Ссылка на список последовательностей, таблицу или компьютерную программу

[0001] Список последовательностей, одновременно представленный в соответствии с § 1.821 раздела 37 Свода федеральных нормативных актов США в машиночитаемой форме (CRF) через EFS-Web, как файл с именем KALSEC_75_PCT_SEQ_LISTING.txt, включен в настоящее описание путем ссылки. Электронная копия Списка последовательностей была создана 25 сентября 2019 года с размером файла 259 килобайт.

Область техники, к которой относится изобретение

[0002] Настоящее изобретение относится к способу получения горького компонента пива посредством катализируемой ферментами биоконверсии изо-альфа-кислот, полученных из хмеля, в дигидро- (rho)-изо-альфа-кислоты. Дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты обладают превосходными характеристиками, улучшающими их применимость в качестве добавки к напитку. Потребители могут предпочесть дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты, полученные с помощью данного способа, который не требует использования агрессивных химических реагентов и использует ферменты, которые могут встречаться в природе.

Уровень техники изобретения

[0003] Традиционные способы придания горечи пиву используют цельный свежий хмель, цельный сушеный хмель или гранулы хмеля, добавленные во время кипячения в котле. Экстракты хмеля, полученные путем экстрагирования хмеля сверхкритическим диоксидом углерода, или изомеризованные гранулы хмеля, полученные путем нагревания хмеля в присутствии катализатора, являются более поздними инновациями в получении горького компонента, которые также были приняты пивоварами. Гранулы хмеля также могут быть добавлены позже в процессе пивоварения, а в случае сухого охмеления хмель добавляется в готовое пиво перед фильтрацией. Эти способы имеют в качестве недостатков низкий уровень использования горьких соединений, присутствующих в хмеле, что неблагоприятно сказывается на стоимости. Пиво или другие солодовые напитки, произведенные таким образом, нестабильны на свету и должны быть упакованы в темно-коричневые бутылки или банки или помещены в темное место во избежание индуцированного светом образования 3-метил-2-бутен-1-тиола (3-МБТ), который дает ярко выраженный «засвеченный» или выдохшийся аромат. Помещение бутылок в картонные коробки или полное оборачивание их светонепроницаемой или светофильтрующей бумагой, фольгой или пластиковыми покрытиями является еще одним дорогостоящим способом защиты этих напитков от выдохшегося на свету вкуса и аромата.

[0004] Горечь в пиве, сваренном традиционным способом, в первую очередь связана с изо-альфа-кислотами. Эти соединения образуются в процессе пивоварения в результате изомеризации гумулонов, которые являются естественными соединениями в лупулиновых железах хмеля. Следствием этого, учитывая естественную нестабильность изо-альфа-кислот по отношению к фотохимическим реакциям в пиве, является то, что напиток склонен к образованию характерного привкуса или неприятного запаха.

[0005] Полностью светлое стабильное пиво или другие солодовые напитки можно приготовить с использованием так называемых усовершенствованных или модифицированных кислот хмеля. Пиво, приготовленное с использованием этих горьких компонентов, может быть упаковано в бутылки из бесцветного стекла, не опасаясь образования неприятного запаха. Дигидро- (rho)-изо-альфа-кислоты являются продуктами восстановления изо-альфа-кислот, которые светостабильны. На сегодняшний день эти соединения в природе не обнаружены. Традиционно часть изо-альфа-кислот, которая отвечает за фотохимические процессы, изменялась восстановлением карбонильной группы с использованием боргидрида натрия.

[0006] Боргидрид натрия представляет собой неорганическое соединение, которое можно использовать для восстановления кетонов. Оно чрезвычайно опасно при попадании на кожу, в глаза, вдыхании или проглатывании, при пероральной LD50 160 мг/кг (для крыс). Боргидрид натрия также легко воспламеняется, вызывает коррозию и чрезвычайно активен по отношению к окислителям, кислотам, щелочам и влаге (боргидрид натрия; MSDS No.S9125; Sigma-Aldrich Co.: Saint Louis, MO, 01 ноября 2015 г.).

[0007] Потребители все чаще отдают предпочтение натуральным материалам перед синтетическими или полусинтетическими. Таким образом, существует потребность не только в создании композиций, использующих натуральные материалы в качестве горьких компонентов для пива и других напитков, но также в способах более естественного производства указанных материалов.

[0008] Биокаталитическое производство представляет собой новую технологию, которая обеспечивает высокоселективное, безопасное, чистое и масштабируемое производство ценных химических соединений. Биокаталитическое производство основано на природных ферментах, которые заменяют химические катализаторы.

[0009] Ферменты представляют собой встречающиеся в природе белки, способные катализировать определенные химические реакции. В природе существуют ферменты, которые в настоящее время способны заменять химические катализаторы при получении модифицированных соединений горечи хмеля (Robinson, P.K., Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays Biochem 2015, 59, 1-41).

[0010] Гумулон представляет собой естественный вторичный метаболит, который может подвергаться воздействию грибов и бактерий, сосуществующих с растением Humulus lupulus. Возможно, что обитающие в почве и растениях грибы и бактерии обладают ферментами, способными модифицировать гумулон в целях детоксикации или удаления. Кроме того, в организмах могли возникнуть ферменты для модификации гумулоноподобных молекул, но из-за неизбирательной активности эти ферменты обладают активностью в отношении представляющих интерес соединений, изо-альфа-кислот (Hult, K.; Berglund, P., Enzyme promiscuity: mechanism and applications. Trends Biotechnol. 2007, 25 (5), 231-238; Nobeli, I.; Favia, A. D.; Thornton, J. M., Protein promiscuity and its implications for biotechnology. Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 157-167).

[0011] Ферменты, которые катализируют реакции окисления/восстановления, то есть перенос атомов или электронов водорода и кислорода от одного вещества к другому, в целом классифицируются как оксидоредуктазы. Более конкретно, ферменты, восстанавливающие кетонные группы до гидроксильных групп, известны как кеторедуктазы или карбонилредуктазы и зависят от добавления экзогенного источника восстанавливающих эквивалентов (например, кофакторов НАДН, НАДФН). В соответствии с существующим названием охарактеризованных здесь ферментов, эти ферменты будут называться «кеторедуктазами».

[0012] Затраты по использованию дорогих кофакторов (НАДН, НАДФН) могут быть снижены путем включения дополнительных ферментов и субстратов для рециклирования кофакторов, например, глюкозодегидрогеназы и глюкозы, или путем использования кеторедуктазы, которая также способна окислять дешевое и естественный сырье, такое как этанол.

[0013] Существует много примеров применения ферментов в пивоварении и их благоприятного влияния на конечные свойства пива (Pozen, M., Enzymes in Brewing. Ind. Eng. Chem, 1934, 26 (11), 1127-1133.). Известно, что присутствие дрожжевых ферментов при естественном брожении пива приводит к образованию соединений, влияющих на вкус и аромат конечного напитка (Praet, T.; Opstaele, F.; Jaskula-Goiris, B.; Aerts, G.; De Cooman, L., Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation. Cerevisia, 2012, 36, 125-132.). Экзогенно добавленные ферменты обеспечивают различные улучшения процесса пивоварения, такие как снижение вязкости, увеличение количества сбраживаемых сахаров, защита от холода и осветление (Wallerstein, L. (1947) Bentonite and Proteolytic Enzyme Treatment of Beer, US Patent 2,433,411.; Ghionno, L.; Marconi, O.; Sileoni, V.; De Francesco, G.; Perretti, G., Brewing with prolyl endopeptidase from Aspergillus niger: the impact of enzymatic treatment on gluten levels, quality attributes, and sensory profile. Int. J. Food Sci. Technol, 2017, 52 (6), 1367-1374.). Кроме того, экстракты хмеля специально предварительно обрабатывали ферментами для модификации ароматических соединений, полученных из хмеля (Gros, J.; Tran, T.T. H.; Collin, S., Enzymatic release of odourant polyfunctional thiols from cysteine conjugates in hop. J. Inst. Brew. 2013, 119 (4), 221-227).

[0014] Однако до настоящего изобретения ферменты, способные катализировать восстановление изо-альфа-кислот до дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот, не наблюдались в природе и, таким образом, не были описаны в литературе. Раскрытый в настоящем изобретении способ представляет собой новую ферментативную реакцию.

Задача изобретения

[0015] Задачей настоящего изобретения является создание способа ферментативного получения дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот, модифицированного варианта природных горьких веществ, полученных из растения хмеля. Настоящий способ разработан для замены существующих производственных процессов, в которых используется химический реагент, боргидрид натрия.

Сущность изобретения

[0016] Настоящее изобретение относится к способу, который можно масштабировать до промышленных уровней для биоконверсии изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты, которые затем можно использовать в качестве природного и светостабильного горького компонента для напитков.

[0017] В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу высокопроизводительной биоконверсии изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты с использованием фермента кеторедуктазы или микроорганизма, экспрессирующего ген, кодирующий указанную кеторедуктазу.

[0018] В другом аспекте настоящее изобретения относится к такому способу получения дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот, где способ проводят в водной системе с мягкими условиями температуры и pH, что делает его экологически безопасным производственным процессом.

[0019] В одном варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает добавление к смеси изо-альфа-кислот очищенного фермента кеторедуктазы и НАДФН или НАДФ с последующей инкубацией до получения желаемого выхода.

[0020] В другом варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает добавление к смеси изо-альфа-кислот очищенного фермента кеторедуктазы и НАДФН или НАДФ в присутствии изопропанола для рециклирования кофактора с последующей инкубацией до получения желаемого выхода.

[0021] В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрация изо-альфа-кислот, то есть субстрата, является максимальной для увеличения объемной производительности биоконверсии.

[0022] В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрация кофактора НАДФН или НАДФ в смеси минимизирована для улучшения экономических показателей биоконверсии.

[0023] В одном варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает добавление к смеси изоальфа-кислот очищенного фермента кеторедуктазы и НАДФН или НАДФ в присутствии другого фермента (такого как глюкозодегидрогеназа) для рециклирования кофактора с последующей инкубацией до получения желаемого выхода.

[0024] В другом варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает добавление к смеси изо-альфа-кислот цельноклеточного биокатализатора с последующей инкубацией до получения желаемого выхода, где цельноклеточный биокатализатор представляет собой иммобилизованный микроорганизм, экспрессирующий ген, кодирующий кеторедуктазу.

[0025] В другом варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает обеспечение растущего микроорганизма, экспрессирующего ген, кодирующий кеторедуктазу, изо-альфа-кислотой.

[0026] В другом варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты включает добавление к экстракту альфа-кислот термостабильного фермента кеторедуктазы, где смесь нагревают и инкубируют до желаемого выхода дигидро-(rho)-изо-альфа кислот.

[0027] В другом варианте осуществления настоящего изобретения кеторедуктаза, используемая в способе настоящего изобретения, преимущественно восстанавливает карбонильную группу в боковой цепи у C(4) изо-альфа-кислот, превращая светочувствительную ацилоиновую группу во вторичный спирт с получением светостабильного производного изо-альфа-кислоты (Фигура 1).

[0028] В другом варианте осуществления настоящего изобретения кеторедуктаза, используемая в способе настоящего изобретения, катализирует предпочтительно в минимальной степени или вообще не катализирует восстановление любого конкретного члена из шести основных изо-альфа-кислот: цис-изогумулона, транс-изогумулона, цис-изокогумулона, транс-изокогумулона, цис-изоадгумулона и транс-изоадгумулона.

[0029] В другом варианте осуществления изобретения кеторедуктаза, используемая в способе настоящего изобретения, специфично восстанавливает цис-изогумулон, цис-изокогумулон и цис-изоадгумулон.

[0030] В другом варианте осуществления настоящего изобретения кеторедуктаза, используемая в способе настоящего изобретения, специфично восстанавливает транс-изогумулон, транс-изокогумулон и транс-изоадгумулон.

[0031] В другом варианте осуществления настоящего изобретения смесь 2 или более ферментов кеторедуктазы, проявляющих указанную выше субстратную специфичность, используется в способе настоящего изобретения для восстановления смеси цис- и транс-изо-альфа-кислот до их соответствующих дигидро-изо-альфа-кислот.

[0032] В другом варианте осуществления настоящего изобретения смесь 2 или более ферментов кеторедуктазы, проявляющих субстратную специфичность, может быть добавлена к реакционной смеси для получения уникальной смеси дигидро-изо-альфа-кислот, которая отличается от смеси, производимой химическими восстановителями, такими как борогидрид натрия.

[0033] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, как определено выше, где коммерчески доступная кеторедуктаза выбрана из KRED-P1-B05, KRED-P2-B02, KRED-P2-C02, KRED-P2-C11, KRED-P2-D11, KRED-P2-G03, KRED-P2-G09, KRED-101, KRED-119, KRED-130, KRED-NADH-110, KRED-430, KRED-431, KRED-432, KRED-433, KRED-434, KRED-435 и KRED-436.

[0034] В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ферменту кеторедуктаза, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 100. , SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146 или SEQ ID NO: 158.

[0035] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, как определено выше, где фермент кеторедуктаза или микроорганизм, экспрессирующий ген, кодирующий фермент кеторедуктазу, может необязательно иметь одно или несколько различий в аминокислотных остатках по сравнению с ферментом кеторедуктаза, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146 или SEQ ID NO: 158.

[0036] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, как определено выше, где кеторедуктаза на 99, 95, 90, 85, 80, 75 или 70 процентов гомологична ферменту кеторедуктаза, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146 или SEQ ID NO: 158.

Краткое описание чертежей

[0037] На Фигуре 1 показано катализируемое ферментом восстановление репрезентативного эпимера изо-альфа-кислот.

[0038] На Фигуре 2 показана СВЭЖХ-хроматограмма для Codexis KRED-P1-B05 (SEQ ID NO: 4), инкубированной с изо-альфа-кислотами (кислый раствор) в течение 48 часов при температуре 30°C.

[0039] На Фигуре 3 показана ВЭЖХ-хроматограмма и количественное определение пика для Codexis KRED-P1-B05 (SEQ ID NO: 4), инкубированной с изо-альфа-кислотами (кислый раствор) в течение 48 часов при температуре 30°C.

[0040] На Фигуре 4 показана СВЭЖХ-хроматограмма для Codexis KRED-433, инкубированной с изо-альфа-кислотами в течение 24 часов при температуре 30°C.

[0041] На Фигуре 5 показана улучшенная активность KRED SEQ ID NO: 80, 104, 100, 136, 116, 132, 162, 150, 152, 144, 146 и 158 при высокой концентрации субстрата и низкой концентрации НАДФ.

Подробное описание изобретения

[0042] В настоящем изобретении фермент кеторедуктаза заменяет функцию боргидрида натрия и позволяет использовать более естественный способ получения добавки к напитку, дигидро-(rho)-изо-альфа кислоты. Фермент может представлять собой любую кеторедуктазу, специфично восстанавливающую кетонную группу до гидроксигруппы любого или всех изомеров изо-альфа-кислоты (ко-, н-ад- и цис/транс-). Фермент может иметь бактериальное, грибное или растительное происхождение, но не ограничивается ими. Фермент может быть кофактор-зависимым (НАДН или НАДФН) или независимым.

[0043] Используемые здесь термины «изо-альфа-кислоты», «изо-альфа-кислоты хмеля» и «изо-альфа-кислоты из хмеля» могут использоваться взаимозаменяемо.

[0044] Раствор изо-альфа-кислоты подвергают ферментативной обработке с использованием очищенного фермента или смеси, содержащей фермент и, при необходимости, дополнительные ферменты для рециклирования кофактора. Количество фермента зависит от параметров инкубации, включая продолжительность, температуру, количество и концентрацию субстрата.

[0045] Альтернативно раствор изо-альфа кислоты подвергают ферментативной обработке с использованием смеси, содержащей микроорганизм, экспрессирующий указанный фермент. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу восстановления изо-альфа-кислот в соответствии с настоящим изобретением, который включает культивирование микроорганизма, продуцирующего кеторедуктазу, при необходимости индуцируя экспрессию кеторедуктазы. Интактные клетки можно собирать и добавлять непосредственно в реакцию вместо выделенного фермента для восстановления изо-альфа-кислот, как описано выше. Кроме того, собранные клетки можно иммобилизовать перед добавлением в реакцию восстановления. Микроорганизм можно культивировать и ферментировать известными способами. Микроорганизм может представлять собой бактерии или грибы.

[0046] Смесь цис- и транс-изо-альфа-кислот можно инкубировать с одной кеторедуктазой, проявляющей способность восстанавливать оба изомера. Альтернативно, смесь цис- и транс-изо-альфа-кислот можно инкубировать с 2 или более кеторедуктазами, проявляющими разную специфичность, если полученный продукт представляет собой смесь цис- и транс-дигидро-изо-альфа-кислот.

[0047] Альтернативно, раствор, содержащий только цис-изо-альфа-кислоты, можно инкубировать с кеторедуктазой, специфичной для цис-изомера, и полученный продукт представляет собой раствор цис-дигидро-изо-альфа-кислот. Раствор, содержащий только цис-дигидро-изо-альфа-кислоты, может обладать желательными свойствами горечи и/или термостабильности.

[0048] Альтернативно, раствор, содержащий только транс-изо-альфа-кислоты, можно инкубировать с кеторедуктазой, специфичной для транс-изомера, и полученный продукт представляет собой раствор транс-дигидро-изо-альфа-кислот. Раствор, содержащий только транс-дигидро-изо-альфа-кислоты, может обладать желательными свойствами горечи.

[0049] Создаваемые для конкретного случая смеси транс- и цис-изо-альфа-кислот можно инкубировать с 1 или несколькими кеторедуктазами, проявляющими переменную субстратную специфичность, для получения уникальных смесей дигидро-изо-альфа-кислот, которые иначе недостижимы.

[0050] Смесь изо-альфа-кислот может быть подвергнута ферментативной реакции с использованием фермента кеторедуктазы в дополнение к ферментам для катализа дополнительных желаемых модификаций, таким как, но без ограничений, дегидрогеназы, изомеразы, гидратазы и лиазы. Ферменты с различной активностью можно комбинировать в реакции в одной емкости или добавлять последовательно.

[0051] Подходящий растворитель для применения при инкубации ферментов включает воду и смеси воды с другим совместимым с ферментом растворителем, таким как этанол или изопропанол. Ферментативная активность улучшается за счет буферизации водных растворов. Буферные агенты включают без ограничений трис(гидроксиметил)аминометан (также известный как Трис), 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновую кислоту (также известную как HEPES), фосфат натрия и фосфат калия.

[0052] Фермент и изо-альфа-кислоты инкубируют в подходящем диапазоне значений pH, например, pH от 6 до 10, и диапазоне температур, например, от 10 до 90°C, и выдерживают при этой температуре в течение достаточного времени для превращения изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты с желаемым выходом. Непрерывное перемешивание обеспечивает постоянную температуру и воздействие фермента на субстрат. Продолжительность реакции, обычно составляет от 24 до 48 часов, и она будет зависеть от количества и концентрации фермента и субстрата, присутствующего растворителя и выбранной температуры.

[0053] Фермент может быть свободным в растворе, иммобилизованным на гранулах или подобных смешиваемых основах или иммобилизованным на пленке или смоле, через которые пропускают раствор изо-альфа-кислот. Уровень чистоты фермента может варьировать от 30 до 90+% в зависимости от способа очистки.

[0054] Фермент может быть удален из конечного продукта путем физической фильтрации или центрифугирования. Фермент также можно инактивировать путем воздействия экстремальной температуры или pH, и он может оставаться в конечном продукте.

[0055] Используемая здесь кеторедуктаза включает коммерчески доступные кеторедуктазы, такие как KRED-P1-B05, KRED-P2-B02, KRED-P2-C02, KRED-P2-C11, KRED-P2-D11, KRED-P2-G03, KRED-P2-G09, KRED-101, KRED-119, KRED-130, KRED-NADH-110, KRED-430, KRED-431, KRED-432, KRED-433, KRED-434, KRED-435 и KRED-436 (доступные от компании Codexis, Inc., Редвуд-Сити, Калифорния). Настоящее изобретение также относится к указанной выше кеторедуктазе, которая включает одно или несколько различий в аминокислотных остатках, а также кеторедуктазе, имеющей 99, 95, 90, 85, 80, 75 и/или 70 процентов гомологии с указанными выше кеторедуктазами.

[0056] Настоящее изобретение также относится к кеторедуктазам, направленно получаемым известными способами мутагенеза, проявляющим переменную активность в отношении одной или смеси изо-альфа-кислот. Некоторые варианты значительно улучшены по устойчивости к субстрату, температуре, устойчивости к растворителям и/или цикличности производственного процесса по сравнению с коммерчески доступными кеторедуктазами.

[0057] Используемые здесь термины «процент гомологии последовательностей», «процент гомологии» и «процент идентичности» относятся к сравнениям между полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями и определяются путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где для оптимального выравнивания двух последовательностей часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пробелы) по сравнению с эталонной последовательностью. Процент рассчитывается путем определения количества положений, в которых или идентичное основание нуклеиновой кислоты, или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, либо основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток выравниваются с пробелом, чтобы получить количество совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательностей. Определение оптимального выравнивания и процента гомологии последовательностей выполняется с использованием алгоритмов BLAST и BLAST 2.0 (см., Например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; и Altschul et al., Nucleic Acids Res. 3389-3402 [1977]). Программное обеспечение для проведения анализа алгоритмом BLAST общедоступно на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации.

Примеры

[0058] Следующие ниже примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Пример 1

Хозяева экспрессии E. coli, содержащие рекомбинантные гены KRED

Гены, кодирующие KRED, клонировали в экспрессионный вектор pCK110900 (см. Фиг.3 в публикации заявки на патент США No.2006/0195947), в функциональной связи с промотором lac под контролем репрессора lac1. Экспрессионный вектор также содержит ориджин репликации P15a и ген устойчивости к хлорамфениколу. Полученные плазмиды трансформировали в E. coli штамм W3110, используя стандартные методы, известные в данной области техники. Трансформанты выделяли, подвергая клетки селекции по устойчивости к хлорамфениколу, как известно в данной области техники (см., например, патент США No.8383346 и Международную патентную заявку WO2010/144103).

Пример 2

Получение осадков сырых клеток, содержащих высокопроизводительные KRED

[0060] Клетки E. coli, содержащие рекомбинантные гены, кодирующие KRED, из моноклональных колоний инокулировали в 190 мкл бульона Луриа-Бертани (LB), содержащего 1% глюкозы и 30 мкг/мл хлорамфеникола, в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов. Планшеты запечатывали O₂-проницаемыми пленками, и культуры выращивали в течение ночи при температуре 20°C, 200 об/мин и влажности 85%. Затем по 20 мкл каждой из клеточных культур переносили в лунки 96-луночных планшетов с глубокими лунками, содержащие 380 мкл среды TB и 30 мкг/мл хлорамфеникола (CAM). Планшеты с глубокими лунками запечатывали O₂-проницаемыми пленками и инкубировали при температуре 30°C, 250 об./мин и влажности 85% до достижения ОП₆₀₀ 0,6-0,8. Затем клеточные культуры индуцировали добавлением изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение ночи в тех же условиях, что и первоначально. Затем клетки осаждали центрифугированием при температуре 4°C, 4000 об./мин в течение 10 мин. Супернатанты удаляли, а осадок замораживали при температуре -80°C перед лизисом.

Пример 3

Получение клеточных лизатов, содержащих высокопроизводительные KRED

[0061] Сначала осадки клеток, которые были получены, как описано в Примере 2, лизировали путем добавления 150 мкл лизирующего буфера, содержащего 100 мМ триэтаноламина*H₂SO₄ с pH 8 и 2 мМ MgSO₄ или 100 мМ фосфата калия pH 8 и 2 мМ MgSO₄, 1 г/л лизоцима и 0,5 г/л сульфата полимиксина B (PMBS). Затем осадки клеток встряхивали при комнатной температуре в течение 2 часов на настольном шейкере. Планшеты центрифугировали при 4000 об./мин в течение 15 минут при температуре 4°C для удаления остатков клеток. Затем супернатанты использовали в биокаталитических реакциях для определения уровней их активности.

Пример 4

Получение лиофилизированных лизатов из культур во встряхиваемой колбе (SF)

[0062] Процедуры встряхивания колб могут быть использованы для создания порошков сконструированных полипептидов KRED в встряхиваемых колбах (SFP), которые подходят для вторичных скрининговых анализов и/или использования в биокаталитических процессах, описанных здесь. Получение ферментов в порошке во встряхиваемой колбе (SFP) обеспечивает получение более чистого препарата (например, до 30% общего белка) сконструированного фермента по сравнению с клеточным лизатом, используемым в высокопроизводительных анализах (HTP), а также позволяет использовать более концентрированные растворы ферментов. Для начала выбранные культуры HTP, выращенные, как описано выше, помещали на чашки с агаром LB с 1% глюкозы и 30 мкг/мл САМ и выращивали в течение ночи при температуре 37°C. Отдельную колонию из каждой культуры переносили в 6 мл среды LB с 1% глюкозы и 30 мкг/мл САМ. Культуры выращивали в течение 18 часов при температуре 30°C при встряхивании 250 об./мин и пересевали в соотношении приблизительно 1:50 в 250 мл среды ТВ, содержащей 30 мкг/мл САМ, до конечной ОП₆₀₀ 0,05. Культуры выращивали в течение приблизительно 3 часов при температуре 30°C при встряхивании 250 об./мин до ОП₆₀₀ от 0,8 до 1,0 и индуцировали 1 мМ IPTG. Затем культуры выращивали в течение 20 ч при температуре 30°C при встряхивании 250 об./мин. Культуры центрифугировали (4000 об./мин, 20 мин при температуре 4°C). Супернатант удаляли, и осадки ресуспендировали в 35 мл 50 мМ фосфата калия, pH 8, с 2 мМ MgSO₄. Повторно суспендированные клетки центрифугировали (4000 об./мин в течение 20 минут при температуре 4°C). Супернатант удаляли, осадки ресуспендировали в 6 мл 50 мМ фосфата калия pH 8 с 2 мМ MgSO₄, и клетки лизировали с использованием дезинтегратора клеток от Constant Systems (One Shot). Лизаты осаждали (10000 об./мин в течение 60 мин при температуре 4°C), а супернатанты замораживали и лиофилизировали для получения ферментов во встряхиваемой колбе (SF).

Пример 5

Скрининг коммерчески доступной панели ферментов KRED

Скрининговый анализ KRED

[0063] Набор коммерчески доступных кеторедуктаз протестировали на их способность восстанавливать изо-альфа-кислоты с использованием коммерчески доступных «Наборов реагентов для скрининга KRED» (Codexis Inc., Редвуд-Сити, Калифорния). Для части ферментов в этом скрининге ферментный анализ проводили в пробирках объемом 1,5 мл с общим объемом 1000 мкл на пробирку, которые содержали 10 г/л порошка фермента, 2,9 или 6,9 г/л субстрата изо-альфа-кислот и 0,8 г/л НАДФ в 30 об.% изопропанола (IPA) в 128 мМ фосфате натрия pH 7 с 1,7 мМ MgSO₄. Пробирки закрывали и инкубировали при температуре 30°C со встряхиванием при 180 об./мин в течение 24-48 часов. Полученную реакционную смесь фильтровали для удаления фермента с использованием устройства для центробежной фильтрации с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 10000. Изо-альфа-кислоты и дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты определяли количественно с помощью СВЭЖХ. См., например, хроматограмму Codexis KRED-433, представленную на Фигуре 4.

[0064] Для другой части ферментов в этом скрининге ферментный анализ проводили в пробирках объемом 1,5 мл, в общем объеме 1000 мкл на пробирку, которые содержали 10 г/л порошка фермента, 1,5 г/л субстрата изо-альфа-кислот, 0,8 г/л НАДФ, 0,7 г/л НАД, 14,4 г/л D-глюкозы и 4,3 Ед/мл глюкозодегидрогеназы в 263 мМ фосфате натрия pH 7 с 1,7 мМ MgSO₄. Пробирки закрывали и инкубировали при температуре 30°C со встряхиванием при 180 об./мин в течение 24-48 часов. Полученную реакционную смесь фильтровали для удаления фермента с использованием устройства для центробежной фильтрации с MWCO 10000. Изо-альфа-кислоты и дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты определяли количественно с помощью СВЭЖХ.

Анализ характеристик кеторедуктаз

[0065] Кеторедуктазы, продуцирующие детектируемые количества дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот, были дополнительно охарактеризованы в различных условиях реакции. С этой целью ферментные анализы проводили в пробирках объемом 2,0 мл, в общем объеме 1000 мкл на пробирку, которые содержали 10-20 г/л порошка фермента, 1,5-6,0 г/л субстрата изо-альфа-кислот, 0,8 г/л НАДФ. (необязательно 0,7 г/л НАД, 14,4 г/л D-глюкозы, 4,3 Ед/мл глюкозодегидрогеназы или 30 об.% изопропанола) в 100-263 мМ фосфате натрия с pH 7-9 (или, альтернативно, Трис-HCl) с 1,7 мМ MgSO₄. Пробирки закрывали и инкубировали при температуре 30-40°C со встряхиванием при 180 об./мин в течение 24-48 часов. Полученные реакционные смеси фильтровали для удаления фермента. Изо-альфа-кислоты и дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты определяли с помощью СВЭЖХ-тандемной масс-спектрометрии и ВЭЖХ.

Результаты

Результаты скрининга KRED

[0066] Некоторые коммерчески доступные ферменты из «Наборов реагентов для скрининга KRED» Codexis способны восстанавливать изо-альфа-кислоты (Таблица 1). Исходный набор состоял из 24 кеторедуктаз (называемых KRED), которые были отобраны (то есть натуральные) или разработаны производителем для широкого диапазона субстратов и повышенной активности. Дополнительный набор состоял из 7 вариантов, сконструированных на основе KRED-130.

Таблица 1. Результаты коммерчески доступной панели ферментов KRED Фермент кеторедуктаза Обнаружены ли Rho?¹ KRED-P1-A04 - KRED-P1-A12 - KRED-P1-B02 - KRED-P1-B05 + KRED-P1-B10 - KRED-P1-B12 - KRED-P1-C01 - KRED-P1-H08 - KRED-P2-B02 + KRED-P2-C02 + KRED-P2-C11 + KRED-P2-D03 - KRED-P2-D11 + KRED-P2-D12 - KRED-P2-G03 + KRED-P2-H07 - KRED-P3-B03 - KRED-P3-G09 + KRED-P3-H12 - KRED-101 + KRED-119 + KRED-130 + KRED-NADH-101 - KRED-NADH-110 + KRED-430 + KRED-431 + KRED-432 + KRED-433 + KRED-434 + KRED-435 + KRED-436 + ¹+ = Пики, соответствующие дигидро-изо-альфа-кислотам (Rho), наблюдаемые при СВЭЖХ-МС после инкубации с ферментом.

Характеристика кеторедуктаз

[0067] Считали, что ферменты восстанавливают изо-альфа-кислоты, если пики, соответствующие цис/транс-ко/ад/н-дигидро-(rho)-изо-альфа кислоте, детектируются с помощью СВЭЖХ с большей интенсивностью, чем у контрольного образца без фермента.

[0068] KRED-P1-B05 (SEQ ID NO: 4) продуцировала наибольшее количество дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот за 24-часовой период по данным качественного сравнения высот пиков СВЭЖХ (см. Фигуру 2). KRED-P1-B05 (SEQ ID NO: 4) получена из фермента, кодируемого нуклеотидом (SEQ ID NO: 1), который кодирует аминокислотную последовательность, которая представляет собой природную кеторедуктазу дикого типа из Lactobacillus kefir (SEQ ID NO: 2). Дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты, продуцируемые этой кеторедуктазой, присутствовали в достаточно высокой концентрации, чтобы ее можно было количественно определить с помощью ВЭЖХ. Через 24 часа при температуре 30°C KRED-P1-B05 достигает выхода 18% дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот. Реакцию дублировали с продолжительностью 48 часов, достигая выхода 42% дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот. (См. Фигуру 3). Когда температуру реакции повышали с 30°C до 37°C в течение 48 часов, выход составлял 33%.

[0069] Активность KRED-P1-B05 первоначально тестировали с использованием буфера (128 мМ фосфата натрия, pH 7 с 1,7 мМ сульфата магния, 0,8 г/л мМ НАДФ) в дополнение к 30 об.% изопропанола для рециклирования кофактора. Множественные условия реакции (температура, продолжительность, состав буфера, концентрация субстрата и т.д.) были определены как подходящие для восстановления изо-альфа-кислот.

Субстратная специфичность

[0070] Идеальная кеторедуктаза для целей биотрансформации не проявляет субстратной специфичности в отношении конгенеров изогумулона, которые варьируются в зависимости от состава боковой цепи (н-, ад- и ко-изогумулон). Кроме того, кеторедуктаза не проявляет специфичности в отношении цис- и транс-изомеров изогумулона, которые пространственно варьируются в группе третичного спирта C4, проксимальной к участку ферментативного восстановления. Субстратная специфичность определяется аминокислотной последовательностью и, следовательно, геометрией субстрат-связывающего кармана фермента. Более крупные связывающие карманы подходят для более крупных субстратов, а также для большего разнообразия субстратов по сравнению с более ограниченными связывающими карманами.

[0071] Несмотря на присутствие двух дополнительных кетонных групп в молекуле изо-альфа-кислоты, для всех охарактеризованных кеторедуктаз наблюдалось только желаемое восстановление боковой цепи С4.

Пример 6

Эволюция и скрининг сконструированных полипептидов, полученных из SEQ ID NO: 4, на предмет повышенной активности KRED

[0072] Фермент SEQ ID NO: 4 был выбран в качестве исходного фермента на основании результатов скрининга вариантов восстановления ен-кислотного субстрата. Библиотеки сконструированных генов были созданы с использованием хорошо зарекомендовавших себя методов (например, насыщающего мутагенеза и рекомбинации ранее идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в режиме HTP, как описано в Примере 2, а растворимый лизат получали, как описано в Примере 3.

[0073] Сконструированный полинуклеотид SEQ ID NO: 3, который кодирует SEQ ID NO: 4, демонстрирующий превосходную активность KRED, был использован для создания дополнительных сконструированных полипептидов из Таблицы 2. Эти полипептиды продемонстрировали улучшенное образование дигидро-(rho)-изо-альфа кислот из изо-альфа-кислот по сравнению с исходным полипептидом. Сконструированные полипептиды были получены из «основной» аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 с использованием методов направленной эволюции, как описано выше, вместе с HTP анализом и аналитическими методами, описанными ниже в Таблице 2.

Таблица 2. Активность варианта KRED по сравнению с SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: (нд/ак) Кратность увеличения процента конверсии (относительно SEQ ID NO: 4)¹ 5/6 ++++ 7/8 +++ 9/10 +++ 11/12 +++ 13/14 ++ 15/16 ++ 17/18 ++ 19/20 ++ 21/22 ++ 23/24 + 25/26 + 27/28 + 29/30 + 31/32 + 33/34 + 35/36 + 37/38 + 39/40 + 41/42 + 43/44 + 45/46 + 47/48 + 49/50 + 51/52 + 53/54 + 55/56 + 57/58 + 59/60 + 61/62 + 63/64 + 65/66 + 67/68 + 69/70 + ¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонного полипептида SEQ ID NO: 4 и обозначали следующим образом: «+» > 1,0, но < 2,0, «++»≥2, но≤4, «+++»≥4, но≤8, «++++»≥8

[0074] Направленная эволюция началась с полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 3. Затем сконструированные полипептиды были выбраны в качестве исходных «основных» последовательностей гена. Библиотеки сконструированных полипептидов создавали с использованием различных хорошо известных методик (например, насыщающего мутагенеза, рекомбинации ранее идентифицированных полезных аминокислотных различий) и подвергали скринингу с использованием HTP анализа и аналитических методов, которые измеряли способность полипептидов превращать субстраты изо-альфа-кислоты в желаемые продукты дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты.

[0075] Ферментный анализ проводили в 96-луночном формате с общим объемом 200 мкл/лунку, которые содержали 50% об./об. лизата HTP фермента, 8 г/л субстрата изо-альфа-кислот и 0,1 г/л НАДФ в 40 об.% изопропанола (IPA) в 100 мМ триэтаноламине с pH 8 *H₂SO₄ с 2 мМ MgSO₄. Планшеты запечатывали и инкубировали при температуре 40°C со встряхиванием при 600 об./мин в течение 20-24 часов.

[0076] Через 20-24 часа добавляли 1000 мкл ацетонитрила с 0,1% уксусной кислотой. Планшеты запечатывали и центрифугировали при 4000 об./мин при температуре 4°C в течение 10 мин. Образец с остановленной реакцией дополнительно разбавляли в 4-5 раз смесью ацетонитрил:вода 50:50 перед ВЭЖХ-анализом. Параметры ВЭЖХ описаны ниже в Таблице 3.

Таблица 3. Параметры ВЭЖХ Прибор Agilent 1100 HPLC Колонка 30 × 50 мм 2,7 мкм колонка Waters XBridge Phenyl Подвижная фаза A: 0,1% уксусная кислота в воде, B: 0,1% уксусная кислота в ацетонитриле Параметры запуска 42:58 A/B за 1 минуту; рампа до 10:90 A/B за 1 минуту Скорость потока 1,5 мл/мин Время анализа 2,0 мин Peak Retention Times Соединение время удерживания [мин] Примечание
Изо-1 0,6 смесь ко-Изо изомеров
Изо-2 0,7 смесь н/ад-Изо изомеров
Изо-3 0,8 смесь н/ад-Изо изомеров
Rho-1 1,0 смесь ко-Rho изомеров
Rho-2 1,2 смесь н/ад-Rho изомеров
Rho-3 1,4 смесь н/ад-Rho изомеров Температура колонки 50°C Объем пробы 10 мкл Детекция 260 нм

Пример 7

Эволюция и скрининг сконструированных полипептидов, полученных из SEQ ID NO: 6, на предмет повышенной активности KRED

[0077] Библиотеки сконструированных генов были получены с использованием хорошо известных методов (например, насыщающего мутагенеза и рекомбинации ранее идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в режиме HTP, как описано в Примере 2, а растворимый лизат получали, как описано в Примере 3.

[0078] Сконструированный полинуклеотид SEQ ID NO: 5, который кодирует полипептид SEQ ID NO: 6, демонстрирующий превосходную активность KRED, был использован для создания дополнительных сконструированных полипептидов из Таблицы 4. Эти полипептиды продемонстрировали улучшенное образование дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты из изо-альфа-кислот по сравнению с исходным полипептидом. Сконструированные полипептиды были получены из «основной» аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 с использованием методов направленной эволюции, как описано выше, вместе с HTP анализом и аналитическими методами, описанными в Таблице 3.

Таблица 4. Активность варианта KRED по сравнению с SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: (нд/ак) Кратность увеличения процента конверсии (относительно SEQ ID NO: 6)¹ 71/72 ++++ 73/74 +++ 75/76 +++ 77/78 +++ 79/80 +++ 81/82 ++ 83/84 ++ 85/86 + 87/88 + 89/90 + 91/92 + 93/94 + 95/96 + 97/98 + ¹Уровни повышенной активности определяли относительно эталонного полипептида SEQ ID NO: 6 и обозначали следующим образом: «+» > 1,0, но < 2,0, «++»≥2, но≤4, «+++»≥4, но≤8, «++++»≥8

[0079] Направленная эволюция началась с полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 5. Затем сконструированные полипептиды были выбраны в качестве исходных «основных» последовательностей гена. Библиотеки сконструированных полипептидов создавали с использованием различных хорошо известных методик (например, насыщающий мутагенез, рекомбинация ранее идентифицированных полезных аминокислотных различий) и подвергали скринингу с использованием HTP анализа и аналитических методов, которые измеряли способность полипептидов превращать субстраты изо-альфа-кислоты в желаемые продукты дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты.

[0080] Ферментный анализ проводили в 96-луночном формате с общим объемом 200 мкл/лунку, которые содержали 50% об./об. лизата HTP фермента, 16 или 40 г/л субстрата изо-альфа-кислот и 0,1 г/л НАДФ в 40 об.% изопропанола (IPA) в 100 мМ триэтаноламине с pH 8 *H₂SO₄ с 2 мМ MgSO₄. Планшеты запечатывали и инкубировали при температуре 40°C со встряхиванием при 600 об./мин в течение 20-24 часов.

[0081] Через 20-24 часа добавляли 1000 мкл ацетонитрила с 0,1% уксусной кислотой. Планшеты запечатывали и центрифугировали при 4000 об./мин при температуре 4°C в течение 10 мин. Образец с остановленной реакцией дополнительно разбавляли в 10-20 раз смесью ацетонитрил:вода 50:50 перед ВЭЖХ-анализом. Параметры ВЭЖХ описаны в Таблице 3.

Пример 8

Эволюция и скрининг сконструированных полипептидов, полученных из SEQ ID NO: 80, на предмет повышенной активности KRED

[0082] Библиотеки сконструированных генов были получены с использованием хорошо известных методов (например, насыщающего мутагенеза и рекомбинации ранее идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в режиме HTP, как описано в Примере 2, а растворимый лизат получали, как описано в Примере 3.

[0083] Сконструированный полинуклеотид SEQ ID NO: 79, который кодирует полипептид SEQ ID NO: 80, демонстрирующий превосходную активность KRED, был использован для создания дополнительных сконструированных полипептидов из Таблицы 5. Эти полипептиды продемонстрировали улучшенное образование дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот из изо-альфа-кислот по сравнению с исходным полипептидом. Сконструированные полипептиды были получены из «основной» аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80 с использованием методов направленной эволюции, как описано выше, вместе с HTP анализом и аналитическими методами, описанными ниже в Таблице 3.

Таблица 5. Активность варианта KRED по сравнению с SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: (нд/ак) Кратность увеличения процента конверсии (относительно SEQ ID NO: 80)¹ 99/100 ++++ 101/102 ++++ 103/104 +++ 105/106 +++ 107/108 +++ 109/110 +++ 111/112 +++ 113/114 ++ 115/116 ++ 117/118 ++ 119/120 ++ 121/122 ++ 123/124 ++ 125/126 ++ 127/128 ++ 129/130 + 131/132 + 133/134 + 135/136 + 137/138 + 139/140 + 141/142 +

[0084] Направленная эволюция началась с полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 79. Затем сконструированные полипептиды были выбраны в качестве исходных «основных» последовательностей гена. Библиотеки сконструированных полипептидов создавали с использованием различных хорошо известных методик (например, насыщающий мутагенез, рекомбинация ранее идентифицированных полезных аминокислотных различий) и подвергали скринингу с использованием HTP анализа и аналитических методов, которые измеряли способность полипептидов превращать субстраты изо-альфа-кислоты в желаемые продукты дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты.

[0085] Ферментный анализ проводили в 96-луночном формате с общим объемом 200 мкл/лунку, которые содержали 25% об./об. лизата HTP фермента, 60 или 80 г/л субстрата изо-альфа-кислот и 0,02 г/л НАДФ в 40 об.% изопропанола (IPA) в 100 мМ фосфате калия с pH 8 с 2 мМ MgSO₄. Планшеты запечатывали и инкубировали при температуре 45°C со встряхиванием при 600 об./мин в течение 20-24 часов.

[0086] Через 20-24 часа добавляли 1000 мкл ацетонитрила с 0,1% уксусной кислотой. Планшеты запечатывали и центрифугировали при 4000 об./мин при температуре 4°C в течение 10 мин. Образец с остановленной реакцией дополнительно разбавляли в 20-40 раз смесью ацетонитрил:вода 50:50 перед ВЭЖХ-анализом. Параметры ВЭЖХ описаны в Таблице 3.

Пример 9

Эволюция и скрининг сконструированных полипептидов, полученных из SEQ ID NO: 80, на предмет повышенной активности KRED при высокой концентрации субстрата

[0087] Библиотеки сконструированных генов были получены с использованием хорошо известных методов (например, насыщающего мутагенеза и рекомбинации ранее идентифицированных полезных мутаций). Полипептиды, кодируемые каждым геном, получали в режиме HTP, как описано в Примере 2, а растворимый лизат получали, как описано в Примере 3.

[0088] Сконструированный полинуклеотид SEQ ID NO: 79, который кодирует полипептид SEQ ID NO: 80, демонстрирующий превосходную активность KRED, был использован для создания дополнительных сконструированных полипептидов из Таблицы 6. Эти полипептиды продемонстрировали улучшенное образование дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот из изо-альфа-кислот по сравнению с исходным полипептидом. Сконструированные полипептиды были получены из «основной» аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80 с использованием методов направленной эволюции, как описано выше, и описаны ниже в Таблице 3.

Таблица 6. Активность варианта KRED по сравнению с SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: (нд/ак) Кратность увеличения процента конверсии (относительно SEQ ID NO: 80)¹ 143/144 ++++ 145/146 ++++ 147/148 ++++ 149/150 ++++ 99/100 ++++ 151/152 +++ 153/154 +++ 155/156 +++ 103/104 ++ 157/158 ++ 159/160 ++ 139/140 + 161/162 +

[0089] Направленная эволюция началась с полинуклеотида, представленного в SEQ ID NO: 79. Затем сконструированные полипептиды были выбраны в качестве исходных «основных» последовательностей гена. Библиотеки сконструированных полипептидов создавали с использованием различных хорошо известных методик (например, насыщающий мутагенез, рекомбинация ранее идентифицированных полезных аминокислотных различий) и подвергали скринингу с использованием HTP анализа и аналитических методов, которые измеряли способность полипептидов превращать субстраты изо-альфа-кислоты в желаемые продукты дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты.

[0090] Ферментный анализ проводили в 96-луночном формате с общим объемом 200 мкл/лунку, которые содержали 10-20% об./об. лизата HTP фермента, 80 или 160 г/л субстрата изо-альфа-кислот и 0,02 г/л НАДФ в 40 об.% изопропанола (IPA) в 100 мМ фосфате калия с pH 8 с 2 мМ MgSO₄. Планшеты запечатывали и инкубировали при температуре 45°C со встряхиванием при 600 об./мин в течение 20-24 часов.

[0091] Через 20-24 часа добавляли 1000 мкл ацетонитрила с 0,1% уксусной кислотой. Планшеты запечатывали и центрифугировали при 4000 об./мин при температуре 4°C в течение 10 мин. Образец с остановленной реакцией дополнительно разбавляли в 20-40 раз смесью ацетонитрил:вода 50:50 перед ВЭЖХ-анализом. Параметры ВЭЖХ описаны в Таблице 3.

Пример 10

Эволюция и скрининг сконструированных полипептидов, полученных из SEQ ID NO: 80, 104, 100, 136, 116, 132, 162, 150, 152, 144 и 146, на предмет повышенной активности KRED при высокой концентрации субстрата и низкой концентрации НАДФ

[0092] Исходный раствор фермента с концентрацией 200 г/л получали растворением 100 мг порошка фермента в 500 мкл 100 мМ калий-фосфатного буфера с pH 8 с 2 мМ MgSO₄ и 0,1 г/л НАДФ. В лунку 96-луночного планшета с глубокими лунками добавляли 40 мкл исходного раствора фермента/ НАДФ, 80 мкл изопропанола и 80 мкл 40 мас.% водного раствора изо-альфа-кислоты. Конечная реакционная смесь содержала 40 г/л фермента, 160 г/л изо-альфа-кислоты и 0,02 г/л НАДФ в 40% IPA. Планшет запечатывали и инкубировали при температуре 40°C в течение 24 часов, затем реакцию останавливали и анализировали с помощью ВЭЖХ-УФ. Данные представлены в Таблице 7 и на Фигуре 5.

Таблица 7. Активность KRED при высокой концентрации субстрата и низкой концентрации НАДФН SEQ ID NO: (нд/ак) % Конверсии 40 г/л 20 г/л 10 г/л 5 г/л 2,5 г/л 1,25 г/л 79/80 4,2 1,9 0,9 0,5 0,1 0,0 103/104 28,2 16,5 8,7 5,2 2,2 1,2 99/100 23,1 11,2 6,1 3,3 1,3 0,6 135/136 23,6 7,5 2,4 1,2 0,6 0,0 115/116 8,5 3,2 1,2 0,7 0,2 0,0 131/132 5,3 2,2 0,8 0,4 0,1 0,0 161/162 29,1 14,4 5,6 2,1 0,7 0,3 149/150 29,0 14,9 6,0 2,4 1,0 0,2 151/152 30,6 17,9 7,4 3,6 2,0 1,2 143/144 29,1 14,4 5,8 2,4 1,2 0,4 145/146 24,3 12,3 4,7 1,9 0,8 0,1 157/158 3,0 1,1 0,4 0,0 0,0 0,0

Пример 11

Ферментативная обработка подкисленных изо-альфа-кислот хмеля с рециклированием кофактора путем окисления изопропанола

[0093] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10, где источником изо-альфа-кислот является высококонцентрированный материал (68,9% изо-альфа-кислот), имеющий значение pH <7.

Пример 12

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с рециклированием кофактора глюкозодегидрогеназой

[0094] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10, за исключением того, что изопропанол заменяют на 4,3 ед./мл глюкозодегидрогеназы, 0,7 г/л мМ НАД и 14,4 г/л D-глюкозы.

Пример 13

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля без рециклирования кофактора

[0095] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10, за исключением того, что изопропанол заменяют эквимолярным количеством НАДФН в качестве субстрата.

Пример 14

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с рециклированием кофактора путем окисления этанола

[0096] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10, за исключением того, что изопропанол заменяют этанолом.

Пример 15

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля кеторедуктазой, иммобилизованной на SiO₂

[0097] Кеторедуктазу адсорбируют на SiO₂ и сшивают с глутаральдегидом с получением материала иммобилизованной кеторедуктазы. Изо-альфа-кислоты обрабатывают иммобилизованной кеторедуктазой способом, описанным в Примере 10. Полученную реакционную смесь центрифугируют при 10000 g для удаления иммобилизованного фермента.

Пример 16

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля кеторедуктазой, иммобилизованной на ДЭАЭ-целлюлозе

[0098] Кеторедуктазу сшивают с глутаральдегидом и адсорбируют на ДЭАЭ-целлюлозе с получением материала иммобилизованной кеторедуктазы. Изо-альфа-кислоты обрабатывают иммобилизованной кеторедуктазой способом, описанным в Примере 10. Полученную реакционную смесь центрифугируют при 10000 g для удаления иммобилизованного фермента.

Пример 17

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля кеторедуктазой, иммобилизованной на оксиде алюминия, обработанном PEI

[0099] Кеторедуктазу сшивают с глутаральдегидом и адсорбируют на оксиде алюминия, обработанном полиэтилимином (PEI), с получением материала иммобилизованной кеторедуктазы. Изо-альфа-кислоты обрабатывают иммобилизованной кеторедуктазой способом, описанным в Примере 10. Полученную реакционную смесь центрифугируют при 10000 g для удаления иммобилизованного фермента.

Пример 18

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с рециклированием кофактора НАДН

[00100] Обработка ферментом, при которой кофактор НАДФН заменяется НАДН. Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10, но НАДФН заменяют на НАД.

Пример 19

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с последующей экстракцией

[00101] Ферментативную обработку выполняют с последующей экстракцией для увеличения конечной концентрации дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот. Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10. Полученную реакционную смесь фильтруют для удаления фермента и экстрагируют пищевым растворителем для достижения желаемой концентрации дигидро-(rho)-изо-альфа-кислот.

Пример 20

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с последующей термической инактивацией

[00102] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10. Реакцию инкубируют при температуре 30°C с орбитальным встряхиванием при 180 об./мин в течение 24 часов. Полученную реакционную смесь нагревают при температуре 80-100°C в течение 10-30 минут для инактивации фермента.

Пример 21

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с последующей химической инактивацией

[00103] Изо-альфа-кислоты обрабатывают способом, описанным в Примере 10. Реакцию инкубируют при температуре 30°C с орбитальным встряхиванием при 180 об./ мин в течение 24 часов. Пищевой этанол добавляют до конечной концентрации >50% для инактивации фермента.

Пример 22

Ферментативная обработка изо-альфа-кислот хмеля с рециклированием иммобилизованной кеторедуктазы

[00104] Кеторедуктазу сшивают с глутаральдегидом и адсорбируют на ДЭАЭ-целлюлозе с получением материала иммобилизованной кеторедуктазы. Затем изо-альфа-кислоты обрабатывают иммобилизованной кеторедуктазой способом, описанным в Примере 10. Полученную реакционную смесь центрифугируют при 10000 g для отделения иммобилизованной кеторедуктазы от реакционной смеси. Иммобилизованную кеторедуктазу восстанавливают, промывается водой или водным буфером и повторно используется в новой реакционной смеси.

Заключение

[00105] 162 кеторедуктазы были охарактеризованы как превращающие изо-альфа-кислоты в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты. Кеторедуктазы, охарактеризованные в этом исследовании, обладают ферментативной активностью, которая ранее не описывалась. Кеторедуктазы, охарактеризованные в этом исследовании, восстанавливают кетонную группу до спирта и, таким образом, являются кеторедуктазами. Эти результаты демонстрируют, что биокатализатор кеторедуктаза можно использовать для превращения изо-альфа-кислот в дигидро-(rho)-изо-альфа-кислоты в новом процессе биотрансформации. Настоящее изобретение предназначено для замены существующих процессов, в которых используется боргидрид натрия.

[00106] Настоящее изобретение не должно ограничиваться в объеме описанными здесь конкретными вариантами его осуществления. А именно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к описанным здесь станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Предполагается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

[00107] Все патенты, заявки, публикации, способы тестирования, литература и другие материалы, цитируемые в описании настоящего изобретения, включены в него путем ссылки.

Цитируемые ссылки

1. Sodium Borohydride; MSDS No. S9125; Sigma-Aldrich Co.: Saint Louis, MO November 01, 2015. (accessed 06/08/17).

2. Robinson, P. K., Enzymes: principles and biotechnological applications. Essays Biochem 2015, 59, 1-41.

3. Hult, K.; Berglund, P., Enzyme promiscuity: mechanism and applications. Trends Biotechnol. 2007, 25 (5), 231-238.

4. Nobeli, I.; Favia, A. D.; Thornton, J. M., Protein promiscuity and its implications for biotechnology. Nat. Biotechnol. 2009, 27 (2), 157-167.

5. Pozen, M., Enzymes in Brewing. Ind. Eng. Chem, 1934, 26 (11), 1127-1133.

6. Praet, T.; Opstaele, F.; Jaskula-Goiris, B.; Aerts, G.; De Cooman, L., Biotransformations of hop-derived aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae upon fermentation. Cerevisia, 2012, 36, 125-132.

7. Wallerstein, L. (1947) Bentonite and Proteolytic Enzyme Treatment of Beer, US Patent 2,433,411.

8. Ghionno, L.; Marconi, O.; Sileoni, V.; De Francesco, G.; Perretti, G., Brewing with prolyl endopeptidase from Aspergillus niger: the impact of enzymatic treatment on gluten levels, quality attributes, and sensory profile. Int. J. Food Sci. Technol, 2017, 52 (6), 1367-1374.

9. Gros, J.; Tran, T. T. H.; Collin, S., Enzymatic release of odourant polyfunctional thiols from cysteine conjugates in hop. J. Inst. Brew. 2013, 119 (4), 221-227.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> KALAMAZOO HOLDINGS, INC.

<120> ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ХМЕЛЕПРОДУКТОВ

<130> KALSEC 75 PCT

<140>

<141> 2019-09-26

<150> US 62/736,555

<151> 2018-09-26

<160> 162

<210> 1

<211> 759

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> KRED дикого типа из Lactobacillus kefir

<400> 1

atgaccgatc gtctgaaggg caaagtagcc atcgtaaccg gcgggactct gggtatcggt 60

ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120

gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180

cagcacgatg catccgatga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240

ttcggcccgg ttacgaccgt cgtgaacaat gcagggattg cagtttccaa aagcgttgaa 300

gacactacca cggaggaatg gcgtaaactg ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360

ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420

atgagcagta ttgaggggtt cgtaggcgat ccgacgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480

ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540

gtgcgtgtca acacagtaca tccgggctat atcaagaccc cgctggtcga tgatctggaa 600

ggtgctgagg aaatgatgtc acagcgtacg aaaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660

aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720

gcagaatttg tggtcgacgg cgggtatacc gcacagtga 759

<210> 2

<211> 252

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> KRED дикого типа из Lactobacillus kefir

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 759

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный вариант KRED из Lactobacillus kefir

<400> 3

atgaccgatc gtctgaagca taaagtagcc atcgtaaccg gcgggacact gggtatcggt 60

ttggcaatcg ccgataaatt tgtagaggag ggtgcgaaag tagttattac tggtcgtcac 120

gcggatgtag gtgaaaaggc cgccaaatca atcggcggca ctgatgttat tcgctttgtc 180

cagcacgatg cgtccgaaga agcaggctgg acgaaactgt tcgacaccac cgaggaggca 240

ttcggcccgg ttacgaccgt cgtgaacaat gcagggattg gggttattaa aagcgttgaa 300

gacactacca cggaggaatg gcgtaaactg ctgtccgtta atctggatgg tgtttttttc 360

ggcacccgtc tgggcattca gcgcatgaaa aataaaggct tgggcgctag catcatcaat 420

atgagcagta ttctggggct cgtaggcgat ccgacgctgg gggcatacaa cgcttccaag 480

ggggcggtac gtatcatgtc gaaaagcgca gcgctggatt gcgcactgaa ggactacgat 540

gtgcgtgtca acacagtaca tccgggcccc atcaagaccc cgcggctcga tgatctggaa 600

ggttgggagg aaatgatgtc acagcgtacg ttaaccccta tgggccacat tggcgaaccg 660

aatgacatcg catggatctg tgtgtacctg gcatctgacg aatcgaaatt tgcgacgggt 720

gcagaatttg tggtcgacgg cgggtggacc gcacagtga 759

<210> 4

<211> 252

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный вариант KRED из Lactobacillus kefir

<400> 4

Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Glu Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Val Ile

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Leu Gly Leu Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Arg Leu Asp Asp Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Leu Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Trp Thr Ala Gln

245 250

<210> 5

<211> 756

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный вариант KRED из Lactobacillus kefir

<400> 5