Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи Российский патент 2023 года по МПК C12N5/09 

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в области биомедицинских исследований и разработок для поиска новых терапевтических подходов к лечению социально значимых заболеваний. Изобретение позволяет получить трехмерные клеточные конструкты (органоиды) из плоскоклеточных опухолей органов головы и шеи с использованием гелированной аутоплазмы и без применения культуральных добавок ксеногенного происхождения.

Уровень техники

Предпосылки создания изобретения

Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения, в 2018 году онкологические заболевания были диагностированы у 18,1 млн человек и стали причиной смерти 9,6 млн больных; это пугающе огромные цифры, при этом прогнозы выглядят крайне неутешительно: предполагается, что к 2040 году данные показатели могут практически удвоиться [1].

В последние десятилетия многое было предпринято для повышения эффективности раннего выявления онкологических заболеваний и поиска новых терапевтических подходов, однако лишь небольшая часть разрабатываемых методов доказывает свою безопасность и эффективность при прохождении клинических испытаний [2]. Одним из наиболее сложных препятствий на пути в клиническую практику можно по праву считать малую доступность релевантных доклинических моделей, которые бы в полной мере отражали всю сложность организации опухолевой ткани человека. Самая распространенная и недорогая in vitro модель, представляющая собой 2D опухолевые клеточные линии, является чрезмерно упрощенной за счет невозможности воспроизведения исходной гетерогенности опухолевой ткани и ее микроокружения [3], а ведь взаимодействие клеточного (стволовых клеток опухоли, эпителия, эндотелия, инфильтрирующих опухоль иммунных клеток) и неклеточного (внеклеточного матрикса и биологически активных веществ) компонентов во многом определяет прогрессирование заболевания и, соответственно, эффективность терапевтического воздействия [4]. Значительно более сложно устроенная in vivo модель ксенографтов предполагает трансплантацию фрагментов опухолевой ткани иммунодефицитным животным; такая модель достаточно точно отражает гетерогенность опухолевой ткани и даже позволяет изучать процесс метастазирования, однако сложна и дорога в исполнении, обладает низкой воспроизводимостью и исключает возможность исследования вклада иммунного компонента [5]. Одной из наиболее перспективных на сегодняшний день является клеточная 3D модель, которая объединяет преимущества описанных выше моделей: доступность, возможность стандартизации, релевантность, соответствие концепции

персонализированной медицины. Трехмерная клеточная культура по-прежнему не в полной мере способна воспроизвести условия микроокружения опухоли и достаточно ресурсозатратна, однако постепенное развитие биотехнологии в конечном итоге должно привести к повышению эффективности и распространению данного метода моделирования [6].

Трехмерные клеточные модели включают в себя сфероиды и тканевые эксплантаты, а также более сложно устроенные органоиды (в случае получения их из опухолевой ткани часто используют термин «тумороиды»), которые обладают способностью к самоорганизации, содержат гетерогенный клеточный компонент, нуждаются во внеклеточном матриксе и сложном коктейле ростовых факторов. За последние несколько лет органоиды были успешно получены из нормальной и опухолевой тканей головного мозга, легких, пищевода, желудка, кишечника, печени, поджелудочной железы, почек, слюнных желез, яичников, молочных желез, простаты и других органов [6], при этом для каждого источника была необходима разработка отдельного протокола изоляции клеток и условий формирования органоидов. Кроме сложного коктейля ростовых факторов и агонистов/антагонистов различных сигнальных путей для образования органоидов необходим внеклеточный матрикс, в качестве которого в подавляющем количестве исследований используют коммерчески доступный матрикс базальной мембраны саркомы мышей линии Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Помимо высокой вариабельности свойств EHS матрикс обладает еще одним очевидным недостатком - он не соответствует animal-derived free стандартам, которые в ближайшее время, несомненно, станут обязательны для биомедицинских продуктов, поэтому исследователи активно ищут ему замену среди синтетических или природных гидрогелей [7].

К настоящему времени известно несколько изобретений, представляющих собой способы культивирования органоидов из различных тканей и органов человека и животных.

Известны способы культивирования клеток и получения органоидов из эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека (патент RU 2631005 С1, дата публикации 15.09.2017), получения органоидов из эпителиальных стволовых клеток нормальной или опухолевой ткани желудка, поджелудочной железы, толстого или тонкого кишечника (патент RU 2555545 С2, дата публикации 10.07.2015), получения органоидов из эпителиальных и мезенхимальных клеток пульпы зуба (патент RU 2638783 С2, дата публикации 15.12.2017), получения органоидов печени из единственной эпителиальной стволовой клетки, выделенной из фрагмента печени или желчного протока печени (патент RU 2579995 С2, дата публикации 10.04.2016) и аналогичные изобретения, главным недостатком которых является использование культуральных добавок (в том числе фетальной бычьей сыворотки) и внеклеточного матрикса ксеногенного происхождения.

Известен способ культивирования органоидов без указания конкретных клеточных типов с использованием множества вариантов матриксов в виде гидрогелей с вязкостью от 50 до 150 кПа, полученных из природных полисахаридов и белков (агарозы, альгината, хитозана, декстрана, желатина, ламинина, коллагенов, гиалуроната, фибрина или их сочетаний), натуральных внеклеточных матриксов (Matrigel, Myogel или Cartigel), синтетических полимеров (полиуретана, полиамида, поливинилового спирта, полиэтилен гликоля, полиэтилен оксида, полипропилен гликоля, полипропилен оксида, политетраметилен оксида, поливинилпирролидона, полиакриламида, полигидроксиэтилакрилата, полигидроксиэтилметакрилата или их сочетаний) (патент WO2018050862A1, дата публикации 19.09.2016). Недостатком данного изобретения является отсутствие подробного протокола получения органоидов из конкретной ткани или органа.

На сегодняшний день не зарегистрировано изобретений, представляющих собой способы культивирования органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи. Между тем, опухоли головы и шеи занимают 6 место в структуре онкологических заболеваний человека (первые три места данного анти-рейтинга принадлежат раку легких, раку молочной железы и колоректальному раку) [1], в 2018 году было зарегистрировано более 890 тысяч новых случаев и около 450 тысяч смертей вследствие данного заболевания. Согласно прогнозам, частота выявлений опухолей органов головы и шеи продолжит расти и составит к 2030 году более 1 млн случаев [8]. Опухоли головы и шеи представлены в основном плоскоклеточным раком (около 90%), для которого характерен быстрый инвазивный рост, активное метастазирование и возможность рецидивов [8]. Одним из возможных методов для выбора наиболее эффективной тактики лечения (лекарственной, волновой, иммунной терапии) может стать получение органоидов из биоптатов опухолевой ткани в рамках концепции персонализированной медицины. Очевидно, что полученные органоиды должны сохранять основные характеристики исходной опухолевой ткани (в том числе экспрессию маркеров стволовых клеток опухолей головы и шеи CD44 и цитокератина 17 [8-10]) и не подвергаться в процессе культивирования воздействию агентов, способных их изменить, в том числе воздействию продуктов ксеногенного происхождения.

Технической задачей изобретения является разработка способа получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи без применения культуральных добавок, в том числе внеклеточного матрикса, ксеногенного происхождения.

Технический результат изобретения состоит в том, что предлагаемый способ обеспечивает получение органоидов из клеток, выделенных из опухолевой ткани органов головы и шеи, при этом способ позволяет отказаться от использования ксеногенных компонентов сред в процессе обработки ткани и получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов).

Для достижения указанного технического результата предложено изобретение, описываемое следующей формулой: биоптат опухоли органов головы и шеи в течение 4 часов после оперативного вмешательства транспортируют в культуральную лабораторию, где материал отмывают от возможных контаминирующих агентов, очищают от тканей перитуморальной области и поврежденных электроножом тканей, замораживают небольшой фрагмент для последующего гистологического исследования, оставшийся материал измельчают с помощью хирургических инструментов и подвергают ферментативной диссоциации в 5-кратном объеме нагретой до 37°С среды, содержащей рекомбинантные протеазы (коллагеназы 1, 2, 4 или аналог трипсина) и ДНКазу, в течение 90 минут при помешивании на орбитальном шейкере при 50 об/мин, после чего суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют буферным раствором в 10 раз, пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм и осаждают центрифугированием при 200g, затем лизируют содержащиеся в суспензии эритроциты специализированным буфером, после чего снова осаждают центрифугированием при 200g, образовавшийся осадок клеток ресуспендируют в 1 мл культуральной среды и оценивают концентрацию и доли живых и мертвых клеток, после чего разбавляют полной культуральной средой, состоящей из DMEM/F12,199 среды или иной бессывороточной среды с необязательным добавлением 25 мМ солей HEPES, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1 × антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% (v/v) аутогенной плазмы и необязательно дополненной иными факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими реактивами), до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием, который помещают в СО₂-инкубатор (стандартные условия 37°С, 5% СО₂, насыщенная влажность), визуально подтверждая полимеризацию фибрина, далее динамику формирования органоидов оценивают с помощью инвертированного микроскопа, получают органоиды и при необходимости сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы, после чего органоиды характеризуют, сравнивая их свойства с исходной опухолевой тканью, из которой они были выделены.

Предложенный способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи включает этап забора биологического материала у пациентов с плоскоклеточным раком органов головы и шеи, этап транспортировки биоматериала из операционного блока в культуральную лабораторию, этап первичной подготовки биоматериала (обработки ткани и ее фрагментации), этап ферментативной диссоциации ткани, этап очищения суспензии клеток от нежелательных примесей, этап 3D культивирования, этап верификации полученных органоидов.

В процессе проведения исследований была установлена значимость следующих принципиальных моментов на различных этапах реализации изобретения:

первичный материал транспортируют из оперативного блока в культуральную лабораторию в срок не более 4 часов при хранении материала при +4°С в транспортной среде, т.к. при большем сроке хранения повышается вероятность гибели части клеток и изменения исходного соотношения клеточных субпопуляций опухоли;

для предотвращения возможной контаминации ткань трижды промывают в растворе ЭДТА, затем аналогичным образом в растворе антибиотика-антимикотика, после чего трижды отмывают от реагентов в буферном растворе (растворе Хенкса или аналогичном);

в случае использования электрохирургического метода разъединения тканей (электроножа) биоматериал тщательно очищают от обугленных участков, т.к. они могут содержать токсичные продукты распада;

опухолевую ткань максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области (соединительной, мышечной, жировой), т.к. их присутствие значимо увеличивает время ферментативной диссоциации, что негативно сказывается на выживаемости клеток;

для ферментативной диссоциации ткани используют animal-free реагенты - рекомбинантные коллагеназы (в этом случае для обеспечения стабильной протеазной активности ферментов в раствор добавляют 5 мМ Са⁺⁺) или рекомбинантный трипсин, либо их комбинацию, дополнительно используют рекомбинантную ДНКазу для разрушения длинных нитей ДНК, попадающих в раствор из клеток с разрушенными мембранами и повышающих его вязкость;

непосредственно перед использованием диссоциирующий раствор подогревают до 37°С для достижения температурного оптимума ферментов;

объем диссоциирующего раствора превышает объем материала в 5 раз, т.к. такое соотношение является достаточным для эффективного выделения клеток из ткани;

ферментативную диссоциацию проводят при 37°С в условиях постоянного перемешивания на орбитальном шейкере с минимальной скоростью 50 об/мин, т.к. такой режим является наиболее щадящим и предотвращает повреждение клеточных мембран;

процесс ферментативной обработки ткани не должен превышать 90 минут, т.к. более длительная инкубация приводит к значительному падению жизнеспособности выделяемых клеток;

суспензию изолированных из ткани клеток разбавляют буферным раствором (раствором Хенкса или аналогичным) в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм, т.к. такая фильтрация позволяет избавиться от недиссоциировавших фрагментов ткани, но оставляет в растворе небольшие конгломераты из нескольких клеток, которые допустимо использовать в дальнейшей работе;

суспензию клеток после отмывания от ферментов дополнительно инкубируют в буфере, лизирующем эритроциты, т.к. примесь эритроцитов значительно снижает эффективность образования органоидов из целевых клеток опухолевой ткани за счет физического препятствия взаимодействию клеток в суспензии;

для осаждения клеток используют щадящий режим центрифугирования (200g) для предотвращения дополнительного повреждения клеточных мембран;

концентрацию клеток в суспензии определяют с помощью счетчика и анализатора жизнеспособности клеток, после чего переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием из расчета 100 тысяч живых клеток в 1 мл, т.к. меньшая концентрация приведет к низкой эффективности образования органоидов, а при более высокой концентрации происходит быстрое истощение культуральной среды;

в качестве культуральной среды используют DMEM/F12, либо 199 среду, либо иную бессывороточную культуральную среду, которая может быть дополнена натриевой солью HEPES для увеличения буферной емкости, а также факторами роста (преимущественно FGF и EGF или иными), ингибиторами BMP (преимущественно Noggin или иными), ингибиторами SMAD-сигнального пути (преимущественно А83-01 или иными), ингибиторами Rho-киназы (преимущественно Y-27632 или иными), активаторами Wnt-сигнального пути (преимущественно R-Spondin 1-4, CHIR99021 или иными), либо иными культуральными добавками, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода;

в культуральную среду вносят 2% (v/v) аутогенной плазмы, полученной от донора опухолевой ткани, при этом при 37°С в течение 30 минут происходит полимеризация фибрина с образованием геля, который обеспечивает активную миграцию клеток в трехмерной сети фибриновых волокон с формированием органоидов, состоящих из различных клеточных субпопуляций, выделенных из исходной опухолевой ткани;

после культивирования в течение нескольких суток сформировавшиеся органоиды могут быть извлечены для исследования либо перенесены в более вязкий матрикс на основе культуральной среды, содержащей 25% (v/v) аутогенной плазмы.

Только строгое соблюдение всех указанных особенностей процесса позволяет эффективно выделять клетки с высокой жизнеспособностью из опухолевой ткани органов головы и шеи и получать из них органоиды, не используя при этом культуральные добавки (в том числе внеклеточный матрикс) ксеногенного происхождения.

Возможность объективного достижения технического результата при использовании изобретения подтверждена данными, приведенными в примере, представляющем собой протокол выделения клеток из опухолевой ткани органов головы и шеи с последующим получением из них трехмерных клеточных конструктов (органоидов) (пример 1), а также в примере, содержащем сведения экспериментального характера, касающиеся характеристики органоидов, полученных с использованием представленного в примере 1 протокола (пример 2).

Изобретение поясняется чертежом, где на рисунке 1 представлен внешний вид органоидов, полученных по протоколу из примера 1, на рисунке 2 представлены данные о соответствии морфологического строения органоида и исходной опухолевой ткани, на рисунке 3 представлены данные о сохранении в органоиде стволовых клеток опухоли, имеющих те же фенотипические признаки, что и в исходной опухолевой ткани, и таблицей 1, в которой представлены данные о донорах опухолевой ткани, из которых были успешно получены органоиды по протоколу из примера 1.

Пример 1. Протокол получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов) из опухолевой ткани органов головы и шеи

1. Транспортировка биоптата опухолевой ткани в культуральную лабораторию

Биопсийный материал помещают в пробирку, содержащую бессывороточную среду (DMEM/F12, F12, 199 среда) с добавлением 1 × антибиотика-антимикотика, охлажденную до +4°С. Дополнительно у донора забирают кровь в вакуумную систему типа Vacuette® с цитратом натрия. Пробирки маркируют, в вертикальном положении помещают в медицинский термоконтейнер и в срок строго не более 4 часов транспортируют в культуральную лабораторию.

2. Первичная обработка биоматериала

Материал тщательно отмывают от возможных контаминирующих агентов в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,02% ЭДТА (растворе Версена), затем в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 × антибиотик-антимикотик, затем в фосфатно-солевом буфере или растворе Хенкса без добавок. В каждом растворе ткань промывают 3 раза. Затем опухолевую ткань с помощью хирургических инструментов максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области (соединительной, мышечной, жировой), а также участков обугленной при использовании электроножа ткани. Оставшийся материал еще раз промывают в фосфатно-солевом буфере или растворе Хенкса без добавок, небольшой фрагмент замораживают для дальнейшего гистологического исследования, основную часть измельчают с помощью ножниц.

3. Ферментативная диссоциация опухолевой ткани

Диссоциирующий раствор готовят непосредственно перед использованием. В культуральную среду DMEM/F12 или 199 среду добавляют рекомбинантные коллагеназы 1 и 4 (либо 1, 2 и 4) до концентрации 1 мг/мл, дополненные 5 мМ Са⁺⁺(из раствора СаСl₂), либо в указанные среды добавляют 10% (v/v) рекомбинантной протеазы TrypLE™ Select Enzyme (10×). Дополнительно в диссоциирующий раствор вносят ДНКазу до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Перед использованием готовый раствор подогревают на водяной бане до 37°С. В пробирку вносят измельченную ткань и добавляют 5-кратный объем диссоциирующего раствора. Инкубацию проводят при 37°С в условиях постоянного перемешивания с помощью орбитального шейкера (режим 50 об/мин). Инкубацию останавливают после диссоциации всех визуализируемых фрагментов ткани либо через 90 минут после начала.

4. Подготовка выделенной суспензии клеток к культивированию

Суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют раствором Хенкса или фосфатно-солевым буфером в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм, после чего осаждают центрифугированием при 200g. Клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл раствора Хенкса, добавляют 10-кратный объем лизирующего эритроциты буфера и инкубируют в соответствии с протоколом, предлагаемым производителем, после чего снова осаждают центрифугированием при 200g. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл полной культуральной среды, отбирают аликвоту суспензии для оценки концентрации и долей живых и мертвых клеток с помощью автоматического счетчика и анализатора жизнеспособности клеток.

5. Получение органоидов в условиях 3D культивирования

Готовят полную культуральную среду на основе DMEM/F12, 199 среды или иной бессывороточной среды (допустимо добавление 25 мМ солей HEPES), содержащей 2 мМ L-глутамина, 1 × антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% (v/v) аутогенной плазмы. Также среда может быть дополнена иными культуральными добавками, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода (факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими).

Для получения аутогенной плазмы пробирки с кровью центрифугируют при 300g в течение 5 минут при 18°С. Плазму разделяют на аликвоты по 1 мл, часть используют для приготовления среды, оставшуюся часть хранят при температуре ниже -25°С и используют по мере необходимости (допустимый срок хранения составляет 36 месяцев).

Суспензию клеток разбавляют полной культуральной средой до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием. Культуральную посуду помещают в СО₂-инкубатор (стандартные условия 37°С, 5% СО₂, насыщенная влажность), через 30 минут визуально подтверждают полимеризацию фибрина. Динамику формирования органоидов оценивают с помощью инвертированного микроскопа каждые 24 часа. При необходимости сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы.

6. Верификация полученных органоидов

Для характеристики исходной опухолевой ткани изготавливают криосрезы, которые затем окрашивают гематоксилином-эозином (для получения обзорных препаратов) либо с антителами к специфическим маркерам опухоли (CD44, цитокератин 17 и др.).

Для характеристики органоидов используют аналогичные методы окрашивания криосрезов или иные методы исследований в зависимости от поставленных задач.

Пример 2. Характеристика органоидов, полученных с использованием представленного в примере 1 Протокола получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов) из опухолевой ткани органов головы и шеи

При использовании протокола, представленного в примере 1, были успешно получены органоиды из опухолевой ткани от 5 доноров (таблица 1).

Динамика формирования органоидов представлена на рисунке 1.

В качестве примера верификации приведена сравнительная характеристика биоптата опухолевой ткани от донора (мужчины 58 лет) с плоскоклеточным раком гортани и органоидов, полученных из данной ткани в соответствии с протоколом, представленным в примере 1.

При исследовании ткани была выявлена характерная для плоскоклеточного рака (плоскоклеточной карциномы) гистологическая картина: обильный инвазивный рост плоскоклеточного эпителия, представленного крупными клетками с эозинофильной цитоплазмой, формирующего округлые скопления и окруженного рыхлой волокнистой соединительной тканью стромы. Органоиды, полученные из данной ткани, имели сходное строение: скопления крупных эпителиальных клеток с эозинофильной цитоплазмой, разделенные тяжами стромальных клеток (рисунок 2).

Иммуногистохимическое окрашивание подтвердило экспрессию эпителиальными клетками интегрального клеточного гликопротеина CD44 и цитокератина 17, маркеров опухолевых клеток органов головы и шеи (рисунок 3).

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают соответствие основных свойств (морфологическое строение, клеточный состав) опухолевой ткани органов головы и шеи и получаемых из нее органоидов, что свидетельствуют о высокой эффективности предложенного изобретения.

Список литературы

1. World Health Organization. (2020). WHO report on cancer: setting priorities, investing wisely and providing care for all. World Health Organization. https://apps.who.int/iris/handle/10665/330745.

2. Fogel DB. Factors associated with clinical trials that fail and opportunities for improving the likelihood of success: A review. Contemp.Clin. Trials Commun. 2018, 11:156-164.

3. Gillet JP, Varma S, Gottesman MM. The Clinical Relevance of Cancer Cell Lines. J. Natl. Cancer Inst. 2013, 105:452-458.

4. Hinshaw DC, Shevde LA. The tumor microenvironment innately modulates cancer progression. Cancer Res. 2019, 79:4557-4566.

5. Olson B, Li Y, Lin Y, Liu ET, Patnaik A. Mouse Models for Cancer Immunotherapy Research. Cancer Discov. 2018, 8:1358-1365.

6. Gunti S, Hoke A, Vu K, London N. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers. 2021, 13(4):874.

7. Kaur S, Kaur I, Rawal P, Tripathi DM, Vasudevan A. Non-matrigel scaffolds for organoid cultures. Cancer Letters. 2021, 504: 58-66.

8. Johnson DE, Burtness B, Leemans CR, Lui V, Bauman J, Grandis J. Head and neck squamous cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2020, 6:92.

9. Chen J, Zhou J, Lu J, Xiong H, Shi X, Gong 1. Significance of CD44 expression in head and neck cancer: a systemic review and meta-analysis. BMC Cancer. 2014, 14:15.

10. Kiani MN, Asif M, Ansari FM, Ara N, Ishaque M, Khan AR. Diagnostic utility of Cytokeratin 13 and Cytokeratin 17 in Oral Epithelial Dysplasia and Oral Squamous Cell Carcinoma. APJCB. 2020, 5(4).

Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи

Изобретение относится к биотехнологии, клеточной биологии и медицине, в частности к способу получения трёхмерных клеточных органоидов из плоскоклеточных опухолей органов головы и шеи. Для осуществления указанного способа первичный материал транспортируют из оперативного блока в культуральную лабораторию в срок не более 4 часов при хранении материала при +4°С в транспортной среде. Далее ткань трижды промывают в растворе ЭДТА, затем аналогичным образом в растворе антибиотика-антимикотика, после чего трижды отмывают от реагентов в буферном растворе. Опухолевую ткань максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области. Для ферментативной диссоциации ткани в течение 60-90 минут при 37°С в условиях постоянного перемешивания на орбитальном шейкере с минимальной скоростью 50 об/мин используют рекомбинантные коллагеназы или рекомбинантный трипсин, либо их комбинацию, дополнительно используют рекомбинантную ДНКазу. Объем диссоциирующего раствора превышает объем материала в 5 раз. Суспензию изолированных из ткани клеток разбавляют буферным раствором в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм. В качестве культуральной среды используют DMEM/F12, либо 199 среду, необходимую для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода. В культуральную среду вносят 2% v/v аутогенной плазмы, полученной от донора опухолевой ткани. После культивирования в течение нескольких суток сформировавшиеся органоиды могут быть извлечены для исследования либо перенесены в более вязкий матрикс на основе культуральной среды, содержащей 25% v/v аутогенной плазмы. Настоящее изобретение позволяет получить органоиды из опухолевой ткани органов головы и шеи. 3 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи, характеризующийся тем, что биоптат опухоли органов головы и шеи в течение 4 часов после оперативного вмешательства транспортируют в культуральную лабораторию, где материал три раза промывают в растворе ЭДТА, три раза в растворе антибиотика-антимикотика, три раза отмывают от реагентов в растворе Хенкса, очищают от тканей перитуморальной области и поврежденных электроножом тканей, после чего замораживают небольшой фрагмент для последующего гистологического исследования, а оставшийся материал измельчают с помощью хирургических инструментов и подвергают ферментативной диссоциации в 5-кратном объеме нагретой до 37°С среды, содержащей ДНКазу и рекомбинантые коллагеназы 1 и 4 или 1, 2, 4 или рекомбинантный трипсин в течение 60-90 минут при помешивании на орбитальном шейкере при 50 об/мин, после чего суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют раствором Хенкса в 10 раз, пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм и осаждают центрифугированием при 200g, затем лизируют содержащиеся в суспензии эритроциты специализированным буфером и снова осаждают центрифугированием при 200g, после чего образовавшийся осадок клеток ресуспендируют в 1 мл культуральной среды, оценивают концентрацию и доли живых и мертвых клеток, разбавляют полной культуральной средой, состоящей из DMEM/F12 или 199 среды, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1× антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% v/v аутогенной плазмы и необязательно дополненной иными факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими реактивами, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода, до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием, который помещают в СO₂-инкубатор, обеспечивающий 37°С, 5% СО₂ и насыщенную влажность, визуально подтверждая полимеризацию фибрина и оценивая динамику формирования органоидов с помощью инвертированного микроскопа, после чего в течение 2-3 суток сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы, после чего органоиды характеризуют, сравнивая их свойства с исходной опухолевой тканью, из которой они были выделены.