Способ получения суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток Российский патент 2024 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к медицине и биологии, и может быть использовано в пробоподготовке для получения суспензии опухолевых клеток простаты для последующего секвенирования единичных клеток.

Рак простаты (РП) - наиболее часто встречающееся онкологическое заболевание среди мужского населения, которое характеризуется высоким уровнем смертности [Костин Андрей Александрович, Асратов Асатулла Турсунович, Кульченко Нина Геннадьевна, Толкачев Александр Олегович/Прогнозирование развития рака простаты с помощью общих моделей дискриминантного анализа // Вестник РУДН. Серия: Медицина. 2015. № 3. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/prognozirovanie-razvitiya-raka-predstatelnoy-zhelezy-s-pomoschyu-obschih-modeley-diskriminantnogo-analiza].

Рак простаты - крайне гетерогенное заболевание, и в зависимости от степени нарушения архитектуры тканей и клеточной морфологии может наблюдаться более агрессивный рост опухоли и худший исход (Epstein et al.,2016).

Ввиду разнообразия опухолевого микроокружения при раке простаты возникает необходимость в более глубоком понимании тканевого иммунитета в здоровой ткани простаты и характера его нарушения при раке простаты, чтобы обосновать будущие терапевтические стратегии.

Современные исследования канцерогенеза, молекулярных механизмов опухолевой прогрессии и метастазирования все больше фокусируются на мультиомиксных подходах.

В работе [Miyahira АК, Zarif JC, Coombs СС, Flavell RR, Russo JW, Zaidi S, Zhao D, Zhao SG, Pienta KJ, Soule HR. Prostate cancer research in the 21st century; report from the 2021 Coffey-Holden prostate cancer academy meeting. Prostate. 2022 Feb;82(2): 169-181. doi: 10.1002/pros.24262. Epub 2021 Nov 3. PMID: 34734426; PMCID: PMC8688282] затрагивается тема перехода на новый уровень понимания процессов развития рака простаты и пространственную организацию самой опухоли, что в свою очередь повышает используемые ресурсы и сложность исследований и повышения рисков получить не качественные результаты в связи с ошибками в пробоподготовке.

Одним из современных подходов молекулярной биологии является singe-cell секвенирование (секвенирование единичных клеток).

Одноклеточное секвенирование - это относительно новая технология, которая только недавно стала доступна широкому рынку благодаря инновациям в области масштабирования и стандартизации [Haque, A. et al.].

Метод открывает возможности выявления новых и редких типов клеток и их состояния, связанные с прогрессированием опухоли и метастазированием, которые не были ранее исследованы методами массового анализа и позволяет определять глобальное транскрипционное разнообразие в опухолевых клонах, что дает возможность раскрыть механизмы терапевтической резистентности и иммунного ответа.

Секвенирование одиночных клеток является достаточно дорогостоящей технологией (стоимость секвенирования единичных клеток примерно в 7-15 раз выше, чем при традиционном NGS - анализе), особенно по сравнению с традиционными методами секвенирования РНК. Однако при тщательном подходе к пробоподготовке можно снизить эти затраты. Поскольку изоляция отдельных клеток имеет первостепенное значение для этого подхода, критическим моментом работы с технологией является диссоциация ткани на отдельные клетки, при которой не нарушается структура транскриптома.

Каждый вид ткани для дальнейшей обработки и секвенирования требует подбора индивидуальных условий диссоциации, и ввиду особенности структуры и морфологии ткани простаты исследователи при получении суспензии единичных клеток отмечали присутствие дебриса, большого количества мертвых клеток и клеточных агрегатов.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения суспензии опухолевых клеток рака простаты, заключающийся в том, что последовательно выполняют:

1) Механическое измельчение ткани скальпелем или ножницами на небольшие кусочки (<1 мм) в среде Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).

2) Обработку пробы смесью реактивов коллагеназа/гиалуронидаза/диспаза (Fisher Scientific, кат. ном. NC-9694308 и 354 235).

3) Суспендирование пробы.

4) Инкубирование проб при температуре 37°С со скоростью встряхивания 40 об/мин в течение 60 мин на термошейкере.

5) Фильтрование проб через сетчатый фильтр с диаметром пор 40 мкм.

6) Повторное суспендирование.

7) Центрифугирование

8) Удаление эритроцитов с помощью буфера для лизиса эритроцитов (Thermo Fisher Scientific, кат. № 1966634).

9) Дополнительное концентрирование живых клеток с помощью набора для удаления мертвых клеток (Miltenyi Biotec, кат. № 130-090-101) [Ma, X., Guo, J., Liu, К. et al. Identification of a distinct luminal subgroup diagnosing and stratifying early stage prostate cancer by tissue-based single-cell RNA sequencing. Mol Cancer 19, 147 (2020). https://doi.org/l0.1186/sl2943-020-01264-9].

К недостаткам прототипа следует отнести следующее: в результате использования способа большинство клеток оставалось в виде кластеров, а не отдельных клеток, наблюдался дебрис, выход живых клеток снижался из-за механического воздействия на клетки и использования буфера для лизиса эритроцитов. Дополнительное концентрирование с помощью набора для удаления мертвых клеток снижало общий выход клеток. Кроме этого, в условиях недоступности коммерческих наборов осуществление способа становится трудоемким процессом.

Задачей изобретения является создание воспроизводимого способа получения суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток в условиях проблем с поставкой коммерческих наборов реактивов из-за границы.

Технический результат - увеличение общего выхода клеток с высокой жизнеспособностью, получение единичных опухолевых клеток простаты, упрощение и сокращение времени получения суспензии за счет исключения необходимости удаления эритроцитов и концентрирования суспензии.

Предлагаемый способ получения суспензии опухолевых клеток простаты реализуется следующим образом:

1) Проводят механическое измельчение опухолевой ткани простаты

• Размещают чашки Петри на хладагент, на чашки добавляют 500 мкл модифицированной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Этот широко используемая среда для поддержки роста различных клеток млекопитающих, содержащая четырехкратную концентрацию аминокислот и витаминов, а также глицин, серии и нитрат железа. DMEM выпускается в различных составах для широкого спектра применений в культивировании клеток, в жидком и порошкообразном виде.

• Пинцетом помещают опухолевую ткань простаты размером 5x5 мм на чашку Петри в среду DMEM.

• Измельчают скальпелем до получения кусочков менее 1 мм.

• Пастеровской пипеткой полученную смесь измельченной опухолевой ткани в среде DMEM переносят в фалькон, аккуратно суспендируя.

• Чашки Петри промывают 500 мкл DMEM

• Раствор из чашек Петри переносят в пробирку и добавляют дополнительно 1,2 мл DMEM (общий объем составляет 2,2 мл).

• Фальконы помещают на лед во избежание гибели клеток

2) Проводят ферментативную диссоциацию опухолевой ткани простаты с помощью раствора коллагеназы и ДНКазы

• В фальконы добавляют коллагеназу в количестве 200 мкл на 2,2 мл и ДНКазу в количестве 50 мкг/мл смеси измельченной опухолевой ткани в среде DMEM.

• Инкубируют пробу при 37°С в течение 20 минут со скоростью встряхивания 40 об/мин на термошейкере

• Пастеровскими пипетками раствор фильтруют через сетчатый фильтр с диаметром пор 70 мкм в новые пробирки на 50 мл.

• Пробирки промывают 5 мл DMEM, пропускают через тот же сетчатый фильтр.

3) Проводят финальное промывание суспензии клеток.

• Раствор центрифугируют в течение 3 -5 мин при 800 RPM.

• Супернатант сливают и доводят раствором DMEM до 1 мл.

• Суспендируют клетки медленно на льду во избежание гибели клеток.

Таким образом, за счет использования смеси коллагеназы и ДНКазы для ферментативной диссоциации измельченной опухолевой ткани в среде DMEM и инкубирования в течение 20 минут улучшается разделение клеток и их переход в однородную суспензию, а фильтрование через сетчатый фильтр с диаметром пор 70 мкм позволяет эффективнее удалить дебрис и клеточные агломераты.

Предлагаемый способ подходит для небольших кусочков тканей размером 5x5 мм, при этом наблюдается увеличение общего выхода клеток с высокой жизнеспособностью. Полученная суспензия на выходе чистая, гомогенная, клетки видны в световом микроскопе без кластеров и агрегатов.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Биообразец пациента А. - опухолевая ткань простаты (гистологически подтвержденная) размером 5×5 мм.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента А. с использованием предлагаемого способа. Результат: отсутствие дебриса, малое количества клеточных кластеров, чистая и гомогенная суспензия. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 45%.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента А. по способу-прототипу с использованием набора реактивов коллагеназа/гиалуронидаза/диспаза.

Результат: присутствие дебриса, большого количества клеточных кластеров. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 18%.

Пример 2.

Биообразец пациента В - опухолевая ткань простаты (гистологически подтвержденная) размером 5×5 мм.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента В. с использованием предлагаемого способа. Результат: отсутствие дебриса, малое количество клеточных кластеров. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 55%.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента В. по способу-прототипу с использованием набора реактивов коллагеназа/гиалуронидаза/диспаза. Результат: присутствие дебриса, большого количества клеточных кластеров и недиссоциированных фрагментов. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 22%.

Пример 3.

Биообразец пациента С - опухолевая ткань простаты (гистологически подтвержденная) размером 5×5 мм.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента С.с использованием предлагаемого способа. Результат: отсутствие дебриса, малое количества клеточных агломератов. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 55%.

Проведено получение суспензии опухолевых клеток простаты для секвенирования единичных клеток из биоматериала пациента С.по способу-прототипу с использованием набора реактивов коллагеназа/гиалуронидаза/диспаза. Результат: присутствие дебриса, погибших клеток и большое количество клеточных кластеров. После проверки на автоматическом счетчике клеток ТС20 Bio-RAD процент живых клеток в среднем составлял 22%.

Изобретение относится к биотехнологии. Разработан способ получения суспензии опухолевых клеток простаты. Способ включает измельчение опухолевой ткани простаты до размера менее 1 мм, суспендирование, ферментативную диссоциацию смеси измельченной опухолевой ткани в среде DMEM раствором, содержащим коллагеназу, инкубирование, фильтрование, центрифугирование, повторное суспендирование, отличающийся тем, что ферментативную диссоциацию проводят раствором, содержащим коллагеназу в количестве 200 мкл на 2,2 мл и ДНКазу в количестве 50 мкг/мл смеси измельченной опухолевой ткани в среде DMEM, инкубирование проводят в течение 20 минут, а фильтрование проводят через сетчатый фильтр с диаметром пор 70 мкм. Способ обеспечивает увеличение общего выхода клеток с высокой жизнеспособностью, получение единичных опухолевых клеток простаты для последующего секвенирования, упрощение и сокращение времени получения суспензии за счет исключения необходимости удаления эритроцитов и концентрирования суспензии. 3 пр.

Способ получения суспензии опухолевых клеток простаты, включающий измельчение опухолевой ткани простаты до размера менее 1 мм в среде Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), суспендирование, ферментативную диссоциацию смеси измельченной опухолевой ткани в среде DMEM раствором, содержащим коллагеназу, инкубирование при температуре 37°C со скоростью встряхивания 40 об/мин на термошейкере, фильтрование через сетчатый фильтр, центрифугирование, повторное суспендирование, отличающийся тем, что ферментативную диссоциацию проводят раствором, содержащим коллагеназу в количестве 200 мкл на 2,2 мл и ДНКазу в количестве 50 мкг/мл смеси измельченной опухолевой ткани в среде DMEM, инкубирование проводят в течение 20 минут, а фильтрование проводят через сетчатый фильтр с диаметром пор 70 мкм.