (который, хотя он и не показан, может включать две молекулы Tn5) с образованием примера транспосомного комплекса 24’’. Частичный Y-адаптер 25’ может включать две мозаичные концевые последовательности M₁, M₂, которые гибридизируются друг с другом. Одна из мозаичных концевых последовательностей M₁ имеет свободный конец, который способен присоединяться к фрагментированным цепям ДНК во время тагментации и, следовательно, аналогичен перенесенной цепи 26, показанной на Фиг. 2A-2C. Другая из мозаичных концевых последовательностей M₂ может быть присоединена ко второй последовательности праймера для секвенирования (например, последовательности праймера для секвенирования чтения 2) и второй последовательности (P7), которая имеет ту же последовательность, что и по меньшей мере часть другого из праймеров для амплификации (P7) на проточной кювете так, что ее копия комплементарна (например, P7') праймеру для амплификации (P7). В данном примере другая из мозаичных концевых последовательностей M₂, вторая последовательность праймера для секвенирования и вторая последовательность составляют последовательность 22 адаптера. Последовательности 22 адаптера не присоединяются к фрагментированным цепям ДНК во время тагментации и, таким образом, аналогичны неперенесенным цепям 28, показанным на Фиг. 2A-2C.

[0045] Загрузка транспосомного комплекса 24’’ на твердую подложку 16 может включать смешивание транспосомного комплекса 24’’ с твердой подложкой 16 и воздействие на смесь подходящих условий для лигирования мозаичного конца M₁ частичного Y-образного адаптера 25’ с 3'-концом последовательности 18 адаптера. Как показано на Фиг. 1, к каждой из последовательностей 18 адаптера на твердой подложке 16 могут быть присоединены отдельные транспосомные комплексы 24’’.

[0046] В этом примере процесса образования комплекса 10 затем может быть выполнен процесс тагментации. Текучая среда (например, буфер для тагментации), включающая более длинный образец нуклеиновой кислоты 30 (например, ДНК), может быть добавлена к твердой подложке 16, с которой связаны последовательность 18 адаптера и транспосомные комплексы 24’’. При контактировании образца с транспосомными комплексами 24’’ тагментируется более длинный образец нуклеиновой кислоты. В этом примере тагментации образец 30 фрагментируют на фрагменты 14, 14' и каждый из фрагментов 14, 14' помечают на 5'-конце, при этом мозаичный конец M₁ частичного Y-адаптера 25’ остается свободным.

[0047] Как показано на Фиг. 1, тагментация более длинного образца нуклеиновой кислоты 30 приводит к образованию множества мостиковых молекул между транспосомными комплексами 24’’. Мостиковые молекулы охватывают твердую подложку 16. Транспосомные комплексы 24’’ и последовательности 18 адаптера сохраняют непрерывность образца 30 нуклеиновой кислоты в виде мостиковых молекул, и, таким образом, мостиковые молекулы представляют собой фрагменты 14, 14‘ библиотеки с сохраненной непрерывностью.

[0048] Затем фермент транспозазы можно удалять посредством обработки додецил сульфатом натрия (SDS) или нагреванием или расщеплением протеиназой K. После удаления ферментов транспозазы остаются фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью, прикрепленные к твердой подложке 16.

[0049] Для завершения обработки готовых к секвенированию фрагментов выполняют дополнительное удлинение и лигирование (обозначенные звездочками на Фиг. 1) для обеспечения присоединения фрагментов 14 и 14‘ к последовательностям 22. Полученный комплекс 10 показан на Фиг. 1.

[0050] Каждый фрагмент 14, 14‘ библиотеки с сохраненной непрерывностью является частью соответствующих готовых к секвенированию фрагментов 12, 12' нуклеиновой кислоты, каждый из которых также включает соответствующие последовательности 18 и 22 адаптера, присоединенные с обоих концов. Последовательности 18 адаптера являются последовательностями, изначально связанными с твердой подложкой 16, и включают первую последовательность праймера для секвенирования и первую последовательность, комплементарную одному из праймеров проточной кюветы. Последовательности 18 адаптера присоединены к одному члену 20 связывающейся пары. Последовательности 22 адаптера получены от Y-адаптера 25’ и включают вторую последовательность, идентичную другому праймеру проточной кюветы и второй последовательности праймера для секвенирования. Поскольку каждый готовый к секвенированию фрагмент 14, 14’ нуклеиновой кислоты включает подходящие адаптеры для мостиковой амплификации и секвенирования, ПЦР-амплификацию не выполняют. Таким образом, эти фрагменты 12, 12’ готовы к секвенированию. Более того, поскольку фрагменты 14, 14‘ библиотеки с сохраненной непрерывностью получены из одного и того же более длинного образца 30 нуклеиновой кислоты, фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью могут подходить для областей применения со связанными длинными чтениями, описанных в настоящем документе.

[0051] Другой пример способа образования другого примера комплекса 10' (Фиг. 2C) показан на Фиг. 2A-2C.

[0052] В этом примере последовательность 18' адаптера связывается с твердой подложкой 16 посредством одного элемента 20 связывающейся пары. В примере данная последовательность 18’ адаптера может включать гибридизируемую последовательность Н, первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 1) и первую последовательность (например, P5), которая идентична по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, P5) на проточной кювете так, что ее копия комплементарна (например, P5’) праймеру для амплификации (Р5). Последовательность 18 адаптера связана с одним из членов 20 связывающейся пары (например, биотином) таким образом, что она может связываться с поверхностью твердой подложки 16 (которая содержит другой член (например, авидин, стрептавидин и т. д.)) связывающейся пары.

[0053] Как показано на Фиг. 2A, транспосомный комплекс 24 может также быть связан с твердой подложкой 16. Перед загрузкой транспосомного комплекса 24 на твердую подложку 16 L-адаптер 21 можно смешивать с ферментом 32 транспозазы (например, включая две молекулы Tn5) с образованием примера транспосомного комплекса 24. L-адаптер 21 может включать две мозаичные концевые последовательности M₁, M₂, которые гибридизируются друг с другом. Одна из мозаичных концевых последовательностей M₁ представляет собой перенесенную цепь 26, добавляемую к одному концу каждого фрагмента 14, 14’ в процессе лигирования, выполняемом после процесса тагментации. Другая из мозаичных концевых последовательностей M₂ является частью неперенесенной цепи 28, удаляемой после выполнения процессов лигирования и тагментации. Эта мозаичная концевая последовательность M₂ присоединена к комплементарной гибридизируемой последовательности HC, которая комплементарна гибридизируемой последовательности H последовательности 18’ адаптера, присоединенной к твердой подложке 16. Комплементарная гибридизируемая последовательность HC позволяет L-адаптеру 21 гибридизироваться с последовательностью 18’ адаптера. Таким образом, комплементарная гибридизируемая последовательность HC позволяет загружать транспосомный комплекс 24 на твердую подложку.

[0054] Загрузка транспосомного комплекса 24 на твердую подложку 16 может включать смешивание транспосомного комплекса 24 с твердой подложкой 16 и воздействие на смесь подходящих условий для гибридизации комплементарной гибридизируемой последовательности HC L-адаптера 21 с гибридизируемой последовательностью H последовательности 18’ адаптера. Как показано на Фиг. 2A, к каждой из последовательностей 18’ адаптера на твердой подложке 16 может быть присоединен отдельный транспосомный комплекс 24.

[0055] В этом примере способа образования комплекса 10 затем выполняют процесс тагментации. Текучая среда (например, буфер для тагментации), включающая более длинный образец 30 нуклеиновой кислоты (например, ДНК), может быть добавлена к твердой подложке 16, на которую загружен транспосомный комплекс 24. При контактировании образца 30 с транспосомными комплексами 24, связанными с твердой подложкой, тагментируется более длинный образец 30 нуклеиновой кислоты. В этом примере тагментации образец 30 фрагментируют на фрагменты 14, 14' и каждый из фрагментов 14, 14' помечают на 5'-конце, с мозаичной концевой последовательностью M₁ частичного L-адаптера 21.

[0056] Как показано на Фиг. 2A, тагментация более длинного образца нуклеиновой кислоты 30 приводит к образованию множества мостиковых молекул между смежными транспосомными комплексами 24 и, следовательно, смежными последовательностями 18’ адаптера. Мостиковые молекулы охватывают твердую подложку 16. Транспосомные комплексы 24 и последовательности 18 адаптера сохраняют непрерывность образца 30 нуклеиновой кислоты в виде мостиковых молекул, и, таким образом, мостиковые молекулы представляют собой фрагменты 14, 14‘ библиотеки с сохраненной непрерывностью.

[0057] Затем фермент 32 транспозазы можно удалять посредством обработки додецил сульфатом натрия (SDS) или нагреванием или расщеплением протеиназой K.

[0058] Затем может быть выполнено лигирование для связывания свободных мозаичных концевых последовательностей M₁ с соответствующими последовательностями 18’ адаптера. на Фиг. 2A звезды представляют собой места выполнения лигирования. В примере лигирование может быть инициировано посредством введения буферного раствора, содержащего подходящую лигазу, и нагревания до приблизительно подходящей температуры в течение подходящего времени для инициирования ферментативной активности. Примеры подходящих ферментов лигазы включают ДНК-лигазу E.Coli, лигазу Т7 и т. д. В примере буферный раствор, содержащий ДНК-лигазу E.Coli, может также включать никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺). В данном примере нагревание до около 16°C в течение около 15 минут инициирует ферментативную активность. Полученная структура показана на Фиг. 2B.

[0059] Неперенесенная цепь 28 L-адаптера 21 может быть затем удалена. В этом примере каждую из неперенесенных цепей 28 удаляют с использованием любого подходящего 5’-3’-экзонуклеазного фермента 23, такого как экзонуклеаза Т7. В примере удаление неперенесенной цепи может быть инициировано посредством введения буфера, содержащего 5’-3’-экзонуклеазный фермент 23, и ожидания в течение предварительно заданного времени. 5’-3’-экзонуклеазный фермент 23 способен расщеплять неперенесенную цепь 28 при комнатной температуре (например, от около 22°C до около 25°C), и, таким образом, дополнительный нагрев не используют. Затем расщепленные неперенесенные цепи 28 можно смывать.

[0060] Использование экзонуклеазного фермента для удаления неперенесенных цепей 28 может быть более желательным, чем использование термической денатурации. 5’-3’-экзонуклеазный фермент 23 эффективно расщепляет неперенесенные цепи 28, что позволяет получить более чистый темплат (чем при использовании термической денатурации) для гибридизации присоединенной впоследствии последовательности адаптера (см. номера 22 позиций на Фиг. 2C). Это может повысить выход библиотеки. Кроме того, удаление неперенесенных цепей 28 с помощью 5’-3’-экзонуклеазного фермента 23 может улучшить покрытие библиотекой областей, богатых аденином (A) и тимином (T), потери которых наблюдались после термической денатурации неперенесенных цепей 28 (см. Фиг. 11). Кроме того, расщепление ферментом экзонуклеазой не увеличивает время всего процесса подготовки библиотеки.

[0061] Как показано на Фиг. 2C, данный пример способа образования комплекса 10’ включает введение частичного Y-адаптера 25. Частичный Y-адаптер 25 включает мозаичную концевую последовательность M₃, которая комплементарна мозаичной концевой последовательности M₁ и последовательности 22 адаптера. Последовательность 22 адаптера может включать вторую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 2) и вторую последовательность (P7'), которая комплементарна другому из праймеров для амплификации (P7) на проточной кювете. Как показано на Фиг. 2C, мозаичная концевая последовательность M₃ частичного Y-адаптера 25 гибридизируется с мозаичной концевой последовательностью M₁ перенесенной цепи 26 (уже лигированной с последовательностью 18’ адаптера) и, таким образом, прикрепляет частичный Y-адаптер 25 к твердой подложке 16.

[0062] В примерах, описанных в настоящем документе, последовательности 18, 18’ и/или 22 адаптера также могут включать индекс образца для секвенирования или последовательность штрих-кода. Эти последовательности можно использовать в качестве резервных или альтернативных для способов компартментализации, описанных в настоящем документе.

[0063] Для создания готовых к секвенированию фрагментов выполняют дополнительное удлинение и лигирование для обеспечения присоединения фрагментов 14 и 14’ к мозаичной концевой последовательности M₃ и, следовательно, к последовательностям 22.

[0064] Полученный комплекс 10’ показан на Фиг. 2C.

[0065] Еще один пример способа образования комплекса 10' (показан на Фиг. 2C) частично показан на Фиг. 3. В этом примере способа лигирование перенесенной цепи 26 и расщепление неперенесенной цепи 28 выполняют в рамках единого однореакторного протокола.

[0066] В этом примере последовательность 18' адаптера связывается с твердой подложкой 16 посредством одного элемента 20 связывающейся пары. Можно использовать последовательность 18’ адаптера, описанную со ссылкой на Фиг. 2A, которая включает гибридизируемую последовательность Н, первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 1) и первую последовательность (P5), которая идентична по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, P5) на проточной кювете так, что ее копия комплементарна (например, P5’) праймеру для амплификации (Р5). Кроме того, в данном примере способа транспосомный комплекс 24 загружают на твердую подложку 16, как описано со ссылкой на Фиг. 2A. Вкратце, комплементарную гибридизируемую последовательность HC L-адаптера 21 транспосомного комплекса 24 гибридизируют с гибридизируемой последовательностью H последовательности 18‘ адаптера.

[0067] В этом примере способа образования комплекса 10' (Фиг. 2C) тагментацию выполняют так, как описано со ссылкой на Фиг. 2A.

[0068] Затем можно совместно выполнять лигирование перенесенной цепи 26 и расщепление неперенесенной цепи 28. Это схематически показано на Фиг. 3. Для обеспечения синергической работы лигазы и экзонуклеазного фермента состав реагента, который вводят в тагментированную твердую подложку, включает буфер, фермент лигазу, 5'-3'-экзонуклеазный фермент 23 (экзонуклеаза T7) и любой другой компонент, требуемый соответствующими ферментами (например, кофактор, такой как НАД⁺). В примере лигирование и расщепление можно инициировать посредством введения состава реагента и нагревания до около 25°C в течение около 15 минут для инициирования ферментативной активности.

[0069] Включение лигазы и экзонуклеазного фермента в один и тот же состав реагента может сокращать время протокола (например, на около 10 минут по сравнению с примером способа, показанным на Фиг. 2A-2C), а также сокращать количество стадий промывки.

[0070] Этот пример способа затем продолжают посредством введения части Y-адаптера 25, как описано со ссылкой на Фиг. 2C. Для создания готовых к секвенированию фрагментов и конечного комплекса 10’ выполняют дополнительное удлинение и лигирование для обеспечения присоединения фрагментов 14 и 14’ к мозаичной концевой последовательности M₃ и, следовательно, к последовательностям 22.

[0071] В способах, описанных со ссылкой на Фиг. 1 и Фиг. 2A-Фиг. 2C и Фиг. 3, получения комплексов 10, 10’ приведено несколько примеров, но следует понимать, что можно применять и другие способы при условии, что готовые к секвенированию фрагменты 12, 12' нуклеиновых кислот присоединены к твердой подложке 16.

[0072] В других примерах, описанных в настоящем документе, информацию о непрерывности можно сохранять посредством выполнения части подготовки библиотеки за пределами проточной кюветы и выполнения части подготовки библиотеки на проточной кювете.

[0073] В этом примере подготовка библиотеки может быть инициирована за пределами проточной кюветы с помощью тагментации, как схематически показано на Фиг. 4.

[0074] В показанном примере текучую среду (например, буфер для тагментации), включающую более длинный образец 30 нуклеиновой кислоты (например, двухцепочечную ДНК), можно смешивать с транспосомными комплексами 24'. В примере, показанном на Фиг. 4, каждый транспосомный комплекс 24’ представляет собой димер, включающий два фермента транспозазы (которые в совокупности обозначены цифрой «32» на Фиг. 4), перенесенную цепь 26' и неперенесенную цепь 28'. В других примерах могут быть использованы различные транспосомные комплексы, например, один из которых включает ферменты 32 транспозазы и перенесенную цепь 26', а другой включает ферменты 32 транспозазы и неперенесенную цепь 28'.

[0075] В этом примере перенесенные цепи 26’ представляют собой адаптеры, которые добавляют к одному концу каждого фрагмента 14, 14' в процессе тагментации. В примере каждая перенесенная цепь 26 представляет собой адаптер, включающий первую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 1) и первую последовательность (P5’), которая комплементарна по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, P5) на проточной кювете.

[0076] В этом примере неперенесенные цепи 28’ представляют собой адаптеры, которые не встроены в фрагмент 14, 14' во время тагментации, но впоследствии могут быть лигированы с другим концом каждого фрагмента 14, 14'. Как показано на Фиг. 4, неперенесенные цепи 28’ могут быть присоединены к перенесенной цепи 26' посредством по меньшей мере частичного спаривания оснований во время тагментации. В данном примере неперенесенная цепь 28’ представляет собой адаптер, включающий вторую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 2) и вторую последовательность (P7), которая идентична по меньшей мере части одного из праймеров для амплификации (например, P7) на проточной кювете так, что ее копия комплементарна (например, P7') праймеру для амплификации (P7).

[0077] Как показано на Фиг. 4, в текучей среде транспосомы 24’ разделяют более длинный образец 30 нуклеиновой кислоты на фрагменты 14, 14' и лигируют перенесенные цепи 26' с 5'-концом каждого фрагмента 14, 14'. В примере перенесенную цепь 26’ встраивают в 5'-конец каждого фрагмента 14, 14' более длинного образца 30 нуклеиновой кислоты посредством односторонней транспозиции. Неперенесенные цепи 28’ могут быть присоединены к перенесенной цепи 26' посредством спаривания оснований.

[0078] Этот пример процесса тагментации сохраняет непрерывность более длинного образца 30 нуклеиновой кислоты, поскольку созданные фрагменты 14, 14' (и любые перенесенные цепи 26' и неперенесенные цепи 28', непосредственно или опосредованно соединенные с ними) остаются присоединенными друг к другу посредством транспозазы 32. Присоединенные фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью в настоящем документе называются присоединенными фрагментами 34.

[0079] Как упомянуто в настоящем документе, присоединенные фрагменты 34 могут быть введены в проточную кювету, в которой может быть выполнена дополнительная обработка для завершения подготовки библиотеки. Это схематически показано на Фиг. 8, которая будет описана дополнительно со ссылкой на способы, описанные в настоящем документе.

[0080] Проточная кювета

[0081] В способах, описанных в настоящем документе, можно использовать проточную кювету 36, пример которой изображен на Фиг. 5A. Проточная кювета 36 включает субстрат 38, который по меньшей мере частично образует дорожку или проточный канал 40.

[0082] Субстрат 38 может представлять собой один слой/материал. Примеры подходящих однослойных субстратов включают эпоксисилоксан, стекло, модифицированное или функционализированное стекло, пластмассы (включая акрилы, полистирол и сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (например, TEFLON® производства компании Chemours), циклические олефины / циклоолефиновые полимеры (COP) (например, ZEONOR® производства компании Zeon), полиимиды и т. п.), нейлон (полиамиды), керамику / оксидную керамику, кварц, плавленый кварц или материалы на основе кварца, силикат алюминия, кремний и модифицированный кремний (например, лигированный бором кремний p +), нитрид кремния (Si₃N₄), оксид кремния (SiO₂), пентоксид тантала (Ta₂O₅) или другой (-ие) оксид (-ы) тантала (TaO_x), оксид гафния (HaO₂), углерод, металлы, неорганические стекла или т. п. Субстрат 38 может также представлять собой многослойную структуру. Некоторые примеры многослойной структуры включают стекло или кремний со слоем покрытия из оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности. Другие примеры многослойной структуры включают нижележащую подложку (например, стекло или кремний), на которую нанесена узорчатая смола. Другие примеры многослойного субстрата могут включать субстрат типа «кремний на изоляторе» (SOI).

[0083] В примере субстрат 38 может иметь диаметр в диапазоне от около 2 мм до около 300 мм, или прямоугольный лист или панель, наибольший размер которой составляет до около 10 футов (~ 3 метра). В примере субстрат 38 представляет собой пластину с диаметром в диапазоне от около 200 мм до около 300 мм. В качестве другого примера субстрат 38 представляет собой кристалл с шириной в диапазоне от около 0,1 мм до около 10 мм. Хотя приведены примеры размеров, следует понимать, что можно использовать субстрат 38 любых приемлемых размеров. В другом примере можно использовать панель, представляющую собой прямоугольную подложку, имеющую большую площадь поверхности, чем круглая пластина диаметром 300 мм.

[0084] В примере, показанном на Фиг. 5A, проточная кювета 36 включает проточные каналы 40. Хотя показано несколько проточных каналов 40, следует понимать, что в проточную кювету 36 может быть включено любое количество каналов 40 (например, один канал 40, четыре канала 40 и т. д.). Каждый проточный канал 40 представляет собой область, образованную между двумя соединенными компонентами (например, субстратом 36 и крышкой или двумя субстратами 36), которые могут содержать текучие среды (например, описанные в настоящем документе), вводимые в них и удаляемые из них. Каждый проточный канал 40 может быть изолирован от другого проточного канала 40 таким образом, что текучая среда, введенная в любой конкретный проточный канал 40, не протекает в любой смежный проточный канал 40. Некоторые примеры текучих сред, вводимых в проточные каналы 40, могут содержать реакционные компоненты (например, фрагменты 14, 14' библиотеки с сохраненной непрерывностью (например, на твердой подложке 16 или присоединенные друг к другу), полимеразы, праймеры для секвенирования, нуклеотиды и т. д.), промывочные растворы, разблокирующие агенты и т. д.

[0085] Проточный канал 40 может быть образован в субстрате 38 с использованием любого подходящего способа, который частично зависит от материала (-ов) субстрата 38. В одном примере проточный канал 40 вытравлен в стеклянном субстрате 38. В другом примере проточный канал 40 может быть сформирован в полимерном многослойном субстрате 38 с помощью фотолитографии, наноимпринт-литографии и т. д. В еще одном примере на субстрат 38 можно наносить отдельный материал (не показан) таким образом, что этот отдельный материал образует стенки проточного канала 40, а субстрат 38 образует нижнюю часть проточного канала 40.

[0086] В примере проточный канал 40 имеет прямолинейную конфигурацию. Длина и ширина проточного канала 40 могут быть соответственно меньше длины и ширины субстрата 38 так, что часть поверхности субстрата, окружающая проточный канал 40, доступна для прикрепления к крышке (не показана) или другому субстрату 38. В некоторых случаях ширина каждого проточного канала 40 может составлять по меньшей мере около 1 мм, по меньшей мере около 2,5 мм, по меньшей мере около 5 мм, по меньшей мере около 7 мм, по меньшей мере около 10 мм или более. В некоторых случаях длина каждой дорожки / проточного канала 40 может составлять по меньшей мере около 10 мм, по меньшей мере около 25 мм, по меньшей мере около 50 мм, по меньшей мере около 100 мм или более. Ширина и/или длина каждого проточного канала 40 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение. В другом примере проточный канал 40 имеет квадратную форму (например, 10 мм x 10 мм).

[0087] Глубина каждого проточного канала 40 может иметь глубину в пределах одного слоя, при использовании микроконтактной, аэрозольной или струйной печати для нанесения отдельного материала, который образует стенки проточного канала. Глубина может быть больше, когда используют отдельный материал (не показан) для связывания крышки с субстратом 38 или для связывания двух субстратов 38 друг с другом. В других примерах глубина каждого проточного канала 40 может составлять около 1 мкм, около 10 мкм, около 50 мкм, около 100 мкм или более. В примере глубина может находиться в диапазоне от около 10 мкм до около 100 мкм. В другом примере глубина может находиться в диапазоне от около 10 мкм до около 30 мкм. В еще одном примере глубина составляет около 5 мкм или менее. Следует понимать, что глубина каждого проточного канала 40 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение.

[0088] Различные примеры архитектуры внутри проточных каналов 40 проточной кюветы 36 показаны на Фиг. 5B и Фиг. 5C.

[0089] В примере, показанном на Фиг. 5B, проточная кювета 36 включает однослойный субстрат 38A и проточный канал 40, образованный, по меньшей мере частично, в однослойном субстрате 38A.

[0090] В проточном канале 40 присутствует полимерный гидрогель 42. Пример полимерного гидрогеля 42 включает акриламидный сополимер, такой как сополимер N-(5-азидоацетамидилпентил)акриламида и акриламида (PAZAM). PAZAM и некоторые другие формы акриламидного сополимера представлены следующей структурой (I):

где:

R^A выбран из группы, состоящей из азидо, необязательно замещенного амино, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкина, галогена, необязательно замещенного гидразона, необязательно замещенного гидразина, карбоксила, гидрокси, необязательно замещенного тетразола, необязательно замещенного тетразина, нитрилоксида, нитрона, сульфата и тиола;

R^B представляет собой H или необязательно замещенный алкил;

каждый из R^C, R^D и R^E независимо выбран из группы, состоящей из H и необязательно замещенного алкила;

каждый из -(CH₂)_p- может быть необязательно замещенным;

p представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50;

n представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 50 000; и

m представляет собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000.

[0091] Специалисту в данной области будет понятно, что конфигурация повторяющихся элементов n и m в структуре (I) является типичной, а мономерные субъединицы могут присутствовать в любом порядке в структуре полимера (например, случайная, блочная, структурированная форма или их комбинация).

[0092] Молекулярная масса PAZAM и других форм акриламидного сополимера может находиться в диапазоне от около 5 кДа до около 1500 кДа или от около 10 кДа до около 1000 кДа, или может составлять в конкретном примере около 312 кДа.

[0093] В некоторых примерах PAZAM и другие формы акриламидного сополимера являются линейными полимерами. В некоторых других примерах PAZAM и другие формы акриламидного сополимера представляют собой слабо сшитые полимеры.

[0094] В других примерах полимерный гидрогель 42 может представлять собой вариант структуры (I). В одном примере акриламидное звено может быть заменено N,N-диметилакриламидом (). В этом примере акриламидное звено в структуре (I) может быть заменено

где каждый из R^D, R^E и R^F представляет собой H или алкил C1-C6 алкил, а каждый из R^G и R^H представляет собой C1-C6 алкил (вместо H, как в случае с акриламидом). В этом примере q может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000. В другом примере N,N-диметилакриламид можно использовать в дополнение к акриламидному звену. В данном примере структура (I) может включать

в дополнение к повторяющимся элементам n и m, причем каждый из R^D, R^E и R^F представляет собой H или C1-C6 алкил, а каждый из R^G и R^H представляет собой C1-C6 алкил. В этом примере q может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100 000.

[0095] В качестве другого примера исходного полимерного гидрогеля повторяющийся элемент n в структуре (I) может быть заменен мономером, включающим гетероциклическую азидную группу, имеющую структуру (II):

где R¹ представляет собой H или C1-C6 алкил; R₂ представляет собой H или C1-C6 алкил; L представляет собой линкер, включающий линейную цепь из 2-20 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и 10 необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; E представляет собой линейную цепь, включающую от 1 до 4 атомов, выбранных из группы, состоящей из углерода, кислорода и азота и необязательных заместителей у углерода и любых атомов азота в цепи; A представляет собой N-замещенный амид, у которого к N присоединены H или C1-C4 алкил; и Z представляет собой азотсодержащий гетероцикл. Примеры Z включают 5-10 членов кольца, присутствующих в виде одной циклической структуры или слитой структуры.

[0096] В качестве еще одного примера полимерный гидрогель 42 может включать повторяющееся звено каждой из структур (III) и (IV):

где каждый из R^1a, R^2a, R^1b и R^2b независимо выбран из водорода, необязательно замещенного алкила или необязательно замещенного фенила; каждый из R^3a и R^3b независимо выбран из водорода, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного фенила или необязательно замещенного C7-C14 аралкила; и каждый из L¹ и L² независимо выбран из необязательно замещенного алкиленового линкера или необязательно замещенного гетероалкиленового линкера.

[0097] Следует понимать, что для образования полимерного гидрогеля 42 можно использовать другие молекулы при условии, что они функционализированы трансплантационными олигонуклеотидными праймерами 44, 46. Другие примеры подходящих полимерных слоев включают слои, имеющие коллоидную структуру, например агароза; или полимерную сетчатую структуру, например желатин; или сшитую полимерную структуру, например полиакриламидные полимеры и сополимеры, не содержащий силанов акриламид (SFA) или азидолизированный вариант SFA. Примеры подходящих полиакриламидных полимеров можно синтезировать из акриламида и акриловой кислоты или акриловой кислоты, содержащей винильную группу, или из мономеров, которые вступают в реакции фотоциклоприсоединения [2 + 2]. Другие примеры подходящих полимерных гидрогелей 42 включают смешанные сополимеры акриламидов и акрилатов. В описанных в настоящем документе примерах можно использовать различные архитектуры полимеров, содержащие акриловые мономеры (например, акриламиды, акрилаты и т. п.), такие как разветвленные полимеры, включая звездчатые полимеры, звездообразные или звездчатые блок-полимеры, дендримеры и т. п. Например, мономеры (например, акриламид, содержащий акриламид катализатор и т. д.) могут быть введены, либо случайным образом, либо в блоке, в ветви (фрагменты) звездообразного полимера.

[0098] Для введения полимерного гидрогеля 42 в проточный канал 40 можно создавать смесь полимерного гидрогеля 42, а затем наносить ее на субстрат 38A (имеющий проточный канал 40, по меньшей мере частично образованный в нем). В одном примере полимерный гидрогель 42 может присутствовать в смеси (например, с водой или с этанолом и водой). Затем смесь может быть нанесена на поверхности субстрата (включая проточный (-е) канал (-ы) 40) посредством центрифугирования, или погружения, или распыления, или потоком материала при положительном или отрицательном давлении, или с использованием другой подходящей методики. Такие типы методик сплошным слоем наносят полимерный гидрогель 42 на субстрат 38A (например, в проточном канале 40 и на промежуточных областях 48, окружающих проточный канал 40). Для специфического нанесения полимерного гидрогеля 42 в проточный канал 40, а не на промежуточные области 48, можно использовать и другие способы селективного осаждения (например, с использованием маски, управляемой методиками печати и т. п.).

[0099] В некоторых примерах поверхность субстрата (включая часть, которая является открытой в проточном канале 40) можно активировать, а затем наносить на нее смесь (включая полимерный гидрогель 42). В одном примере силан или производное силана (например, норборненсилан) можно наносить на поверхность субстрата с помощью осаждения из паровой фазы, нанесения методом центрифугирования или других методов осаждения. В другом примере поверхность субстрата можно подвергать плазменному озолению с образованием активирующего (-их) поверхность агента (-ов) (например, групп -OH), который (-ые) можно присоединять к полимерному гидрогелю 42.

[0100] В зависимости от полимерного гидрогеля 42 нанесенная смесь может быть подвергнута процессу отверждения. В примере отверждение может происходить при температуре в диапазоне от комнатной температуры (например, около 25°C) до около 95°C в течение времени в диапазоне от около 1 миллисекунды до около нескольких дней.

[0101] В некоторых примерах можно затем выполнять полировку, чтобы удалить исходный полимерный гидрогель 42 с промежуточных областей 48 по периметру проточного (-ых) канала (-ов) 40 и при этом оставить полимерный гидрогель 42 на поверхности в проточном (-ых) канале (-ах) 40 по меньшей мере по существу нетронутым.

[0102] Проточная кювета 36 также включает праймеры 44, 46 для амплификации.

[0103] Для встраивания праймеров 44, 46 для амплификации в полимерный гидрогель 42 в проточном канале 40 можно реализовать процесс прививания. В примере праймеры 44, 46 для амплификации можно иммобилизовать на полимерном гидрогеле 42 с помощью одноточечного ковалентного присоединения на 5′-конце праймеров 44, 46 или вблизи них. Данное присоединение оставляет i) незанятый специфичный для адаптера участок праймеров 44, 46 для соединения с родственным фрагментом нуклеиновой кислоты (например, участок P5’, присоединенный к фрагменту 14, 14’) и ii) незанятую 3′-гидроксильную группу для удлинения праймера. Для этой цели можно использовать любое подходящее средство ковалентного связывания. Примеры праймеров с концевой группой, которые можно использовать, включают праймеры с концевой алкиновой группой, которые можно присоединять к азидной функциональной группе полимерного гидрогеля 42. Конкретные примеры подходящих праймеров 44, 46 включают праймеры P5 и P7, используемые на поверхности доступных в продаже проточных кювет, продаваемых компанией Illumina Inc., для секвенирования на приборах HiSeq™, HiSeqX™, MiSeq™, MiSeqDX™, MiNISeq™, NextSeq™, NextSeqDX™, NovaSeq™, Genome Analyzer™, ISEQ™ и других инструментальных платформах.

[0104] В примере прививание может включать проточное нанесение (например, с использованием временно связанной или постоянно связанной крышки), нанесение покрытия посредством замачивания, нанесение напылением, нанесение трамбовкой или другим подходящим способом, при котором праймеры 44, 46 будут присоединены к полимерному гидрогелю 42 на проточном канале 42. В каждом из данных примеров методик можно использовать раствор праймера или смесь праймера, которая может включать праймер (-ы) 44, 46, воду, буфер и катализатор. При любом из способов прививания праймеры 44, 46 реагируют с реакционноспособными группами полимерного гидрогеля 42 в проточном канале 40 и не имеют аффинности к окружающему субстрату 38A. Таким образом, праймеры 44, 46 избирательно прививают на полимерный гидрогель 42 в проточном канале 40.

[0105] В примере, показанном на Фиг. 5C, проточная кювета 38 включает многослойный субстрат 38B, который включает подложку 52 и профилированный материал 50, расположенный на подложке 52. Профилированный материал 50 образует углубления 54, разделенные промежуточными областями 48. Углубления 54 расположены в пределах каждого из проточных каналов 40.

[0106] В примере, показанном на Фиг. 5C, профилированный материал 50 расположен на подложке 52. Следует понимать, что в качестве профилированного материала 50 можно использовать любой материал, который можно избирательно осаждать или осаждать и профилировать с образованием углублений 54 и промежуточных областей 48.

[0107] В качестве одного из примеров неорганический оксид можно избирательно наносить на подложку 52 посредством осаждения из паровой фазы, аэрозольной печати или струйной печати. Примеры подходящих неорганических оксидов включают оксид тантала (например, Ta₂O₅), оксид алюминия (например, Al₂O₃), оксид кремния (например, SiO₂), оксид гафния (например, HfO₂) и т. д.

[0108] В качестве другого примера на подложку 52 можно наносить смолу, а затем профилировать ее. К подходящим методикам нанесения относятся химическое осаждение из паровой фазы, нанесение окунанием, нанесение обмакиванием, нанесение центрифугированием, нанесение распылением, нанесение с использованием лопастей, нанесение методом ультразвукового распыления, нанесение с использованием ракельного ножа, аэрозольная печать, трафаретная печать, микроконтактная печать и т. д. Подходящие технологии профилирования включают фотолитографию, наноимпринтную литографию (NIL), методики штамповки, методики тиснения, методики литья, методики микротравления, методики печати и т. п. Некоторые примеры подходящих смол включают смолу на основе многогранной олигомерной силсесквиоксановой смолы (POSS), не содержащую POSS эпоксидную смолу, полиэтиленгликолевую смолу, полиэфирную смолу (например, эпоксидные смолы с открытым кольцом), акриловую смолу, акрилатную смолу, метакрилатную смолу, аморфную фторполимерную смолу (например, CYTOP® производства Bellex) и их комбинации.

[0109] Используемый в настоящем документе термин «многогранный олигомерный силсесквиоксан» (POSS) относится к химической композиции, которая представляет собой гибридное промежуточное соединение (например, RSiO_1,5) между соединением кремнезема (SiO₂) и силикона (R₂SiO). Примером POSS может служить описанный в публикации Kehagias et al., Microelectronics Engineering 86 (2009), pp. 776-778, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. В примере композиция представляет собой кремнийорганическое соединение с химической формулой [RSiO_3/2]_n, в которой группы R могут быть одинаковыми или разными. Примеры групп R для POSS включают эпоксидную смолу, азид/азидо, тиол, полиэтиленгликоль, норборнен, тетразин, акрилаты и/или метакрилаты или дополнительно, например, алкильную, арильную, алкоксильную и/или галогеналкильную группу. Композиция смолы, описанная в настоящем документе, может содержать одну или более других каркасных или сердцевинных структур по сравнению с мономерными звеньями. Многогранная структура может представлять собой структуру Т₈, такую как:

и представленную в виде: . Это мономерное звено обычно имеет восемь плеч из функциональных групп R₁-R₈.

[0110] Мономерное звено может иметь каркасную структуру с 10 атомами кремния и 10 R-группами, обозначаемыми как Т₁₀, такую как: , или может иметь каркасную структуру с 12 атомами кремния и 12 R-группами, обозначенными как Т₁₂, такую как: . Материал на основе POSS может в альтернативном варианте осуществления включать каркасные структуры Т₆, Т₁₄ или Т₁₆. Среднее содержание «клетки» можно регулировать во время синтеза и/или контролировать с помощью способов очистки, а в описанных в настоящем документе примерах можно использовать распределение размеров «клетки» мономерных звеньев.

[0111] Как показано на Фиг. 5C, профилированный материал 50 включает образованные в нем углубления 54 и промежуточные области 48, разделяющие смежные углубления 54. Может быть предусмотрено множество различных схем размещения углублений 54, включая правильные, повторяющиеся и неправильные узоры. В примере углубления 54 расположены шестиугольной сеткой для обеспечения плотной упаковки и повышения плотности. Другие схемы размещения могут включать, например, прямолинейные (прямоугольные) схемы размещения, треугольные схемы размещения и т. п. В некоторых примерах схема размещения или узор может иметь координатный формат x-y из углублений 54, расположенных в строках и столбцах. В некоторых других вариантах осуществления схема размещения или узор может иметь повторяющееся расположение углублений 54 и/или промежуточных областей 48. В дополнительных других примерах схема размещения или узор может представлять собой произвольное расположение углублений 54 и/или промежуточных областей 48. Узор может включать пятна, щитки, полосы, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, круги, дуги, галочки, клетки, диагональные линии, стрелки, квадраты и/или перекрестные штриховки.

[0112] Схема размещения или узор углублений 54 может характеризоваться с точки зрения плотности углублений 54 (количества углублений 54) в определенной области. Например, углубления 54 могут присутствовать с плотностью приблизительно 2 миллиона на мм². Плотность может быть скорректирована до различных плотностей, включая, например, плотность около 100 на мм², около 1000 на мм², около 0,1 миллиона на мм², около 1 миллиона на мм², около 2 миллионов на мм², около 5 миллионов на мм², около 10 миллионов на мм², около 50 миллионов на мм² или более, или менее. Дополнительно следует понимать, что плотность углублений 54 в профилированном материале 50 может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов. Например, массив высокой плотности может характеризоваться наличием углублений 54, разделенных менее чем около 100 нм, массив средней плотности может характеризоваться наличием углублений 54, разделенных расстоянием от около 400 нм до около 1 мкм, а массив низкой плотности может характеризоваться наличием углублений 54, разделенных более чем около 1 мкм. Хотя приведены примеры плотностей, следует понимать, что можно использовать любые подходящие значения плотности. Плотность углублений 54 может частично зависеть от глубины углублений 54. В некоторых случаях может быть желательно, чтобы расстояние между углублениями 54 было еще больше, чем в примерах, перечисленных в настоящем документе.

[0113] Схема размещения или узор углублений 54 может также или альтернативно характеризоваться по среднему шагу или расстоянию от центра одного углубления 54 до центра соседнего углубления 54 (расстояние между центрами) или расстояние от края одного углубления 54 до края смежного углубления 54 (расстояние между краями). Узор может быть правильным, так что коэффициент вариации относительно среднего шага является небольшим, или узор могут быть неправильным, и в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае средний шаг может составлять, например, около 50 нм, около 0,1 мкм, около 0,5 мкм, около 1 мкм, около 5 мкм, около 10 мкм, около 100 мкм или более, или менее. Средний шаг для конкретного расположения углублений 54 может находиться в диапазоне от одного из нижних значений до одного из верхних значений, выбранных из приведенных выше диапазонов. В примере углубления 54 имеют шаг (расстояние между центрами) около 1,5 мкм. Хотя предоставлены примеры средних значений шага следует понимать, что можно использовать другие средние значения шага.

[0114] Размер каждого углубления 54 может характеризоваться объемом, площадью его отверстия, глубиной и/или диаметром.

[0115] Каждое углубление 54 может иметь любой объем, способный удерживать текучую среду. Минимальный или максимальный объем может быть выбран, например, таким образом, чтобы соответствовать пропускной способности (например, мультиплексность), разрешению, нуклеотидам или реакционной способности аналита, ожидаемой при последующих применениях проточной кюветы 38. Например, объем может составлять по меньшей мере около 1 × 10^-3 мкм³, по меньшей мере около 1 × 10^-2 мкм³, по меньшей мере около 0,1 мкм³, по меньшей мере около 1 мкм³, по меньшей мере около 10 мкм³, по меньшей мере около 100 мкм³ или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления объем может составлять не более около 1 × 10⁴ мкм³, не более около 1 × 10³ мкм³, не более около 100 мкм³, не более около 10 мкм³, не более около 1 мкм³, не более около 0,1 мкм³ или менее.

[0116] Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть выбрана на основании критериев, аналогичных описанным выше для объема. Например, площадь для каждого отверстия углубления может составлять по меньшей мере около 1 × 10^-3 мкм², по меньшей мере около 1 × 10^-2 мкм², по меньшей мере около 0,1 мкм², по меньшей мере около 1 мкм², по меньшей мере около 10 мкм², по меньшей мере около 100 мкм² или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления площадь может составлять не более около 1 × 10³ мкм², не более около 100 мкм², не более около 10 мкм², не более около 1 мкм², не более около 0,1 мкм², не более около 1 × 10⁻² мкм² или менее. Площадь, занимаемая каждым отверстием углубления, может быть больше или меньше указанных значений или находиться в промежутке между указанными выше значениями.

[0117] Глубина каждого углубления 54 может быть достаточно большой для размещения части полимерного гидрогеля 42. В примере глубина может составлять по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления глубина может составлять не более около 1 × 10³ мкм, не более около 100 мкм, не более около 10 мкм или менее. В некоторых примерах глубина составляет около 0,4 мкм. Глубина каждого углубления 54 может быть больше, меньше или находится между указанными выше значениями.

[0118] В некоторых случаях диаметр или длина и ширина каждого углубления 54 могут составлять по меньшей мере около 50 нм, по меньшей мере около 0,1 мкм, по меньшей мере около 0,5 мкм, по меньшей мере около 1 мкм, по меньшей мере около 10 мкм, по меньшей мере около 100 мкм или более. В альтернативном или дополнительном варианте осуществления диаметр или длина и ширина могут составлять не более около 1 × 10³ мкм, не более около 100 мкм, не более около 10 мкм, не более около 1 мкм, не более около 0,5 мкм, не более около 0,1 мкм или менее (например, около 50 нм). В некоторых примерах диаметр или длина и ширина составляют около 0,4 мкм. Диаметр или длина и ширина каждого углубления 54 может быть больше, меньше вышеуказанных значений или может иметь промежуточное значение.

[0119] В примере, показанном на Фиг. 5C, полимерный гидрогель 42 расположен внутри каждого из углублений 54. Полимерный гидрогель 42 можно наносить так, как описано со ссылкой на Фиг. 5B, чтобы полимерный гидрогель 42 находился в углублениях 54 и не находился на окружающих промежуточных областях 48.

[0120] Хотя это не показано на Фиг. 5A, Фиг. 5B или Фиг. 5C, следует понимать, что проточная кювета 36 может также включать крышку, прикрепленную к субстрату 38. В примере крышка может быть соединена с по меньшей мере частью субстрата 38, например, на некоторых промежуточных областях 48. Связь, образованная между крышкой и субстратом 38, может представлять собой химическую связь или механическую связь (например, с применением крепежного элемента и т. д.).

[0121] Крышка может быть выполнена из любого материала, прозрачного для возбуждающего света, направленного в сторону субстрата 38. В качестве примеров крышка может представлять собой стекло (например, боросиликатное стекло, плавленый кварц и т. п.), пластик или т. п. Доступным в продаже примером подходящего боросиликатного стекла является D 263® от компании Schott North America, Inc. Доступные в продаже примеры подходящих пластиковых материалов, а именно циклоолефиновых полимеров, представляют собой продукты ZEONOR® производства Zeon Chemicals L.P.

[0122] Крышка может быть соединена с субстратом 38 с помощью любого подходящего способа, такого как лазерная пайка, диффузионная пайка, анодная пайка, пайка эвтектическим сплавом, пайка плазменным активированием, пайка стеклокристаллическим припоем, или другими способами, известными в данной области. В примере можно использовать слой разделителя при прикреплении крышки к субстрату 38. Слой разделителя может быть выполнен из любого материала, который будет герметично соединять по меньшей мере участок субстрата 38 и крышку. В некоторых примерах разделительный слой может представлять собой поглощающий излучение материал, который способствует связыванию субстрата 38 с крышкой.

[0123] В других примерах проточная кювета 36 может также включать дополнительный профилированный или непрофилированный субстрат 38, присоединенный к субстрату 38. Субстраты 38 могут быть связаны, как описано в настоящем документе.

[0124] Способы

[0125] Способ по существу включает генерирование серии синхронизированных кластерных изображений для множества фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью из образца генома. Каждое синхронизированное кластерное изображение в серии последовательно генерируют посредством введения в проточную кювету 36 соответствующего образца, включающего некоторые фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью, причем некоторые фрагменты 14, 14' библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединены к твердой подложке 16 (Фиг. 1) или присоединены друг к другу (например, присоединенные фрагменты 34, показанные на Фиг. 3); инициирования отсоединения фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью из твердой подложки 16 или друг от друга 34; амплификации фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества соответствующих матричных цепей; окрашивания соответствующих матричных цепей; и визуализации соответствующих матричных цепей.

[0126] При использовании способа (-ов), описанного (-ых) в настоящем документе, фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью используют в комбинации с последовательной амплификацией и визуализацией для генерации серии синхронизированных кластерных изображений. Каждое синхронизированное кластерное изображение регистрирует пространственное расположение и ориентацию матричных цепей, сгенерированных с использованием конкретного образца. Таким образом, эти изображения можно использовать для идентификации положений кластера (матричная цепь), в которых кластер получают из конкретного образца, введенного в проточную кювету в конкретное время.

[0127] Способы могут незначительно различаться в зависимости от того, вводятся ли комплексы 10 в проточную кювету 36 или вводятся ли прикрепленные фрагменты 34 в проточную кювету. Ниже приведено описание различных примеров.

[0128] Способы с использованием комплекса 10 или 10'

[0129] В этом примере образец генома (например, образец 30) фрагментируют с образованием множества фрагментов 14, 14’ с сохраненной непрерывностью, причем каждый из них присоединен к твердой подложке 16. Следует понимать, что все фрагменты 14, 14’ с сохраненной непрерывностью из образца 30 генома могут не быть присоединены к одной и той же твердой подложке 16; но фрагменты 14, 14’ с сохраненной непрерывностью, ассоциированные с конкретными частями образца 30 генома, могут быть присоединены к соответствующим твердым подложкам 16. Таким образом, образец 30 генома фрагментируется с образованием множества комплексов 10 или 10'. Это может быть выполнено, как описано со ссылкой на Фиг. 1, Фиг. 2A-Фиг. 2C, Фиг. 3 или с использованием любого другого способа сохранения непрерывности, который включает адаптеры 18, 22 или 18', 22 к каждому из фрагментов 14, 14' таким образом, что они представляют собой готовые к секвенированию фрагменты 12, 12'.

[0130] Комплексы 10 или 10', образованные с использованием образца 30 генома, могут быть включены в смесь. Таким образом, каждый из множества фрагментов 14, 14’ с сохраненной непрерывностью также включен в смесь. Жидкий носитель смеси может представлять собой буфер, такой как буфер трис-HCl или солевой буферный раствор цитрата натрия (SSC) 0,5x.

[0131] Жидкий носитель может быть добавлен ко множеству фрагментов 14, 14’ с сохраненной непрерывностью (например, присутствующих в комплексах 10 или 10') для первоначального формирования смеси, а затем смесь может быть разведена дополнительным жидким носителем для получения предварительно заданного количества разведенных образцов, которые должны быть по отдельности введены в проточную кювету 36 (или в ее отдельную дорожку 40).

[0132] Конечный объем полученной смеси и, следовательно, разведение смеси можно контролировать любым удобным способом. В некоторых случаях разведение может зависеть от объема проточной кюветы 36 (или, например, каждого канала 40 многоканальной проточной кюветы) и требуемого количества образцов, вводимых в проточную кювету 36. В одном примере объем проточной кюветы 36 (или ее канала 40) можно использовать в качестве предельного коэффициента разведения. Таким образом, в некоторых примерах жидкость-носитель может быть добавлена для разведения смеси до предварительно заданного объема, при этом заданный объем определяется i) объемом проточной кюветы 36 в виде предельного разведения и ii) заданным количеством разведенных образцов, вводимых в проточную кювету 36. Например, проточная кювета 36 или одна дорожка 40 проточной кюветы 36 может иметь объем около 50 мкл, а требуемое количество проб может составлять 200. В данном примере смесь можно разводить до около 10 000 мкл. В качестве другого примера проточная кювета 36 или одна дорожка 40 проточной кюветы 36 может иметь объем около 100 мкл, а требуемое количество проб может составлять 384. В данном примере смесь можно разводить до около 38 400 мкл.

[0133] Требуемое количество разведенных образцов может зависеть, например, от объема проточной кюветы 36 и требуемого разрешения отдельных матричных цепей на соответствующих синхронизированных кластерных изображениях. При меньшем объеме проточных кювет 38 может быть желательно иметь более разведенную смесь так, чтобы каждый отдельный разведенный образец, вводимый в проточную кювету 36, содержал меньше фрагментов 14, 14' библиотеки с сохраненной непрерывностью (чем при использовании менее разведенной смеси). В проточной кювете 36 такого типа при меньшем количестве фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью будет меньшее количество матричных цепей, за счет чего может улучшиться разрешение матричных цепей на соответствующих синхронизированных кластерных изображениях. В примере требуемое количество образцов может находиться в диапазоне от около 100 образцов до около 1000 образцов. В других примерах требуемое количество разведенных образцов, получаемых из смеси, может составлять более 1000. Верхний предел количества разведенных образцов может частично зависеть от желаемого временного интервала, в течение которого должен быть реализован общий способ.

[0134] Затем смесь можно разделять на предварительно заданное число разведенных образцов. В одном примере разведенную смесь можно разделять так, чтобы получать все разведенные образцы одновременно. В другом примере предварительно заданный объем любого одного разведенного образца можно отделять от основной смеси при его введении в проточную кювету 36.

[0135] на Фиг. 6A-6D показан пример непрофилированной проточной кюветы 36 (например, как показано на Фиг. 5B) сверху на разных стадиях генерирования синхронизированных кластерных изображений.

[0136] Как схематически показано на Фиг. 6A-6D, проточную кювету 36 можно вводить в систему, которая включает приемный отсек 35 проточной кюветы; систему 37 управления жидкостью, включающую подающие текучие среды 39, которые соответственно подают разведенный образец 56A и краситель (не показан) в проточную кювету 36, расположенную в приемном отсеке 35 проточной кюветы; систему 62 освещения, расположенную таким образом, чтобы освещать проточную кювету 36, расположенную в приемном отсеке 35 проточной кюветы; систему 64 обнаружения, расположенную таким образом, чтобы захватывать изображение проточной кюветы 36, расположенной в приемном отсеке 35 проточной кюветы; и контроллер 41, находящийся в функциональной связи с системой 37 управления текучей средой, системой 62 освещения и системой 64 обнаружения, причем контроллер 41 выполнен с возможностью инициирования введения разведенного образца 56A в проточную кювету 36, расположенную в приемном отсеке 35 проточной кюветы, посредством подающих текучих сред 39; инициирования введения красителя в проточную кювету 36, расположенную в приемном отсеке 35 проточной кюветы, посредством подающих текучих сред 39 после генерирования матричных цепей 58A в проточной кювете 36, расположенной в приемном отсеке 35 проточной кюветы, из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, присутствующих в разведенном образце 56A; инициирования освещения окрашенных матричных цепей в проточной кювете 36, расположенной в приемном отсеке 35 проточной кюветы, системой 62 освещения; и инициирования визуализации обнаружения освещенных окрашенных матричных цепей в проточной кювете 36, расположенной в приемном отсеке 35 проточной кюветы, системой 64 обнаружения.

[0137] Находясь в нужном положении, проточная кювета 36 находится в сообщении по текучей среде с системой 39 управления текучей средой (например, насосы, клапаны и т. п.) и находится в оптическом сообщении с системой 62 освещения и системой 64 обнаружения.

[0138] на Фиг. 6A первый из разведенных образцов 56A (включая некоторые из комплексов 10 или 10', показанных как 10A на Фиг. 6A) вводят в проточную кювету 36. Введение любого из соответствующих разведенных образцов 56A (или, например, 56B на Фиг. 6C) включает направление по текучей среде одного из разведенных образцов 56A, 56B в проточную кювету 36. Разведенный образец 56А может быть введен, например, в кассете 45, а система 37 управления текучей средой может транспортировать образец 56А по текучей среде из кассеты 45 в проточный канал 40 проточной кюветы 36 с помощью подающих текучих сред 39 (например, насосы, клапаны и т. п.).

[0139] Учитывая концентрацию комплексов 10A в разведенном образце 56A, большинство или все комплексы 10A будут оседать на полимерном гидрогеле 42 и любых расположенных на нем праймерах 44, 46 (которые не показаны на Фиг. 6A-6D). В некоторых примерах комплексы 10A могут оседать и оставаться в проточном канале 40 или в углублениях 54 благодаря глубине проточного канала 40 или углублений 54. В других примерах проточный канал 40 или углубления 54 могут включать захватный сайт, к которому присоединяются комплексы 10А.

[0140] Следует понимать, что некоторые комплексы 10А могут не оседать и эти комплексы 10A будут удалены из проточной кюветы 36 перед дальнейшей обработкой. Таким образом, некоторые примеры способа включают смывание незахваченных комплексов 10А с проточной кюветы 36. Смывание может включать введение текучей среды в проточную кювету 36. Поток может выталкивать любые не осевшие и/или не прикрепленные комплексы 10A через выходное отверстие проточной кюветы 36.

[0141] Этот пример способа также включает инициирование отсоединения фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью от соответствующих твердых подложек 16, к которым они присоединены. В этом примере готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты (включая фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью и присоединенные к ним адаптеры 18, 22 или 18’, 22) отсоединяются от соответствующих твердых подложек 16. на Фиг. 6A отсоединение готовых к секвенированию фрагментов 12, 12‘ нуклеиновой кислоты от твердых подложек 16 представлено стрелками, направленными наружу от каждой твердой подложки 16.

[0142] Отсоединение готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты может быть инициировано несколькими различными способами. В одном примере инициирование отсоединения включает нагревание проточной кюветы 36. В этом примере в систему может быть включен нагреватель 43. Контроллер 41 может активировать нагреватель 43, который инициирует отсоединение фрагментов 12, 12’ библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки 16 или друг от друга. В качестве примера для по меньшей мере частичного разрушения связей и, следовательно, инициирования отсоединения готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты можно использовать температуры выше 70°C. В другом примере инициирование отсоединения включает введение расщепляющего агента в проточную кювету 36. Систему 37 управления текучей средой можно использовать для доставки расщепляющего агента. Расщепляющий агент может инициировать химическое, ферментативное или фотохимическое отсоединение готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты от твердой подложки 16. В этих примерах другой стимул, такой как нагрев или свет, может активировать расщепляющий агент, который отсоединяет готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты от твердой подложки 16. Например, в качестве расщепляющего агента можно вводить свободный биотин и можно использовать нагревание до около 92°C для индуцирования освобождения биотинилированного олигонуклеотида от твердой подложки 16.

[0143] Отсоединенные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12‘ нуклеиновой кислоты транспортируют из твердой подложки 16 и высевают на полимерный гидрогель 42. Более конкретно, праймеры 46, 48 для амплификации засевают отсоединенные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12‘ нуклеиновой кислоты относительно ограниченным образом. В примере посев осуществляют посредством гибридизации между первой или второй последовательностями фрагмента 12, 12’ и комплементарным одним из праймеров 46, 48 на полимерном гидрогеле 42 в проточной кювете 36. Посев можно проводить при подходящей температуре гибридизации для готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты и праймера (-ов) 46, 48. Нагревателем 43 можно управлять, чтобы довести проточную кювету 36 до температуры посева.

[0144] Для удаления гранул можно применять процесс смывания.

[0145] Затем посеянные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты можно амплифицировать с использованием любого подходящего способа, такого как образование кластеров. В одном примере генерирования кластеров отсоединенные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты копируются из гибридизированных праймеров 46, 48 посредством удлинения с 3’-конца с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Первоначальные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты денатурируют, в результате чего копии остаются иммобилизованными внутри проточного канала 40 или углублений 54. Можно использовать любой процесс клональной амплификации. В одном примере для амплификации иммобилизованных копий можно использовать изотермическую мостиковую амплификацию. Например, скопированные темплаты образуют петлю и гибридизируются со смежным комплементарным праймером 46, 48, а полимераза копирует скопированные темплаты с образованием двухцепочечных мостиков, которые денатурируют с образованием двух одноцепочечных цепей. Эти две цепи образуют петлю и гибридизируются со смежными комплементарными праймерами 46, 48, а затем снова удлиняются с образованием двух новых двухцепочечных петель. Процесс повторяют на каждой копии темплата в циклах изотермической денатурации и амплификации с получением плотных клональных кластеров. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурируют. В примере обратную цепь удаляют посредством специфического расщепления оснований, в результате чего остаются шаблонные полинуклеотидные цепи прямого направления. Следует понимать, что кластеризация приводит к формированию нескольких матричных цепей 58А в проточном канале 40 или некоторых углублениях 54. В некоторых примерах контроллер 41 воздействует на нагреватель 43, который запускает термический цикл для амплификации засеянных готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты.

[0146] на Фиг. 6B показаны кластеры 60A матричных цепей 58A, сгенерированные из комплексов 10A первого разведенного образца 56 (компартмент). Кластеры 60A на Фиг. 6B приведены для ясности. Хотя на Фиг. 6B показаны четыре кластера 60A, следует понимать, что количество кластеров 60A будет зависеть от количества комплексов 10A, введенных в образец 56A, а также от количества готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты, отсоединенных от каждой твердой подложки 16. Из каждого из отсоединенных готовых к секвенированию фрагментов 12, 12' нуклеиновой кислоты генерируют кластер 60A. Более того, отсоединенные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты могут диффундировать по поверхности проточной кюветы, и, таким образом, на поверхности проточной кюветы могут быть сгенерированы кластеры 60A.

[0147] После генерирования кластеров 60A для получения первого разведенного образца 56A в проточную кювету 36 вводят краситель. Можно использовать любой флуоресцентный краситель, способный окрашивать матричные цепи 58A. Примеры подходящих флуоресцентных красителей включают красители линейки SYBR® производства компании Molecular Probes, Inc. (например, SYBR® Green, SYBR® Gold, SYBR® Safe и т. п.), бромид этидия, йодид пропидия, кристаллический фиолетовый, краситель EVAGREEN® (производства Biotium), DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) или т. п. Окрашивающий состав вводят в проточную кювету 36 и, например, из второй кассеты (не показана), позволяют проинкубироваться в течение соответствующего периода времени для окрашивания матричных цепей 58A, а затем вымывают из проточной кюветы 36.

[0148] Затем систему 62 освещения можно использовать для освещения окрашенных матричных цепей 58A в проточной кювете 36. Система освещения может включать источник света и множество оптических компонентов Примеры источников света могут включать лазеры, дуговые лампы, светодиоды или лазерные диоды. Оптические компоненты могут представлять собой, например, отражатели, дихроичные зеркала, светоделители, коллиматоры, линзы, фильтры, клинья, призмы, зеркала, детекторы и т. п. Система освещения может быть функционально расположена таким образом, чтобы направлять возбуждающий свет на поверхность проточной кюветы, которая соответствует используемому пятну.

[0149] Систему 64 обнаружения можно использовать для захвата изображения I₁ флуоресцирующих матричных цепей 58A. Данное изображение I₁ представляет собой синхронизированное кластерное изображение разведенного образца 56A, поскольку на нем показано пространственное расположение и ориентация матричных цепей 58A, связанных с разведенным образцом 56A. Для захвата изображения I₁ кластеров 60A на проточной кювете 36 можно использовать любую подходящую камеру.

[0150] Изображение I₁ может храниться в электронном виде для последующего извлечения и использования. Таким образом, некоторые примеры системы включают электронный запоминающий компонент 47 для хранения изображения I₁. В электронной записи изображение I₁ может быть связано с разведенным образцом 56A. Изображению I₁ также может быть присвоена временная запись. Таким образом, некоторые примеры способа включают присвоение каждому синхронизированному кластерному изображению I₁ в серии временной записи введения соответствующего образца, включая некоторые фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью. Временная запись может включать временную метку, на которой отмечено, когда был введен и/или получен снимок разведенного образца 56A, номер стадии в последовательности введения и/или визуализации (например, образец 1 из 200, образец 2 из 200, образец Х из 200) или их комбинации.

[0151] Промывка может происходить после получения изображений кластеров 60A на проточной кювете 36. Можно использовать воду, буфер или другой мягкий промывочный раствор.

[0152] Процессы, показанные и описанные со ссылкой на Фиг. 6A и Фиг. 6B, затем повторяют со вторым разведенным образцом 56B (показанным на Фиг. 6C).

[0153] на Фиг. 6C второй разведенный образец 56B вводят в проточную кювету 36. Комплексы 10B (которые могут быть комплексами 10 или 10') оседают и/или прикрепляются к поверхности проточной кюветы.

[0154] Как показано на Фиг. 6C, способ затем включает инициирование отсоединения фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью от соответствующих твердых подложек 16, к которым они присоединены. В этом примере готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты (включая фрагменты 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью и присоединенные к ним адаптеры 18, 22 или 18’, 22) отсоединяются от соответствующих твердых подложек 16.

[0155] Отсоединенные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12‘ нуклеиновой кислоты транспортируют из твердой подложки 16 и высевают на полимерный гидрогель 42. Затем посеянные готовые к секвенированию фрагменты 12, 12’ нуклеиновой кислоты можно амплифицировать с использованием любого подходящего способа, такого как образование кластеров. Следует понимать, что данный цикл кластеризации приводит к формированию нескольких матричных цепей 58В в проточном канале 40 или некоторых углублениях 54.

[0156] на Фиг. 6D показаны кластеры 60В матричных цепей 58В, сгенерированные из комплексов 10В второго разведенного образца 56В (компартмент). Кластеры 60A и 60B на Фиг. 6D приведены для ясности. Хотя на Фиг. 6D показаны три кластера 60В, следует понимать, что количество кластеров 60В будет зависеть от количества комплексов 10В, введенных в образец 56В, а также от количества готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты, отсоединенных от каждой твердой подложки 16.

[0157] После генерирования кластеров 60В для получения второго разведенного образца 56В в проточную кювету 36 снова вводят краситель. Такое же окрашивание, которое используют для окрашивания матричных цепей 58a, можно использовать для окрашивания матричных цепей 58B и любых впоследствии сгенерированных матричных цепей.

[0158] Затем систему 62 освещения можно использовать для освещения окрашенных матричных цепей 58A и 58В в проточной кювете 36. Систему 64 обнаружения можно использовать для захвата изображения I₂ флуоресцирующих матричных цепей 58A и 58B в соответствующих кластерах 60A и 60B.

[0159] Изображение I₂ может также храниться в электронном виде для последующего извлечения и использования. В электронной записи изображение I₂ может быть связано с разведенным образцом 56B. Изображению I₂ также может быть присвоена временная запись. Временная запись может включать временную метку, на которой отмечено, когда был получен снимок разведенного образца 56В, номер стадии в последовательности (например, образец 2 из 200) или их комбинации.

[0160] Промывка может происходить после получения изображений кластеров 60A, 60В на проточной кювете 36. Можно использовать воду, буфер или другой мягкий промывочный раствор.

[0161] Процессы, показанные и описанные со ссылкой на Фиг. 6A и Фиг. 6B, можно затем повторять, например, с использованием описанной системы, для количества разведенных образцов, полученных из исходной смеси. Каждое дополнительное изображение I₃, I₄, … I_x будет отображать новые кластеры 60C, 60D, ... 60X матричных цепей 58C, 58D, … 58X, сгенерированных при введении соответствующих разведенных образцов 56C, 56D, … 56X. Все изображения I₁, I₂, … I_x, полученные для соответствующих разведенных образцов 56A, 56B, ...56X, ассоциируют с конкретной смесью и, следовательно, с конкретной более длинной молекулой 30 нуклеиновой кислоты.

[0162] Поскольку каждое последовательное изображение I₂, I₃, I₄, … I_x отображает вновь сформированный кластер 60B, 60C, 60D, ... 60X относительно непосредственно предшествующего изображения I₁, I₂, I₃, … Ix, можно использовать вычитание изображений для создания обработанного кластерного изображения для каждого образца, введенного после первого образца 56A. Некоторые примеры обработанных кластерных изображений RI_x показаны на Фиг. 6.

[0163] на Фиг. 7 представлены изображения I₁, I₂, I₃, I₄, I₅, I₆, полученные для шести образцов 56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F, которые последовательно вводят, амплифицируют, окрашивают и визуализируют, как описано со ссылкой на Фиг. 6A и Фиг. 6B. Как показано, новые кластеры 60A, 60B, 60C, 60D, 60E и 60F соответственно генерируют для каждого из вновь введенных и обработанных образцов 56A, 56B, 56C, 56D, 56E, 56F.

[0164] Поскольку изображение I₁ для первого образца 56A включает кластеры 60A из одного образца, не требуется генерировать обработанное кластерное изображение, так как исходное изображение I₁ можно использовать для пространственной идентификации кластеров 60A. Для каждого образца, введенного после первого образца 56A, генерируется обработанное кластерное изображение RI₂, RI₃, RI₄, RI₅, RI₆ для каждого из других изображений I₂, I₃, I₄, I₅, I₆. В одном примере изображение I₁ (на котором показаны матричные цепи 58A в кластерах 60A) может быть вычтено из изображения I₂ (на котором показаны матричные цепи 58A в кластерах 60A и матричные цепи 58B в кластерах 60B) для генерирования обработанного кластерного изображения RI₂ для второго образца 56B. Это обработанное кластерное изображение RI₂ показывает пространственное расположение и ориентацию матричных цепей 58B в кластерах 60B, ассоциированных со вторым образцом 56B. В другом примере изображение I₁ (на котором показаны матричные цепи 58A в кластерах 60A) и изображение I₂ (на котором показаны матричные цепи 58A в кластерах 60A и матричные цепи 58B в кластерах 60B) можно вычитать из изображения I₃ (на котором показаны матричные цепи 58A в кластерах 60A, матричные цепи 58B в кластерах 60B и матричные цепи 58C в кластерах 60C) для генерирования обработанного кластерного изображения RI₃ для третьего образца, например 56C. Это обработанное кластерное изображение RI₃ показывает пространственное расположение и ориентацию матричных цепей 58C в кластерах 60C, ассоциированных с третьим образцом 56C. Обработанное кластерное изображение RI₄, RI₅ и RI₆ можно генерировать аналогичным образом посредством вычитания любого из предшествующих изображений.

[0165] Следует понимать, что вычитание изображения может быть выполнено для любого из I₁, I₂, I₃, … I_x последовательно. Полученное обработанное кластерное изображение RI_x для любого заданного разведенного образца 56X показывает пространственное местоположение и ориентацию матричных цепей 58X, ассоциированных с таким разведенным образцом 56X.

[0166] Обработанные кластерные изображения могут быть сохранены для последующего анализа.

[0167] Способы с использованием присоединенных фрагментов 34

[0168] В этом примере образец генома фрагментируют с образованием множества фрагментов 14, 14’ с сохраненной непрерывностью, которые присоединены друг к другу, например как присоединенные фрагменты 34. Следует понимать, что все фрагменты 14, 14’ с сохраненной непрерывностью из образца генома могут не быть присоединены друг к другу; вместо этого процесс, показанный на Фиг. 4, может приводить к образованию нескольких присоединенных фрагментов 34.

[0169] Присоединенные фрагменты 34, образованные с использованием образца генома, могут быть включены в смесь. Таким образом, каждый из множества фрагментов 14, 14’ с сохраненной непрерывностью также включен в смесь. Жидкий носитель смеси может представлять собой буфер, такой как буфер трис-HCl или солевой буферный раствор цитрата натрия (SSC) 0,5x.

[0170] Жидкий носитель может быть добавлен ко множеству присоединенных фрагментов 34 для первоначального формирования смеси, а затем смесь может быть разведена дополнительным жидким носителем для получения предварительно заданного количества разведенных образцов, которые должны быть по отдельности введены в проточную кювету 36 (или в ее отдельную дорожку 40).

[0171] Конечный объем полученной смеси и, следовательно, разведение смеси можно контролировать любым удобным способом, как описано в настоящем документе.

[0172] Затем смесь можно разделять на предварительно заданное число разведенных образцов. В одном примере разведенную смесь можно разделять так, чтобы получать все разведенные образцы одновременно. В другом примере предварительно заданный объем любого одного разведенного образца можно отделять от основной смеси при его введении в проточную кювету 36.

[0173] В данном примере способа присоединенные фрагменты 34, показанные на Фиг. 4, вводят в проточный канал как часть одного из разведенных образцов. Пример такого разведенного образца 66A показан на Фиг. 8.

[0174] Как показано на Фиг. 8, транспозазы 32 внутри проточной кюветы 36 удаляются с присоединенных фрагментов 34. Это может быть достигнуто, например, с помощью SDS или протеиназы. За счет удаления транспозаз 32 высвобождаются соответствующие фрагменты 14, 14' с сохраненной непрерывностью (и любые цепи 26', 28', непосредственно или опосредованно присоединенные к ним) из смежных фрагментов 14, 14' с сохраненной непрерывностью. Другими словами, субфрагменты 72 присоединенных фрагментов 34 отсоединяются, и возможен их посев на полимерный гидрогель 42 через перенесенные цепи 26'. Как схематически показано на Фиг. 8, перенесенные цепи 26’ гибридизируют с соответствующими и комплементарными праймерами 46 на поверхности проточной кюветы 36. В некоторых случаях во время гибридизации можно применять нагревание. Применение тепла может зависеть от температуры плавления перенесенных цепей 26'. В качестве одного примера участок Р5’ перенесенной цепи 26' гибридизируют с комплементарным праймером Р5 46 для амплификации, присоединенным к полимерному гидрогелю 42.

[0175] Через проточный канал проточной кюветы 36 может быть пропущен промывочный раствор для удаления транспозазы 32 из проточной кюветы 36. Пример подходящего промывочного раствора включает SDS, который может удалять транспозазу. Для полоскания проточной кюветы 36 можно использовать второй промывочный раствор, такой как TRIS или промывочный буфер гибридизации.

[0176] Перед амплификацией данный пример способа дополнительно включает введение второго участка последовательности (например, неперенесенной цепи 28') в каждый из гибридизированных фрагментов 14, 14' библиотеки с сохраненной непрерывностью на конце, противоположном гибридизированному концу. Таким образом, в некоторых примерах способа каждый из фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью включает первый участок последовательности на первом конце, который гибридизируется с первой последовательностью 46 праймера на поверхности проточной кюветы 26; и перед амплификацией способ дополнительно включает присоединение второго участка последовательности к каждому из гибридизированных фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью на втором конце, противоположном первому концу, причем второй участок последовательности идентичен второй последовательности 48 праймера на поверхности проточной кюветы 36 так, что копия второго участка последовательности может гибридизироваться со второй последовательностью 48 праймера.

[0177] Введение второго участка последовательности может быть выполнено с использованием удлиняющего лигирования. В примере может быть инициировано удлиняющее лигирование (как показано стрелками 74 на Фиг. 8) для присоединения неперенесенных цепей 28’ к соответствующим фрагментам 14, 14'. В примере удлиняющее лигирование может быть инициировано посредством введения смеси для удлиняющего лигирования в проточную кювету 36 и нагревания до подходящей температуры для определения активности фермента (например, от около 37°C до около 50°C).

[0178] Смесь для удлиняющего лигирования может включать лигирующий фермент (например, ДНК-лигазу), который катализирует образование связи между неперенесенной цепью 28’ и ее соответствующим фрагментом 14 или 14'. Как описано со ссылкой на Фиг. 4, неперенесенные цепи 28’ включают вторую последовательность праймера для секвенирования (например, последовательность праймера для секвенирования чтения 2) и вторую последовательность (P7), идентичную по меньшей мере части другого из праймеров 48 (P7) для амплификации на поверхности проточной кюветы. Эта вторая последовательность позволяет создавать комплементарную копию, например P7', в процессе амплификации, которая может гибридизироваться с праймером 48 для амплификации (P7) на поверхности проточной кюветы в процессе кластеризации. Таким образом, лигирование приводит к образованию готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ библиотеки, присоединенных к поверхности проточной кюветы.

[0179] Смесь для удлиняющего лигирования может также включать блокирующую группу, которая присоединяется к открытым концам праймеров 46 для предотвращения нежелательного удлинения на данных праймерах 46. В альтернативном варианте осуществления праймеры 46 можно прививать на поверхность с присоединенными к ним блокирующими группами (например, 3'-фосфат). В еще одном примере блокирующие группы можно не использовать.

[0180] В ходе присоединения полученных фрагментов 12, 12’ друг к другу можно использовать нагревание для отделения фрагментов 12' от фрагментов 12. Фрагменты 12', которые не гибридизируются с праймерами 46, могут быть удалены из проточной кюветы 36 с промывочной жидкостью.

[0181] При использовании любые блокированные праймеры 46 можно затем разблокировать (например, с помощью киназы или другого подходящего разблокирующего агента), чтобы можно было выполнить амплификацию. В данном примере амплификацию можно выполнять с использованием любого подходящего способа, такого как генерирование кластера. Генерирование кластера может быть выполнено, как описано в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 6A. Можно использовать систему, описанную со ссылкой на Фиг. 6A.

[0182] на Фиг. 9A представлены кластеры 70A матричных цепей 68A, сгенерированные из присоединенных фрагментов 34 разведенного образца 66A (показанного на Фиг. 8). Кластеры 70A на Фиг. 9A приведены для ясности. Хотя на Фиг. 9A показаны четыре кластера 70A, следует понимать, что количество кластеров 70A будет зависеть от количества присоединенных фрагментов 34, введенных в образец 66A, а также от количества готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты, отсоединенных от присоединенных фрагментов 34.

[0183] После генерирования кластеров 70A для получения первого разведенного образца 66A в проточную кювету 36 вводят краситель, как описано со ссылкой на Фиг. 6B. Краситель вводят в проточную кювету 36, позволяют проинкубироваться в течение соответствующего периода времени для окрашивания матричных цепей 68A, а затем вымывают из проточной кюветы 36.

[0184] Затем систему 62 освещения можно использовать для освещения окрашенных матричных цепей 68A в проточной кювете 36, а систему 64 обнаружения можно использовать для захвата изображения I₁ флуоресцирующих матричных цепей 68A. Данное изображение I₁ представляет собой синхронизированное кластерное изображение разведенного образца 66A, поскольку на нем показано пространственное расположение и ориентация матричных цепей 68A, связанных с разведенным образцом 66A.

[0185] Изображение I₁ может храниться в электронном виде для последующего извлечения и использования. В электронной записи изображение I₁ может быть связано с разведенным образцом 66A. Изображению I₁ также может быть присвоена временная запись. Временная запись может включать временную метку, на которой отмечено, когда был введен и/или получен снимок разведенного образца 66A, номер стадии в последовательности введения и/или визуализации (например, образец 1 из 200, образец 2 из 200, образец Х из 200) или их комбинации.

[0186] Промывка может происходить после получения изображений кластеров 70A на проточной кювете 36. Можно использовать воду, буфер или другой мягкий промывочный раствор.

[0187] Процессы, показанные и описанные со ссылкой на Фиг. 8 и Фиг. 9A, затем повторяют со вторым разведенным образцом 66B (показанным на Фиг. 9B).

[0188] на Фиг. 9B второй разведенный образец 66B вводят в проточную кювету 36. Присоединенные фрагменты 34 могут быть разделены на субфрагменты 72, как описано со ссылкой на Фиг. 8. Одна перенесенная цепь 26 по меньшей мере некоторых субфрагментов 72 будет гибридизироваться с комплементарными праймерами 46 для амплификации на проточной кювете 36. Затем может быть выполнено удлиняющее лигирование и другие процессы, описанные со ссылкой на Фиг. 8, в результате чего к поверхности проточной кюветы присоединяются готовые к секвенированию фрагменты 12 нуклеиновой кислоты.

[0189] Генерирование кластера может быть выполнено, как описано в настоящем документе со ссылкой на Фиг. 6A.

[0190] на Фиг. 9C представлены кластеры 70B матричных цепей 68B, сгенерированные из присоединенных фрагментов 34 второго разведенного образца 66B. Кластеры 70A и 70B на Фиг. 9C приведены для ясности. Хотя на Фиг. 9C показаны два кластера 70В, следует понимать, что количество кластеров 70В будет зависеть от количества присоединенных фрагментов 34, введенных в образец 66В, а также от количества готовых к секвенированию фрагментов 12, 12’ нуклеиновой кислоты, отсоединенных от присоединенных фрагментов 34.

[0191] После генерирования кластеров 70В для получения второго разведенного образца 66В в проточную кювету 36 снова вводят краситель. Такое же окрашивание, которое используют для окрашивания матричных цепей 68a, можно использовать для окрашивания матричных цепей 68B и любых впоследствии сгенерированных матричных цепей.

[0192] Затем систему 62 освещения можно использовать для освещения окрашенных матричных цепей 68A и 68В в проточной кювете 36. Систему 64 обнаружения можно использовать для захвата изображения I₂ флуоресцирующих матричных цепей 68A и 68B в соответствующих кластерах 70A и 70B.

[0193] Изображение I₂ может также храниться в электронном виде для последующего извлечения и использования. В электронной записи изображение I₂ может быть связано с разведенным образцом 66B. Изображению I₂ также может быть присвоена временная запись. Временная запись может включать временную метку, на которой отмечено, когда был получен снимок и/или введен разведенный образец 56В, номер стадии в последовательности (например, образец 2 из 1000) или их комбинации.

[0194] Промывка может происходить после получения изображений кластеров 70A, 70В на проточной кювете 36. Можно использовать воду, буфер или другой мягкий промывочный раствор.

[0195] Процессы, показанные и описанные со ссылкой на Фиг. 9B и Фиг. 9C, можно затем повторять для количества разведенных образцов, полученных из исходной смеси. Каждое дополнительное изображение I₃, I₄, … I_x будет отображать новые кластеры 70C, 70D, ... 70X матричных цепей 68C, 68D, … 68X, полученных при введении соответствующих разведенных образцов 66C, 66D, … 66X. Все изображения I₁, I₂, … I_x, полученные для соответствующих разведенных образцов 66A, 66B, …66X, ассоциируют с конкретной смесью и, следовательно, с конкретной более длинной молекулой 30 нуклеиновой кислоты.

[0196] Поскольку каждое последовательное изображение I₂, I₃, I₄, … Ix отображает вновь сформированный кластер 70B, 70C, 70D, … 70X относительно непосредственно предшествующего изображения I₁, I₂, I₃, … Ix, можно использовать вычитание изображений для генерирования обработанного кластерного изображения для каждого образца, введенного после первого образца 66A. Обработанные кластерные изображения RI_x можно генерировать, как описано со ссылкой на Фиг. 7.

[0197] Следует понимать, что вычитание изображения может быть выполнено для любого из I₁, I₂, I₃, … I_x последовательно. Полученное обработанное кластерное изображение RI_x для любого заданного разведенного образца 66X показывает пространственное местоположение и ориентацию матричных цепей 68X, ассоциированных с таким разведенным образцом 66X.

[0198] Обработанные кластерные изображения могут быть сохранены для последующего анализа.

[0199] Другие способы

[0200] Вместо введения отдельных разведенных образцов 56A, 66A разведенная смесь может диффундировать в проточную кювету в предварительно заданных объемах, а обработка на проточной кювете 38 может происходить так, как описано в настоящем документе, для амплификации, окрашивания и записи изображений созданных матричных цепей 58X, 68X. Диффузией можно управлять таким образом, чтобы вводить один предварительно заданный объем за раз.

[0201] Таким образом, некоторые примеры способа включают генерирование синхронизированного кластерного изображения для каждого из предельно разведенных образцов, введенных в проточную кювету 36, посредством: управления диффузией смеси в проточную кювету таким образом, чтобы предельно разведенные образцы поступали в проточную кювету 36 поочередно; инициирования отсоединения фрагментов 14, 14 ‘ библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки 16 или друг от друга (например, от присоединенных фрагментов 34) в одном из предельно разведенных образцов в проточной кювете 36; амплификации фрагментов 14, 14’ библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества соответствующих матричных цепей 58A, 68A; окрашивания соответствующих матричных цепей 58A, 68A; и визуализации соответствующих матричных цепей 58A, 68A.

[0202] Секвенирование и анализ

[0203] После амплификации и визуализации всех разведенных образцов из смеси, как описано в настоящем документе, проточная кювета 36 готова к операции секвенирования. Можно использовать различные подходы или технологии секвенирования, включая методики, часто называемые секвенированием посредством синтеза (SBS), секвенированием циклических матриц, секвенированием посредством лигирования, пиросеквенированием и т. п.

[0204] В качестве одного примера секвенирование посредством синтеза (SBS) можно выполнять на такой системе, как HiSeq™, HiSeqX™, MiSeq™, MiSeqDX™, MiNISeq™, NovaSeq™, NextSeqDX™, ISEQ™, NextSeq™, или на других системах секвенирования Illumina (г. Сан-Диего, штат Калифорния, США). При методике SBS выполняют мониторинг удлинения праймеров секвенирования вдоль матричных цепей 58A, 58B, ... 58X для определения последовательности нуклеотидов в темплатах. 3’-концы матричных цепей 58A, 58B, … 58X и любые связанные с проточной кюветой праймеры 46, 48 (не присоединенные к матричным цепям 58A, 58B, … 58X) можно заблокировать для предотвращения помех реакции секвенирования, и в частности для предотвращения нежелательного праймирования.

[0205] Можно вносить праймер для секвенирования, который гибридизируется с комплементарной последовательностью на матричных цепях 58A, 58B, … 58X. Данный праймер для секвенирования подготавливает матричные цепи 58A, 58B, … 58X к секвенированию

[0206] Основным химическим процессом может быть полимеризация (например, катализируемая ферментом полимеразой) или лигирование (например, катализируемое ферментом лигазой). В конкретном процессе SBS на основе полимеразы к праймеру для секвенирования добавляют флуоресцентно-меченые нуклеотиды зависимым от темплата образом, чтобы для определения последовательности темплата можно было использовать определение порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру для секвенирования. Например, для запуска первого цикла SBS в проточную кювету 36 или через нее можно подавать один или более меченых нуклеотидов, ДНК-полимеразу и т. п., причем удлинение праймера для секвенирования приводит к встраиванию меченого нуклеотида. Такое встраивание можно обнаруживать с помощью события визуализации. Во время визуализации изображения система 62 освещения может подавать на проточную кювету 36 возбуждающий свет.

[0207] В некоторых примерах флуоресцентно-меченые нуклеотиды могут дополнительно обладать свойством обратимой терминации, которое прекращает дальнейшее удлинение праймера после добавления нуклеотида к темплату. Например, в темплат может быть добавлен нуклеотидный аналог, имеющий функциональную группу - обратимый терминатор, так что последующее удлинение не будет происходить до тех пор, пока не будет подан разблокирующий агент для удаления функциональной группы. Таким образом, для примеров с обратимой терминацией в проточную кювету 36 можно подавать разблокирующий реагент и т. п. (после обнаружения).

[0208] Промывка (-и) может (могут) происходить между различными стадиями подачи текучей среды. Затем цикл SBS можно повторять n раз для удлинения темплата на n нуклеотидов и таким образом определять последовательность длиной n.

[0209] Хотя метод SBS описан подробно, следует понимать, что проточную кювету 36, описанную в настоящем документе, можно использовать с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических сферах применения.

[0210] Чтения секвенирования, полученные в ходе операции секвенирования, можно группировать вместе на основе обработанных кластерных изображений RI₂, RI₃, … RI_x. Затем сгруппированные чтения секвенирования можно связывать с соответствующим одним из разведенных образцов на основе обработанных кластерных изображений RI₂, RI₃, … RI_x. Можно сделать вывод о том, что сгруппированные и связанные чтения секвенирования получены из одного и того же более длинного образца 30 нуклеиновой кислоты. Таким образом, некоторые примеры способа включают выполнение операции секвенирования на проточной кювете 26, включающей соответствующие матричные цепи для каждого из множества фрагментов библиотеки; и группирование чтений секвенирования по разным группам на основании обработанных кластерных изображений RI, RI₂, RI₃, … RI_x.

[0211] Для дополнительной иллюстрации настоящего описания в настоящем документе приведены примеры. Следует понимать, что эти примеры приведены в целях иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничивающий объем настоящего описания.

ПРИМЕРЫ

[0212] Пример 1

[0213] Олигонуклеотиды штрих-кода (например, адаптер 18) присоединяли посредством биотинового линкера к гранулам стрептавидина M280 (Thermofisher) с образованием гранульного пула. Универсальную транспосому гибридизировали с комплементарной последовательностью на концах олигонуклеотидов с образованием связанной с гранулами транспосомы (BLT). Затем BLT промывали в промывочном буфере, ресуспендировали в рабочем буфере и добавляли вспомогательные белки (одноцепочечный связывающий белок (Thermofisher) и двухцепочечные связывающие белки (Illumina)).

[0214] В смесь BLT добавляли высокомолекулярную ДНК NA12878 (экстрагированную из культивированных клеток с использованием протокола экстракции ДНК Qiagen MagAttract® HMW) и осторожно переворачивали пробирки для смешивания. Затем пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение около 15 минут для обеспечения оборачивания ДНК вокруг гранул. Затем в каждую пробирку добавляли буфер для тагментации (содержащий хлорид магния и трис-ацетат) и инкубировали образцы в течение около 10 минут при температуре около 55°C. На этой стадии транспосома тагментировала ДНК, и тагментированная ДНК присоединялась к BLT. После реакции тагментации добавляли додецилсульфат натрия (SDS) и инкубировали образцы при комнатной температуре в течение около 5 минут для денатурации транспозазы. Затем пробирки помещали на магнит и удаляли супернатант. Гранулы промывали промывочным буфером. После заключительной промывки гранулы ресуспендировали в смеси лигаз (содержащей лигазу Т7 и связанный с ней буфер для Т7 лигазы производства компании NEB). Затем образцы смешивали и оставляли инкубироваться в течение около 45 минут при комнатной температуре. В течение этого времени гэп в матричной цепи (в которую первоначально гибридизировалась транспосома) лигировали, тем самым физически присоединяя меченую ДНК к грануле. Затем образцы помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы снова промывали в промывочном буфере.

[0215] Затем меченые гранулы разделяли на две группы для удаления неперенесенных цепей и введения указателя образца (например, адаптер 22). Одну группу (группа сравнения) подвергали воздействию сравнительного рабочего процесса, в котором для удаления неперенесенных цепей использовали тепло. Другую группу (группа примера) подвергали воздействию примера рабочего процесса, в котором для удаления неперенесенных цепей использовали экзонуклеазу.

[0216] Группу сравнения ресуспендировали в промывочном буфере и нагревали до температуры около 80°C в течение около 5 минут для денатурации не участвующих в переносе цепей. Пробирки, содержащие группу сравнения, затем помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы промывали. Затем к гранулам группы сравнения добавляли указатель образца, разведенный в промывочном буфере, и эту смесь инкубировали при температуре около 80°C в течение около 1 минуты с последующим понижением температуры.

[0217] Группу сравнения суспендировали в смеси экзонуклеаз Т7 (содержащей экзонуклеазу Т7 и буфер NEB Buffer 4) и позволили проинкубироваться при комнатной температуре в течение около 10 минут. 5’-3’ экзонуклеазная активность экзонуклеазы Т7 расщепляла неперенесенные цепи. Пробирки, содержащие группу сравнения, затем помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы промывали. Затем к гранулам группы сравнения добавляли указатель образца, разведенный в промывочном буфере, и эту смесь инкубировали при температуре около 55°C в течение около 5 минут для выполнения присоединения указателя образца.

[0218] Пробирки, содержащие группу сравнения и группу примера соответственно, помещали на магнит и удаляли супернатант. Добавляли смесь для удлиняющего лигирования и инкубировали образцы в течение около 5 минут при температуре около 37°C. Затем пробирки снова помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы группы сравнения и группы примера промывали в промывочном буфере. После последней промывки гранулы ресуспендировали в промывочном буфере.

[0219] Некоторые гранулы группы сравнения и некоторые гранулы группы примера отбирали в качестве подобразца и использовали в реакции ПЦР. В дополнение к соответствующим гранулам каждая ПЦР-смесь состояла из смеси для ПЦР EPM компании Illumina и олигонуклеотидов P5 и P7. Каждый образец амплифицировали с использованием ПЦР.

[0220] После ПЦР подобразец супернатанта ПЦР каждой из группы сравнения и группы примера переносили в свежую пробирку и проводили селекцию по размеру 0,50х-0,62х (твердофазная обратимая иммобилизация, SPRI) с использованием гранул для очистки образцов. Полученные библиотеки элюировали в буфере для ресуспендирования. Эти библиотеки секвенировали на отдельных проточных кюветах HiSeqTM 2500 Rapid (с использованием стандартной длины цикла чтения 2x101). После создания Fastq образцы выравнивали с человеческим геномом (hg38) и данные импортировали в IGV.

[0221] на Фиг. 10 показано покрытие, полученное с использованием библиотеки из каждой группы сравнения (термическая денатурация с мечением) и группы примера (меченая экзонуклеаза Т7), для богатой АТ области человеческого генома, на которую, как известно, отрицательно влияют высокотемпературные стадии в протоколе подготовки библиотеки. Результаты для фрагментов библиотеки группы сравнения, неперенесенные цепи которых были удалены посредством термической денатурации, показаны в верхней части Фиг. 10, а результаты для фрагментов библиотеки группы примера, неперенесенные цепи которых удаляли посредством экзонуклеазного расщепления, показаны в нижней части Фиг. 10. Согласно иллюстрации для фрагментов библиотеки группы примера наблюдался полный охват богатой AT области, а для фрагментов библиотеки группы сравнения в этой же области наблюдался лишь частичный охват. Эти результаты показывают, что применение способа ферментативного расщепления, описанного в настоящем документе, увеличивает покрытие библиотеки и улучшает секвенирование по сравнению с термической денатурацией в богатых AT областях генома.

[0222] Пример 2

[0223] Комплексы были получены так, как описано в способе, показанном на Фиг. 2A-2C (многостадийное лигирование и расщепление), и в способе, показанном на Фиг. 3 (однореакторное лигирование и расщепление).

[0224] Генерацию BLT, связывание ДНК, тагментацию и воздействие SDS выполняли, как описано в примере 1. После удаления транспозазы и связанной с ней промывки меченые гранулы затем разделяли на две группы для удаления неперенесенных цепей посредством многостадийного лигирования и расщепления (обозначаемого как группа 2 примера) или посредством однореакторного лигирования и расщепления (обозначаемого как группа 3 примера).

[0225] Группу 2 примера ресуспендировали в смеси ДНК-лигазы E. Coli, включающей ДНК-лигазу E. Coli и связанный с ним буфер, оба производства компании NEB. Образцы группы 2 примера затем смешивали и инкубировали в течение около 15 минут при температуре около 16°C. Пробирки с образцами группы 2 примера затем помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы группы 2 примера промывали в промывочном буфере. После промывки гранулы группы 2 примера ресуспендировали в смеси, содержащей экзонуклеазу Т7 и буфер NEB Buffer 4, и инкубировали при температуре около 25°C в течение около 10 минут.

[0226] Группу примера 3 ресуспендировали в объединенной смеси лигазы и экзонуклеазы, включающей ДНК-лигазу E. Coli, экзонуклеазу Т7, НАД⁺ и буфер CUTSMART™ (от компании NEB), при температуре около 25°C в течение около 15 минут.

[0227] Пробирки, содержащие группу 2 примера и группу 3 примера затем помещали на магнит, супернатант удаляли, а соответствующие гранулы промывали. Затем к гранулам каждой группы примера добавляли указатель образца, разведенный в промывочном буфере, и эти смеси инкубировали при температуре около 55°C в течение около 5 минут для обеспечения присоединения указателя образца.

[0228] Пробирки, содержащие соответственно группу примера 2 и группу примера 3, помещали на магнит и удаляли супернатант. Добавляли смесь для удлиняющего лигирования и инкубировали образцы в течение около 5 минут при температуре около 37°C. Затем пробирки снова помещали на магнит, супернатант удаляли, а гранулы группы сравнения и группы примера промывали в промывочном буфере. После последней промывки гранулы ресуспендировали в промывочном буфере.

[0229] Некоторые гранулы группы 2 примера и некоторые гранулы группы 3 примера отбирали в качестве подобразца и использовали в реакции ПЦР. В дополнение к соответствующим гранулам каждая ПЦР-смесь состояла из смеси для ПЦР EPM компании Illumina и олигонуклеотидов P5 и P7. Каждый образец амплифицировали с использованием ПЦР.

[0230] После ПЦР подобразец супернатанта ПЦР каждой из группы 2 примера и группы 3 примера переносили в свежую пробирку. Добавляли гранулы для очистки образцов и выполняли 2,5х SPRI, элюируя полученную библиотеку в ресуспендирующем буфере. Затем очищенные библиотеки анализировали на чипе Bioanalyzer 2100 High Sensitivity и получали кривую, показанную на Фиг. 11. Результаты показывают, что профили размеров и выходы библиотек были сопоставимы в случае многостадийного лигирования и расщепления, а также однореакторного лигирования и расщепления. Эти результаты показывают, что объединенный состав реагента не оказывал вредного влияния на лигирование и не приводил к расщеплению фрагмента или перенесенной цепи.

[0231] Примеры связанных с гранулами фрагментов библиотеки (комплексов), полученных с использованием способов подготовки библиотек, описанных в примерах 1 и 2, можно разделять на подобразцы и разводить с образованием множества разведенных образцов, как описано в настоящем документе. Затем можно выполнять способ, описанный со ссылкой на Фиг. 6A-6D (включая кластеризацию, окрашивание и визуализацию), с каждым из разведенных образцов для генерирования серии синхронизированных кластерных изображений. После амплификации и визуализации всех разведенных образцов проточная кювета готова к операции секвенирования. Для эффективного и надежного восстановления длинного фрагмента ДНК можно использовать методики подготовки библиотек и методики синхронизированной визуализации, описанные в настоящем документе.

[0232] Дополнительные примечания

[0233] Кроме того, следует понимать, что диапазоны, приведенные в настоящем документе, включают указанный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах указанного диапазона, как если бы эти диапазоны были указаны явным образом. Например, диапазон, представленный границами от около 2 мм до около 300 мм, следует интерпретировать как включающий не только явно перечисленные пределы от около 2 мм до около 300 мм, но также включающий индивидуальные значения, такие как около 15 мм, 22,5 мм, 245 мм и т. д., и поддиапазоны, такие как от около 20 мм до около 225 мм и т. д.

[0234] Следует понимать, что все комбинации вышеуказанных концепций и дополнительных концепций, более подробно описанных ниже (при условии, что такие концепции не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в настоящем документе. В частности, все комбинации заявленного объекта изобретения, появляющиеся в конце данного описания, считаются частью обладающего признаками изобретения объекта изобретения, описанного в настоящем документе. Следует также понимать, что терминология, явно используемая в настоящем документе, которая также может присутствовать в любом описании, включенном в настоящий документ посредством ссылки, должна иметь значение, наиболее соответствующее конкретным концепциям, описанным в настоящем документе.

[0235] Хотя подробно описано несколько примеров, следует понимать, что описанные примеры могут быть изменены. Таким образом, представленное выше описание следует рассматривать как не имеющее ограничительного характера.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу идентификации образца, из которого был сгенерирован конкретный набор матричных цепей, включающий генерирование серии синхронизированных кластерных изображений для множества фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью из образца генома, причем каждое синхронизированное кластерное изображение в серии генерируют последовательно. Также раскрыта система для осуществления указанного способа. Изобретение эффективно для идентификации образца, из которого был сгенерирован конкретный набор матричных цепей. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 пр.

1. Способ идентификации образца, из которого был сгенерирован конкретный набор матричных цепей, включающий

генерирование серии синхронизированных кластерных изображений для множества фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью из образца генома, причем каждое синхронизированное кластерное изображение в серии последовательно генерируют посредством:

введения в проточную кювету соответствующего образца, включающего некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, при этом некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединены к твердой подложке или присоединены друг к другу;

инициирования отсоединения некоторых из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга;

амплификации некоторых фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества соответствующих матричных цепей;

окрашивания соответствующих матричных цепей; и

визуализации соответствующих матричных цепей.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий присвоение каждому синхронизированному кластерному изображению в серии временной записи о введении соответствующего образца, включая некоторые фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью.

3. Способ по п. 2, в котором временная запись представляет собой временную отметку или номер стадии в последовательности.

4. Способ по одному из пп. 1-3, дополнительно включающий использование вычитания изображения для создания обработанного кластерного изображения для каждого из соответствующих образцов, причем каждое обработанное кластерное изображение фиксирует пространственное расположение и ориентацию соответствующих матричных цепей, ассоциированных с другим образцом.

5. Способ по п. 4, дополнительно включающий сохранение обработанных кластерных изображений.

6. Способ по п. 4 или 5, дополнительно включающий:

выполнение операции секвенирования на проточной кювете, включающей соответствующие матричные цепи для каждого из множества фрагментов библиотеки; и

группирование чтений секвенирования по разным группам на основании обработанных кластерных изображений.

7. Способ по п. 6, дополнительно включающий связывание различных групп с каждым из различных образцов на основании обработанных кластерных изображений.

8. Способ по одному из пп. 1-6, в котором:

перед генерированием серии синхронизированных кластерных изображений способ дополнительно включает:

добавление жидкого носителя к множеству фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью с образованием смеси; и

разведение смеси жидким носителем для получения предварительно заданного количества разведенных образцов, вводимых в проточную кювету; и

введение соответствующего образца включает направление по текучей среде одного из разведенных образцов в проточную кювету.

9. Способ по п. 8, в котором смесь, включающую множество фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, разводят до предварительно заданного объема на основании i) объема проточной кюветы в качестве предельного разведения и ii) предварительно заданного количества разведенных образцов.

10. Способ по одному из пп. 1-9, в котором:

каждый фрагмент библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединяют к твердой подложке; и

отсоединение включает нагревание.

11. Способ по одному из пп. 1-9, в котором:

каждый из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью включает первый участок последовательности на первом конце, который гибридизируется с первой последовательностью праймера на поверхности проточной кюветы; и

перед амплификацией способ дополнительно включает присоединение второго участка последовательности к каждому из гибридизированных фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью на втором конце, противоположном первому концу, причем второй участок последовательности идентичен второй последовательности праймера на поверхности проточной кюветы.

12. Способ по одному из пп. 1-9, в котором:

каждый фрагмент библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединяют к твердой подложке;

твердая подложка имеет множество присоединенных к ней адаптеров; и

способ дополнительно включает генерирование фрагмента библиотеки с сохраненной непрерывностью, присоединенного к твердой подложке, посредством:

тагментации образца генома в присутствии твердой подложки и множества L-адаптеров, причем каждый L-адаптер включает перенесенную цепь и неперенесенную цепь и таким образом генерирует множество фрагментов образца, в результате чего соответствующая перенесенная цепь встраивается в 5'-конец каждого фрагмента образца, а соответствующая неперенесенная цепь гибридизируется с частью каждого адаптера;

лигирования соответствующих перенесенных цепей с соответствующим одним из множества адаптеров;

расщепления неперенесенной цепи с использованием 5'-3'-экзонуклеазы; и

присоединения частичного Y-адаптера к каждой из перенесенных цепей.

13. Способ по п. 12, в котором лигирование и расщепление происходят в рамках единого однореакторного протокола.

14. Способ идентификации образца, из которого был сгенерирован конкретный набор матричных цепей, включающий:

получение смеси, включающей множество фрагментов образца генома из библиотеки с сохраненной непрерывностью, причем множество фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединены к твердым подложкам или присоединены друг к другу;

разведение смеси для получения предварительно заданного количества разведенных образцов, вводимых в проточную кювету; и

генерирование синхронизированного кластерного изображения для по меньшей мере одного из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью посредством:

введения в проточную кювету первого из разведенных образцов, включающих некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью;

инициирования отсоединения некоторых из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга;

амплификации некоторых фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования множества матричных цепей;

окрашивания множества матричных цепей; и

визуализации множества матричных цепей.

15. Способ по п. 14, в котором смесь разводят до предварительно заданного объема на основании i) объема проточной кюветы в качестве предельного разведения и ii) предварительно заданного количества разведенных образцов, вводимых в проточную кювету.

16. Способ по п. 14 или 15, дополнительно включающий

генерирование второго синхронизированного кластерного изображения для какого-либо другого из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью посредством:

введения в проточную кювету второго из разведенных образцов, включающих некоторые другие фрагменты библиотеки с сохраненной непрерывностью;

инициирования отсоединения какого-либо другого из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга;

амплификации какого-либо другого из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования второго множества матричных цепей;

окрашивания второго множества матричных цепей; и

визуализации второго множества матричных цепей.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий генерирование предварительно заданного количества синхронизированных кластерных изображений для предварительно заданного количества фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью посредством повторения введения, инициирования отсоединения, амплификации, окрашивания и визуализации друг с другом предварительно заданного количества разведенных образцов.

18. Способ по п. 17, дополнительно включающий присвоение каждому из предварительно заданного количества синхронизированных кластерных изображений временной записи о введении соответствующего разведенного образца.

19. Способ по п. 18, в котором временная запись представляет собой временную отметку или номер стадии в последовательности.

20. Способ по одному из пп. 17-19, дополнительно включающий использование вычитания изображения для генерирования обработанного кластерного изображения для каждого из разведенных образцов, введенных в проточную кювету, причем каждое обработанное кластерное изображение фиксирует пространственное расположение и ориентацию множества матричных цепей, ассоциированных с другим из разведенных образцов.

21. Способ по одному из пп. 14-20, в котором:

каждый фрагмент библиотеки с сохраненной непрерывностью присоединяют к твердой подложке;

твердая подложка имеет множество присоединенных к ней адаптеров; и

способ дополнительно включает генерирование фрагмента библиотеки с сохраненной непрерывностью, присоединенного к твердой подложке, посредством:

тагментации образца генома в присутствии твердой подложки и множества L-адаптеров, причем каждый L-адаптер включает перенесенную цепь и неперенесенную цепь и таким образом генерирует множество фрагментов образца, в результате чего соответствующая перенесенная цепь встраивается в 5'-конец каждого фрагмента образца, а соответствующая неперенесенная цепь гибридизируется с частью каждого адаптера;

лигирования соответствующих перенесенных цепей с соответствующим одним из множества адаптеров;

расщепления неперенесенной цепи с использованием 5'-3'-экзонуклеазы; и

присоединения частичного Y-адаптера к каждой из перенесенных цепей.

22. Способ по п. 21, в котором лигирование и расщепление происходят в рамках единого однореакторного протокола.

23. Система для осуществления способа по п. 14, содержащая:

секвенатор, включающий приемный отсек проточной кюветы и нагреватель;

систему управления текучей средой, включающую подающие текучие среды, которые соответственно подают предварительно заданное количество разведенного образца и краситель в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы;

систему освещения, расположенную таким образом, чтобы освещать проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы;

систему обнаружения, расположенную таким образом, чтобы захватывать изображение проточной кюветы, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы; и

контроллер, находящийся в функциональной связи с системой управления текучей средой, системой освещения и системой обнаружения, причем контроллер выполнен с возможностью:

инициирования введения одного из предварительно заданного количества разведенных образцов в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы, посредством подающих текучих сред;

инициирования отсоединения нагревателем некоторых из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью от твердой подложки или друг от друга, причем некоторые из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью содержатся в одном из предварительно заданного количества разведенных образцов;

инициирования выполнения термического цикла нагревателем для амплификации некоторых фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью для генерирования матричных цепей;

инициирования введения красителя в проточную кювету, расположенную в приемном отсеке проточной кюветы, посредством подающих текучих сред, после генерирования матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, из фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью, присутствующих в одном из предварительно заданного количества разведенных образцов;

инициирования освещения окрашенных матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, системой освещения; и

инициирования визуализации освещенных окрашенных матричных цепей в проточной кювете, расположенной в приемном отсеке проточной кюветы, системой обнаружения.

24. Система по п. 23, дополнительно содержащая:

первую кассету, содержащую один из предварительно заданного количества разведенных образцов; и

вторую кассету, содержащую краситель.

25. Система по одному из пп. 23 или 24, дополнительно содержащая электронный компонент памяти для хранения изображения.

26. Система по п. 23, в которой изображение представляет собой синхронизированное кластерное изображение серии синхронизированных кластерных изображений для множества фрагментов библиотеки с сохраненной непрерывностью из образца генома, причем каждое синхронизированное кластерное изображение в серии генерируют последовательно.