Предшествующий уровень техники

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения сиалилированных сахаридов, а также к используемым в нем рекомбинантным или генетически модифицированным микробным клеткам.

На сегодняшний день идентифицировано более 150 различающихся по структуре олигосахаридов грудного молока (НМО, от англ. human milk oligosaccharides). Несмотря на то, что НМО представлены лишь в незначительном количестве среди общих питательных веществ грудного молока, их благотворное влияние на развитие вскармливаемых грудью детей стало очевидным за последние десятилетия.

Было обнаружено, что среди НМО сиалилированные НМО (SHMO, от англ. sialylated HMOs) поддерживают устойчивость к энтеропатогенным бактериям и вирусам. Интересно, что недавние исследования дополнительно продемонстрировали защитное действие длинноцепочечных SHMO в отношении некротизирующего энтероколита, который является одним из самых распространенных и приводящих к летальному исходу заболеваний среди недоношенных младенцев. В дополнение к этому, считается, что SHMO поддерживают развитие головного мозга младенцев и их когнитивных способностей. Помимо этого показано, что сиалилированные олигосахариды нейтрализуют энтеротоксины различных патогенных микроорганизмов, включая Escherichia coli, Vibrio cholerae и Salmonella. Кроме того, было обнаружено, что сиалилированные олигосахариды препятствуют колонизации кишечника Helicobacter pylori и, таким образом, предотвращают или подавляют образование язв желудка и двенадцатиперстной кишки.

Среди сиалилированных олигосахаридов наиболее распространенными компонентами грудного молока являются 3'-сиалиллактоза, 6'-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраоза а, сиалиллакто-N-тетраоза b, сиалиллакто-N-тетраоза с и дисиалиллакто-N-тетраоза.

Поскольку сиалилированные олигосахариды имеют сложную структуру, методы их химического или (химико-)ферментативного синтеза являются нестандартными и связаны с большими трудностями, например, с необходимостью регулирования стереохимической конфигурации, образования специфических связей, доступностью исходного сырья и так далее. Соответственно, имеющиеся в продаже сиалилированные олигосахариды весьма дороги вследствие их низкого содержания в природных источниках.

Ввиду этого были предприняты усилия по конструированию путей обмена веществ у микроорганизмов, продуцирующих сиалилированные олигосахариды, поскольку этот подход является наиболее перспективным способом получения НМО в промышленном масштабе. Для получения SHMO посредством микробиологической ферментации такой микроорганизм обычно культивируют в присутствии экзогенной сиаловой кислоты.

В публикации международной заявки WO 2007/101862 А1 описывается способ крупномасштабного синтеза in vivo сиалилированных олигосахаридов с использованием внутриклеточного пула уридиндифосфат-N-ацетилглюкозамина (УДФ-GlcNAc, от англ. N-acetylglucosamine) путем культивирования микроорганизма в культуральной среде, при этом указанный микроорганизм содержит гетерологичные гены, кодирующие синтетазу цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовой кислоты (ЦМФ-Neu5Ac-синтетазу, от англ. N-acetylneuraminic acid), синтазу сиаловых кислот, С1 cNAc-6-фосфат-2-эпимеразу и сиалилтрансферазу. Вдобавок были делетированы эндогенные гены, кодирующие альдолазу сиаловых кислот (NanA) и ManNac-киназу (NanK).

В публикации международной заявки WO 2014/153253 А1 описываются способы и композиции для модификации бактерий, продуцирующих сиалилированные олигосахариды, а также способ получения сиалилированного олигосахарида в бактерии, причем указанная бактерия содержит экзогенную сиалилтрансферазу, дефектный путь катаболизма сиаловых кислот, обладает способностью синтезировать сиаловые кислоты и содержит функционально активный ген пермеазы лактозы, при этом указанную бактерию культивируют в присутствии лактозы. Способность синтезировать сиаловые кислоты заключается в экспрессии экзогенной ЦМФ-Neu5Ac-синтетазы, экзогенной синтазы сиаловых кислот и экзогенной УДФ-ClcNAc-2-эпимеразы.

Однако, получение сиалилированных олигосахаридов желательно осуществлять путем микробиологической ферментации, в ходе которой не требуется наличия и/или добавления экзогенной сиаловой кислоты. Кроме того, получение сиалилированных олигосахаридов желательно осуществлять с использованием микроорганизмов, для которых нет необходимости в использовании внутриклеточного пула УДФ-N-ClcNAc, поскольку считается, что это будет энергетически выгодно для клетки.

Краткое описание сущности изобретения

Данная задача решается, помимо прочего, путем разработки способа ферментативного получения сиалилированных сахаридов с применением цельных клеток, который не требует добавления экзогенной сиаловой кислоты, и с использованием генетически модифицированной микробной клетки, которая может синтезировать сиалилированные сахариды в отсутствие экзогенной сиаловой кислоты.

Согласно одному из аспектов предложен способ получения сиалилированного сахарида, включающий стадии а) предоставления по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки, которая содержит (1) путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac, NeuNAc), при этом указанный путь биосинтеза сиаловой кислоты включает в себя глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, (2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-сиаловых кислот и (3) гетерологичную сиалилтрансферазу; b) культивирования по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки в ферментационном бульоне и в условиях, позволяющих получать указанный сиалилированный сахарид; и возможно с) извлечения указанного сиалилированного сахарида.

Согласно другому аспекту предложена генетически модифицированная микробная клетка для получения сиалилированного сахарида, причем данная микробная клетка содержит (1) путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, при этом указанный путь биосинтеза сиаловой кислоты содержит глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу; (2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты для переноса N-ацетилнейраминовой кислоты на цитидин-5'-монофосфат с образованием ЦМФ-активированной N-ацетилнейраминовой кислоты; и (3) гетерологичную сиалилтрансферазу.

Согласно другому аспекту предложен сиалилированный сахарид, который может быть получен способом или с использованием генетически модифицированной микробной клетки по изобретению.

Согласно другому аспекту предложено применение сиалилированного сахарида, который получают способом или с использованием генетически модифицированной микробной клетки по изобретению, для приготовления пищевой композиции, предпочтительно композиции для грудных детей.

Согласно еще одному аспекту предложена пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один сиалилированный сахарид, полученный способом или с использованием генетически модифицированной микробной клетки по изобретению.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показано схематичное представление пути биосинтеза сиаловой кислоты, который может быть использован генетически модифицированной микробной клеткой для ферментативного получения сиалилированных сахаридов, при этом в указанном пути биосинтеза сиаловой кислоты используется УДФ-GlcNAc.

На Фиг. 2 показано схематичное представление пути биосинтеза сиаловой кислоты, который может быть использован генетически модифицированной микробной клеткой по изобретению для ферментативного получения сиалилированных сахаридов.

На Фиг. 3 показано схематичное представление другого пути биосинтеза сиаловой кислоты, который может быть использован генетически модифицированной микробной клеткой по изобретению для ферментативного получения сиалилированных сахаридов.

Подробное описание

Согласно первому аспекту предложен способ ферментативного получения сиалилированного сахарида. Способ включает стадии а) предоставления по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки, способной синтезировать данный сиалилированный сахарид, при этом указанная по меньшей мере одна генетически модифицированная микробная клетка содержит (1) путь биосинтеза сиаловой кислоты, включающий в себя глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу; (2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты; и (3) гетерологичную сиалилтрансферазу; b) культивирования по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клетки в ферментационном бульоне и в условиях, позволяющихполучать указанный сиалилированный сахарид, и возможно с) извлечения указанного сиалилированного сахарида.

Соответственно, согласно второму аспекту изобретение также относится к генетически модифицированной микробной клетке для ферментативного получения сиалилированного сахарида, причем данная микробная клетка содержит (1) путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, при этом указанный путь биосинтеза сиаловой кислоты включает в себя глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу; (2) синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-сиаловых кислот для переноса N-ацетилнейраминовой кислоты на цитидин-5'-монофосфат с образованием ЦМФ-активированной сиаловой кислоты; и (3) сиалилтрансферазу для переноса группировки N-ацетилнейраминовой кислоты с ЦМФ-активированной сиаловой кислоты в качестве донорного субстрата на акцепторную молекулу, причем акцепторной молекулой является молекула сахарида, в результате чего осуществляется внутриклеточный биосинтез сиалилированного сахарида.

Генетически модифицированная микробная клетка содержит путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты, в котором не используется УДФ-GlcNAc. Генетически модифицированная микробная клетка содержит путь биосинтеза сиаловой кислоты для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты с использованием глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы. В пути биосинтеза сиаловой кислоты с использованием глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы для внутриклеточного биосинтеза N-ацетилнейраминовой кислоты не используется УДФ-GlcNAc для биосинтеза сиаловой кислоты (Фиг. 2 и Фиг. 3).

Путь биосинтеза сиаловой кислоты содержит активности ферментов глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы и синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты. Путь биосинтеза сиаловой кислоты также содержит а) активности ферментов глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазы и N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы (Фиг. 2); и/или b) активности ферментов глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразы и N-ацетилманнозамин-6-фосфатфосфатазы (Фиг. 3). Поэтому, для внутриклеточного биосинтеза сиаловой кислоты нет необходимости в том, чтобы генетически модифицированная микробная клетка содержала активности ферментов фосфоглюкозамин-мутазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфат-уридилтрансферазы и УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы с одновременным высвобождением УДФ (Фиг. 1). Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка, способная синтезировать сиаловую кислоту, не содержит активности одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из активности ферментов фосфоглюкозамин-мутазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфат-уридилтрансферазы и УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы с одновременным высвобождением УДФ.

Фермент глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза (ЕС 2.6.1.16) катализирует превращение фруктозо-6-фосфата (Frc-6P) в глюкозамин-6-фосфат (GlcN-6P) с использованием глутамина. Обычно считается, что эта ферментативная реакция является первой стадией в пути биосинтеза гексозаминов. Альтернативными названиями глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы являются D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза, GFAT (от англ. Glutamine-Fructose-6-Phosphate Aminotransferase - глутамин-фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза), глюкозамин-6-фосфат-синтаза, гексозофосфат-аминотрансфераза и L-глутамин-D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазу, предпочтительно гетерологичную глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазу, более предпочтительно глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазу, которая происходит из Е. coli (GlmS из Е. coli (UniProtKB - Р17169; SEQ ID NO 67)) или функционально активный вариант GlmS из Е. coli. Наиболее предпочтительно, функционально активный вариант представляет собой версию GlmS из Е. coli, которая демонстрирует значительно сниженную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфатом по сравнению с ферментом дикого типа. Пример функционально активного варианта GlmS из Е. coli, который демонстрирует значительно сниженную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфатом, представлен в SEQ ID NO 68.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазу, предпочтительно глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазу GlmS из Е. coli (SEQ ID NO 69), или нуклеотидную последовательность, кодирующую функционально активный вариант, представляющий собой версию GlmS из E. coli, которая демонстрирует значительно сниженную чувствительность к ингибированию глюкозамин-6-фосфатом по сравнению с ферментом дикого типа, (glmS*54 или glmS* (как представлено в SEQ ID NO 70)).

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 67 и SEQ ID NO 68;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO 69 и SEQ ID NO 70;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 67 и SEQ ID NO 68;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO 69 и SEQ ID NO 70;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения внутриклеточной активности глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка обладает глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазной активностью. Под действием указанной глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы GlcN-6P превращается в N-ацетилглюкозамин-6-фосфат (GlcNAc-6P). Примером глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы является Gna1 из Saccharomyces cerevisiae (UniProtKB - Р43577; SEQ ID NO 77).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, предпочтительно гетерологичную глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазу, более предпочтительно Gna1 из S. cerevisiae (кодируемую нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 78) или ее функционально активный вариант.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в SEQ ID NO 77;

2) нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 78;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, представленный в SEQ ID NO 77;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 78;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения внутриклеточной активности глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка обладает N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазной активностью. Под действием указанной N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазы GlcNAc-6P превращается в N-ацетилглюкозамин (GlcNAc). Примерами N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазы являются фосфатазы сахаров HAD-подобного суперсемейства (от англ. haloacid dehydrogenase - дегидрогеназа галогенкислоты), которые катализируют превращение GlcNAc-6P в GlcNAc. HAD-подобное суперсемейство ферментов названо по имени бактериального фермента дегидрогеназы галогенкислоты и включает фосфатазы. Подходящая фосфатаза HAD-подобного суперсемейства, катализирующая превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, может быть выбрана из группы, состоящей из фруктозо-1-фосфат-фосфатазы (YqaB, UniProtKB - Р77475; SEQ ID NO 79) и альфа-D-глюкозо-1-фосфат-фосфатазы (YihX, UniProtKB - P0A8Y3; SEQ ID NO 80). Считается, что ферменты YqaB из E, coli и YihX из E.coli также воздействуют на GlcNAc-6P (Lee, S.-W. and Oh, M.-K. (2015) Metabolic Engineering, 28: 143-150).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении фосфатаза сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующая превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, представляет собой гетерологичный фермент в генетически модифицированной микробной клетке. В дополнительном и/или альтернативном воплощении фосфатаза сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующая превращение GlcNAc6P в GlcNAc, выбрана из группы, состоящей из YqaB из Е. coli, YihX из Е. coli и их функциональных вариантов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит и экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую фосфатазу сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующую превращение GlcNAc-6P в GlcNAc. В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфатазу сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующую превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, представляет собой гетерологичную нуклеотидную последовательность. В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая фосфатазу сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующую превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, кодирует фруктозо-1-фосфат-фосфатазу из Е. coli или альфа-D-глюкозо-1-фосфат-фосфатазу из Е, coli либо функциональный фрагмент одного из этих двух ферментов.

YqaB из Е. coli кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO 81, в то время как YihX из Е. coli кодируется нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO 82. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 79 и SEQ ID NO 80;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO 81 и SEQ ID NO 82;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 79 и SEQ ID NO 80;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из нуклеотидных последовательностей, которые представлены в одной из SEQ ID NO 81 и SEQ ID NO 82;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения внутриклеточной активности фосфатазы сахаров, которая катализирует превращение GlcNAc-6P в GlcNAc.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении не встречающийся в природе микроорганизм генетически модифицирован таким образом, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, включающую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, которая кодирует фосфатазу сахаров HAD-подобного суперсемейства, катализирующую превращение GlcNAc-6P в GlcNAc, или функциональный фрагмент указанной HAD-фосфатазы, и/или, чтобы содержать фосфатазу сахаров HAD-подобного суперсемейства.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка обладает N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразной активностью. N-Ацетилглюкозамин-2-эпимераза (ЕС 5.1.3.8) представляет собой фермент, который катализирует превращение N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в N-ацетилманнозамин (ManNAc). Данный фермент представляет собой рацемазу, действующую на углеводы и их производные. Систематическим названием фермента этого класса является N-ацил-D-глюкозамин-2-эпимераза. Этот фермент принимает участие в метаболизме амино-сахаров и метаболизме нуклеотид-сахаров, предпочтительно представляет собой гетерологичную N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, предпочтительно гетерологичную N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу. Были описаны примеры N-ацетилглюкозамин-2-эпимераз из Anabena variabilis, Acaryochloris sp., Nostoc sp., Nostoc punctiforme, Bacteroides ovatus или Synechocystis sp. Примером подходящей N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы является N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза из В. ovatus АТСС (Американская коллекция типовых культур) 8483 (UniProtKB - A7LVG6, SEQ ID NO 83), которая кодируется геном BACOVA_01816 (SEQ ID NO 85). Другим примером является Л/-ацетилглюкозамин-2-эпимераза из Synechocystis sp.(штамма РСС 6803) (UniProtKB - Р74124; SEQ ID NO 84), которая также известна как ренин-связывающий белок и кодируется геном slr1975 (SEQ ID NO 86).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу, предпочтительно N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу из В. ovatus АТСС 8483 или Synechocystis sp.(штамма РСС 6803) либо их функциональный вариант.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 83 и SEQ ID NO 84;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO 85 и SEQ ID NO 86;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO 83 и SEQ ID NO 84;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO 85 и SEQ ID NO 86;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности для обеспечения внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка обладает N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразной активностью и N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазной активностью. N-Ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимераза катализирует превращение N-ацетилглюкозамин-6-фосфата (GlcNAc-6P) в N-ацетилманнозамин-6-фосфат (ManNAc-6P), в то время как N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатаза дефосфорилирует ManNAc-6P с получением N-ацетилманнозамина (ManNAc). Наличие N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразной активности и N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазной активности обеспечивает дополнительный или альтернативный путь предоставления ManNAc для получения Neu5Ac.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразу. Примером подходящей N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразы является NanE из Е. coli (UniProtKB - Р0А761, SEQ ID NO 87), которая кодируется геном nanE Е. coli (SEQ ID NO 88).

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую NanE из Е. coil

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в SEQ ID NO 87;

2) нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 88;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, представленный в SEQ ID NO 87;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 88;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения внутриклеточной активности N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазу.

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, кодирующую N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит активность синтазы сиаловых кислот. Синтаза сиаловых кислот катализирует реакцию конденсации ManNAc и фосфоенолпирувата (ФЕП) с образованием N-ацетилнейраминовой кислоты (NeuNAc).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит синтазу сиаловых кислот или ее функциональный вариант, предпочтительно гетерологичную синтазу сиаловых кислот. Известны примеры синтаз сиаловых кислот из бактерий различных видов, таких как Campylobacter jejuni, Streptococcus agalactiae, Butyrivibrio proteociasticus, Methanobrevibacter ruminatium, Acetobacterium woodii, Desulfobacula toluolica, Escherichia coli, Prevotella nigescens, Halorhabdus tiamatea, Desulfotignum phosphitoxidans или Candidates Scalindua sp., Idomarina loihiensis, Fusobacterium nucleatum или Neisseria meningitidis. Предпочтительно, синтазой сиаловых кислот является синтаза N-ацетилнейраминовой кислоты NeuB из С. jejuni (SEQ ID NO 89), которая кодируется геном neuB С. jejuni (SEQ ID NO 90).

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в SEQ ID NO 89;

2) нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 90;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, представленный в SEQ ID NO 89;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 90;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения внутриклеточной активности синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты.

Генетически модифицированная микробная клетка обладает активностью синтетазы цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты для переноса цитидин-5'-монофосфата на N-ацетилнейраминовую кислоту с образованием ЦМФ-активированной N-ацетилнейраминовой кислоты (ЦМФ-NeuNAc). В данной области техники известно и описано несколько синтетаз 5'-монофосфо-(ЦМФ)-сиаловой кислоты, например, синтетазы 5'-монофосфо-(ЦМФ)-сиаловой кислоты из Е. coli, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Streptococcus sp. и так далее.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты, предпочтительно гетерологичную синтетазу цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-N-ацетилнейраминовой кислоты, более предпочтительно N-ацетилнейраминат-цитидилтрансферазу NeuA из Е. coli. NeuA из Е. coli (UnitProtKB - Р13266; SEQ ID NO 91) кодируется геном neuA E. coli (SEQ ID NO 92).

Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую и экспрессирующую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в SEQ ID NO 91;

2) нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 92;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с нуклеотидными последовательностями, кодирующими полипептид, представленный в SEQ ID NO 91;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO 92;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения активности N-ацетилнейраминат-цитидилтрансферазы.

Генетически модифицированная микробная клетка обладает сиалилтрансферазной активностью, предпочтительно активностью гетерологичной сиалилтрансферазы и более предпочтительно сиалилтрансферазной активностью, выбранной из группы, состоящей из α-2,3-сиалилтрансферазной активности, α-2,6-сиалилтрансферазной активности и/или α-2,8-сиалилтрансферазной активности. В результате проявления сиалилтрансферазной активности возможно осуществление переноса группировки N-ацетилнейраминовой кислоты с ЦМФ-NeuNAc на акцепторную молекулу, причем указанной акцепторной молекулой является молекула сахарида, с получением сиалилированного сахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит по меньшей мере одну сиалилтрансферазу, предпочтительно по меньшей мере одну гетерологичную сиалилтрансферазу, при этом указанная сиалилтрансфераза может обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью, и/или α-2,6-сиалилтрансферазной активностью, и/или α-2,8-сиалилтрансферазной активностью для переноса группировки NeuNAc с ЦМФ-NeuNAc в качестве донорного субстрата на акцепторный сахарид.

Термин "сиалилтрансфераза", использованный в данном описании, относится к полипептидам, которые могут обладать сиалилтрансферазной активностью. "Сиалилтрансферазная активность" относится к переносу остатка сиаловой кислоты, предпочтительно остатка N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), с донорного субстрата на акцепторную молекулу. Термин "сиалилтрансфераза" включает в себя функциональные фрагменты сиалилтрансфераз, описанных в данной заявке, функциональные варианты сиалилтрансфераз, описанных в данной заявке, и функциональные фрагменты функциональных вариантов. "Функциональный" в этом отношении означает, что фрагменты и/или варианты могут обладать сиалилтрансферазной активностью. Функциональные фрагменты сиалилтрансферазы охватывают укороченные версии сиалилтрансферазы, которая кодируется своим встречающимся в природе геном, при этом такая укороченная версия может обладать сиалилтрансферазной активностью. Примерами укороченных версий являются сиалилтрансферазы, не содержащие так называемой лидерной последовательности, которая обычно служит для придания полипептиду конкретной внутриклеточной локализации. В типичном случае такие лидерные последовательности удаляются из полипептида во время его внутриклеточного транспорта, и они также отсутствуют во встречающейся в природе зрелой сиалилтрансферазе.

Гетерологичная сиалилтрансфераза способна осуществлять перенос остатка сиаловой кислоты с донорного субстрата на акцепторную молекулу. Термин "способный осуществлять" применительно к гетерологичной сиалилтрансферазе относится к сиалилтрансферазной активности гетерологичной сиалилтрансферазы и к тому положению, что для проявления гетерологичной сиалилтрансферазой своей ферментативной активности необходимы подходящие условия реакции. В отсутствие подходящих условий реакции гетерологичная сиалилтрансфераза не обладает своей ферментативной активностью, однако сохраняет свою ферментативную активность и обладает своей ферментативной активностью при возвращении к подходящим условиям реакции. Подходящие условия реакции включают наличие подходящего донорного субстрата, наличие подходящих акцепторных молекул, наличие важных кофакторов, таких как, например, одновалентные или двухвалентные ионы, значение рН в соответствующем диапазоне, подходящая температура и тому подобное. Нет необходимости в том, чтобы соблюдались оптимальные значения для каждого отдельного фактора, влияющего на ферментативную реакцию с участием гетерологичной сиалилтрансферазы, однако условия реакции должны быть такими, чтобы гетерологичная сиалилтрансфераза проявляла свою ферментативную активность. Соответственно, термин "способный осуществлять" исключает любые условия, в которых ферментативная активность гетерологичной сиалилтрансферазы была бы необратимо нарушена, и также исключает воздействие на гетерологичную сиалилтрансферазу любого такого условия. Напротив, "способный осуществлять" означает, что сиалилтрансфераза является ферментативно активной, т.е. обладает своей сиалилтрансферазной активностью, если для сиалилтрансферазы предусмотрены разрешающие условия реакции (включающие все требования, необходимые для осуществления сиалилтрансферазой своей ферментативной активности).

Сиалилтрансферазы можно различить по типу связи с сахаром, которую они образуют. Использованные в данном описании термины "α-2,3-сиалилтрансфераза" и "α-2,3-сиалилтрансферазная активность" относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые катализируют добавление к галактозе, N-ацетилгалактозамину либо к остатку галактозы или N-ацетилгалактозамина, в качестве акцепторной молекулы, остатка сиаловой кислоты с образованием α-2,3-связи. Аналогичным образом, термины "α-2,6-сиалилтрансфераза" и "α-2,6-сиалилтрансферазная активность" относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые катализируют добавление к галактозе, N-ацетил галактоза ми ну либо к остатку галактозы или N-ацетилгалактозамина, в качестве акцепторной молекулы, остатка сиаловой кислоты с образованием α-2,6-связи. Аналогичным образом, термины "α-2,8-сиалилтрансфераза" и "α-2,8-сиалилтрансферазная активность" относятся к полипептидам и их ферментативной активности, которые катализируют добавление к галактозе, N-ацетилгалактозамину либо к остатку галактозы или N-ацетилгалактозамина, в качестве акцепторной молекулы, остатка сиаловой кислоты с образованием α-2,8-связи.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит гетерологичную сиалилтрансферазу, которая предпочтительно выбрана из группы, состоящей из:

1) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая представлена в любой из SEQ ID NO: 1-33;

2) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из аминокислотных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 1-33; и

3) фрагментов любого из полипептидов из (1) и (2).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка трансформирована для того, чтобы содержать молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает и экспрессирует нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную сиалилтрансферазу. Предпочтительно, нуклеотидную последовательность, которая может быть выбрана из Таблицы 1. В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 34-66;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-33;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-66;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной микробной клетке, для обеспечения проявления сиалилтрансферазной активности.

Выражение "любая из SEQ ID NO: 1-33" относится к "любой SEQ ID NO из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13. SEQ ID NO 14. SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32 и SEQ ID NO 33. Тот же принцип применим к выражению "любая из SEQ ID NO: 34-66". Вообще говоря, выражение "любая из SEQ ID NO: X-Z", где "X" и "Z" представляют собой натуральные числа, относится ко всем последовательностям (нуклеотидным последовательностям или аминокислотным последовательностям), представленным в любой из "SEQ ID NO", содержащих идентификационный номер от X до Z.

Помимо этого, генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована с возможностью экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную сиалилтрансферазу. Для этого нуклеотидная последовательность, кодирующая гетерологичную сиалилтрансферазу, функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную сиалилтрансферазу в генетически модифицированной клетке.

Термин "функционально связанный", использованный в данном описании, относится к функциональной связи между нуклеотидной последовательностью, кодирующей гетерологичную сиалилтрансферазу, и второй нуклеотидной последовательностью - последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор, оператор, энхансер, регулятор, ряд сайтов связывания транскрипционных факторов, терминатор транскрипции, сайт связывания рибосомы), причем данная последовательность контроля экспрессии оказывает влияние на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичную сиалилтрансферазу. Соответственно, термин "промотор" означает последовательности ДНК, которые обычно "предшествуют" гену" в полимерной молекуле ДНК и предоставляют сайт инициации транскрипции в матричной РНК (мРНК). "Регуляторные" последовательности ДНК, обычно также расположенные "вверх по течению от" гена (т.е. предшествующие гену) в указанной полимерной молекуле ДНК, связывают белки, которые определяют частоту (или степень) инициации транскрипции. Совместно именуемые как "промоторная/регуляторная" или "контрольная" последовательность ДНК, эти последовательности, "предшествующие" выбранному гену (или серии генов) в функциональной полимерной молекуле ДНК, действуют совместно в отношении определения того, будет ли происходить транскрипция (и возможно экспрессия) гена. Последовательности ДНК, которые "следуют" за геном в полимерной молекуле ДНК и обеспечивают наличие сигнала терминации транскрипции в мРНК, именуются как последовательности "терминатора" транскрипции.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза, которая может обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью, выбрана из группы, состоящей из:

1) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-27;

2) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из аминокислотных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 1-27; и

3) фрагментов любого из полипептидов из (1) и (2).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную гетерологичную сиалилтрансферазу, которая может обладать а-2,3-сиалилтрансферазной активностью, при этом указанная по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в любой из SEQ ID NO: 1-27;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 34-60;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 1-27;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-60;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной клетке, для обеспечения проявления α-2,3-сиалилтрансферазной активности.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза, которая может обладать α-2,3-сиалилтрансферазной активностью, имеет относительную эффективность по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 200 раз, по меньшей мере в 300 раз, по меньшей мере в 1000 раз, по меньшей мере в 10000 раз превышающую относительную эффективность сиалилтрансферазы, представленной в SEQ ID NO 27, по данным количественного анализа сиалилирования лакто-N-тетраозы (LNT) с применением жидкостной хроматографии в сочетании стандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS).

В другом воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза может обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью.

В дополнительном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза, которая может обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью, выбрана из группы, состоящей из:

1) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 28-33;

2) полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность или состоящих из аминокислотной последовательности, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из аминокислотных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 28-33; и

3) фрагментов любого из полипептидов из (1) и (2).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую указанную гетерологичную сиалилтрансферазу, которая может обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью, при этом указанная по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

1) нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в любой из SEQ ID NO: 28-33;

2) нуклеотидных последовательностей, которые представлены в любой из SEQ ID NO: 61-66;

3) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с одной из нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, который представлен в любой из SEQ ID NO: 28-33;

4) нуклеотидных последовательностей, имеющих идентичность последовательности по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше 99% с любой из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 61-66;

5) нуклеотидных последовательностей, комплементарных любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3) и (4); и

6) фрагментов любой из нуклеотидных последовательностей из (1), (2), (3), (4) и (5);

при этом указанная нуклеотидная последовательность функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, воздействуя на транскрипцию и/или трансляцию указанной нуклеотидной последовательности в генетически модифицированной клетке, для обеспечения проявления α-2,6-сиалилтрансферазной активности.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза, которая может обладать α-2,6-сиалилтрансферазной активностью, имеет относительную эффективность по меньшей мере в 100 раз, более предпочтительно по меньшей мере в 200 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 300 раз превышающую относительную эффективность сиалилтрансферазы, представленной в SEQ ID NO 33, по данным количественного анализа сиалилирования LNT (от англ. lacto-N-neotetraose - лакто-N-неотетраоза).

В дополнительном и/или альтернативном воплощении гетерологичная сиалилтрансфераза может обладать α-2,8-сиалилтрансферазной активностью. Примером гетерологичной сиалилтрансферазы, которая может обладать α-2,8-сиалилтрансферазной активностью, является сиалилтрансфераза CstlI из Campylobacter jejunii ОН4384.

Сиалилтрансфераза способна осуществлять перенос остатка сиаловой кислоты, например, остатка N-ацетилнейраминовой кислоты (NeuSAc), с донорного субстрата, например, ЦМФ-Neu5Ac, на акцепторную молекулу. Акцепторной молекулой является молекула сахарида, предпочтительно молекула сахарида, приведенного в Таблице 2.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой моносахарид, предпочтительно моносахарид, выбранный из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамина, галактозы и N-ацетилгалактозамина.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой дисахарид, предпочтительно дисахарид, выбранный из группы, состоящей из лактозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, лактулозы и мелибиозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой трисахарид, предпочтительно трисахарид, выбранный из группы, состоящей из раффинозы, лакто-N-триозы II, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы и 6'-галактозиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой тетрасахарид, предпочтительно тетрасахарид, выбранный из группы, состоящей из лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы и 3-фукозил-6'-сиалиллактозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении акцепторная молекула представляет собой пентасахарид, предпочтительно пентасахарид, выбранный из группы, состоящей из сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы I и лакто-N-неофукопентаозы V.

Термин "функциональный вариант", использованный в данном описании применительно к упомянутому в данной заявке ферменту, относится к полипептидным вариантам указанных ферментов, не утратившим активности, и последовательность которых по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности указанного фермента. При этом принимается во внимание возможность некоторой вариабельности в данных по геномным последовательностям, из которых эти полипептиды происходят, и также возможность того, что некоторые из аминокислот, присутствующих в этих полипептидах, могут быть заменены без существенного затрагивания каталитической активности фермента.

Термин "функциональный вариант" также включает в себя полипептидные варианты указанных ферментов, которые представляют собой укороченные варианты фермента без существенной утраты каталитической активности. Таким образом, аминокислотная последовательность укороченных вариантов может отличаться от аминокислотных последовательностей указанного фермента в том смысле, что отсутствует одна аминокислота, отсутствуют две аминокислоты или участок, состоящий из следующих друг за другом аминокислот числом больше двух. Укорочение может быть произведено на амино-конце (N-конце), на карбоксильном конце (С-конце) и/или внутри аминокислотной последовательности указанного фермента.

Термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор, сигнальная последовательность или ряд сайтов связывания транскрипционных факторов) и второй нуклеиновокислотной последовательностью, причем данная последовательность контроля экспрессии оказывает влияние на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.

Следует понимать, что в случае микробной клетки, уже несущей один или несколько генов, кодирующих указанные ферменты, и экспрессирующей указанные гены способом, достаточным для продуцирования NeuNAc, ЦМФ-NeuNAc и/или сиалилированного сахарида, нет необходимости в проведении генетической модификации с целью завершения биосинтеза сиаловой кислоты и переноса группировки сиаловой кислоты на акцепторный сахарид, но тем не менее генетическая модификация может быть осуществлена для того, чтобы изменить уровень экспрессии одного или более указанных генов с целью повышения содержания внутри клетки одного или нескольких продуктов указанных генов, как например, с целью повышения количества глутамин:фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы, глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазы, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы и/или синтазы N-ацетилнейраминовой кислоты, что повышает таким образом скорость биосинтеза NeuSAc и, в связи с этим, сиалилированного сахарида, в генетически модифицированной клетке.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении в генетически модифицированной микробной клетке синтезируется больше ФЕП, чем в клетке дикого типа. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована для того, чтобы обладать повышенным путем биосинтеза ФЕП. Предпочтительно, генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована для того, чтобы обладать более высокой активностью фосфоенолпируват-синтазы, например, в том смысле, что ген ppsA, кодирующий фосфоенолпируват-синтазу, сверхэкспрессирован, и/или в том смысле, что не встречающиеся в природе микроорганизмы содержат по меньшей мере одну дополнительную копию нуклеотидной последовательности, что обеспечивает экспрессию фосфоенолпируват-синтазы или ее функционального варианта. Сверхэкспрессия гена ppsA повышает внутриклеточный синтез ФЕП, в результате чего больше молекул ФЕП доступны для продуцирования сиаловой кислоты. Например, подходящей фосфоенолпируват-синтазой является PpsA из Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую PpsA из Е. coli или ее функциональный вариант. Указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая PpsA из Е. coli или ее функциональный вариант, имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью гена ppsA Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка помимо этого содержит один или более генов, кодирующих полипептид, который может обладать активностью фермента, выбранного из группы, состоящей из пермеазы сахарозы, гидролазы сахарозы, фруктокиназы, L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы, глюкозамин-6-фосфат-N-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы, синтазы сиаловых кислот, фосфоенолпируват-синтазы, при этом предпочтительно, что по меньшей мере один из этих генов, предпочтительно все гены, сверхэкспрессируется/сверхэкспрессируются в генетически модифицированной микробной клетке по сравнению с микробной клеткой дикого типа.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении путь катаболизма сиаловых кислот, который протекает естественным образом в линии клеток-предшественников для генетически модифицированной микробной клетки, не работает в генетически модифицированной микробной клетке.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способа и генетически модифицированной микробной клетки у данной генетически модифицированной микробной клетки отсутствует активность, или она обладает более низкой активностью, по сравнению с клеткой-предшественником генетически модифицированной микробной клетки, одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из α-N-ацетилгалактозаминидазы (например, NagA), N-ацетилглюкозамин-киназы (например, NagK), N-ацетилнейраминат-лиазы (синоним: альдолазы N-ацетилнейраминовой кислоты, например, NanA), β-галактозидазы, глюкозамин-6-фосфат-дезаминазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-дезацетилазы, N-ацетилманнозамин-киназы и/или N-ацетилманнозамин-6-фосфат-эпимеразы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении способа и генетически модифицированной микробной клетки генетически модифицированная микробная клетка помимо этого содержит один или более генов, кодирующих полипептид, который может обладать активностью фермента, выбранного из группы, состоящей из N-ацетилглюкозамин-1-фосфат-уридилтрансферазы, глюкозамин-1-фосфат-ацетилтрансферазы, фосфоглюкозамин-мутазы, УДФ-N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы, УДФ-галактозо-4-эпимеразы, галактозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы, фосфоглюкомутазы, глюкозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы, фосфоманномутазы, маннозо-1-фосфат-гуанозилтрансферазы, ГДФ(гуанозиндифосфат)-манноза-4,6-дегидратазы, ГДФ-L-фукозосинтазы и фукозокиназы/L-фукозо-1-фосфат-гуанилтрансферазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из функционально активной пермеазы лактозы, функционально активного переносчика (экспортера) сиаловых кислот, причем она предпочтительно содержит и экспрессирует по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, кодирующую один компонент, выбранный из группы, состоящей из функционально активной пермеазы лактозы, функционально активной пермеазы сахарозы, функционально активного переносчика (экспортера) сиаловых кислот, при этом предпочтительно, чтобы в данной клетке сверхэкспрессировалась по меньшей мере одна из этих нуклеотидных последовательностей.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка дополнительно модифицирована с возможностью перенесения указанного единственного источника углерода в данную клетку посредством механизма без потребления ФЕП.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка обладает функциональной системой утилизации сахарозы. Указанная функционально активная система утилизации сахарозы делает возможным импорт в клетку экзогенно поставляемой сахарозы и ее гидролиз, в результате чего получаемые моносахариды глюкоза и фруктоза могут утилизироваться метаболическим путем благодаря метаболизму генетически модифицированной клетки и в целях получения желаемого сиалилированного олигосахарида.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована для того, чтобы обладать функционально активной системой утилизации сахарозы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении система утилизации сахарозы у не встречающегося в природе микроорганизма содержит систему переноса молекул сахарозы и протонов по механизму симпорта, фруктокиназу, инвертазу и репрессор сахарозного оперона.

Подходящей системой переноса молекул сахарозы и протонов по механизму симпорта является CscB, кодируемая геном cscB, например, CscB из Е. coli (UniProtKB - Р30000), кодируемая геном cscB Е. coli.

Подходящей фруктокиназой (ЕС 2.7.1.4) является CscK, кодируемая геном cscK, например, CscK из Е. coli (UniProtKB - Р40713), кодируемая геном cscK E. coli.

Подходящей инвертазой (ЕС 3.2.1.26), которая катализирует гидролиз концевых нередуцирующих β-D-фруктофуранозидных остатков в β-D-фруктофуранозидах, является CscA, например, CscA из Е. coli (UniProtKB -086076), кодируемая геном cscA E. coli.

Подходящим репрессором сахарозного оперона является CscR, кодируемый геном cscR, например, CscR из Е. coli (UniProtKB - Р62604), кодируемый геном cscR Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная клетка генетически модифицирована для того, чтобы обладать системой переноса молекул сахарозы и протонов по механизму симпорта, фруктокиназой, инвертазой и репрессором сахарозного оперона или функционально активными вариантами любого из этих белков.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная клетка генетически модифицирована для того, чтобы обладать молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидные последовательности, кодирующие систему переноса молекул сахарозы и протонов по механизму симпорта, фруктокиназу, инвертазу и репрессор сахарозного оперона, для экспрессии указанных системы переноса молекул сахарозы и протонов по механизму симпорта, фруктокиназы, инвертазы и репрессора сахарозного оперона. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная клетка генетически модифицирована с возможностью экспрессировать гены cscB, cscK, cscA, предпочтительно гены cscB, cscK, cscA и cscR E. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая функционально активный вариант CscB, CscK, CscA или CscR, имеет идентичность последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% с последовательностью cscB, cscK, cscA или cscR Е. coli, соответственно.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении такой не встречающийся в природе микроорганизм экспрессирует β-галактозид-пермеазу и β-галактозидазу.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении такой не встречающийся в природе микроорганизм генетически модифицирован с возможностью экспрессировать р-галактозидпермеазу, предпочтительно пермеазу лактозы LacY из Е. coli (SEQ ID NO 93) или ее функционально активный вариант и β-галактозидазу, предпочтительно LacZ из Е. coli (SEQ ID NO 95) или ее функционально активный вариант. В дополнительном и/или альтернативном воплощении такой не встречающийся в природе микроорганизм генетически модифицирован с возможностью нести в себе молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую β-галактозид-пермеазу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую LacY из Е. coli (SEQ ID NO 94) или ее функционально активный вариант, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую β-галактозидазу, предпочтительно нуклеотидную последовательность, кодирующую LacZ из Е. coli (SEQ ID NO 96) или ее функционально активный вариант.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая LacY из Е. coli или ее функционально активный вариант, имеет идентичность последовательности с последовательностью lacY Е. coli, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая LacZ из Е. coli или ее функционально активный вариант, имеет идентичность последовательности с последовательностью lacZ Е. coli, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%.

Наличие не встречающегося в природе микроорганизма, который может продуцировать ЦМФ-Neu5Ac и который экспрессирует функционально активную β-галактозид-пермеазу и функционально активную β-галактозидазу, предусматривает культивирование указанного не встречающегося в природе микроорганизма на лактозе как на единственном источнике углерода.

Генетически модифицированная микробная клетка, которая может продуцировать сиалилированные сахариды, возможно может иметь дополнительные свойства и может быть генетически модифицирована для того, чтобы обладать этими дополнительными свойствами. Считается, что эти дополнительные свойства улучшают продуктивность такого не встречающегося в природе микроорганизма, приводя к более высоким выходам сиалилированных сахаридов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована с возможностью аннулирования активности УДФ-глюкоза:ундекапренилфосфат-глюкозо-1-фосфат-трансферазы, предпочтительно посредством делетирования гена wcaJ или его функционально активного варианта, посредством нарушения экспрессии гена wcaJ или его функционально активного варианта или посредством аннулирования активности фермента WcaJ в результате внесения мутаций в кодирующий белок участок, вследствие чего полипептид, кодируемый измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает активностью фермента WcaJ. WcaJ кодирует УДФ-глюкоза:ундекапренилфосфат-глюкозо-1-фосфат-трансферазу. Указанная УДФ-глюкоза:ундекапренилфосфат-глюкозо-1-фосфат-трансфераза представляет собой первый фермент в биосинтезе колановой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована в том смысле, что ген β-галактозидазы (lacZ) делетирован, в том смысле, что экспрессия гена β-галактозидазы нарушена, или в том смысле, что нуклеотидная последовательность кодирующего белок участка в гене β-галактозидазы изменена, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает ферментативной активностью β-галактозидазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована в том смысле, что ген, кодирующий галактокиназу (например, ген galK), делетирован, в том смысле, что экспрессия гена galK нарушена, или в том смысле, что нуклеотидная последовательность кодирующего белок участка в гене galK изменена, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной(ыми) измененной(ыми) нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), не обладает ферментативной активностью галактокиназы. Делетирование или инактивация гена gal/K/GalK имеет то преимущество, что генетически модифицированная микробная клетка может утилизировать галактозу в качестве акцепторного субстрата только в случае реакций сиалилирования.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована в том смысле, что ген, кодирующий N-ацетилгалактозаминидазу (nagA), делетирован, что его экспрессия нарушена или в том смысле, что нуклеотидная последовательность кодирующего белок участка изменена, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной(ыми) измененной(ыми) нуклеотидной(ыми) последовательностью(ями), не обладает ферментативной активностью N-ацетилгалактозаминидазы. Делеция или инактивация nagA/NagA имеет то преимущество, что генетически модифицированная микробная клетка может утилизировать GlcNAc или GlcNAc-6-фосфат в качестве акцептора только в случае реакций сиалилирования.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована с возможностью аннулирования фукозоизомеразной активности, предпочтительно посредством делетирования гена fucI, посредством нарушения экспрессии гена fucI или посредством модификации кодирующего белок участка в гене fucI, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает активностью фукозоизомеразы. Например, L-фукозоизомераза FucI из Е. coli (UniProtKB - Р69922) кодируется геном fucI Е. coli.

Фукулозокиназа катализирует фосфорилирование фукозы. Фукулозокиназа представляет собой второй фермент в подпути, в котором синтезируются L-лактальдегид и глицерофосфат из L-фукозы. Фукулозокиназа FucK из Е. coli (UniProtKB - Р11553) кодируется геном fucK Е. coli. Фукулозокиназа из Е. coli также может катализировать фосфорилирование, с более низкой эффективностью, D-рибулозы, D-ксилулозы и D-фруктозы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована с возможностью аннулирования фукозоизомеразной активности, предпочтительно посредством делетирования гена fucK, или посредством нарушения экспрессии гена fucK, или посредством внесения мутаций в кодирующий белок участк гена fucK, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает активностью фукозоизомеразы.

N-Ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилаза катализирует следующую реакцию: N-ацетил-D-галактозамин-6-фосфат + H₂O → D-галактозамин-6-фосфат + ацетат.N-Ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилаза кодируется геном agaA. В Е. coli N-ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилаза AgaA (UniProtKB - Р42906) кодируется геном agaA Е. coli.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка генетически модифицирована с возможностью аннулирования активности N-ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилазы, предпочтительно путем делетирования гена agaA, путем нарушения экспрессии гена agaA или путем внесения мутаций в кодирующий белок участок в гене agaA, вследствие чего полипептид, кодируемый указанной измененной нуклеотидной последовательностью, не обладает активностью N-ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилазы.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одна генетически модифицированная микробная клетка обладает повышенным продуцированием одного или более нуклеотид-активированных сахаров, выбранных из группы, состоящей из УДФ-N-ацетилглюкозамина, УДФ-галактозы и ГДФ-фукозы. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна генетически модифицированная микробная клетка была дополнительно генетически модифицированадля того, чтобы обладать повышенным продуцированием одного или нескольких указанных нуклеотид-активированных сахаров. Продуцирование по меньшей мере одного из указанных нуклеотид-активированных сахаров в такой дополнительно генетически модифицированной клетке повышено по сравнению с продуцированием того(тех) же нуклеотид-активированного(ых) сахара(ов) в клетке-предшественнике дополнительно генетически модифицированной микробной клетки до подвергания ее дополнительной генетической модификации с целью обладания повышенным продуцированием по меньшей мере одного из указанных нуклеотид-активированных сахаров.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одна микробная клетка дополнительно генетически модифицирована с возможностью сверхэкспрессировать один или несколько генов, кодирующих полипептид, который может обладать активностью фермента, выбранного из группы, состоящей из L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфат-уридилтрансферазы, глюкозамин-1-фосфат-ацетилтрансферазы, фосфоглюкозамин-мутазы, УДФ-галактозо-4-эпимеразы, галактозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы, фосфоглюкомутазы, глюкозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы, фосфоманномутазы, маннозо-1-фосфат-гуанозилтрансферазы, ГДФ-маннозо-4,6-дегидратазы, ГДФ-L-фукозосинтазы и фукозокиназы/L-фукозо-1-фосфат-гуанилтрансферазы.

В настоящее время, и как очевидно в общей области техники и в данном описании применительно к каждому полинуклеотиду или каждой нуклеиновой кислоте, рассмотренных в данном описании, соответственно, указанная сверхэкспрессия одного или нескольких генов или полипептидов, представляет собой сверхэкспрессию по сравнению с клеткой-предшественником дополнительно генетически модифицированной микробной клетки до подвергания ее дополнительной генетической модификации с целью обладания сверхэкспрессией указанных одного или нескольких генов или полипептидов.

Сверхэкспрессия одного или более из указанных генов увеличивает количество соответствующих полипептидов, т.е. фермента(ов), в генетически модифицированной микробной клетке, и поэтому в данной клетке повышается активность соответствующих ферментов, необходимых для повышения внутриклеточного продуцирования сиалилированных сахаридов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере у одной генетически модифицированной клетки отсутствует активность, или она обладает более низкой активностью, одного или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из β-галактозидазы, глюкозамин-6-фосфат-дезаминазы, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-дезацетилазы, N-ацетилманнозамин-киназы, N-ацетилманнозамин-6-фосфат-эпимеразы и альдолазы N-ацетилнейраминовой кислоты, по сравнению с клеткой до подвергания ее генетической модификации.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении один или несколько генов, кодирующих β-галактозидазу, глюкозамин-6-фосфат-дезаминазу, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-дезацетилазу, N-ацетилманнозамин-киназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфат-эпимеразу и альдолазу N-ацетилнейраминовой кислоты, делетирован/делетированы из генома генетически модифицированной клетки, или экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих β-галактозидазу, глюкозамин-6-фосфат-дезаминазу, N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-дезацетилазу, N-ацетилманнозамин-киназу, N-ацетилманнозамин-6-фосфат-эпимеразу и альдолазу N-ацетилнейраминовой кислоты, инактивирована или по меньшей мере ослаблена в генетически модифицированной клетке в результате проведения дополнительной генетической модификации клетки. Экспрессия указанных генов ослаблена в дополнительно генетически модифицированной клетке по сравнению с клеткой-предшественником дополнительно генетически модифицированной клетки до подвергания ее дополнительной генетической модификации с целью обладания ослабленной сверхэкспрессией указанных генов.

Генетически модифицированная микробная клетка предпочтительно представляет собой прокариотическую клетку. Соответствующие микробные клетки включают клетки дрожжей, клетки бактерий, клетки архебактерий, клетки водорослей и клетки грибов.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная микробная клетка представляет собой бактериальную клетку, предпочтительно бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Sporolactobacillus spp., Micromonospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp.и Pseudomonas. Подходящими бактериальными видами являются Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermophiies, Escherichia coli, Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus iactis, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fiuorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophiies и Xanthomonas campestris.

В альтернативном воплощении генетически модифицированная клетка представляет собой клетку дрожжей, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из Saccharomyces sp,, в частности, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis sp., Pichia sp., в частности, Pichia pastoris, Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Yarrowia sp., Rhodotorula sp.и Schizosaccharomyces sp.

Генетически модифицированная клетка модифицирована методами генетической инженерии, чтобы содержать путь биосинтеза NeuNAc, активность синтетазы цитидин-5'-монофосфо-(ЦМФ)-сиаловой кислоты и активность сиалилтрансферазы.

Термин "генетически модифицированная", использованный в данном описании, относится к модификации генотипа микробной клетки с использованием методов молекулярной биологии. Модификация генотипа микробной клетки может включать перенос генов в пределах видовых границ и/или через видовые границы, вставку, делетирование, замену и/или модификацию нуклеотидов, триплетов, генов, открытых рамок считывания, промоторов, энхансеров, терминаторов и других нуклеотидных последовательностей, опосредующих и/или регулирующих генную экспрессию. Модификация генотипа микробной клетки направлена на создание генетически модифицированного микроорганизма, обладающего особыми, желаемыми свойствами. Генетически модифицированные микробные клетки могут содержать один или более генов, которых нет в нативной (не подвергнутой генетической модификации) форме данной клетки. Методы введения молекул экзогенной нуклеиновой кислоты и/или вставки молекул экзогенной нуклеиновой кислоты (рекомбинантной, гетерологичной) в наследственную информацию клетки, с целью вставки, делетирования или изменения нуклеотидной последовательности генетической информации клетки, известны специалисту в данной области. Генетически модифицированные микробные клетки могут содержать один или более генов, которые имеются в нативной форме данной клетки, причем указанные гены модифицируют и повторно вводят в эту микробную клетку искусственным способом. Термин "генетически модифицированный" также охватывает микробные клетки, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся эндогенной для данной клетки, и которая модифицирована без извлечения молекулы данной нуклеиновой кислоты из этой клетки. Такие модификации включают модификации, осуществляемые с использованием замещения генов, сайт-специфических мутаций и связанных с ними методов.

Термин "гетерологичный", использованный в данном описании, относится к полипептиду, аминокислотной последовательности, молекуле нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, который(ая) является чужеродным(ой) для клетки или организма, т.е. к полипептиду, аминокислотной последовательности, молекуле нуклеиновой кислоты или нуклеотидной последовательности, который(ая) не встречается в природе в указанной клетке или указанном организме. "Гетерологичная последовательность", или "гетерологичная нуклеиновая кислота", или "гетерологичный полипептид", как использовано в данном описании, означает все только что перечисленное, которое происходит из источника, чужеродного для данной конкретной клетки хозяина (например, из другого вида) или, если происходит из того же источника, то является модифицированной(ым) по сравнению со своей исходной формой. Таким образом, гетерологичная нуклеиновая кислота, функционально связанная с промотором, происходит из источника, отличающегося от того, из которого происходит промотор, или, в случае происхождения из того же источника, является модифицированной по сравнению с ее первоначальной формой. Гетерологичная последовательность может быть стабильно введена в геном микробной клетки хозяина посредством, например, трансфекции, трансформации, конъюгирования или трансдукции, в результате чего клетка хозяина становится генетически модифицированной. Могут быть применены методы, которые будут зависеть от клетки хозяина и подлежащей введению последовательности. Специалисту в данной области техники известны различные методы, и они описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Соответственно, "гетерологичный полипептид" представляет собой полипептид, который не встречается в природе в данной клетке, и "гетерологичная сиалилтрансфераза" представляет собой сиалилтрансферазу, которая не встречается в природе в данной микробной клетке.

Согласно одному из аспектов предложен способ, посредством которого сиалилированный сахарид может быть получен путем ферментации, т.е. посредством биокатализа с применением цельных клеток, используя генетически модифицированную микробную клетку, как изложено в данном описании ранее. Для получения указанного сиалилированного сахарида нет необходимости в добавлении в ферментационный бульон N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и/или N-ацетилнейраминовой кислоты и/или в культивировании генетически модифицированной микробной клетки в присутствии N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и/или N-ацетилнейраминовой кислоты для внутриклеточного биосинтеза сиалилированного сахарида.

В данном способе по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в ферментационном бульоне и в условиях, позволяющих получать сахарид, содержащий по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении ферментационный бульон содержит по меньшей мере один источник углерода, при этом по меньшей мере один источник углерода предпочтительно выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, глицерина и их комбинаций.

Хотя в способе и в генетически модифицированной/ модифицированной микробной клетке используется источник углерода, нет необходимости добавлять в ферментационный бульон глюкозамин, и/или N-ацетилнейраминовую кислоту, и/или N-ацетил глюкозамин, и/или N-ацетилманнозамин, поскольку N-ацетилнейраминовая кислота продуцируется внутриклеточно генетически модифицированной микробной клеткой. Таким образом, в дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в отсутствие и/или без добавления одного или более чем одного, выбранного из группы, состоящей из глюкозамина, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилманнозамина и N-ацетилнейраминовой кислоты. Генетически модифицированную микробную клетку можно культивировать в отсутствие и/или без добавления галактозы, если галактозу не поставляют в качестве акцепторного субстрата для реакции с участием сиалилтрансферазы. В дополнительном и/или альтернативном воплощении по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в присутствии одного или нескольких моносахаридов (например, галактозы), дисахаридов (например, лактозы), трисахаридов (например, лакто-N-триозы II), тетрасахаридов (например, лакто-N-тетраозы) и/или пентасахаридов (например, сиалиллакто-N-тетраозы а).

Согласно дополнительному и/или альтернативному воплощению по меньшей мере одну генетически модифицированную микробную клетку культивируют в присутствии по меньшей мере одного акцепторного субстрата, выбранного из группы, состоящей из галактозы, N-ацетил галактозами на, N-ацетилглюкозамина, лактозы, лактулозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, лакто-N-триозы, 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина, 3'-галактозиллактозы, 6'-галактозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, 2',3-дифукозиллактозы, 3-фукозил-3'-сиалиллактозы и 3-фукозил-6'-сиалиллактозы. Эти субстраты импортируются в клетку и используются в данной клетке в качестве акцепторных молекул.

Генетически модифицированной клетке для роста, размножения и продуцирования сиалилированных олигосахаридов необходим источник углерода. В дополнительном и/или альтернативном воплощении генетически модифицированная клетка может расти на недорогом единственном источнике углерода, таком как, например, глицерин, глюкоза или сахароза. Указанный единственный источник углерода предоставляет исходный продукт для биосинтеза ЦМФ-сиаловых кислот в генетически модифицированной клетке. Поэтому, чтобы получить сиалилированные олигосахариды, нет необходимости в культивировании генетически модифицированной клетки в присутствии Neu5Ac, ManNAc, GlcNAc или глюкозамина (GlcN).

Способ включает возможную стадию извлечения сиалилированного сахарида, который был продуцирован по меньшей мере одной генетически модифицированной микробной клеткой в процессе ее культивирования в ферментационном бульоне. Сиалилированный сахарид можно извлечь из ферментационного бульона после удаления генетически модифицированных микробных клеток, например, путем центрифугирования, и/или можно извлечь из клеток, например, в том смысле, что клетки собирают из ферментационного бульона путем центрифугирования и подвергают стадии лизирования клеток. После этого сиалилированные сахариды далее можно очистить от ферментационного бульона и/или клеточных лизатов подходящими методами, известными специалисту в данной области. Подходящие методы включают микрофильтрацию, ультрафильтрацию, диафильтрацию, хроматографию по типу хроматографии с псевдодвижущимся слоем, электродиализ, обратный осмос, гель-фильтрацию, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и тому подобные методы.

Способ и генетически модифицированную микробную клетку, применяемую в данном способе, используют для получения сиалилированного сахарида. Термин "сиалилированный сахарид" относится к молекуле сахарида, содержащей по меньшей мере одну группировку N-ацетилнейраминовой кислоты.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении сиалилированный сахарид представляет собой олигосахарид. Термин "олигосахарид", использованный в данном описании, относится к полимерам, состоящим из моносахаридных остатков, при этом указанные полимеры содержат по меньшей мере два моносахаридных остатка, но не больше 10 моносахаридных остатков, предпочтительно не больше 7 моносахаридных остатков. Олигосахариды либо представляют собой линейную цепь моносахаридов, либо являются разветвленными. Помимо этого, моносахаридные остатки в олигосахарид ах могут иметь ряд химических модификаций. Соответственно, олигосахариды могут содержать одну или более несахаридных группировок. Термин "сиалилированный олигосахарид", использованный в данном описании, относится к олигосахаридам, содержащим одну или более группировок N-ацетилнейраминовой кислоты.

Согласно дополнительному и/или альтернативному воплощению сиалилированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы II, 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина и 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина.

Согласно другому аспекту изобретения предложено применение генетически модифицированной микробной клетки, описанной в данной заявке ранее, для получения сиалилированного сахарида в способе ферментации с применением цельных клеток, т.е. сиалилированный сахарид синтезируют, используя генетически модифицированную микробную клетку.

Согласно другому аспекту изобретения предложен сиалилированный сахарид, полученный способом и/или посредством использования генетически модифицированной микробной клетки, которые описаны в данной заявке ранее. В дополнительном и/или альтернативном воплощении сиалилированный сахарид представляет собой сиалилированный олигосахарид, предпочтительно сиалилированный олигосахарид, выбранный из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы II, 3'-сиалилгалактозы, 6'-сиалилгалактозы, 3'-сиалил-N-ацетиллактозамина и 6'-сиалил-N-ацетиллактозамина.

Согласно другому аспекту изобретения предложено применение сиалилированного сахарида, полученного способом, описанным в данной заявке ранее, и/или посредством использования генетически модифицированной микробной клетки, описанной в данной заявке ранее, для приготовления пищевой композиции.

Таким образом, согласно другому аспекту изобретения предложена пищевая композиция, содержащая по меньшей мере один сиалилированный сахарид, предпочтительно по меньшей мере один сиалилированный олигосахарид, который получен способом и/или с использованием генетически модифицированной микробной клетки, которые описаны в данной заявке ранее. В дополнительном и/или альтернативном воплощении сиалилированный олигосахарид выбран из группы, состоящей из 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, сиалиллакто-N-тетраозы а, сиалиллакто-N-тетраозы b, сиалиллакто-N-тетраозы с, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы а, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы b, фукозил-сиалиллакто-N-тетраозы с, дисиалиллакто-N-тетраозы, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы I, фукозилдисиалиллакто-N-тетраозы II.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении пищевая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один нейтральный НМО, предпочтительно 2'-FL.

В дополнительном и/или альтернативном воплощении пищевая композиция содержит 3-SL, 6-SL и 2'-FL.

В дополнительном воплощении пищевая композиция выбрана из группы, состоящей из лекарственных, фармацевтических композиций, смеси для грудных детей и пищевых добавок.

Пищевая композиция может быть представлена в жидкой форме или в твердой форме, включая, но не ограничиваясь этим, порошки, гранулы, хлопья и пеллеты.

Далее настоящее изобретение будет описано применительно к конкретным воплощениям, однако данное изобретение не ограничивается ими, а только формулой изобретения. Кроме того, термины "первый", "второй" и тому подобные в описании и в формуле изобретения используются для различения схожих элементов и необязательно для описания последовательности либо во времени, либо в пространстве, либо при ранжировании, либо для описания любым другим образом. Следует понимать, что используемые таким образом термины являются взаимозаменяемыми при соответствующих обстоятельствах, и что воплощения изобретения, описанные в данной заявке, могут работать в других последовательностях, чем изложено или проиллюстрировано в данном описании.

Нужно отметить, что термин "содержащий", использованный в формуле изобретения, не следует интерпретировать как термин, ограниченный перечисленными ниже средствами; он не исключает другие элементы или стадии. Таким образом, его следует интерпретировать как термин, конкретизирующий наличие указанных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, которые упомянуты, и не исключающий наличия или добавления одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий или компонентов либо их групп. Таким образом, объем выражения "устройство, содержащее средства А и В", не следует ограничивать устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Применительно к настоящему изобретению это означает, что единственными релевантными компонентами данного устройства являются А и В.

Упоминание по всему этому описанию "одного из воплощений" или "какого-либо воплощения" означает, что по меньшей мере в одно из воплощений настоящего изобретения включены конкретный признак, конкретная структура или конкретное характерное свойство, описанные вместе с данным воплощением. Таким образом, случаи появления в различных местах по всему данному описанию фраз "в одном из воплощений" или "в воплощении" не обязательно всегда относятся к одному и тому же воплощению, но относиться могут. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или нескольких воплощениях, что будет очевидно специалисту средней квалификации в данной области техники из этого описания.

Аналогичным образом, должно быть очевидно, что в описании типичных воплощений изобретения различные признаки данного изобретения иногда сгруппированы вместе в одном воплощении, на одном чертеже или их описании с целью оптимизации раскрытия и помощи в понимании одного или более чем одного из различных аспектов изобретения. Однако, этот способ раскрытия не следует интерпретировать как отражение намерения, что заявляемое изобретение требует большего количества признаков, чем явно указанные в каждом пункте формулы изобретения. Скорее, как отражено следующей далее формулой изобретения, аспекты изобретения заключаются не во всех признаках одного описанного выше воплощения. Таким образом, формула изобретения, приведенная после подробного описания, тем самым явно включена в это подробное описание, причем каждый пункт формулы изобретения имеет (юридическую) силу сам по себе в качестве отдельного воплощения данного изобретения.

Кроме того, хотя некоторые воплощения, описанные в данной заявке, включают в себя некоторые, но не другие признаки, включенные в другие воплощения, подразумевается, что комбинации признаков различных воплощений находятся в пределах объема изобретения и образуют другие воплощения, что будет понятно специалистам в данной области техники. Например, в приведенной далее формуле изобретения любое из заявляемых воплощений можно использовать в любой комбинации.

Кроме того, некоторые из воплощений описаны в данной заявке как способ или комбинация элементов способа, который может быть реализован с использованием процессора компьютерной системы или другого средства выполнения данной функции. Таким образом, процессор с необходимыми инструкциями для выполнения такого способа или элемента способа образует средство для осуществления способа или элемента способа. Кроме того, описанный в данной заявке элемент воплощения устройства представляет собой пример средства для осуществления функции, выполняемой этим элементом с целью осуществления изобретения.

В описании и графических материалах, представленных в данной заявке, приведены многочисленные конкретные подробности. Однако очевидно, что воплощения изобретения могут быть осуществлены на практике без этих конкретных подробностей. В других случаях общеизвестные способы, структуры и методы не показаны подробно, чтобы не затруднять понимания этого описания.

Теперь данное изобретение будет раскрыто посредством подробного описания нескольких воплощений изобретения. Очевидно, что в соответствии со знаниями специалистов в данной области техники могут быть созданы другие воплощения изобретения без отклонения от истинной сущности или технического учения изобретения, при этом изобретение ограничено только условиями прилагаемой формулы изобретения.

Примеры

На Фиг. 1-3 показаны схемы, демонстрирующие альтернативные пути для внутриклеточного биосинтеза NeuNAc, ЦМФ-NeuNAc и сиалилированных сахаридов.

С использованием клеток, генетически модифицированных так, как описано в данной заявке, может быть осуществлено ферментативное получение сиалилированных сахаридов. Единственный предусмотренный источник углерода (например, сахароза) поступает в микробную клетку и метаболизируется с образованием фруктозо-6-фосфата (от Фиг. 1 до Фиг. 3). Затем L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза (GlmS) осуществляет превращение фруктозо-6-фосфата в глюкозамин-6-фосфат (от Фиг. 1 до Фиг. 3), который в свою очередь метаболизируется глюкозамин-6-фосфат-N-ацетил-трансферазой (Gna1) до N-ацетилглюкозамин-6-фосфата (Фиг. 2 и Фиг. 3). N-Ацетилглюкозамин-6-фосфат может быть превращен 1) в N-ацетилманнозамин-6-фосфат при участии N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-эпимеразы (NanE) и далее в N-ацетилманнозамин при участии N-ацетилманнозамин-6-фосфат-фосфатазы (Фиг. 3) или 2) в N-ацетилглюкозамин при участии N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-фосфатазы (YihX/YqaB) и далее метаболизирован до N-ацетилманнозамина при участии N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразы (Slr1975) (Фиг. 2). Синтаза сиаловых кислот (NanA) катализирует превращение N-ацетилманнозамина в N-ацетил-нейраминовую кислоту, которая преобразуется в ЦМФ-N-ацетилнейраминовую кислоту при участии синтетазы ЦМФ-сиаловых кислот (от Фиг. 1 до Фиг. 3). Акцепторный субстрат может быть добавлен в культуральную жидкость, введен в клетку и модифицирован или синтезирован de novo рекомбинантной клеткой хозяина. Акцепторный субстрат образует связь с N-ацетилнейраминовой кислотой в реакции, катализируемой сиалилтрансферазой (SiaT), с образованием сиалилированного сахарида, который может быть экспортирован в культуральную жидкость.

Пример 1. Получение различных сиалилированных олигосахаридов

Последовательности генов охарактеризованных или предполагаемых сиалилтрансфераз получали из литературных и общедоступных баз данных. Поскольку часто описывается, что сиалилтрансферазы проявляют более высокую активность при удалении их сигнального пептида, авторы изобретения анализировали соответствующие белковые последовательности, используя для предсказания в режиме "онлайн" программное средство SignalP (Petersen et al., Nature Methods, 2011, Sep 29; 8(10): 785-6). Гены были получены путем синтеза благодаря сотрудничеству с GenScript либо, как аннотировано, в полноразмерной форме, либо, когда предсказано наличие сигнального пептида, в виде укороченного варианта, у которого N-концевой сигнальный пептид отсутствует.

Каждую из сиалилтрансфераз 1-26 субклонировали в составе оперона с neuА методом сиквенс-независимого безлигазного клонирования (SLIC, от англ. sequence and ligation-independent cloning) в pDEST14 с использованием ген-специфичных праймеров, получая плазмиды общего вида: pDEST14-siaT-neuA. Остальные сиалилтрансферазы 27-100 непосредственно субклонировали благодаря сотрудничеству с GenScript в плазмиду рЕТ11а с использованием сайтов рестрикции NdeI и BamHI. Обе экспрессирующие системы позволяют осуществлять изопропилтиогалактозид(IPTG)-индуцибельную (IPTG, от англ. isopropylthiogalactoside) генную экспрессию. Чтобы провести скрининг активностей in vitro, данными плазмидами трансформировали штамм Е. coli BL21(DE3), лишенный активности LacZ.

Штаммы Е, coli, несущие плазмиды для экспрессии siaT9 (α-2,3-сиалилтрансферазы) и siaT18 (α-2,6-сиалилтрансферазы), выращивали при 30°С во встряхиваемых колбах емкостью 100 мл, в которые вносили 20 мл среды 2YT (двукратный дрожжевой экстракт-триптон), дополненной ампициллином (100 мкг/мл). Когда оптическая плотность при 600 нм (OD₆₀₀) для культур достигала значений в диапазоне 0,1-0,3, индуцировали генную экспрессию, добавляя 0,3 мМ изопропилтиогалактозид, и инкубирование продолжали в течение 12-16 часов. Клетки собирали путем центрифугирования и механически разрушали в определенном объеме 50 мМ буфера на основе трис-HCl, рН 7,5, используя стеклянные шарики. Белковый экстракт хранили на льду до начала проведения анализа. Анализ in vitro проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ ЦМФ-Neu5Ac и соответствующие акцепторные субстраты в концентрации от 5 до 20 мМ. Анализ начинали, добавляя 3 мкл белкового экстракта, и продолжали в течение 16 часов. Образование сиалилированных олигосахаридов в результате проявления активности сиалилтрансфераз определяли посредством тонкослойной хроматографии (TLC).

Для этого образцы наносили на пластинки с силикагелем 60 F₂₅₄ (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). В качестве подвижной фазы использовали смесь бутанол:ацетон:уксусная кислота:H₂O (35/35/7/23 (об./об./об./об.)). Для обнаружения разделяемых веществ TLC-пластинку пропитывали реагентом на основе тимола (0,5 г тимола, растворенного в 95 мл этанола с добавлением 5 мл серной кислоты) и нагревали. Сиалилированные продукты реакции двигались медленнее, чем их акцепторные субстраты.

Обе сиалилтрансферазы обладали способностью сиалилировать галактозу или различные олигосахариды, содержащие по меньшей мере один остаток галактозы. Никакого сиалилированного олигосахарида не было обнаружено, когда в реакционную смесь добавляли сахарозу (Таблица 3).

Пример 2. Конструирование путей обмена веществ штамма BL21(DE3) Е. coli c целью получения N-ацетилнейраминовой кислоты

Конструирование путей обмена веществ осуществляли посредством мутагенеза и делетирования определенных эндогенных генов и интегрирования в геном гетерологичных генов. Гены lacZ и araA инактивировали посредством мутагенеза с использованием ошибочно спаривающихся олигонуклеотидов, как описано Ellis и др. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 6742-6746 (2001)).

Делетирование участков генома осуществляли в соответствии со способом Datsenko и Warner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6640-6645 (2000)). Чтобы предотвратить расщепление N-ацетилглюкозамина, из генома штамма BL21(DE3) Е. coli были делетированы следующие гены: ген N-ацетилглюкозамин-специфичного PTS-фермента II (nagE) (PTS - фосфотрансферазная система, от англ. phosphotransferase system), ген N-ацетилглюкозамин-6-фосфат-дезацетилазы (nagA) и ген глюкозамин-6-фосфат-дезаминазы (nagB). Также был целиком делетирован кластер генов катаболизма N-ацетилнейраминовой кислоты, кодирующий N-ацетилманнозамин-киназу (nanK), N-ацетилманнозамин-6-фосфат-эпимеразу (nanE), альдолазу N-ацетилнейраминовой кислоты (папА) и пермеазу сиаловых кислот (nanT). Гены manX, manY и manZ, кодирующие фосфоенолпируват-зависимую фосфотрансферазную систему, облегчающую импорт глюкозамина, также были делетированы. Кроме того, были делетированы гены wzxC-wcaJ. Ген wcaJ кодирует УДФ-глюкоза:ундекапренилфосфат-глюкозо-1-фосфат-трансферазу, катализирующую первую стадию синтеза колановой кислоты (Stevenson et al., J. Bacteriol., 1996, 178: 4885-4893). Помимо этого были делетированы гены fucI, fucK и agaA, кодирующие L-фукозоизомеразу, L-фукулозокиназу и N-ацетилгалактозамин-6-фосфат-дезацетилазу, соответственно.

Интегрирование в геном гетерологичных генов выполняли посредством транспозиции, используя либо транспозазу EZ-Tn5™ (Epicenter, USA), либо высокоактивную С9-мутантную форму транспозазы "моряка" (mariner transposase) Himar1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 11428-11433). Чтобы получить EZ-Tn5 транспосомы, представляющий интерес ген вместе с маркером устойчивости к антибиотикам, фланкированным FRT-сайтами (от англ. flippase recognition target -участок распознования флиппазы), (альтернативно, ген маркера устойчивости был фланкирован сайтами lox66-lox71), амплифицировали. Полученный продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) нес на обоих концах состоящие из 19 пар оснований (п.о.) мозаичные концы - сайты распознавания для транспозазы EZ-Tn5. Для интегрирования с использованием транспозазы Himar1 представляющие интерес экспрессирующие конструкции (опероны) аналогичным образом клонировали вместе с маркерами устойчивости к антибиотикам, фланкированными FRT-сайтами/lox66-lox71-сайтами, и переносили в вектор pEcomar, который кодирует высокоактивную С9-мутантную форму транспозазы "моряка" Himar1 под контролем арабинозного индуцибельного промотора P_araB. Все гены были кодон-оптимизированы для экспрессии в Е. coli и получены путем синтеза в GenScript Corp.

Экспрессируемый фрагмент <P_tet-lacY-FRT-aadA-FRT> интегрировали посредством использования транспозазы EZ-Tn5. После успешного интегрирования гена импортера лактозы LacY из Е. coli K12 TG1 (GenBank: ABN72583) ген устойчивости удаляли из стрептомицин-устойчивых клонов под действием рекомбиназы FLP (флиппазы, от англ. - flippase), кодируемой плазмидой рСР20 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 6640-6645). Кроме того, в геном встраивали кластер генов csc Е. coli W (GenBank: СР002185.1), содержащий гены пермеазы сахарозы, фруктокиназы, гидролазы сахарозы и транскрипционного репрессора (гены cscB, cscK, cscA и cscR, соответственно), позволяющий данному штамму расти на сахарозе в качестве единственного источника углерода. Этот кластер был интегрирован в геном штамма BL21(DE3) Е, coli посредством транспозиции с использованием плазмиды pEcomar-cscABKR.

Полученный штамм дополнительно модифицировали для продуцирования NeuNAc посредством интегрирования в геном следующих экспрессионных кассет: <P_tet-slr1975-gna1-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO 97), <P_tet-neuB-lox66-kanR-lox71> (SEQ ID NO 98), <P_tet-slr1975-P_t5-neuB-FRT-dhfr-FRT> (SEQ ID NO 99), <P_tet-glmS*-gna1-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO 100) и <P_tet-ppsA-1ох66-аасС1-lox71> (SEQ ID NO 101). За исключением экспрессионной кассеты dhfr (дигидрофолатредуктазы) все гены маркеров устойчивости пошагово удаляли из генома (перед следующим раундом интегрирования генов) посредством введения плазмиды pKD-Cre (SEQ ID NO 102), после чего проводили селекцию на чашках с 2YT-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл) и 100 мМ L-арабинозу, при 30°С. После этого устойчивые клоны переносили на чашки с 2YT-агаром без ампициллина, а также антибиотика, использованного для отбора при интегрировании в геном. Чашки инкубировали при 42°С для устранения содержащих данную плазмиду клеток. Для дальнейших экспериментов и модификаций использовали клоны, чувствительные к ампициллину и использованному для отбора антибиотику.

Ген slr1975 (GenBank: BAL35720) кодирует N-ацетилглюкозамин-2-эпимеразу из Synechocystis sp. РСС6803. Ген дпа1 (GenBank: NP_116637) кодирует глюкозамин-6-фосфат-ацетилтрансферазу из Saccharomyces cerevisiae. Ген neuB (GenBank: AF305571) кодирует синтазу сиаловых кислот из Campylobacter jejuni. Ген glmS* представляет собой мутантную версию гена L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы из Е. coli (Metab. Eng., 2005, May; 7(3): 201-14). Ген ppsA (GenBank: ACT43527) кодирует фосфоенолпируват-синтазу из Е. coli BL21(DE3).

Чтобы создать <P_tet-slr1975-gna1-lox66-aacC1-lox71>, гены slr1975 и gna1 субклонировали в виде оперона после конститутивного промотора P_tet(тетрациклинового промотора), выполняли слияние с геном устойчивости к гентамицину (фланкированному lox66/1ох71-сайтами) и встраивали в вектор pEcomar с использованием лигирования по "тупым" концам. Полученную экспрессионную кассету интегрировали в геном с использованием вектора pEcomar-slr195-gna1-aacC1 и высокоактивной С9-мутантной формы транспозазы "моряка" Himar1 под контролем арабинозного индуцибельного промотора P_araB.

Чтобы создать <P_tet-neuB-lox66-kanR-lox71>, ген пеиВ клонировали после конститутивного промотора P_tet и выполняли слияние с геном устойчивости к канамицину (фланкированному 1ох66/1ох71-сайтами). Полученную экспрессионную кассету интегрировали в геном, используя транспозазу EZ-Tn5. Чтобы создать <P_tet-slr1975-P_t5-neuB-FRT-dhfr-FRT>, гены slr1975 и пеиВ по отдельности субклонировали после конститутивных промоторов P_tet и P_t5, соответственно, и проводили слияние с геном устойчивости к триметоприму (фланкированному FRT-сайтами). Полученную экспрессионную кассету интегрировали в геном, используя транспозазу EZ-Tn5.

Экспрессионную кассету <P_tet-glmS*-gna1-lox66-aacC1-lox71> создавали посредством клонирования генов glmS* и gna1 в виде оперона после конститутивного промотора P_tet. Далее выполняли слияние этой конструкции с геном устойчивости к гентамицину (фланкированному 1ох66/1ох71-сайтами). Полученную экспрессионную кассету интегрировали в геном, используя транспозазу EZ-Tn5.

Чтобы создать <P_tet-ppsA-lox66-aacC1-lox71>, ген ppsA клонировали после конститутивного промотора P_tet и выполняли слияние с геном устойчивости к гентамицину (фланкированному 1ох66/1ох71-сайтами). Полученную экспрессионную кассету интегрировали в геном, используя транспозазу EZ-Tn5.

В целом, суммарные модификации генома привели к получению Neu5Ac-продуцирующего штамма Е. coli № NANA1.

Пример 3. Создание и культивирование линии микробных клеток для получения 3'-сиалиллактозы

Штамм Е. coli № NANA1 далее модифицировали посредством интегрирования <P_iei-siaT9-P_i5-neuA-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO 103) в геном с использованием транспозазы EZ-Tn5, получая штамм, продуцирующий 3'-SL. Ген siaT9 (GenBank: BAF91160), кодон-оптимизированный для экспрессии в Е. coli и полученный путем синтеза в GenScript, кодирует α-2,3-сиалилтрансферазу из Vibrio sp. JT-FAJ-16. Ген neuA (GenBank: AF305571) кодирует синтетазу ЦМФ-сиаловых кислот из Campylobacter jejuni.

Культивирование штамма проводили в 96-луночных планшетах. С этой целью одиночные колонии штамма переносили с агаровых чашек в лунки титрационных микропланшетов с 200 мкл минимальной среды, содержащей: NH₄H₂PO₄ - 7 г⋅л^-1; K₂HPO₄ - 7 г⋅л^-1; KОН - 2 г⋅л^-1; лимонную кислоту - 0,3 г л^-1; NH₄Cl - 5 г л^-1; противовспенивающий агент - 1 мл⋅л^-1, 0,1 мМ CaCl₂; 8 мМ MgSO₄, микроэлементы и 2% сахарозы в качестве источника углерода. В состав микроэлементов входили: нитрилотриуксусная кислота - 0,101 г⋅л^-1, рН 6,5; лимоннокислое аммиачное трехвалентное железо - 0,056 г⋅л^-1; MnCl₂ × 4H₂O - 0,01 г⋅л^-1; CoCl₂ × 6H₂O - 0,002 г⋅л^-1; CuCl₂ × 2H₂O - 0,001 г⋅л^-1; борная кислота - 0,002 г⋅л^-1; ZnSO₄ × 7H₂O - 0,009 г⋅л^-1; Na₂MoO₄ × 2H₂O - 0,001 г⋅л^-1; Na₂SeO₃ - 0,002 г⋅л^-1; NiSO₄ × 6H₂O - 0,002 г⋅л^-1. Культивирование проводили в течение приблизительно 20 часов при 30°С с энергичным встряхиванием. Затем по 50 мкл культуральной жидкости переносили в 96-луночные планшеты с глубокими лунками (2,0 мл), содержащими по 400 мкл минимальной среды из расчета на одну лунку.

После инкубирования в течение еще 48 часов культивирование останавливали и с использованием масс-спектрометрии в супернатанте определяли уровень 3'-сиалиллактозы. Масс-спектрометрический анализ проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM, от англ. multiple reaction monitoring), используя систему детектирования на основе жидкостного хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем (LC Triple-Quadrupole MS). В квадруполе 1 (Q1) осуществляется отбор и анализ родительских ионов, фрагментация происходит в ячейке соударений с использованием аргона в качестве инициирующего столкновительную диссоциацию газа (CID gas (от англ. collision-induced dissociation)), отбор фрагментированных ионов производится в квадруполе 3 (Q3). Хроматографическое разделение лактозы, 3'-сиалиллактозы и 6'-сиалиллактозы после разбавления культурального супернатанта в отношении 1:100 в H₂O (со степенью чистоты "для LC/MS") выполняли на колонке для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) XBridge Amide (3,5 мкм; 2,1×50 мм (Waters, USA)) с использованием защитного картриджа XBridge Amide (3,5 мкм; 2,1×10 мм (Waters, USA)). Температура термостата для колонок системы HPLC составляла 50°С. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил:H₂O с 10 мМ ацетатом аммония. В прибор вводили образец объемом 1 мкл; процесс разделения проводили в течение 3,60 мин при скорости потока 400 мкл/мин. 3'-Сиалиллактозу и 6'-сиалиллактозу анализировали методом MRM, используя электрораспылительную ионизацию (ESI) в режиме положительных ионов. Для работы использовали масс-спектрометр с единичным разрешением. Сиалиллактоза образует ион с m/z 656,2 [М+Na]. Родительский ион сиалиллактозы далее фрагментировался в ячейке столкновений с образованием фрагментированных ионов с m/z 612,15; m/z 365,15 и m/z 314,15. "Энергию соударений, напряжение на первом и третьем квадруполях (Q1 Pre Bias и Q3 Pre Bias) оптимизировали индивидуально для каждого аналита. Методы количественного определения выполняли с использованием имеющихся в продаже стандартов (Carbosynth, Compton, UK). По окончании культивирования в культуральном супернатанте достигали титра 3'-SL приблизительно 0,6 гл^-1.

Пример 4. Создание и культивирование линии микробных клеток для получения 6'-сиалиллактозы

Штамм Е. coli № NANA1 далее модифицировали посредством интегрирования <P_tet-siaT18-P_t5-neuA-lox66-aacC1-lox71> (SEQ ID NO 104) в геном с использованием транспозазы EZ-Tn5, получая штамм, продуцирующий 6'-SL. Ген siaT18 (GenBank: АВ500947), кодон-оптимизированный для экспрессии в Е. coli и полученный путем синтеза в GenScript, кодирует α-2,6-сиалилтрансферазу из Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-119. Ген neuA (GenBank: AF305571) кодирует синтетазу ЦМФ-сиаловых кислот из Campylobacter jejuni.

С использованием этого продуцирующего 6'-SL штамма проводили культивирование в 96-луночном планшете, как описано в примере 2. По окончании культивирования в культуральном супернатанте достигали титра 6'-SL приблизительно 0,9 г⋅л^-1.

Пример 5. Состав смеси для грудных детей, содержащей сиалиллактозу

Смесь для грудных детей: Обезжиренное молоко

Растительные масла (пальмовое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло)

Олигосахариды грудного молока

L-Фукоза

6'-Сиалиллактоза

Сухое обезжиренное молоко

Масло из Mortierella alpine

Рыбий жир

Карбонат кальция

Хлорид калия

Витамин С

Хлорид натрия

Витамин Е

Ацетат железа

Сульфат цинка

Ниацин

D-Пантотенат кальция

Сульфат меди

Витамин А

Витамин В1

Витамин В6

Сульфат магния

Иодат калия

Фолиевая кислота

Витамин K

Селенит натрия

Витамин D.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jennewein Biotechnologie GmbH

<120> Получение сиалилированных сахаридов

<130> P 1802 WO

<160> 104

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Campylobacter coli

<400> 1

atgcaaaacg tcattatcgc tggtaacggt ccgagcctgc aatcaatcaa ctatcaacgc 60

ctgccgaaag aatacgacat cttccgctgc aaccagttct acttcgaaga taaatactac 120

ctgggcaaaa acatcaaagc ggcctttttc aatccgtatc cgttcctgca gcaataccat 180

accgcgaaac agctggtgtt caacaacgaa tacaaaatcg aaaacatctt ttgtagcacg 240

ttcaatctgc cgttcatcga aaaagataac ttcatcaaca aattttacga tttctttccg 300

gacgctaaac tgggtcacaa aatcatcgaa aacctgaaag aattttacgc gtacatcaaa 360

tacaacgaaa tctacctgaa caaacgtatt accagcggca tctatatgtg cgcaattgct 420

atcgcgctgg gttataaaaa catttacctg tgtggcatcg atttctatga aggtgaaacg 480

atctacccgt tcaaagccat gtctaaaaac attaagaaaa tttttccgtg gatcaaagat 540

ttcaacccga gtaacttcca ttccaaagaa tacgacatcg aaatcctgaa actgctggaa 600

tcaatctaca aagttaacat ctacgcactg tgcgataact cggccctggc aaattacttc 660

ccgctgctgg tgaacaccga caattcattt gttctggaaa acaaatcgga tgactgtatc 720

aacgatatcc tgctgaccaa caatacgccg ggcattaact tctataaaag ccagatccaa 780

gtcaacaata ccgaaattct gctgctgaac tttcagaata tgatcagcgc caaagaaaac 840

gaaatttcta acctgaacaa aatcctgcaa gactcataca aaaccatcaa cacgaaagaa 900

aacgaaatta gtaatctgaa taaaatcctg caggattcct ataaaacgat taataccaaa 960

gaaaatgaaa tttcgaatct gaacaaaatc ctgcaggata aagacaaact gctgatcgtt 1020

aaagaaaacc tgctgaattt caaaagccgt catggtaaag ccaaatttcg cattcagaac 1080

caactgtctt ataaactggg ccaggcaatg atggtcaata gcaaatctct gctgggttat 1140

atccgtatgc cgtttgtgct gagttacatc aaagacaaac acaaacagga acaaaaaatc 1200

tatcaggaaa aaattaagaa agatccgagc ctgaccctgc cgccgctgga agattatccg 1260

gactacaaag aagctctgaa agaaaaagaa tgcctgacct atcgcctggg ccagacgctg 1320

attaaagcgg atcaagaatg gtacaaaggt ggctatgtga aaatgtggtt cgaaatcaaa 1380

aaactgaaga aagaatacaa aaagaaataa 1410

<210> 2

<211> 1146

<212> ДНК

<213> Vibrio sp.

<400> 2

atgaacaacg acaactccac gaccaccaac aataacgcta ttgaaatcta tgtggatcgt 60

gcgaccctgc cgacgatcca gcaaatgacc aaaattgtta gccagaaaac gtctaacaaa 120

aaactgatct catggtcgcg ctacccgatt accgataaaa gcctgctgaa gaaaattaac 180

gcggaatttt tcaaagaaca atttgaactg acggaaagcc tgaaaaacat catcctgtct 240

gaaaacatcg ataacctgat cattcatggc aataccctgt ggagtattga tgtggttgac 300

attatcaaag aagtcaacct gctgggcaaa aatattccga tcgaactgca cttttatgat 360

gacggttccg ccgaatacgt tcgtatctac gaatttagta aactgccgga atccgaacag 420

aaatacaaaa ccagcctgtc taaaaacaac atcaaattct caatcgatgg caccgactcg 480

ttcaaaaaca cgatcgaaaa catctacggt ttcagccaac tgtatccgac cacgtaccac 540

atgctgcgtg cagatatctt cgacaccacg ctgaaaatta acccgctgcg cgaactgctg 600

tcaaacaaca tcaaacagat gaaatgggat tacttcaaag acttcaacta caaacaaaaa 660

gatatctttt actcactgac caacttcaac ccgaaagaaa tccaggaaga cttcaacaaa 720

aactcgaaca aaaacttcat cttcatcggc agtaactccg cgaccgccac ggcagaagaa 780

caaatcaata ttatcagcga agcgaagaaa gaaaacagca gcattatcac caattcaatt 840

tcggattatg acctgttttt caaaggtcat ccgtctgcca cgtttaacga acagattatc 900

aatgcacacg atatgatcga aatcaacaac aaaatcccgt tcgaagctct gatcatgacc 960

ggcattctgc cggatgccgt tggcggtatg ggtagttccg tctttttcag tatcccgaaa 1020

gaagtcaaaa acaaattcgt gttctataaa agtggtacgg atatcgaaaa taactccctg 1080

attcaggtga tgctgaaact gaatctgatt aaccgcgata atattaaact gatctctgac 1140

atttaa 1146

<210> 3

<211> 1173

<212> ДНК

<213> Photobacterium sp.

<400> 3

atgggctgta atagcgactc caaccacaac aactccgacg gcaacatcac caaaaacaaa 60

acgatcgaag tttatgtcga tcgtgcaacc ctgccgacga ttcagcaaat gacccagatc 120

atcaacgaaa atagcaacaa caaaaaactg atttcatggt cgcgctaccc gatcaatgat 180

gaagaactgc tggaatcaat taacggctcg tttttcaaaa acaactctga actgatcaaa 240

agtctggatt ccatgattct gaccaatgac attaagaaag tgatcatcaa cggtaacacg 300

ctgtgggcgg ccgatgtggt taacatcatc aaatcaatcg aagcgttcgg caagaaaacc 360

gaaatcgaac tgaactttta tgatgacggt tcggccgaat atgtgcgtct gtacgacttt 420

agcaaactgc cggaatctga acaggaatac aaaattagcc tgtctaaaga taacattctg 480

agcagcatca acggcaccca gccgttcgaa aacgtcgtgg aaaacatcta cggtttcagt 540

caactgtacc cgaccacgta ccacatgctg cgtgccgata tctttgaaac caatctgccg 600

ctgcgcagtc tgaaaggcgt tctgtccaac aacatcaaac agatgaaatg ggattacttc 660

aaaaccttca acagccagca aaaagacaaa ttctacaact tcacgggttt taacccggat 720

gaaattatgg aacaatacaa agcaagcccg aacaaaaatt ttatcttcgt cggcaccaat 780

tctggcaccg caacggctga acagcaaatt gatatcctga ccgaagctaa aaacccgaac 840

agcccgatta tcacgaaatc gatccagggc ttcgacctgt ttttcaaagg tcatccgtct 900

gcaacctaca acaaacaaat catcgatgct cacaacatga tcgaaatcta caacaaaatc 960

ccgttcgaag cgctgatcat gaccgatgcc ctgccggatg cggtgggcgg tatgggcagc 1020

agcgtgtttt tcagcctgcc gaataccgtg gaaaacaaat tcattttcta taaatccgat 1080

acggacattg aaaacaatgc cctgatccag gttatgattg aactgaatat cgtgaaccgt 1140

aatgatgtga aactgatctc ggacctgcaa taa 1173

<210> 4

<211> 1167

<212> ДНК

<213> Pasteurella multocida

<400> 4

atgaaaacga ttaccctgta tctggacccg gcgtccctgc cggcactgaa ccaactgatg 60

gattttacgc agaacaatga agacaaaacc catccgcgta tctttggcct gtctcgcttc 120

aaaattccgg ataacattat cacccaatat cagaatatcc actttgttga actgaaagac 180

aatcgtccga cggaagccct gttcaccatt ctggatcagt acccgggtaa cattgaactg 240

gacatccatc tgaatattgc tcacagcgtc cagctgattc gtccgatcct ggcgtatcgc 300

tttaaacatc tggatcgtgt gtccatccag cgcctgaacc tgtatgatga cggctcaatg 360

gaatacgttg atctggaaaa agaagaaaac aaagacatct cggcagaaat taaacaagct 420

gaaaaacagc tgagccatta tctgctgacg ggtaaaatca aattcgataa cccgaccatt 480

gcgcgctacg tttggcagtc tgcctttccg gtcaaatatc acttcctgag tacggactac 540

tttgaaaaag cagaatttct gcaaccgctg aaagaatatc tggcggaaaa ttaccagaaa 600

atggattgga cggcctatca gcaactgacc ccggaacagc aagcatttta cctgaccctg 660

gttggcttca acgacgaagt caaacagagt ctggaagtgc agcaagcgaa atttattttc 720

acgggcacca cgacctggga aggtaatacc gatgttcgtg aatattacgc ccagcaacag 780

ctgaacctgc tgaatcattt tacccaggcg ggcggcgacc tgtttattgg tgaccattac 840

aaaatttact tcaaaggtca cccgcgcggc ggtgaaatca acgattacat cctgaacaac 900

gcaaaaaaca tcacgaatat cccggctaat atctctttcg aagtgctgat gatgaccggc 960

ctgctgccgg ataaagtcgg cggtgtggct agctctctgt acttcagtct gccgaaagaa 1020

aaaattagtc acatcatctt caccagcaac aaacaggtca aatcaaaaga agatgccctg 1080

aacaatccgt acgtgaaagt tatgcgtcgc ctgggtatta tcgatgaatc gcaagtgatc 1140

ttttgggaca gcctgaaaca gctgtaa 1167

<210> 5

<211> 1116

<212> ДНК

<213> Neisseria meningitidis

<400> 5

atgggcctga aaaaagcctg cctgaccgtg ctgtgtctga tcgtgttttg cttcggcatc 60

ttttatacgt tcgatcgtgt gaaccagggt gaacgcaatg cagttagtct gctgaaagaa 120

aaactgttta acgaagaagg cgaaccggtg aatctgatct tctgttacac cattctgcaa 180

atgaaagttg ccgaacgtat tatggcacag catccgggtg aacgctttta tgtggttctg 240

atgagcgaaa accgtaacga aaaatacgat tactacttca accagatcaa agataaagcg 300

gaacgcgcct atttctttca cctgccgtac ggcctgaaca aaagttttaa tttcattccg 360

acgatggcgg aactgaaagt gaaaagcatg ctgctgccga aagttaaacg tatctatctg 420

gcaagcctgg aaaaagtgtc tattgcggcc tttctgagca cctacccgga tgcggaaatc 480

aaaaccttcg atgatggcac gggtaatctg attcagagct ctagttatct gggcgatgaa 540

ttttctgtta acggtacgat caaacgtaat ttcgcccgca tgatgatcgg tgattggtct 600

attgcgaaaa cccgcaacgc cagtgatgaa cattacacga tcttcaaagg cctgaaaaac 660

atcatggatg atggtcgtcg caaaatgacc tacctgccgc tgttcgatgc gtctgaactg 720

aaaacgggcg atgaaaccgg cggtacggtg cgtattctgc tgggtagccc ggataaagaa 780

atgaaagaaa tctctgaaaa agcagcgaaa aacttcaaaa tccagtatgt tgccccgcac 840

ccgcgtcaga cctacggcct gagtggtgtg accacgctga acagcccgta tgttattgaa 900

gattacatcc tgcgtgaaat taagaaaaac ccgcataccc gctatgaaat ctacacgttt 960

ttcagcggcg ccgcactgac catgaaagat tttccgaacg tgcacgttta tgcactgaaa 1020

ccggcgtctc tgccggaaga ttattggctg aaaccggtgt acgcgctgtt tacccagagt 1080

ggtattccga tcctgacgtt cgatgataaa aattaa 1116

<210> 6

<211> 852

<212> ДНК

<213> Pasteurella multocida

<400> 6

atggataaat ttgcagaaca tgaaattccg aaagcagtga tcgttgctgg caacggtgaa 60

agtctgtccc agattgatta tcgtctgctg ccgaaaaact acgacgtctt ccgttgcaac 120

caattctact tcgaagaacg ctacttcctg ggcaataaaa tcaaagccgt gtttttcacc 180

ccgggtgttt ttctggaaca gtattacacg ctgtatcatc tgaaacgcaa caatgaatac 240

tttgtcgata acgtgattct gagctctttc aatcacccga ccgtggacct ggaaaaatca 300

cagaaaatcc aagcactgtt catcgatgtt atcaacggct acgaaaaata cctgtcgaaa 360

ctgaccgctt tcgatgttta tctgcgttac aaagaactgt atgaaaatca gcgcattacg 420

agcggtgttt acatgtgcgc tgtcgcgatc gccatgggct ataccgatat ttacctgacg 480

ggtatcgact tttatcaagc gtctgaagaa aactacgcct tcgataacaa aaaaccgaat 540

attatccgtc tgctgccgga ctttcgcaaa gaaaaaaccc tgttcagcta tcattctaaa 600

gatattgacc tggaagcgct gtcatttctg cagcaacatt accacgtgaa cttctactca 660

atctcgccga tgagtccgct gtccaaacat tttccgatcc cgacggttga agatgactgt 720

gaaaccacgt tcgtcgcccc gctgaaagaa aactatatta atgacatcct gctgccgccg 780

cactttgtct atgaaaaact gggcgtggat aaactggcgg ccgcactgga acatcaccat 840

caccatcact aa 852

<210> 7

<211> 1158

<212> ДНК

<213> Pasteurella dagmatis

<400> 7

atgaccattt acctggaccc ggcgtctctg ccgaccctga accaactgat gcattttacg 60

aaagaaagcg aagacaaaga aaccgcacgt atttttggct tctctcgctt taaactgccg 120

gaaaaaatca cggaacagta caacaacatc catttcgtgg aaatcaaaaa caatcgtccg 180

acggaagata ttttcaccat cctggaccag tacccggaaa aactggaact ggatctgcat 240

ctgaacattg cacacagcat ccagctgttt catccgattc tgcaatatcg tttcaaacac 300

ccggatcgca ttagtatcaa atccctgaac ctgtatgatg acggcaccat ggaatacgtt 360

gatctggaaa aagaagaaaa caaagacatc aaaagtgcga tcaaaaaagc cgaaaaacag 420

ctgtccgatt atctgctgac gggtaaaatt aactttgaca atccgaccct ggcacgctac 480

gtttggcagt cacaatatcc ggtcaaatac catttcctgt cgacggaata ttttgaaaaa 540

gctgaattcc tgcagccgct gaaaacctat ctggcgggca aataccaaaa aatggattgg 600

tcagcctatg aaaaactgtc gccggaacag caaacgtttt acctgaaact ggtcggtttc 660

agtgatgaaa ccaaacagct gtttcacacg gaacaaacca aatttatttt cacgggcacc 720

acgacctggg agggtaacac cgatatccgt gaatattacg cgaaacagca actgaatctg 780

ctgaaacatt ttacccacag cgaaggcgac ctgtttatcg gtgaccagta caaaatctac 840

ttcaaaggcc atccgcgcgg cggtgatatt aacgactata tcctgaaaca cgcaaaagat 900

attacgaaca tcccggctaa tattagcttc gaaatcctga tgatgaccgg tctgctgccg 960

gacaaagtcg gcggtgtggc gagctctctg tacttctctc tgccgaaaga aaaaatcagc 1020

cacattatct tcacctctaa caagaaaatt aaaaacaaag aagatgccct gaatgacccg 1080

tacgtgcgtg ttatgctgcg tctgggtatg attgacaaaa gccaaattat cttctgggat 1140

tctctgaaac aactgtaa 1158

<210> 8

<211> 1173

<212> ДНК

<213> Photobacterium phosphoreum

<400> 8

atgggctgta actccgatag caaacacaat aacagtgatg gcaatattac caaaaacaaa 60

acgatcgaag tctatgtgga ccgtgcgacc ctgccgacga ttcagcaaat gacccagatc 120

atcaacgaaa atagcaacaa caaaaaactg atttcatggt cgcgttaccc gatcaatgat 180

gaaacgctgc tggaatcaat taatggctcg tttttcaaaa accgcccgga actgatcaaa 240

agtctggatt ccatgattct gaccaacgaa attaagaaag tgatcatcaa cggtaacacg 300

ctgtgggcag ttgacgtggt taatattatc aaaagcattg aagctctggg caagaaaacc 360

gaaatcgaac tgaacttcta tgatgacggt tctgcggaat atgtgcgtct gtacgatttt 420

agccgcctgc cggaatctga acaggaatac aaaattagcc tgtctaaaga taacattcag 480

agcagcatca acggcaccca accgttcgac aacagcatcg aaaacatcta cggtttctct 540

cagctgtatc cgaccacgta ccacatgctg cgtgccgata tctttgaaac caatctgccg 600

ctgacgagtc tgaaacgcgt tatctccaac aacatcaaac agatgaaatg ggattacttc 660

accacgttca attcccagca gaaaaacaaa ttttacaact tcaccggctt caacccggaa 720

aaaatcaaag aacaatacaa agcgagtccg cacgaaaatt ttattttcat tggcaccaac 780

tccggcaccg ccaccgcaga acagcaaatt gatatcctga ccgaagccaa aaaaccggac 840

tcaccgatta tcaccaacag cattcagggc ctggacctgt ttttcaaagg tcatccgtct 900

gcgacctata accagcaaat tatcgacgcc cacaacatga tcgaaatcta caacaaaatc 960

ccgttcgaag cactgatcat gaccgatgca ctgccggacg ctgttggcgg tatgggtagt 1020

tccgtctttt tctcactgcc gaataccgtc gaaaacaaat tcattttcta taaatcggat 1080

acggacattg aaaacaatgc tctgatccag gttatgatcg aactgaatat cgtgaaccgc 1140

aatgatgtga aactgattag tgacctgcaa taa 1173

<210> 9

<211> 1254

<212> ДНК

<213> Avibacterium paragallinarum

<400> 9

atgcgtaaaa tcatcacctt cttcagcctg ttcttctcga tctcagcgtg gtgtcaaaaa 60

atggaaatct acctggacta tgcgtcgctg ccgagcctga acatgatcct gaacctggtt 120

gaaaacaaaa acaacgaaaa agtcgaacgt attatcggct tcgaacgctt tgatttcaac 180

aaagaaattc tgaatagctt ctctaaagaa cgtatcgaat ttagtaaagt ctccattctg 240

gatatcaaag aattttcaga caaactgtac ctgaacattg aaaaatcgga tacgccggtg 300

gacctgatta tccataccaa tctggatcac tcagttcgtt cgctgctgag catctttaaa 360

accctgagtc cgctgttcca taaaatcaac atcgaaaaac tgtacctgta cgatgacggc 420

agcggtaact atgttgatct gtaccagcac cgccaagaaa atatttctgc gattctgatc 480

gaagcccaga aaaaactgaa agacgcgctg gaaaatcgtg aaacggatac cgacaaactg 540

catagcctga cgcgctatac ctggcacaaa atctttccga cggaatatat cctgctgcgt 600

ccggattacc tggatattga cgaaaaaatg caaccgctga aacatttcct gagcgatacc 660

atcgtgtcta tggacctgtc tcgctttagt catttctcca aaaaccagaa agaactgttt 720

ctgaaaatca cgcacttcga tcaaaacatc ttcaacgaac tgaacatcgg caccaaaaac 780

aaagaataca aaacgttcat cttcaccggc accacgacct gggaaaaaga taagaaaaaa 840

cgtctgaaca acgcgaaact gcagacggaa attctggaat cttttatcaa accgaacggc 900

aaattctacc tgggtaacga tatcaaaatc tttttcaaag gccacccgaa aggtgatgac 960

attaacgact acattatccg caaaaccggc gcagaaaaaa ttccggctaa catcccgttt 1020

gaagttctga tgatgacgaa tagtctgccg gattatgtcg gcggtattat gagtaccgtg 1080

tacttttccc tgccgccgaa aaatattgat aaagtggttt tcctgggttc cgaaaaaatc 1140

aaaaacgaaa acgacgccaa atcacagacc ctgtcgaaac tgatgctgat gctgaacgtc 1200

atcacgccgg aacagatttt ctttgaagaa atgccgaacc cgattaactt ttaa 1254

<210> 10

<211> 1293

<212> ДНК

<213> Campylobacter jejuni

<400> 10

atgacccgca cccgtatgga aaacgaactg attgtgagca aaaacatgca gaacattatt 60

atcgccggta acggtccgag cctgaaaaat attaactata aacgtctgcc gcgcgaatac 120

gatgtgttcc gttgcaacca gttctacttc gaagacaaat actacctggg caagaaaatt 180

aaagccgtgt ttttcaatcc gggcgtgttt ctgcaacaat atcataccgc aaaacagctg 240

attctgaaaa acgaatacga aatcaaaaac atcttttgta gcaccttcaa tctgccgttt 300

atcgaatcta acgatttcct gcaccaattt tataactttt tcccggacgc taaactgggc 360

tacgaagtca tcgaaaacct gaaagaattt tacgcgtaca tcaaatacaa cgaaatctac 420

ttcaacaaac gcatcacctc tggcgtgtat atgtgcgcga ttgccatcgc actgggttat 480

aaaacgattt acctgtgtgg catcgatttc tatgaaggtg acgttattta cccgtttgaa 540

gcaatgagta ccaacattaa aacgatcttc ccgggtatca aagatttcaa accgagtaac 600

tgccattcca aagaatatga catcgaagcg ctgaaactgc tgaaaagcat ctacaaagtt 660

aacatctacg ccctgtgtga tgacagtatt ctggcaaatc atttcccgct gtccattaac 720

atcaacaaca acttcaccct ggaaaacaaa cacaacaact caatcaacga tattctgctg 780

accgacaata cgccgggcgt ctcgttttat aaaaatcagc tgaaagccga taacaaaatc 840

atgctgaact tctacaacat cctgcatagc aaagataacc tgatcaaatt cctgaacaaa 900

gaaatcgctg ttctgaaaaa acagaccacg caacgtgcta aagcgcgcat tcagaaccac 960

ctgagctata aactgggcca agccctgatt atcaatagca aatctgtcct gggtttcctg 1020

tctctgccgt ttattatcct gtcaattgtg atctcgcaca aacaggaaca aaaagcgtat 1080

aaattcaaag tgaagaaaaa cccgaacctg gcactgccgc cgctggaaac ctatccggat 1140

tacaacgaag ccctgaaaga aaaagaatgc ttcacgtaca aactgggcga agaatttatc 1200

aaagcaggta aaaactggta tggcgaaggt tacatcaaat ttatcttcaa agatgttccg 1260

cgtctgaaac gtgaatttga aaaaggcgaa taa 1293

<210> 11

<211> 1188

<212> ДНК

<213> Heliobacter acinonychis

<400> 11

atgaataaga aaccgctgat tattgctggc aacgggccaa gcatcaaaga cttagattat 60

gcgttgttcc cgaaagactt tgatgtattc cgatgtaatc aattctactt cgaggacaaa 120

tactatttag ggcgggaaat aaaaggggtg ttctttaacg cgcacgtctt cgatctccaa 180

atgaagatca ctaaagccat agtcaaaaac ggggaatatc acccggacca catatattgc 240

acacatgtcg aaccgtacgg ttacgttaac ggaaaccagc aactcatgca agagtacctg 300

gaaaaacatt ttgtgggagt ccgaagcacg tacgcatacc tgaaagatct agagccattc 360

tttattctgc acagtaagta tcgcaacttc tacgaccagc acttcacaac gggcatcatg 420

atgctactgg tggccatcca attgggatac aaagaaatat acctgtgcgg aatagacttc 480

tacgaaaacg gattcggaca tttctacgag aaccaagggg gattctttga agaggatagc 540

gatccgatgc acgataagaa catagacatc caagcactgg aactggcaaa gaaatacgcg 600

aaaatctacg cactggtacc gaacagcgcc ctagtgaaaa tgattccgtt gagcagccaa 660

aaaggagttc tggaaaaggt gaaggaccgg atcgggttgg gcgagtttaa gagagagaaa 720

ttcgggcaaa aagaattgga aagacagaag gaattagaac gacaaaaaga gctcgaacgc 780

caaaaggagc ttgaacgtca aaaggaactt gaacgacaaa aagagttgga gaggcagaaa 840

gaactcgaac gccaaaaaga attagagaga cagaaggaat tagagcgcca aaaggagctt 900

gagcgtcaaa aagaattaga gaggcagaag gagttagaaa ggcagaaaga actggagaga 960

cagaaagaac tcgaaaggca gaaggagttg gaacgccaaa aagaactaga attagaacga 1020

tccttaaaag cacgattgaa agcggtactc gcgagcaaag gcatccgcgg cgacaacctg 1080

ataatcgtaa gtttaaaaga cacctaccga ctgtttaaag ggggatttgc gttactcttg 1140

gacctgaagg cgctaaagtc aatcattaaa gcattcctga agagataa 1188

<210> 12

<211> 783

<212> ДНК

<213> Campylobacter jejuni

<400> 12

atgggcaaaa aagtgattat tgcgggcaac ggcccgagcc tgaaagaaat tgattatagc 60

cgtctgccga acgattttga tgtgtttcgc tgcaaccagt tttatttcga agataaatat 120

tacctgggca aaaaatgcaa agcggtgttc tataatccga tcctgttctt cgaacagtat 180

tacaccctga aacatctgat tcagaaccag gaatatgaaa ccgaactgat catgtgcagc 240

aactataacc aggcgcatct ggaaaacgaa aactttgtga aaaccttcta cgattatttt 300

ccggatgcgc atctgggcta tgattttttc aaacagctga aagatttcaa cgcgtacttc 360

aaattccacg aaatctattt caaccagcgt attaccagcg gcgtgtatat gtgcgcggtg 420

gcgattgcgc tgggctataa agaaatttat ctgagcggca tcgattttta tcagaacggc 480

agcagctatg cgtttgatac caaacagaaa aacctgctga aactggcccc gaactttaaa 540

aacgataaca gccactatat tggccatagc aaaaacaccg atatcaaagc gctggaattt 600

ctggaaaaaa cctataaaat caaactgtat tgcctgtgcc cgaacagcct gctggccaac 660

tttattgaac tggcaccgaa tctgaacagc aacttcatca tccaggaaaa aaacaactat 720

accaaagata ttctgattcc gagcagcgaa gcgtatggca aattcagcaa aaacatcaac 780

taa 783

<210> 13

<211> 897

<212> ДНК

<213> Streptococcus entericus

<400> 13

atgaagaaag tctacttctg ccatacggtc taccatctgc tgattaccct gtgcaaaatt 60

agcgttgaag aacaagttga aattattgtg ttcgataccg ttagtaatca tgaactgatt 120

gtccagaaaa tccgcgacgt gtttgttaac accacggtgc tgttcgcaga acaaaatacc 180

gatttttcca ttctggaaat cgatcgcgct acggacattt atgtgttcaa cgactggacc 240

ccgatcggcg cgtatctgcg taaaaacaaa ctgttttacc atctgatcga agatggttat 300

aactaccacg aatataacgt ttacgcgaat gccctgacca tgaaacgtcg cctgctgaac 360

ttcgtgctgc gtcgcgaaga accgtcaggc ttttcgcgtt atgttcgcag cattgaagtt 420

aaccgtgtca aatacctgcc gaatgattgc cgcaaaagca aatgggttga aaaaccgcgt 480

tctgccctgt tcgaaaatct ggtcccggaa cataaacaga aaatcatcac gatcttcggc 540

ctggaaaact atcaagatag cctgcgcggt gtcctggtgc tgacccagcc gctggtgcaa 600

gactactggg atcgcgacat taccacggaa gaagaacagc tggaatttta tcgtcaaatc 660

gtggaatctt acggcgaagg tgaacaggtg tttttcaaaa ttcacccgcg tgataaagtt 720

gactatagct ctctgaccaa cgtcattttt ctgaagaaaa acgtcccgat ggaagtgtac 780

gaactgattg ccgattgtca ttttaccaaa ggtatcacgc acagttccac cgcactggac 840

ttcctgtcct gtgtggataa gaaaatcacc ctgaaacaaa tgaaagcaaa tagttaa 897

<210> 14

<211> 888

<212> ДНК

<213> Haemophilus ducreyi

<400> 14

atgaaagaaa tcgccatcat ctccaaccaa cgcatgttct tcctgtactg tctgctgacc 60

aataaaaatg tcgaagacgt gttcttcatt tttgaaaaag gcgcgatgcc gaacaatctg 120

accagcattt ctcatttcat cgtgctggat cacagtaaat ccgaatgcta tgactttttc 180

tacttcaact tcatcagttg taaatatcgt ctgcgcggcc tggatgttta cggtgcagac 240

catatcaaag gcgctaaatt tttcctggaa cgtcaccgct ttttcgtggt tgaagatggt 300

atgatgaact acagcaaaaa catgtacgca ttctctctgt tccgtacccg caatccggtg 360

attctgccgg gcggttttca tccgaacgtt aaaaccatct tcctgacgaa agataatccg 420

attccggacc agatcgctca caaacgtgaa atcatcaaca tcaaaaccct gtggcaagcg 480

aaaaccgcca cggaaaaaac gaaaattctg agctttttcg aaatcgatat gcaggaaatt 540

tcagttatca aaaaccgctc gtttgtcctg tatacccaac cgctgtcaga agataaactg 600

ctgacggaag cggaaaaaat tgacatctat cgtaccattc tgacgaaata caaccattcg 660

cagaccgtta tcaaaccgca cccgcgcgat aaaacggact ataaacaact gtttccggat 720

gcctatgtca tgaaaggcac ctacccgagt gaactgctga cgctgctggg tgtcaacttc 780

aacaaagtga tcaccctgtt ttccacggcg gtcttcgatt atccgaaaga aaaaatcgac 840

ttctacggca ccgcggtgca tccgaaactg ctggatttct ttgactaa 888

<210> 15

<211> 1467

<212> ДНК

<213> Alistipes sp.

<400> 15

atggccctgc tgagcggtac cgccgcatgc tcagatgacg aagtctcgca gaacctgatc 60

gtgattaatg gcggtgaaca ttttctgagc ctggatggtc tggcccgtgc aggtaaaatt 120

agcgtgctgg caccggctcc gtggcgtgtt acgaaagcag ctggtgatac ctggtttcgc 180

ctgagcgcaa ccgaaggtcc ggctggttac agcgaagtgg aactgtctct ggatgaaaat 240

ccgggtgccg cacgtagcgc acagctggcg tttgcctgtg gtgatgcgat tgtgccgttc 300

cgcctgagtc aaggcgcact gtccgctggt tatgattcac cggactatta cttttacgtt 360

accttcggca cgatgccgac cctgtatgcc ggtatccatc tgctgagcca cgataaaccg 420

ggctatgtct tttactcacg ttcgaaaacg tttgacccgg ccgaattccc ggcacgtgct 480

gaagttacca ccgcagctga tcgtaccgcc gatgcaaccc aggccgaaat ggaagcaatg 540

gctcgcgaaa tgaaacgtcg catcctggaa attaactctg cggatccgac cgccgtgttt 600

ggcctgtatg ttgatgacct gcgttgccgc attggctacg attggttcgt ggcgcagggt 660

atcgacagtg cccgtgtcaa agtgagcatg ctgtctgatg gcaccggcac gtacaacaat 720

ttttataact acttcggtga cgcggccacg gcggaacaaa attgggaaag ttatgcgtcc 780

gaagttgaag ccctggattg gaatcacggc ggtcgttatc cggaaacccg ctcgctgccg 840

gaatttgaaa gctacacgtg gccgtattac ctgtctaccc gtccggatta tcgcctggtg 900

gttcaggacg gcagtctgct ggaaagctct tgtccgttta ttaccgaaaa actgggtgaa 960

atggaaatcg aatccattca accgtatgaa atgctgtcag ccctgccgga aagttcccgt 1020

aaacgctttt atgatatggc aggcttcgat tacgacaaat ttgcagctct gttcgatgcg 1080

tccccgaaga aaaacctgat tatcattggt acctctcatg cggatgatgc cagtgcacgt 1140

ctgcagcgtg attacgttgc acgcatcatg gaacagtatg gcgctcaata cgatgtcttt 1200

ttcaaaccgc acccggcaga caccacgtca gctggttatg aaacggaatt tccgggcctg 1260

accctgctgc cgggtcaaat gccgtttgaa atcttcgttt ggtccctgat tgatcgtgtc 1320

gacatgatcg gcggttatcc gtcaacggtc tttctgaccg ttccggtcga taaagtgcgc 1380

tttatttttg ccgcggatgc agcttctctg gtgcgtccgc tgaatatcct gttccgcgat 1440

gcgaccgacg ttgaatggat gcagtaa 1467

<210> 16

<211> 876

<212> ДНК

<213> Campylobacter jejuni

<400> 16

atgaagaaag tgattatcgc cggcaatggt ccgagcctga aagaaattga ttattctcgt 60

ctgccgaatg atttcgacgt ctttcgctgc aaccagttct actttgaaga caaatattac 120

ctgggcaaaa aatgtaaagc cgtgttttat accccgaact ttttctttga acagtattac 180

acgctgaaac atctgattca gaaccaagaa tatgaaaccg aactgatcat gtgctcaaac 240

tacaatcaag cacatctgga aaacgaaaac ttcgtcaaaa cgttctacga ttacttcccg 300

gacgctcacc tgggttacga tttctttaaa cagctgaaag aattcaacgc gtacttcaaa 360

ttccacgaaa tctacttcaa ccaacgtatc acctcaggcg tgtatatgtg tgcggttgcc 420

attgcactgg gttataaaga aatttacctg tcgggcatcg atttttatca gaatggtagc 480

tcttacgcct tcgacacgaa acaagaaaat ctgctgaaac tggcaccgga ttttaaaaac 540

gaccgctcac attatattgg ccactcgaaa aacaccgata tcaaagctct ggaattcctg 600

gaaaaaacgt acaaaatcaa actgtactgc ctgtgtccga atagtctgct ggctaacttt 660

atcgaactgg cgccgaacct gaattccaac ttcatcatcc aggagaaaaa caactacacc 720

aaagatatcc tgatcccgag ttccgaagcg tacggcaaat ttagcaaaaa catcaacttc 780

aagaaaatta aaatcaaaga aaacgtgtat tacaaactga ttaaagatct gctgcgtctg 840

ccgtctgaca tcaaacatta ttttaaaggt aaataa 876

<210> 17

<211> 939

<212> ДНК

<213> Streptococcus agalactiae

<400> 17

atgacgaatc gcaaaatcta tgtctgccac accctgtacc atctgctgat ctgcctgtat 60

aaagaagaaa tctactcaaa tctggaaatt atcctgagca gcagcattcc ggatgtggac 120

aacctggaga aaaaactgaa aagcaaaacc atcaacatcc atattctgga agaatcctca 180

ggcgaatctg aagaactgct gagtgttctg aaagatgcag gtctgtctta cagtaaattc 240

gatagcaact gcttcatctt caacgacgct accccgattg gccgtacgct gatcaaacac 300

ggtatttatt acaatctgat cgaagatggc ctgaactgtt ttacctactc gattttcagc 360

cagaaactgt ggaaatacta cgtgaaaaaa tacatcctgc ataaaattca accgcacggc 420

ttttcccgct actgcctggg tatcgaagtg aacagtctgg ttaatctgcc gaaagatccg 480

cgttacaaaa aattcatcga agtcccgcgc aaagaactgt tcgacaatgt tacggaatac 540

cagaaagaaa tggcgatcaa cctgtttggc gccgtccgtg tgtctattaa atccccgtca 600

gttctggtcc tgacccagcc gctgtccatc gataaagaat ttatgtcata caacaacaaa 660

atcgaaacgt cggaagaaca attcaacttc tacaaaagca tcgtgaacga atacatcaac 720

aaaggttaca acgtctacct gaaagtgcat ccgcgtgatg tggttgacta ttctaaactg 780

ccggttgaac tgctgccgag taacgtcccg atggaaatta tcgaactgat gctgaccggc 840

cgctttgaat gcggtattac ccatagcagc accgccctgg atttcctgac ctgtgtggac 900

aagaaaatta cgctggttga tctgaaagac attaaataa 939

<210> 18

<211> 1233

<212> ДНК

<213> Bibersteinia trehalosi

<400> 18

atggaattct gcaaaatggc aacgacgcaa aaaatctgtg tctacctgga ctatgctacg 60

atcccgagcc tgaactacat cctgcacttt gcgcaacatt tcgaagatca ggaaaccatt 120

cgtctgtttg gcctgtcccg cttccacatt ccggaatcag tcatccagcg ctatccgaaa 180

ggtgtggttc aattttaccc gaaccaggaa aaagacttca gcgcgctgct gctggccctg 240

aaaaacatcc tgatcgaagt taaacagcaa cagcgtaaat gcgaaatcga actgcatctg 300

aacctgtttc actatcagct gctgctgctg ccgttcctga gtctgtatct ggatacccag 360

gactactgtc atctgacgct gaaattttac gatgacggct ctgaagcgat tagtgccctg 420

caggaactgg cactggctcc ggatctggcg gcccaaatcc agtttgaaaa acaacagttc 480

gacgaactgg tcgtgaaaaa atcgtttaaa ctgtcgctgc tgagccgcta tttttggggt 540

aaactgttcg aaagcgaata catttggttc aatcaagcaa tcctgcagaa agctgaactg 600

caaattctga aacaggaaat cagctctagt cgtcagatgg attttgcaat ttatcaacag 660

atgtccgacg aacaaaaaca gctggtgctg gaaattctga acatcgatct gaataaagtt 720

gcttacctga aacaactgat ggaaaaccag ccgtcttttc tgttcctggg caccacgctg 780

tttaatatta cccaggaaac caaaacgtgg ctgatgcaga tgcatgtgga tctgatccaa 840

cagtattgcc tgccgagcgg ccagtttttc aacaataaag ccggctatct gtgtttttac 900

aaaggtcacc cgaacgaaaa agaaatgaac caaatgatcc tgtctcagtt caaaaacctg 960

atcgcgctgc cggatgacat tccgctggaa atcctgctgc tgctgggcgt tattccgagt 1020

aaagtcggcg gttttgcatc ctcagctctg tttaacttca ccccggcgca gatcgaaaat 1080

attatctttt tcacgccgcg ttatttcgaa aaagataatc gcctgcacgc cacgcaatac 1140

cgtctgatgc agggcctgat tgaactgggt tatctggacg ctgaaaaatc tgtgacccac 1200

tttgaaatca tgcaactgct gacgaaagaa taa 1233

<210> 19

<211> 1221

<212> ДНК

<213> Haemophilus parahaemolyticus

<400> 19

atgaccgaac agtacatcaa aaacgtggaa gtttacctgg attacgcgac catcccgacg 60

ctgaactact tctaccattt caccgaaaac aaagatgaca tcgccacgat tcgtctgttt 120

ggcctgggtc gcttcaacat cagtaaatcc atcatcgaaa gctacccgga aggcattatc 180

cgttactgcc cgattatctt tgaagatcaa accgcatttc agcaactgtt cattaccctg 240

ctgacggaag acagtttttg tcagtatcgc tttaacttcc atattaacct gtttcactcc 300

tggaaaatgc tgatcccgct gctgcatatt atctggcagt ttaaacacaa agtcctggat 360

attaaactga acttctatga tgacggcagt gaaggtctgg tgacgctgtc caaaatcgaa 420

cagaactaca gctctgaaat cctgcaaaaa atcatcgata tcgactcaca gtcgttttat 480

gcagataaac tgtctttcct ggatgaagac attgctcgtt acctgtggaa cagtctgttt 540

gaatcccatt attacctgct gaacgacttc ctgctgaaaa acgaaaaact gtcactgctg 600

aaaaactcga tcaaatactg ccacatcatg gatctggaac gctacctgca gtttacccaa 660

gaagaaaaag actttttcaa cgaactgctg ggcatcaaca tccagagtct ggaagataaa 720

atcaaaatct tccagcagaa gaaaaccttt attttcacgg gtaccacgat cttcagcctg 780

ccgaaagaag aagaagaaac cctgtatcgt ctgcatctga acgcaatcct gaattatatt 840

cacccgaacg gcaaatactt tattggcgat ggtttcacgc tggttatcaa aggtcatccg 900

caccagaaag aaatgaacag ccgcctggaa aaatcttttg aaaaagctgt catgctgccg 960

gataatatcc cgttcgaaat tctgtatctg atcggctgca aaccggacaa aattggcggt 1020

tttgtgagca cctcttactt cagctgtgat aagaaaaaca ttgcggacct gctgtttatc 1080

tctgcccgtc aagaagaagt tcgcaaaaac gattacctgt ttaacatcca gtaccaactg 1140

cgtgacatga tgattaaaac cggttttatc caggaagaaa aaacgcactt ctactcagat 1200

atcccgatct tcatctcgta a 1221

<210> 20

<211> 903

<212> ДНК

<213> Haemophilus somnus

<400> 20

atgaaatata acatcaaaat taaagctatc gtcatcgtgt cgagcctgcg tatgctgctg 60

atcttcctga tgctgaataa ataccacctg gatgaagttc tgtttgtctt caacgaaggc 120

ttcgaactgc ataaaaaata caaaatcaaa cactatgtgg cgattaaaaa gaaaattacc 180

aaattctggc gtctgtacta caaactgtac ttctaccgtt tcaaaattga ccgcatcccg 240

gtttatggcg cagatcatct gggttggacc gactattttc tgaaatactt cgatttctac 300

ctgattgaag acggcatcgc taacttctcc ccgaaacgtt acgaaattaa cctgacgcgc 360

aatatcccgg tctttggttt ccataaaacc gtgaagaaaa tttacctgac gagtctggaa 420

aatgttccgt ccgatattcg tcataaagtc gaactgatca gcctggaaca cctgtggaaa 480

acccgcacgg cgcaggaaca acacaacatc ctggatttct ttgcctttaa tctggacagc 540

ctgatctctc tgaaaatgaa aaaatacatc ctgttcaccc agtgcctgtc agaagatcgc 600

gtcatttcgg aacaggaaaa aatcgcgatc taccaacata tcatcaaaaa ctacgatgaa 660

cgtctgctgg ttatcaaacc gcacccgcgc gaaaccacgg actatcagaa atactttgaa 720

aatgtcttcg tgtaccaaga tgtggttccg agcgaactgt ttgaactgct ggacgtgaac 780

ttcgaacgtg ttattaccct gttttctacg gccgtgttca aatatgatcg caatatcgtt 840

gacttctacg gtacgcgcat ccacgacaaa atctatcaat ggttcggcga catcaaattc 900

taa 903

<210> 21

<211> 1146

<212> ДНК

<213> Vibrio harveyi

<400> 21

atggattctt cgccggaaaa caccagctct acgctggaaa tttacatcga ttcagcaacc 60

ctgccgtcgc tgcagcacat ggtgaaaatt atcgacgaac aaagtggcaa caaaaaactg 120

atcaactgga aacgttatcc gatcgatgac gaactgctgc tggataaaat caacgctctg 180

agcttttctg ataccacgga cctgacccgt tatatggaaa gtattctgct gatcggcgat 240

attaaacgcg tggttattaa cggtaatagt ctgtccaact acaatattgt cggcgtgatg 300

cgctccatca acgccctggg tctggatctg gacgttgaaa tcaattttta tgatgacggt 360

tcagcagaat atgtccgtct gtacaacttc tcgcagctgc cggaagctga acgcgaactg 420

ctggtgtcaa tgtcgaaaaa caatattctg gcggccgtta acggcatcgg ttcttatgat 480

agcggctctc cggaaaatat ttacggtttt gcgcagattt atccggccac ctaccacatg 540

ctgcgtgcgg acattttcga tacggacctg gaaatcggcc tgattcgcga tatcctgggt 600

gacaacgtca aacagatgaa atggggccaa tttctgggtt tcaacgaaga acagaaagaa 660

ctgttttatc aactgaccag cttcaacccg gataaaatcc aggcgcaata caaagaatct 720

ccgaacaaaa acttcgtttt cgtcggcacc aacagtcgtt ccgcaacggc tgaacagcaa 780

atcaacatca tcaaagaagc caaaaaactg gatagcgaaa ttatcccgaa cagcatcgat 840

ggctatgacc tgtttttcaa aggtcatccg agcgcgacct acaaccagca aattgttgat 900

gcccacgaca tgaccgaaat ctataatcgc acgccgtttg aagtcctggc aatgacgagt 960

tccctgccgg atgctgtggg cggtatgggc tcatcgctgt ttttctcact gccgaaaacc 1020

gtggaaacga aattcatttt ctataaaagt ggcaccgata ttgaatccaa tgcgctgatc 1080

caggttatgc tgaaactggg tatcattacg gacgaaaaag tgcgctttac gacggacatc 1140

aaataa 1146

<210> 22

<211> 1452

<212> ДНК

<213> Alistipes sp.

<400> 22

atggccagct gttctgatga cgataaagaa cagacgggtt ttcaaatcga cgatggctct 60

ggtttcctga gtctggatgc agctgcgcgt agtggctcca ttgccatcac cgcaaacaat 120

tcatggtcgg tgacgcagga taaagacagc gaatggctga ccctgagcac cacgtctggt 180

gcagcaggtc gtaccgaaat tggtatcatg ctggaagcga acccgggcga agctcgtaat 240

gcgggtctga cctttaactc tggcggtcgc acgtatccgt tcgtgattac ccagagtgcc 300

catgttacgg cagattttga cgatgctgac cactgctttt atatcacctt tggtaccctg 360

ccgaccctgt atgcaggtct gcatgtgctg tcccacgata aaccgtcata tgtgtttttc 420

cagcgttccc aaacctttcg cccggaagaa ttcccggccc atgcagaagt tacgattgct 480

gcggatccgt cagctaatgc gaccgatgaa gacatggaac gtatgcgcac ggccatgaaa 540

cagcaaattc tgaaaatcaa cgttgaagat ccgaccgcag tttttggcct gtatgtcgac 600

gatctgcgtt gtggcattgg ttacgattgg ttcgtcgccc agggtatcga cagtacccgc 660

gtgaaagtta gtatgctgtc cgatggcacc ggcacgtaca acaacttcta caactacttc 720

ggcgatccgg ccaccgcaga acaaaactgg gaaaattacg ccgcacaggt ggaagcgctg 780

gattggcaac acggcggtcg ttttccggaa acccgcatgc cggatggttt tgacttctat 840

gaatggccgt attacctggc aacgcgtccg aactaccgcc tggttctgca ggacgatgac 900

ctgctggaag cgacgtctcc gtttatgacc gaacgtctgc agcaaatgcg caccgaatcg 960

aaacagccgt atgaactgct ggccagcctg ccggctgaag cccgtcaacg ctttttccgt 1020

atggctggct ttgattacga cgcgtttgct gcgctgttcg atgccagccc gaagaaaaac 1080

ctggtcatta tcggcacgtc acatacctcg gaagaaagcg aagcacagca agccgcatat 1140

gtggaacgta ttatcggcga ttatggtacc gcctacgaca ttttctttaa accgcacccg 1200

gcagatagct ctagttccaa ctacgaagaa cgctttgaag gtctgaccct gctgccgggt 1260

cagatgccgt ttgaaatttt cgtctggtcg ctgctggata aagtggacct gatcggcggt 1320

tattcatcga cggtgtttct gaccgtcccg gtggaaaaaa ccggctttat tttcgctgcg 1380

aatgctgaaa gcctgccgcg cccgctgaac gttctgttcc gtaatgcgga acatgtccgc 1440

tggatccagt aa 1452

<210> 23

<211> 1452

<212> ДНК

<213> Alistipes shahii

<400> 23

atggacgatg gcaccccgag tgtcagcatc aacggcggca ccgacttcct gagcctggac 60

cacctggcac gcagcggcaa aatcacggtc aacgcaccgg ctccgtggtc tgtgaccctg 120

gccccggaaa attacggcca ggatgaaaaa ccggactggc tgaccctgag cgccgaagaa 180

ggcccggcag gttatagcga aatcgatgtt acctttgcgg aaaacccggg tccggcccgt 240

tccgcatcac tgctgttcag ctgcgatggt aaaaccctgg cctttacggt ttcgcagagc 300

gcaggcggta cgggtttcga tgctccggac tattactttt atatttcggt cggcaccatg 360

ccgacgctgt actcgggtct gcatctgctg agccacgata aaccgtctta tgttagttac 420

gaacgtgcga gcacctttga tgcggccgaa ttcccggacc gcgcgtttgt ctatccggtg 480

gccgatccga ccggtcatgc aaccaacgaa gaactgcgtg cgatgagcga agccatgaaa 540

cgtcgcatcc tggaaattaa tgcagaagat ccgaccgctg ttttcggtct gtgggtcgat 600

gacctgcgtt gccgcctggg ctacgattgg tttgtggctc aaggtatcga ctctgcgcgc 660

gtgaaagtta cgatgctgag tgatggcacc gcgacgtata acaattttca taactacttc 720

ggtgacgcag ctaccgccga acagaactgg aatgattatg cggccgaagt tgaagcactg 780

gactggaatc atggcggtcg ttatccggaa acccgtgccc cggaagaatt cgcctcctac 840

acctggccgt attacctgtc aacgcgtccg gattatcgcc tgatgctgca aaacagctct 900

ctgatggaaa gttcctgtcc gtttatcgca gatcgcctgg cagctatgaa aatggaatcc 960

gtgcagccgt atgaactgct gacggcactg ccggaagctt caaaacagca attctatcgt 1020

atggccaaat ttgattacgc acgctttgct ggcctgttcg acctgtctcc gaagaaaaac 1080

ctgattatca ttggtacctc tcattcatcg gcggccagtg aacagcaaca ggcagcttac 1140

gtcgaacgta tcattcaaca gtatggcagt gattacgaca ttttctttaa accgcacccg 1200

gcagatagct ctagtgctgg ttatccggac cgctttgaag gtctgaccct gctgccgggt 1260

cagatgccgt ttgaaatctt cgtttgggcg ctgctggata aaatcgacat gattggcggt 1320

tatccgtcca ccacgtttat ttcagtgccg ctggataaag ttggctttct gttcgcggcc 1380

gatgccgacg gtctggtccg cccgctgaat atcctgttcc gtgacgctgc aaatgtcgaa 1440

tggattcaat aa 1452

<210> 24

<211> 1206

<212> ДНК

<213> Actinobacillus suis

<400> 24

atggaacgca cgccgcaact gcaagcggtg gacatttaca ttgacttcgc aacgatcccg 60

agcctgagct actttctgca ctttctgaaa cataaacacg atgatcagcg tctgcgtctg 120

ttcagcctgg cccgttttga aatgccgcaa accctgattg aacagtatga aggcattatc 180

cagttctcgc gcaacgtgga acataatgtt gaaccgctgc tggaacagct gcaaacgatc 240

ctgtcacaag aaggtaaaca gtttgaactg catctgcacc tgaacctgtt tcattcgttc 300

gaaatgtttc tgaatctgag cccgacctac acgcagtaca aagaaaaaat ctctaaaatc 360

gttctgcacc tgtatgatga cggcagtgaa ggtgtcatga aacagtacca actgcagaaa 420

agctctagtc tggtgcagga tctggcggcc accaaagcat ctctggttag cctgttcgaa 480

aacggcgaag gttcgtttag ccagattgat ctgatccgtt atgtctggaa tgctgtgctg 540

gaaacccatt attacctgct gtctgatcac tttctgctgg acgaaaaact gcagccgctg 600

aaagcagaac tgggccatta ccaactgctg aacctgagtg cttatcagta cctgtcctca 660

gaagatctgc tgtggctgaa acagattctg aaaatcgaca ccgaactgga aagcctgatg 720

caaaaactga cggcgcagcc ggtgtatttc tttagcggta ccacgttttt caacatcagt 780

ttcgaagata aacaacgtct ggcgaatatc catgccattc tgatccgcga acacctggac 840

ccgaactccc agctgtttat tggcgaaccg tacctgtttg tcttcaaagg tcatccgaac 900

tcaccggaaa ttaatcaggc cctgcgtgaa tattacccga acgttatctt cctgccggaa 960

aatattccgt ttgaaatcct gaccctgctg ggcttctccc cgcaaaaaat tggcggtttt 1020

gcgtcaacga tccacgttaa ttccgaacag tcaaaactgg ccaaactgtt tttcctgacc 1080

tcgacggatg aacaagaacg ccagctgagc gacggttata ttaaacaata cgcactggct 1140

caggctatgc tggaaatgca actggtctcg caagaacaag tctattactg ctcgctgtcg 1200

tcgtaa 1206

<210> 25

<211> 1206

<212> ДНК

<213> Actinobacillus capsulatus

<400> 25

atggaacgca tcccgcaact gcaagctgtc gatatttaca ttgacttcgc cacgatcccg 60

agcctgtcct actttctgca ctttctgaaa cataaacacg atcatcagcg tctgcgcctg 120

ttcagcctgg cgcgttttga aatgccgcag accgtcattg aacaatatga aggcattatc 180

cagttctcac gcaacgtgga acacaatgtt gaacaactgc tggaacagct gcaaacgatc 240

ctgtcgcagg aaggtaaaca atttgaactg cacctgcatc tgaacctgtt tcacagtttc 300

gaaatgtttc tgaatctgtc cccgacctac acgaaataca aagaaaaaat ctcaaaaatc 360

gttctgcatc tgtatgatga cggctcggaa ggtgtcatga aacagtacca actgcagcaa 420

agtaactccc tggcacagga tctggctagc accaaagcgt cactggtttc gctgttcaaa 480

aacggcgaag gtgccttttc tcagattgat ctgatccgtt atgtctggaa tgcagtgctg 540

gaaacccact attacctgct gtcagaccac tttctggccc atgaaaaact gcagccgctg 600

aaaattgaac tgggccatta ccagctgctg aatctgtctg cctatcaata cctgagctct 660

gaagatctgc tgtggctgaa acaaattctg aaaatcgacg cagaactgga aagtctgatg 720

cataaactga ccacgcagcc ggtgtatttc tttagcggta ccacgttttt caacatttcg 780

ttcgaagata aacagcgtct ggccaatatc cacgcaattc tgatccgcga acatctggac 840

ccgaacagtc agctgtttat cggcgaaccg tacctgtttg ttttcaaagg tcacccgaac 900

tccccggaaa ttaatcaggc tctgcgcgaa tattacccga acgcgatctt cctgccggaa 960

aatattccgt ttgaaatcct gaccctgctg ggcttcagcc cgcagaaaat tggcggtttt 1020

gcttctacga tccatgtgaa cagcgaacaa tctaaactgg cgaaactgtt tttcctgacc 1080

agtacggatg aacaggaacg taatcgctcc gacggttata ttaaacagta cgcgctggcc 1140

caagcaatgc tggaaatgca actggtctcg caagaacaag tctactactg ctcgctgtcg 1200

tcgtaa 1206

<210> 26

<211> 936

<212> ДНК

<213> Haemophilus somnus

<400> 26

atgttccgtg aagacaatat gaacctgatt atctgctgta cgccgctgca agtgattatc 60

gccgaaaaaa ttatcgaacg ctatccggaa cagaaatttt atggcgttat gctggaatca 120

ttctacaacg ataaattcga cttctacgaa aacaaactga aacatctgtg ccacgaattt 180

ttctgtatca aaatcgcacg tttcaaactg gaacgctata aaaacctgct gtcactgctg 240

aaaatcaaaa acaaaacctt cgatcgtgtc ttcctggcta acatcgaaaa acgctacatc 300

catatcatcc tgtcgaacat tttctttaaa gaactgtaca ccttcgatga cggcacggcg 360

aacatcgccc cgaatagtca tctgtatcaa gaatacgatc actccctgaa aaaacgtatt 420

accgacatcc tgctgccgaa ccattacaac agcaacaaag tgaaaaacat cagcaaactg 480

cactactcta tctaccgctg caaaaacaac atcatcgata acatcgaata catgccgctg 540

tttaacctgg agaaaaaata cacggcacag gataaaagta tttccatcct gctgggtcaa 600

ccgattttct atgacgaaga gaaaaacatt cgtctgatca aagaagtcat cgccaaattc 660

aaaatcgatt actacttccc gcacccgcgc gaagattact acatcgacaa cgtgtcttac 720

atcaaaaccc cgctgatctt tgaagaattt tacgcggaac gttcaatcga aaattcgatc 780

aaaatctata cctttttcag ctctgccgtg ctgaacatcg ttacgaaaga aaatattgat 840

cgcatctacg cactgaaacc gaaactgacg gaaaaagcgt atctggattg ttacgacatc 900

ctgaaagatt tcggtatcaa agttatcgac atctaa 936

<210> 27

<211> 1200

<212> ДНК

<213> Haemophilus ducreyi

<400> 27

atgctgattc aacagaacct ggaaatctac ctggactacg caaccatccc gagcctggcc 60

tgctttatgc acttcattca acacaaagat gacgtcgata gtattcgtct gtttggcctg 120

gcacgcttcg atatcccgca gtccattatc gaccgttacc cggctaacca cctgttttat 180

cacaacatcg ataatcgcga cctgaccgca gtgctgaacc agctggcgga tattctggcc 240

caggaaaata aacgttttca aatcaacctg catctgaacc tgtttcacag cattgacctg 300

tttttcgcta tttatccgat ctaccagcaa tatcagcata aaatttctac catccagctg 360

caactgtacg atgacggcag cgaaggtatt gttacgcagc attctctgtg caaaattgcg 420

gatctggaac agctgatcct gcaacacaaa aacgtgctgc tggaactgct gaccaaaggc 480

acggccaacg ttccgaatcc gaccctgctg cgttatctgt ggaacaatat tatcgattca 540

cagtttcatc tgatctcgga ccattttctg caacacccga aactgcaacc gctgaaacgt 600

ctgctgaaac gctacaccat tctggatttt acgtgttatc cgcgcttcaa tgccgaacag 660

aaacaactgc tgaaagaaat tctgcatatc tcaaacgaac tggaaaatct gctgaaactg 720

ctgaaacagc acaacacctt tctgttcacg ggcaccacgg cgtttaatct ggatcaggaa 780

aaactggacc tgctgaccca actgcatatc ctgctgctga acgaacacca gaatccgcat 840

tcaacgcact acattggcaa caattatctg ctgctgatca aaggtcatgc aaactcgccg 900

gctctgaatc ataccctggc gctgcacttt ccggatgcga ttttcctgcc ggccaatatt 960

ccgtttgaaa tcttcgcgat gctgggcttt acgccgaaca aaatgggcgg tttcgccagc 1020

acctcttaca ttaattatcc gacggaaaac atcaatcacc tgtttttcct gaccagtgat 1080

cagccgtcca ttcgcacgaa atggctggac tacgaaaaac aatttggtct gatgtattcc 1140

ctgctggcaa tgcagaaaat caacgaagat caggcgttta tgtgcaccat tcacaattaa 1200

<210> 28

<211> 1494

<212> ДНК

<213> Photobacterium leiognathi

<400> 28

atgtgtaacg ataatcaaaa tacggtcgat gttgttgtga gcaccgttaa cgataacgtc 60

atcgaaaaca acacgtacca agttaaaccg atcgataccc cgaccacgtt tgacagttac 120

tcctggattc agacgtgcgg caccccgatc ctgaaagatg acgaaaaata ttcactgtcg 180

tttgatttcg tcgccccgga actggatcag gacgaaaaat tctgtttcga atttaccggc 240

gatgttgacg gtaaacgtta tgtcacgcag accaacctga cggtggttgc accgaccctg 300

gaagtttacg tcgatcatgc tagtctgccg tccctgcagc aactgatgaa aatcatccag 360

cagaaaaacg aatactcaca gaatgaacgt ttcatttcgt ggggccgcat cggtctgacg 420

gaagataacg cggaaaaact gaatgcccat atttatccgc tggcaggcaa caatacctca 480

caggaactgg tggatgcagt gatcgattac gctgactcga aaaaccgtct gaatctggaa 540

ctgaacacga ataccgcgca cagctttccg aacctggccc cgattctgcg cattatcagc 600

tctaaaagca acatcctgat ctctaacatc aacctgtacg atgacggcag tgctgaatat 660

gtgaacctgt acaattggaa agataccgaa gacaaatccg tgaaactgag cgattctttc 720

ctggttctga aagactactt taacggtatt agttccgaaa aaccgagcgg catctatggt 780

cgctacaact ggcatcaact gtataatacg tcttattact tcctgcgtaa agattacctg 840

accgttgaac cgcagctgca cgacctgcgc gaatatctgg gcggtagtct gaaacaaatg 900

tcctgggatg gcttttcaca gctgtcgaaa ggtgacaaag aactgttcct gaacattgtc 960

ggctttgatc aggaaaaact gcagcaagaa taccagcaat cagaactgcc gaatttcgtg 1020

tttacgggca ccacgacctg ggcaggcggt gaaaccaaag aatattacgc tcagcaacag 1080

gtgaacgtcg tgaacaatgc gattaatgaa accagcccgt attacctggg ccgtgaacat 1140

gacctgtttt tcaaaggtca cccgcgcggc ggtattatca atgatattat cctgggcagt 1200

ttcaacaata tgattgacat cccggccaaa gtgtcctttg aagttctgat gatgacgggt 1260

atgctgccgg ataccgtggg cggtattgcg tcatcgctgt attttagcat cccggccgaa 1320

aaagtctctt tcattgtgtt taccagctct gatacgatca ccgatcgtga agacgcgctg 1380

aaatctccgc tggtgcaggt tatgatgacc ctgggcattg ttaaagaaaa agatgtgctg 1440

ttctggtcgg atctgccgga ttgttcctcg ggtgtttgta ttgctcagta ttaa 1494

<210> 29

<211> 1497

<212> ДНК

<213> Photobacterium sp.

<400> 29

atgagtgaag aaaacaccca gtccattatt aaaaacgaca tcaacaaaac catcatcgat 60

gaagaatacg ttaacctgga accgatcaac cagtctaaca tcagttttac caaacatagc 120

tgggtccaga cctgcggtac gcagcaactg ctgacggaac aaaacaaaga atcaatttcg 180

ctgagcgtgg ttgcgccgcg tctggatgac gatgaaaaat actgtttcga tttcaacggt 240

gttagtaata aaggcgaaaa atacatcacc aaagtcacgc tgaatgtcgt ggcaccgtct 300

ctggaagttt atgtggatca tgctagtctg ccgaccctgc aacaactgat ggatattatc 360

aaatcggaag aagaaaaccc gaccgcacag cgttacattg cttggggccg catcgtgccg 420

acggacgaac agatgaaaga actgaatatt accagctttg cgctgatcaa caatcacacg 480

ccggccgatc tggttcagga aattgtcaaa caggcgcaaa ccaaacatcg tctgaacgtg 540

aaactgagca gcaatacggc ccactcgttt gacaatctgg ttccgattct gaaagaactg 600

aacagcttca acaatgtgac cgttacgaat atcgatctgt atgacgatgg cagcgcggaa 660

tatgttaacc tgtacaattg gcgcgacacc ctgaacaaaa cggataatct gaaaattggc 720

aaagactatc tggaagatgt cattaacggt atcaatgaag ataccagcaa caccggcacg 780

agttccgtgt acaattggca gaaactgtat ccggctaact accattttct gcgtaaagat 840

tatctgaccc tggaaccgtc cctgcacgaa ctgcgcgact acattggtga ttcactgaaa 900

cagatgcaat gggacggctt caaaaaattc aactcgaaac agcaagaact gtttctgagc 960

atcgtgaatt tcgataaaca gaaactgcaa aacgaataca attcatcgaa cctgccgaat 1020

tttgtgttca ccggtaccac ggtttgggca ggcaaccacg aacgcgaata ctacgctaaa 1080

cagcaaatca acgttatcaa caacgccatc aacgaaagct ctccgcatta tctgggtaat 1140

tcctacgacc tgtttttcaa aggccacccg ggcggtggca ttatcaacac cctgatcatg 1200

cagaattatc cgtcaatggt cgatattccg tccaaaatct catttgaagt gctgatgatg 1260

accgacatgc tgccggatgc cgtggcaggt attgcgagtt ccctgtactt cacgatcccg 1320

gccgaaaaaa tcaaattcat cgttttcacc tctacggaaa ccattacgga tcgtgaaacc 1380

gccctgcgta gtccgctggt ccaggtgatg attaaactgg gcatcgtgaa agaagaaaat 1440

gtgctgttct gggcggacct gccgaattgc gaaacgggtg tctgtattgc tgtctga 1497

<210> 30

<211> 1449

<212> ДНК

<213> Photobacterium leiognathi

<400> 30

atgaacgata atcaaaatac ggtggacgtg gtggtctcaa ccgtcaacga taacgtgatc 60

gaaaacaaca cgtaccaagt caaaccgatc gataccccga ccacgttcga ctcatactcg 120

tggattcaga cgtgcggcac cccgatcctg aaagatgacg aaaaatatag cctgtctttt 180

gatttcgttg ccccggaact ggatcaagac gaaaaattct gtttcgaatt taccggcgat 240

gtggatggta aacgttatgt gacgcagacc aacctgacgg tggttgcacc gaccctggaa 300

gtttacgtcg atcatgcttc actgccgtcg ctgcagcaac tgatgaaaat catccagcag 360

aaaaacgaat acagccagaa tgaacgcttt atttcttggg gccgtatccg cctgacggaa 420

gataacgcgg aaaaactgaa tgcccatatt tatccgctgg caggcaacaa taccagccag 480

gaactggtgg acgcagttat cgattacgct gactctaaaa accgtctgaa tctggaactg 540

aacacgaata ccggccacag tttccgtaac attgcgccga tcctgcgcgc caccagctct 600

aaaaacaaca tcctgatctc caacatcaac ctgtacgatg acggtagtgc tgaatatgtg 660

tccctgtaca actggaaaga taccgacaat aaatcacaga aactgagtga ttcctttctg 720

gttctgaaag actacctgaa tggcatcagt tccgaaaaac cgaacggtat ttatagcatc 780

tacaattggc atcagctgta tcactcatcg tattacttcc tgcgtaaaga ttacctgacg 840

gtggaaacca aactgcacga cctgcgcgaa tatctgggcg gttcactgaa acaaatgtcg 900

tgggatacct ttagccagct gtctaaaggc gacaaagaac tgttcctgaa cattgttggt 960

tttgatcagg aaaaactgca gcaagaatac cagcaaagcg aactgccgaa tttcgtcttt 1020

acgggcacca cgacctgggc aggcggtgaa accaaagaat attacgctca gcaacaggtg 1080

aacgtcgtga acaatgcgat taatgaaacc tctccgtatt acctgggccg tgaacatgac 1140

ctgtttttca aaggtcaccc gcgcggcggt attatcaatg atattatcct gggctcattc 1200

aacaatatga ttgacatccc ggccaaagtt tcgtttgaag tcctgatgat gacgggtatg 1260

ctgccggata ccgttggcgg tattgcgagc agcctgtatt ttagtatccc ggccgaaaaa 1320

gtgtccttca ttgtttttac cagttccgat acgatcaccg atcgcgaaga cgcgctgaaa 1380

agtccgctgg tccaagtgat gatgaccctg ggcattgtga aagaaaaaga tgtgctgttc 1440

tggtgctaa 1449

<210> 31

<211> 2028

<212> ДНК

<213> Photobacterium damsela

<400> 31

atgaaaaaga tcctgaccgt cctgagcatc tttatcctga gcgcctgtaa tagcgacaac 60

acctctctga aagaaaccgt ctccagcaac agcgcggatg tggttgaaac ggaaacctat 120

cagctgaccc cgattgacgc cccgagcagc tttctgagcc attcttggga acagacgtgc 180

ggcaccccga tcctgaatga aagtgataaa caagcgattt cctttgactt cgtggccccg 240

gaactgaaac aggatgaaaa atactgtttc acgttcaaag gcatcaccgg tgaccaccgc 300

tacattacga acaccaccct gaccgttgtg gcaccgacgc tggaagtgta tatcgatcat 360

gctagtctgc cgagcctgca acaactgatt cacattatcc aggcgaaaga tgaatacccg 420

tcaaaccaac gctttgtttc gtggaaacgt gttaccgtcg atgcggacaa cgccaataaa 480

ctgaatattc atacctatcc gctgaaaggc aacaatacgt caccggaaat ggttgcggcc 540

atcgatgaat atgcacaatc gaaaaaccgc ctgaatattg aattttacac gaataccgct 600

catgtcttca acaatctgcc gccgattatc cagccgctgt acaacaacga aaaagtcaaa 660

atttcacaca tctcgctgta cgatgacggt agttccgaat atgtgagtct gtaccagtgg 720

aaagataccc cgaacaaaat tgaaacgctg gaaggcgaag tgagcctgct ggcaaattat 780

ctggctggca ccagcccgga tgcaccgaaa ggcatgggta accgttataa ttggcataaa 840

ctgtacgata ccgactatta ctttctgcgc gaagattatc tggacgtgga agcgaacctg 900

cacgatctgc gtgactacct gggttcatcg gcaaaacaga tgccgtggga tgaatttgct 960

aaactgagtg actcccagca aaccctgttt ctggatatcg ttggcttcga caaagaacag 1020

ctgcaacaac agtattcaca atcgccgctg ccgaatttta tttttaccgg caccaccacc 1080

tgggcgggcg gtgaaacgaa agaatattac gcccaacagc aagtgaacgt tattaacaat 1140

gccatcaatg aaaccagccc gtattacctg ggcaaagatt acgacctgtt tttcaaaggt 1200

catccggcag gcggtgtgat caacgatatt atcctgggca gttttccgga catgattaat 1260

atcccggcta aaatttcctt cgaagtgctg atgatgaccg atatgctgcc ggacacggtt 1320

gcaggtatcg ctagctctct gtattttacc attccggcgg ataaagtgaa ctttatcgtt 1380

ttcacgagtt ccgatacgat taccgaccgt gaagaagccc tgaaaagccc gctggtccag 1440

gtgatgctga ccctgggcat cgtcaaagaa aaagatgtgc tgttctgggc agaccacaaa 1500

gttaatagca tggaagtcgc gattgatgaa gcctgcaccc gcattatcgc aaaacgtcag 1560

ccgacggctt ctgatctgcg cctggtgatt gcgattatca aaacgatcac cgatctggaa 1620

cgtattggcg acgttgccga atctattgcg aaagtcgcgc tggaatcttt ttctaacaaa 1680

cagtacaatc tgctggttag cctggaatct ctgggtcaac ataccgtgcg catgctgcac 1740

gaagttctgg atgcattcgc tcgtatggac gtcaaagcag ctatcgaagt gtatcaggaa 1800

gatgaccgca tcgatcaaga atacgaaagt attgtccgtc agctgatggc ccacatgatg 1860

gaagatccgt catcgattcc gaacgttatg aaagtcatgt gggcggcccg ttccatcgaa 1920

cgcgttggtg atcgttgcca gaatatttgt gaatacatca tctacttcgt gaaaggcaaa 1980

gatgttcgcc acaccaaacc ggatgacttc ggtacgatgc tggactaa 2028

<210> 32

<211> 1533

<212> ДНК

<213> Photobacterium damsela

<400> 32