Способ автокаталитической активации прохимозина быка при культивировании Pichia pastoris в ферментере Российский патент 2023 года по МПК C12N9/64 C12N15/81 C12R1/84 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам ферментации дрожжей при продукции рекомбинантных протеаз. При экспрессии рекомбинантных протеаз, в частности, химозина одним из наиболее эффективных подходов является экспрессия в виде проферментов [1]. Так, при использовании одинаковой генетической конструкции для экспрессии пре-прохимозина, прохимозина и химозина в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris наибольший уровень экспрессии характерен для прохимозина. Экспрессия в виде профермента позволяет добиться максимальных выходов с одной стороны, за счет снижения неспецифического протеолитической активности протеазы, с другой вынуждает использовать методы активации проферментов для формирования зрелых форм фермента.

Так, для прохимозина существует разработанный метод активации с использованием понижения pH культуральной жидкости с pH 5,5 до 2 с последующим восстановлением до pH 5,5 [1]. При понижении до pH 2 зимоген приобретает характерную конформацию, позволяющую автокаталитически расщепить прохимозин до N-концевого пептида (аминокислотные остатки 1-42) и зрелого химозина. Существенным элементом активации зимогена химозина является его двухстадийность: на первом этапе, при понижении pH до 2 происходит отщепление N-концевого участка в 27 аминокислот с формированием из прохимозина (40777 Да) псевдохимозина (37400 Да). Псевдохимозин стабилен в диапазоне pH ниже 3,0 и больше 6,0. При значении pH 4,5 псевдохимозин переходит в состояние активированного химозина [2].

Значение pI прохимозина 4,7 и при активации методом понижения pH с последующим восстановлением химозин проходит через изоэлектрическую точку дважды. Это приводит к определенным потерям в активности фермента, так как часть белка выпадает в осадок.

Существующие подходы предлагают несколько альтернатив по активации при промышленной очистке и выделении химозина. Так, в одном случае очистка может производится при значении pH 2, однако часть белка все равно теряется при однократном переходе через изоэлектическую точку [2]. Другой подход заключатся в культивации дрожжей Pichia pastoris при pH 4, при этом нет необходимости переходить через изоэлектическую точку прохимозина для активации, однако продукция фермента в этих условиях культивирования ниже. Ещё одной альтернативой данному подходу является увеличение времени культивирования с 72 ч до 120 ч [3], что приводит к автокаталитическому расщеплению прохимозина при значении pH 5.5. Однако отрицательной стороной такого подхода является увеличение длины цикла ферментации на 40%, кроме того, незначительная часть фермента в таких условиях остается в форме прохимозина.

Вне зависимости от использованного промотора в конструкции для экспрессии рекомбинантного химозина в Pichia pastoris (индуцибельный AOX1 или конститутивный GAP) конечным продуктом в культуральной жидкости помимо минорных примесей является смесь трех разных состояний фермента на разной степени активации зимогена: прохимозин (40777 Да), псевдохимозин (37400 Да), химозин (35600 Да).

Использование Pichia pastoris в качестве штамм-продуцента позволяет получать рекомбинантный химозин в гомогенном виде с высоким выходом. Существующие системы экспрессии рекомбинантного химозина основаны на нескольких видах продуцентов химозина. Большинство из них используют в качестве генетического конструкта про-форму фермента прохимозин, который в дальнейшем активируется до зрелого химозина при помощи активации понижением pH.

Из патента RU2670071C1 известна рекомбинантная плазмида pET21a-ProChym, для экспрессии рекомбинантного химозина быка Bos taurus в Е.coli. Данный вариант продукции подразумевает экспрессию в E. coli c последующим рефолдингом из телец включения и активацией понижением pH. Данный способ не удобен, так как требует последующего рефолдинга и активации, что приводит к усложнению процесса очитки и потерям при получении активного белка.

Патент US9307775B2 предлагает метод очистки и получения рекомбинантного химозина при продукции рекомбинантного прохимозина в Aspergillus niger var. awamori при использовании плазмиды pGAMpR-C. Прохимозин секретируется снаружи клетки, а затем активируется до химозина понижением pH. Данная схема с одной стороны позволяет получать рекомбинантный химозин в большом количестве, однако вкусовые качества сыра получаемого при помощи рекомбинантного химозина, получаемого в Aspergillus sp., несколько хуже природного из-за характерных для Aspergillus примесей.

Технической задачей заявленного изобретения является создание способа культивирования метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, которые позволяют получить культуральную жидкость, содержащую на выходе активированный химозин (35600 Да) после 72 ч индукции продукции химозина и не требующую дополнительной активации.

Для формирования условий для перехода прохимозина в химозин в культуральной жидкости во время ферментации необходимо сформировать критическую массу активированного химозина в процессе культивирования. Так известно, что для поддержания pH в культуральную жидкость вносятся титрующие агенты (5% H₂SO₄ и 10% NH₃). Формирование на ранних этапах культивирования небольшого пула активированного химозина за счет незначительного сдвига pH (до pH 4,1) титрующими агентами в сочетании с поддержанием необходимой концентрации кальция как кофактора химозина, позволяют запустить процесс автокаталитической активации в ферментере. Конечным результатом данного процесса является переход прохимозина в химозин в культуральной жидкости без активации сдвигом pH.

Активация химозина при культивировании в ферментере осуществляется в стандартном режиме культивирования в ферментере штамма-продуцента AOX1-Chym1 прохимозина. Уровень активации зимогена составляет не более 35 %, однако понижение pH до уровня 4,1 на 30 минут на 24 ч культивирования при уровне кальция в среде 0,5 г/л приводит к формированию достаточного количества активированного химозина, который позволяет осуществлять процесс автокаталитической активации зимогена прохимозина (Рисунок 1). Процесс активации прохимозина в химозин происходит при значении pH ниже 4,2. Кальций является кофактором в данном процессе, при этом повышение уровня кальция до максимального значения ускоряет процесс активации химозина и при значении pH 4,1.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание способа культивирования метилотрофных дрожжей, продуцентов прохимозина, позволяющего активировать прохимозин в зрелый химозин прямо в процессе ферментации.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами различных протоколов культивации.

Пример 1. Культивирование штамм-продуцента Pichia pastoris прохимозина в ферментере

Для культивирования штамма-продуцента Pichia pastoris pPICzα-Chym1 прохимозина использовался ферментер “Biostat B+” (“Sartorius”, Германия) объемом 2л. Для получения посевной культуры штамм-продуцент выращивали в течение суток в шейкере-инкубаторе при 30^оС и 250 об/мин на среде BMGY, следующего состава (%): дрожжевой экстракт – 1.0, глицерин – 1.0, пептон – 2.0, дрожжевых азотистых оснований – 1.34, 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.0. Засев ферментера осуществляли из 1 колбы (150 мл среды), культивирование проводили на минеральной среде с глицерином, следующего состава (г/л): 70 глицерин − 70, KH₂PO₄ − 9.9, (NH₄)₂SO4 − 15.7, г/л MgSO₄ − 4.6, CaCl₂ − 0.35, биотин – 4.0, PTM1 − 0.972%, пеногаситель Софэксил (“Софэкс-Силикон” Россия) − 0.1%, при 30^оС, а после добавления метанола температуру снижали до 26^оС. При выращивании на среде с глицерином поддерживали рН среды 4.0, после индукции метанолом значение рН меняли на 5.5. Сорбитол (2%) добавляли одновременно с индукцией метанолом через 24 ч и 48 ч. Добавление метанола осуществляли раз в три часа до его содержания в среде 1%. Для этого использовали 50%-ный раствор метанола с 2.2%-ным PTM1. Автоматическое поддержание значения рН среды осуществляли титрованием 10%-ными растворами NH₄OH и Н₂SO₄.

Пример 2. Определение активности химозина в культуральной жидкости

Активность химозина определяли в соответствии с ранее разработанной методикой определения молоко-свертывающей активности [2]. Сухое обезжиренное молоко (“Промакс”, Россия) было восстановлено в виде 26%-ного раствора с добавлением 0.5 г/л CaCl₂, pH 6.5. Молоко перемешивали при 25 ^оС в течении 30 мин и инкубировали при 37°С 20 мин. К 1 мл восстановленного обезжиренного молока, содержащего 0.1 г/мл хлорида кальция добавляли 100 мкл КЖ после активации химозина. Определяли время образования сгустка при 37°С. В качестве положительного контроля использовали контрольный раствор с известной активностью химозина (“Proquiga”, Испания) 600 IMCU/мл (IMCU – International milk clotting units, международные единицы свертываемости молока, ГОСТ 11815-2015).

Пример 3. Сравнение культивирования штамм-продуцента Pichia pastoris прохимозина в ферментере с активацией рекомбинантного химозина в процессе ферментации со стандартным протоколом культивирования штамм-продуцента Pichia pastoris прохимозина в ферментере

Для культивирования штамма-продуцента Pichia pastoris pPICzα-Chym1 прохимозина использовался ферментер “Biostat B+” (“Sartorius”, Германия) объемом 2л. Для получения посевной культуры штамм-продуцент выращивали в течение суток в шейкере-инкубаторе при 30^оС и 250 об/мин на среде BMGY, следующего состава (%): дрожжевой экстракт – 1.0, глицерин – 1.0, пептон – 2.0, дрожжевых азотистых оснований – 1.34, 100 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.0. Засев ферментера осуществляли из 1 колбы (150 мл среды), культивирование проводили на минеральной среде с глицерином, следующего состава (г/л): 70 глицерин − 70, KH₂PO₄ − 9.9, (NH₄)₂SO4 − 15.7, г/л MgSO₄ − 4.6, CaCl₂ − 0.5, биотин – 4.0, PTM1 − 0.972%, пеногаситель Софэксил (“Софэкс-Силикон” Россия) − 0.1%, при 30^оС, а после добавления метанола температуру снижали до 26^оС. При выращивании на среде с глицерином поддерживали рН среды 4.0, после индукции метанолом значение рН меняли на 5.5. Сорбитол (2%) добавляли одновременно с индукцией метанолом через 24 ч и 48 ч. На 24ч индукции экспрессии метанолом понижали pH культуральной жидкости с 5,5 до 4,1 на 30 минут. Затем восстанавливали pH до 5,5. Добавление метанола осуществляли раз в три часа до его содержания в среде 1%. Для этого использовали 50%-ный раствор метанола с 2.2%-ным PTM1. Автоматическое поддержание значения рН среды осуществляли титрованием 10%-ными растворами NH₄OH и Н₂SO₄.

Сравнение выходов по активированному химозину в результате модифицированного способа культивирования (кратковременное снижение pH, повышенная концентрация кальция) и стандартного способа культивирования приведены на рисунке 1. Мы можем наблюдать изменение в количестве активированного прохимозина в зависимости от условий культивирования. Так, после 72 часов культивирования выход активированного химозина увеличился с 33% до 95% при модифицированном протоколе культивации.

Источники информации

1. Van den Berg J.A., van der Laken K.J., van Ooyen A.J., Renniers T.C., Rietveld K., Schaap A., Brake A.J., Bishop R.J., Schultz K., Moyer. D. // Nat. Biotechnol. 1990. V. 8. № 2. P. 135–139.

2. Noseda D.G., Recúpero M.N., Blasco M., Ortiz G.E., Galvagno M.A. // Protein Expr. Purif. 2013. V. 92. № 2. P. 235–244.

3. Dunn-Coleman N.S., Bloebaum P., Berka R.M., Bodie E., Robinson N., Armstrong G., Ward M., Przetak M., Carter G.L., LaCost R. // Nat. Biotechnol. 1991. V. 9. № 10. P. 976–981.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения рекомбинантного химозина. Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, продуцирующие рекомбинантный прохимозин, культивируют на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и глицерин, при рН 4. Содержание ионов кальция поддерживают на уровне не менее 0,5 г/л. Добавляют метанол и сорбитол и изменяют рН на 5,5. На 24 ч индукции промотора химозина метанолом в течение 30 минут понижают значение pH с 5,5 до 4,1 в ферментере. Изобретение позволяет получить зрелый химозин прямо в процессе ферментации. 1 ил., 3 пр.

Способ получения рекомбинантного химозина, включающий культивирование продуцирующих рекомбинантный прохимозин метилотрофных дрожжей Pichia pastoris на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и глицерин, при рН 4, добавление метанола и сорбитола и изменение рН на 5,5, отличающийся тем, что на 24 ч индукции промотора химозина метанолом в течение 30 минут понижают значение pH с 5,5 до 4,1 в ферментере и в составе культуральной жидкости по ходу культивирования содержание ионов кальция поддерживают на уровне не менее 0,5 г/л.