АНТИТЕЛА С ПРИВИТЫМ ПРЕДСЕРДНЫМ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКИМ ПЕПТИДОМ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 C07K14/58 C07K19/00 C12N15/62 C12N15/63 A61K38/22 A61K39/395 A61P9/12 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, содержащему по меньшей мере одну гетерологичную аминокислотную, последовательность, включенную вовнутрь по меньшей мере одного CDR участка указанного антитела или его фрагмента, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная аминокислотная последовательность содержит N-терминальную линкерную последовательность (Ntls), предсердный натрийуретический пептид (ANP) и C-терминальную линкерную последовательность (Ctls). Необязательно, по меньшей мере часть указанного по меньшей мере одного CDR участка замещена указанной по меньшей мере одной гетерологичной аминокислотной последовательностью, включенной в него. По меньшей мере 12 аминокислотных остатков присутствуют между аминокислотным остатком HC (тяжелая цепь) res25 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1; аминокислотным остатком HC res51 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2; аминокислотным остатком HC res92 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3; аминокислотным остатком LC (легкой цепи) res26 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1; аминокислотным остатком LC res49 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или аминокислотным остатком LC res88 по Кэботу и первым аминокислотным остатком ANP в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3. Кроме того, по меньшей мере 9 аминокислотных остатков присутствуют между последним аминокислотным остатком ANP и аминокислотным остатком HC res35a по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1; аминокислотным остатком HC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2; аминокислотным остатком HC res106 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3; аминокислотным остатком LC res 32 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1; аминокислотным остатком LC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или аминокислотным остатком LC res98 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту для применения в способе лечения, композиции, содержащей антитело или его фрагмент, нуклеиновой кислоте или смеси нуклеиновых кислот, кодирующей антитело или его фрагмент, клетке-хозяину, содержащей такую нуклеиновую кислоту или смесь нуклеиновых кислот, и к способу получения антитела или его фрагмента.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Натрийуретические пептиды представляют собой семейство трех структурно родственных пептидов с нейрогуморальным действием. Предсердный натрийуретический пептид (ANP) представляет собой пептид из 28 аминокислот, содержащий центральную кольцевую структуру, образованную дисульфидным мостиком между цистеиновыми остатками 7 и 23. Человеческий ANP экспрессируется в клетках миоцитов предсердий в виде пре-прогормона длиной 153 аминокислоты. Расщепление сигнального пептида дает форму прогормона, которая затем дополнительно расщепляется на зрелый ANP и N-концевой остаток, известный как NT-proANP. Подобно ANP, также мозговой натрийуретический пептид (BNP) и натрийуретический пептид C-типа (CNP) продуцируются из белков-предшественников и содержат центральную кольцевую структуру. BNP в основном продуцируется и высвобождается кардиомиоцитами левого и правого предсердий сердца, тогда как BNP в основном продуцируется кардиомиоцитами желудочков. CNP синтезируется эндотелиальными клетками кровеносных сосудов. Помимо этих мест, натрийуретические пептиды также продуцируются в меньших количествах в других частях тела, например, в мозге, почках и надпочечниках. Натрийуретический пептид кодируется тремя отдельными генами, NPPA, NPPB, и NPPC. Аминокислотные последовательности трех пептидов являются высоко консервативными у млекопитающих (Potter et al., Handb Exp Pharmacol. 2009; (191):341-66). Тем не менее, были описаны значительные модификации последовательности натрийуретических пептидов, такие как усечения, аминокислотные замены, а также химерные слияния (например, CD-NP (McKie et al., Curr Heart Fail Rep.2010 Sep; 7 (3): 93-9)), которые приводят к мощным натрийуретическим пептидам, которые активируют клеточные рецепторы или связываются с ними и могут вызывать соответствующие физиологические эффекты.

Натрийуретические пептиды связываются с тремя различными типами мембраносвязанных рецепторов - NPR-A, NPR-B и NPR-C, тем самым опосредуя их биологические эффекты. ANP и BNP с наибольшим сродством связываются с NPR-A; напротив, CNP имеет самое высокое сродство к рецептору NPR-B. NPR-A и NPR-B содержат (партикулярно) домен гуанилатциклазы (pGC), ферментативная активность которого вызывает повышение (внутриклеточного) циклического гуанозинмонофосфата (cGMP). В качестве вторичного посредника cGMP регулирует различные клеточные процессы. Рецептор NPR-C не проявляет активности в отношении гуанилатциклазы и также называется рецептором «клиренса», поскольку он может связывать натрийуретические пептиды, что приводит к их разрушению посредством эндоцитоза. Описана дополнительная сигнальная функция рецептора NPR-C посредством модуляции cAMP (Anand-Srivastava, Peptides. 2005 Jun; 26 (6): 1044-59).

Сердечные гормоны ANP и BNP выделяются при растяжении желудочков и предсердий, например. из-за чрезмерного объема плазмы. Они оказывают сосудорасширяющее действие за счет расслабления гладких мышц сосудов и приводят к снижению кровяного давления. В почках ANP вызывает среди прочего увеличение экскреции с мочой (диурез), а также повышение концентрации ионов натрия в моче (натрийурез). Полагают, что ANP представляет собой компенсаторный антагонист ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), которая чрезмерно активируется при ряде сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, ANP оказывает и другие нейрогуморальные эффекты, включая ингибирующее действие на симпатическую нервную систему, а также комплексное регулирующее действие на барорефлекс (Woods et al., Clin Exp Pharmacol Physiol. 2004 Nov; 31 (11): 791-4). Противовоспалительные, антигипертрофические и антифиброзные эффекты ANP, а также BNP и CNP были продемонстрированы на животных моделях для различных заболеваний (например, Knowles et al., 2001, J. Clin. Invest. 107: 975-984; Dahrouj et al., J Pharmacol Exp Ther. 2013 Jan; 344 (1): 96-102; Baliga et al., Br J Pharmacol. 2014 Jul; 171 (14): 3463-75; Mitaka et al. Intensive Care Med Exp.2014 Dec; 2 (1): 28; Werner et al., Basic Res Cardiol. 2016 Mar; 111 (2): 22; Kimura et al., Respir Res. 2016 Feb 19; 17: 19). Активация NPR-B посредством CNP играет существенную роль в росте костей (Yasoda et al., Clin. Calcium. 2009 Jul; 19 (7): 1003-8) и целостности эндотелия сосудов (Moyes et al., J Clin Invest. 2014 Sep; 124 (9): 4039-51).

Широкий спектр физиологических эффектов натрийуретических пептидов и их рецепторов делает их привлекательными целями при открытии новых лекарственных средств (Lumsden et al., Curr Pharm Des. 2010; 16 (37): 4080-8; Buglioni et al., Annu Rev Med. 2016; 67: 229-43). Например, натрийуретическая система cGMP может подавляться при различных патофизиологических состояниях, что может приводить к гипертонии, повышенной клеточной пролиферации, фиброзу, воспалению, эндотелиальной дисфункции, диабету, метаболическому синдрому, атеросклерозу, сердечной недостаточности, инфаркту миокарда, легочной гипертензии, глазным и почечным заболеваниям, костным заболеваниям, инсульту и/или сексуальная дисфункция.

Основным препятствием для терапевтического использования натрийуретических пептидов является их очень короткий период полужизни в плазме, составляющий всего несколько минут, в организме (Hunt et al., J Clin Endocrinol Metab. 1994 Jun; 78 (6): 1428-35; Kimura et al., Eur J Clin Pharmacol.2007 Jul; 63 (7): 699-702). Помимо эндоцитоза рецептором NPR-C, натрийуретические пептиды эффективно протеолитически расщепляются ферментами неприлизином (NEP) и разлагающим инсулин ферментом (IDE). Связанные с этим краткосрочные биологические эффекты вводимых натрийуретических пептидов ограничивают их терапевтическое использование в основном при до острых показаний. Например, инфузии рекомбинантного карперитида (ANP) и несиритида (BNP) одобрены для лечения острой декомпенсированной сердечной недостаточности в разных странах.

Лечению хронических заболеваний в значительной степени способствовало бы обеспечение агонистов NPR-A и NPR-B с увеличенным периодом полужизни в плазме, более высокой протеолитической стабильностью и увеличенной продолжительностью действия.

В последние годы были описаны несколько производных и вариантов натрийуретических пептидов, например, CD-NP (McKie et al., Curr Heart Fail Rep.2010 Sep; 7 (3): 93-9), ZD100 / MANP (McKie et al., Hypertension. 2010 Dec; 56 (6): 1152-9), PL-3994 (Edelson et al., Pulm Pharmacol Ther. 2013 Apr; 26 (2): 229-38), Ularitide (Anker et al., Eur Heart J. 2015 Mar 21; 36 (12): 715-2), ANX-042 (Pan et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Jul. 7; 106 (27): 11282-7) и BMN-111 (Wendt et al., J. Pharmacol Exp Ther. 2015 Apr; 353 (1): 132-49). Период полужизни CD-NP составляет около 18.5 мин (Lee et al., BMC Pharmacology 2007, 7 (Suppl I): P38). Другие производные ANP и CNP раскрыты в US 9,193,777 и EP 2 432 489 A, соответственно.

Кроме того, слияния натрийуретического пептида, включая слияния с Fc, слияние с альбумином и ПЭГилированные натрийуретические пептиды, были описаны. Слияния натрийуретический пептид-Fc, например, описаны в US 2010/0310561, WO 2008/154226, WO 2010/117760, WO 2006/107124, WO 2008/136611 и WO 2008/079995. Слияния натрийуретический пептид-альбумин описаны в US 7,521,424 и US 2014/0148390, и ПЭГилированные натрийуретические пептиды описаны в US 2014/0148390.

В WO 2005/060642 описано создание библиотек антител с привитыми пептидами ANP и BNP, полученных вставкой ANP или BNP с двумя рандомизированными фланкирующими аминокислотами на обоих концах в участок CDRH3 человеческого антитела, специфичного к столбнячному токсоиду. Аналогичным образом, в WO 2005/082004 раскрывается создание библиотеки антител с привитым миметиком ANP, полученной заменой всего исходного участка CDRH3 антитела 2G12 на пептид-миметик ANP, фланкированный двумя случайными аминокислотными остатками с каждой стороны. Ни одна из WO 2005/060642 и WO 2005/082004 не раскрывает какие-либо специфические антитела с привитым натрийуретическим пептидом, не говоря уже о функциональных характеристиках таких антител.

Задача настоящего изобретения

Исходя из предшествующего уровня техники задача настоящего изобретения состоит в обеспечении агонистов рецептора натрийуретического пептида с повышенной стабильностью в сыворотке по сравнению с натрийуретическими пептидами дикого типа природного происхождения.

Сущность изобретения

Вышеуказанная задача решается объектами изобретения, раскрытыми в независимых пунктах формулы изобретения. Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что биологически активные варианты натрийуретического пептида со значительно увеличенной стабильностью в сыворотке по сравнению с натрийуретическими пептидами дикого типа природного происхождения могут быть получены посредством включения аминокислотной последовательности натрийуретического пептида в один из CDR участков молекулы иммуноглобулина или ее фрагмента, несмотря на короткую длину и высокую консервативность последовательности участков CDR иммуноглобулина, что создает значительные конформационные ограничения для включения биологически активных пептидов. Однако активность натрийуретических пептидов, включенных в участок CDR иммуноглобулина, как было показано, значительно различается. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что решающим фактором для успешного включения с получением биологически активного варианта натрийуретического пептида является число аминокислотных остатков между включенным натрийуретическим пептидом и ближайшими соседними соединениями CDR-каркаса, N-терминальными и C-терминальными от включенного натрийуретического пептида. Ниже определенного числа N-терминальных и C-терминальных фланкирующих аминокислотных остатков между натрийуретическим пептидом и соседними соединениями CDR-каркаса образуются только слитые конструкции натрийуретического пептида и иммуноглобулина без биологической активности или с резко пониженной биологической активностью. Было обнаружено, что специфические линкерные последовательности, фланкирующие включенный натрийуретический пептид, являются особенно предпочтительными для достижения высокой пептидной активности, хороших уровней экспрессии и/или низких уровней фрагментации белка.

Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является антитело или его фрагмент, содержащее по меньшей мере одну гетерологичную аминокислотную, последовательность, включенную вовнутрь по меньшей мере одного CDR участка указанного антитела или его фрагмента, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная аминокислотная последовательность содержит N-терминальную линкерную последовательность (Ntls), натрийуретический пептид и C-терминальную линкерную последовательность (Ctls), где необязательно по меньшей мере часть указанного по меньшей мере одного CDR участка замещена указанной по меньшей мере одной гетерологичной аминокислотной последовательностью, включенной в него, и где

a) по меньшей мере 12 аминокислотных остатков присутствуют между

i) аминокислотным остатком HC res25 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res S25) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res51 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res I51) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res92 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res C96) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res26 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res S25) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res49 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res Y51) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res88 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res C90) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3; и где

b) по меньшей мере 9 аминокислотных остатков присутствуют между последним аминокислотным остатком натрийуретического пептида и

i) аминокислотным остатком HC res35a по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res M34) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res57 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res T58) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res106 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res G111) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res 32 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res D34) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res57 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res G59) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res98 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res F102) в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3.

Другими объектами настоящего изобретения являются антитело или его фрагмент для применения в способе лечения, композиция, содержащая антитело или его фрагмент, нуклеиновая кислота или смесь нуклеиновых кислот, кодирующая антитело или его фрагмент клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту или смесь нуклеиновых кислот, и способ получения антитела или его фрагмента.

Подробное описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение может стать более понятным посредством последующего подробного описания настоящего изобретения и примеров, приведенных в настоящем документе.

Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, содержащему по меньшей мере одну гетерологичную аминокислотную, последовательность, включенную вовнутрь по меньшей мере одного CDR участка указанного антитела или его фрагмента, где указанная по меньшей мере одна гетерологичная аминокислотная последовательность содержит N-терминальную линкерную последовательность (Ntls), натрийуретический пептид и C-терминальную линкерную последовательность (Ctls), где необязательно по меньшей мере часть указанного по меньшей мере одного CDR участка замещена указанной по меньшей мере одной гетерологичной аминокислотной последовательностью, включенной в него.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что биологически активные варианты натрийуретического пептида со значительно увеличенной стабильностью в сыворотке по сравнению с натрийуретическими пептидами дикого типа природного происхождения, могут быть получены посредством включения аминокислотной последовательности натрийуретического пептида в один из CDR участков молекулы иммуноглобулина или ее фрагмента. Это обнаружение было совершенно неожиданным. Как хорошо известно в данной области техники, короткая длина и высокая консервативность последовательности участков CDR иммуноглобулина, что особенно выражено в CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 и CDRH2, создает значительные конформационные ограничения для включения биологически активных пептидов в окружающие иммуноглобулин последовательности могут отрицательно влиять на экспрессию, складывание и/или биологическую активность включенного пептида. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что активность натрийуретических пептидов, включенных в участок CDR иммуноглобулина, значительно меняется в зависимости от точного пути конструирования антитела с привитым натрийуретическим пептидом. Решающим фактором успешного включения с получением функционального, т.е. биологически активного варианта натрийуретического пептида, как показано, является число аминокислотных остатков между включенным натрийуретическим пептидом и ближайшими соседними соединениями CDR-каркаса, N-терминальными и C-терминальными от включенного натрийуретического пептида. Ниже определенного числа N-термнальных и C-терминальных фланкирующих аминокислотных остатков между натрийуретическим пептидом и соседними соединениями CDR-каркаса образуются только слитые конструкции натрийуретического пептида и иммуноглобулина без биологической активности.

Термины «включенный», «вставленный», «интегрированный», «привитый» и «внедренный», а также «включение», «вставка», «интеграция», «прививание» и «внедрение» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. В контексте настоящего изобретения эти термины относятся к образованию гибридных полинуклеиновых кислот или гибридных полипептидов путем введения гетерологичной последовательности в исходную последовательность антитела или фрагмента антитела. Такое включение может быть осуществлено любыми способами. Обычно антитело или его фрагмент, содержащий натрийуретический пептид, фланкированный N-терминальной и C-терминальной линкерной последовательностью, получают с помощью методики и экспрессии рекомбинантной ДНК, как описано в данном документе.

Включение натрийуретического пептида, фланкированного N-терминальной и C-терминальной линкерной последовательностью, в CDR участок исходной последовательности антитела или его фрагмента, может привести к делеции по меньшей мере части указанного CDR участка. Например, клонирование последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную гетерологичную аминокислотную последовательность, содержащую N-терминальную линкерную последовательность, натрийуретический пептид и C-терминальную линкерную последовательность, может быть осуществлено таким образом, что часть CDR-кодирующей последовательности замещается включенной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Согласно другим частным вариантам осуществления, включение гетерологичной аминокислотной последовательности, содержащей натрийуретический пептид, не приводит к делеции аминокислотных остатков CDR участка, в который гетерологичная аминокислотная последовательность вставлена.

В контексте настоящего изобретения термин «гетерологичная последовательность последовательностей» относится к аминокислотной последовательности, которая не происходит из исходного «пустого» антитела или его фрагмента, в который она включена. Внедрение гетерологической аминокислотной последовательности в антитело или его фрагмент, таким образом, дает сконструированную рекомбинантную молекулу антитела, состоящую из аминокислотных последовательностей различного происхождения.

Термин «натрийуретический пептид» относится к пептидам, которые могут вызывать натрийурез, выведение натрия почками. Натрийуретические пептиды включает включают атриальный натрийуретический пептид (ANP), мозговой натрийуретический пептид (BNP), натрийуретический пептид C-типа (CNP), натрийуретический пептид мамб (DNP) и Уродилатин. Натрийуретические пептиды в контексте настоящего изобретения могут быть любого происхождения. Натрийуретические пептиды включают натуральные натрийуретические пептиды, такие как натрийуретический пептид дикого типа и их мутантные варианты, а также гомолог гомологичные натрийуретические пептиды другого вида. Однако этот термин также включает искусственно созданные натрийуретические пептиды, такие как модифицированные химерные варианты отдельных натрийуретических пептидов. Известно, что использование кодонов у разных видов различно. Таким образом, при экспрессии гетерологичного белка в клетке-мишени может быть необходимо или, по меньшей мере, полезно адаптировать последовательность нуклеиновой кислоты к использованию кодона клеткой-мишенью. Способы разработки и конструирования производных данного белка хорошо известны любому специалисту в данной области техники.

Согласно частным вариантам осуществления натрийуретический пептид выбран из натрийуретического пептида дикого типа любого вида и функционального варианта любого такого натрийуретического пептида дикого типа. В контексте настоящего изобретения термин “функциональный вариант натрийуретического пептида” или “вариант функционального натрийуретического пептида” относится к натрийуретическому пептиду любого происхождения, включая природные и сконструированные пептиды, которые различны по аминокислотной последовательности и/или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность данного натрийуретического пептида, как например натрийуретического пептида дикого типа данного вида, но все еще функционально активны. В контексте настоящего изобретения термин «функционально активный» относится к способности варианта натрийуретического пептида выполнять биологические функции природного натрийуретического пептида, в частности натрийуретического пептида дикого типа. В частности, «функционально активный» означает, что вариант натрийуретического пептида способен связываться со своим соответствующим рецептором. В случае лигандов NPR-A и NPR-B, «функционально активный», в частности, означает способность опосредовать увеличение (внутриклеточного) циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) посредством связывания с одним или обоими этими рецепторами.

Согласно частным вариантам осуществления функциональные варианты натрийуретического пептида способны осуществлять одну или несколько биологических функций данного натрийуретического пептида, такого как натрийуретический пептид дикого типа данного вида на по меньшей мере около 50%, в частности по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80% и самое большее, в частности, по меньшей мере около 90%, где одна или несколько биологических функций включают без ограничение, связывание натрийуретического пептида с его соответствующим рецептором и/или индукцию увеличения внутриклеточного cGMP.

Функциональная активность натрийуретических пептидов может быть измерена любыми методами, включая методы in vitro, которые позволяют либо измерить повышение (внутриклеточного) циклического гуанозинмонофосфата (cGMP), либо измерить изменения клеточных процессов, регулируемых cGMP, включая методы описанный в примерах 3 и 5. Согласно частным вариантам осуществления, вариант натрийуретического пептида (непривитый) считается функционально активным, если его значение EC50, определенное с помощью флуоресцентного анализа, описанного в примере 3, ниже 500 нМ, более конкретно ниже 250 нМ, более конкретно ниже 150 нМ, более конкретно ниже 100 нМ, более конкретно ниже 50 нМ, наиболее конкретно ниже 25 нМ.

Включение такого функционального варианта натрийуретического пептида в один из CDR участков молекулы иммуноглобулина или ее фрагмента, как описано в данном документе, дает иммуноглобулин, привитый натрийуретическим пептидом, с функциональной активностью натрийуретического пептида, и значительно повышенную стабильность в сыворотке по сравнению с непривитым функциональным вариантом натрийуретического пептида, как показано в примерах. Привитый натрийуретическим пептидом иммуноглобулин считается биологически активным (то есть функциональным), если он дает значительный положительный сигнал любым методом, который измеряет увеличение (внутриклеточного) циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) прямо или косвенно путем оценки изменений в клеточных процессах, регулируемых cGMP. В частности, функциональную активность иммуноглобулина с привитым натрийуретическим пептидом можно оценить методами, описанными в примерах 3 и 5. В случае иммуноглобулинов, привитых натрийуретическим пептидом, значимость обычно оценивается на основании i) сравнения с отрицательным образцом, таким как пустой каркас иммуноглобулина, например, конструкция №209, антитело, содержащее SEQ ID NO 65 и SEQ ID NO 66, TPP-5657, ii) сравнение с положительным образцом, например, конструкция №117, антитело, содержащее SEQ ID NO 67 и SEQ ID NO 66, TPP-5661, и iii) дозозависимость.

Несмотря на то, что функциональный вариант натрийуретического пептида согласно настоящему изобретению может содержать любое количество мутаций, включающих добавления, делеции и/или замены одной или нескольких аминокислот по сравнению с эталонным натрийуретическим пептидом, функциональный вариант натрийуретического пептида обычно будет сохранять ключевые характеристики. соответствующего натрийуретического пептида, таких как ключевые остатки в центральном кольцевом домене. Консервативные остатки натрийуретических пептидов описаны, например, в Lincoln R. Potter et al. (Handb Exp Pharmacol. 2009; (191): 341-366). Таким образом, согласно частным вариантам осуществления, функциональный вариант натрийуретического пептида на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичен последовательности согласно последовательности, показанной ниже:

X₁CFGX₂X₃X₄DRIX₅X₆X₇SX₈LGC

где X₁ и X₅ представляют собой G или S;

X₃ представляет собой R или K;

X₆ представляет собой A или S; и

X₂, X₄, X₇ и X₈ могут представлять собой любую аминокислоту.

На самом деле, натрийуретические пептиды любого типа могут быть включены в участок CDR иммуноглобулина или его фрагмента, как описано в настоящем документе. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие одного типа натрийуретического пептида достаточно для удовлетворения обоих минимальных требований достаточной биологической активности привитого натрийуретического пептида, и в частности подходящие N-концевые и C-концевые аминокислотные последовательности могут быть обеспечены другими типами натрийуретических пептидов. Не желая ограничиваться теорией, полагают, что эти схожие требования для успешного внедрения натрийуретического пептида в молекулу иммуноглобулина среди различных типов натрийуретического пептида могут быть обусловлены структурным сходством и/или механизмами действия в семействе натрийуретических пептидов.

Согласно частным вариантам осуществления натрийуретический пептид выбран из группы, состоящей из человеческого ANP, имеющего последовательность SEQ ID NO 23, человеческого BNP, имеющего последовательность согласно SEQ ID NO 24, человеческого CNP, имеющего последовательность согласно SEQ ID NO 25, и пептида, имеющего последовательность на по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% идентичную последовательности согласно любой из SEQ ID NO 23 - 25. Снова, натрийуретический пептид, имеющий последовательность, отличную от человеческих натрийуретических пептидов ANP, BNP и CNP дикого типа, может иметь любое естественное происхождение, например мутантная версия натрийуретического пептида человека дикого типа, или гомолог другого вида, или сконструированный натрийуретический пептид. Способы разработки и конструирования вариантов пептидов хорошо известны специалисту в данной области техники.

Согласно таким частным вариантам осуществления натрийуретический пептид, имеющий последовательность, на по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% идентичную последовательности согласно любой из SEQ ID NO 23 - 25, представляет собой функциональный вариант натрийуретического пептида.

«Процент (%) идентичности последовательности" относительно ссылочной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, соответственно, определяли как процент остатков нуклеиновой кислоты или аминокислотных остатков, соответственно, в последовательности-кандидате, которые идентичны по остаткам нуклеиновой кислоты или аминокислотным остаткам, соответственно в ссылочной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, соответственно, после выравнивания последовательностей и введение гэпов при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Консервативные замены не рассматриваются как часть идентичности последовательности. Согласно частным вариантам осуществления, любые гэпы, введенные в кандидатную последовательность и/или эталонную последовательность, не могут в общей сложности превышать более 50%, более 40%, более 30%, более 25%, более 20%, более 15% или более 10% от общего количества остатков эталонной последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления идентичность последовательности в процентах определяется без введения каких-либо гэпов в кандидатную или эталонную последовательность (т.е. с использованием выравнивания без пробелов). Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые находятся в пределах компетентности специалистов в данной области техники, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такое как BLAST, BLAST 2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых полноразмерных последовательностей.

Натрийуретический пептид, который имеет определенный процент идентичности с последовательностью данного эталонного натрийуретического пептида, например, человеческий ANP, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 23, может содержать одну или несколько мутаций, включающих добавление, делецию и/или замену одной или нескольких аминокислот по сравнению с эталонным натрийуретическим пептидом. Согласно настоящему изобретению указанные удаленные, добавленные и/или замещенные аминокислоты могут быть последовательными аминокислотами или могут быть разбросаны по длине аминокислотной последовательности натрийуретического пептида, которая имеет данный процент идентичности с последовательностью эталонного натрийуретического пептида, например, человеческий ANP, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 23. На уровне ДНК, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая натрийуретический пептид, которая имеет данный процент идентичности с последовательностью данного эталонного натрийуретического пептида может отличаться в большей степени из-за вырожденности генетического кода.

Согласно настоящему изобретению любое количество аминокислот может быть добавлено, удалено и/или заменено, до тех пор, пока сохраняется указанная идентичность с последовательностью эталонного натрийуретического пептида. Согласно частным вариантам осуществления предусмотренная идентичность аминокислотной последовательности соблюдается, и вариант натрийуретического пептида является биологически активным, т.е. является функциональным вариантом натрийуретического пептида. Предпочтительно, чтобы биологическая активность натрийуретического пептида, который имеет заданный процент идентичной последовательности с последовательностью данного эталонного натрийуретического пептида, например, человеческого ANP, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 23, снижается менее чем на 90%, менее чем на 80%, менее чем на 70%, менее чем на 60%, менее чем на 50%, менее чем на 25% или менее чем на 10% по сравнению с указанным эталонным натрийуретическим пептидом, как измерено согласно описанному выше анализу.

Термин "антитело", как применяется в описании настоящего изобретения, описывает иммуноглобулиновые молекулы, предпочтительно состоящие из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, которые, как правило, связываются дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (сокращаемые в настоящем изобретении как VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может содержать, например, три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи (сокращаемый в настоящем изобретении как VL) и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи содержит один домен (CL). Домены VL и VH могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), вкрапленные в области, которые являются более консервативными, называемые каркасными участками (FR). Каждый VH и VL, как правило, состоит из трех CDR и до четырех FR. расположенных от N-конца к С-концу, например, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Как применяется в описании настоящего изобретения, термин «участки, определяющие комплементарность» (CDR; например, CDR1, CDR2 и CDR3), относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена антитела, присутствие которого необходимо для связывания антигена. Каждый вариабельный домен, как правило, имеет три участка CDR, идентифицируемые как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждый участок, определяющий комплементарность, может содержать аминокислотные остатки из "участка, определяющего комплементарность", как определено по Кэботу (например, около остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, около остатков 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196:901-917 (1987)). В некоторых случаях участок, определяющий комплементарность, может включать аминокислоты как из участка CDR, определенного в соответствии с Кэботом, так и из гипервариабельной петли.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела могут быть отнесены к различным "классам". Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM - и некоторые из них могут дополнительно разделяться на "подклассы" (изотипы), например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. В контексте настоящего изобретения термин “антитело” включает молекулы иммуноглобулина любого первичного класса - включая IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY - и любого подкласса - включая IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 и Ig A2 - природного происхождения или полученные рекомбинантными средствами и включает все в общем известные антитела. Предпочтительным классом иммуноглобулинов для применения согласно настоящему изобретению является IgG. Термин “антитело” также относится к другим белковым каркасам, которые способны ориентировать вставки CDR антител в ту же самую активную конформацию связывания, что и в природных антителах, так что связывание антигена-мишени, наблюдаемое с этими химерными белками, сохраняется относительно связывающей активности природного антитела, из которого были получены CDR.

В контексте настоящего изобретения термин «фрагмент» антитела/иммуноглобулина относится к любой части антитела /иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере один участок CDR. В частности, фрагмент антитела согласно настоящему изобретению сохраняет способность увеличивать время полужизни в сыворотке биологически активного пептида, предпочтительно натрийуретического пептида, включенного в него. Фрагменты антитела согласно настоящему изобретению включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 и Fv; диатела; однодоменные антитела (Dabs); линейные антитела; одноцепочечные молекул антител (scFv) и дисульфид-стабилизированные фрагменты антитела Fv (dsFv); а также мультиспецифические фрагменты антитела и фрагменты, содержащие домен VL или VH, которые получают из интактных иммуноглобулинов или получают рекомбинантными средствами.

F(ab')₂ или Fab могут быть разработаны для минимизации или полного удаления межмолекулярных дисульфидных взаимодействий, которые происходят между доменами CH1 и CL. Фрагменты антител в соответствии с настоящим изобретением могут включать вариабельный (вариабельные) участок (участки) отдельно или в комбинации со всеми или частично из следующего: шарнирная область, домены CH1, CH2, CH3 и CL. Также включены фрагменты антител, содержащие любую комбинацию вариабельного (вариабельных) участка (участков) с шарнирной областью, доменом CH1, CH2, CH3 и CL.

Антитело или его фрагмент составляет каркас, который придает стабильность включенному в него натрийуретическому пептиду. Например, время полужизни в сыворотке натрийуретического пептида, включенного в участок CDR антитела, как описано в настоящем документе, может быть увеличено по сравнению с временем полужизни в сыворотке натрийуретического пептида природного происхождения.

В принципе, гетерологичная аминокислотная последовательность, содержащая натрийуретический пептид, может быть включена в любую молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент.В частности, иммуноглобулины любого вида (включая, но не ограничиваясь этим, человека, крупного рогатого скота, мыши, крысы, свиньи, собаки, акулы, ламы и верблюда) и любого первичного класса и подкласса могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Однако для терапевтического использования может быть предпочтительным человеческое или гуманизированное антитело. В контексте настоящего изобретения термин «человеческое антитело» относится к антителам, имеющим аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включает антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека, из В-клеток человека или от животных, трансгенных в отношении одного или нескольких иммуноглобулинов человека. а также синтетические человеческие антитела. Согласно частному варианту осуществления аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи вариабельного домена происходят из последовательностей человеческой зародышевой линии LV 1-40 и HV 3-23 соответственно (для получения дополнительной информации см. Пример 1).

В контексте настоящего изобретения термин «гуманизированное антитело» или «фрагмент гуманизированного антитела» относится к антителу или его фрагменту, которое (i) происходит из источника, отличного от человека (например, трансгенная мышь, несущая гетерологичную иммунную систему), антитело которой основано на последовательности зародышевой линии человека; или (ii) химерное, где вариабельный домен имеет нечеловеческое происхождение, а константный домен имеет человеческое происхождение, или (iii) с привитыми CDR, где CDR вариабельного домена имеют нечеловеческое происхождение, в то время как один или несколько каркасов вариабельного домена имеют человеческое происхождение, и константный домен (если таковой имеется) имеет человеческое происхождение.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может быть моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или более мультиспецифическим.

В контексте настоящего изобретения термин «содержит» или «содержащий» означает «включая, но не ограничиваясь этим». Термин является открытым, означая наличие любых заявленных функций, элементов, целых чисел, стадий или компонентов, но не исключая наличие или добавление одной или нескольких других функций, элементов, целых чисел, стадий, компонентов или их группы. Термин «содержащий», таким образом, включает более ограничительные термины «состоящий из» и «по существу состоящий из». Согласно одному варианту осуществления термин «содержащий», используемый по всей заявке и, в частности, в формуле изобретения, может быть заменен термином «состоящий из».

В контексте настоящего изобретения термин “около” или “приблизительно” означает в пределах от 80% до 120%, альтернативно в пределах от 90% до 110%, включая в пределах от 95% до 105% от данного значения.

В антителе или его фрагменте согласно настоящему изобретению, a) по меньшей мере 12 аминокислотных остатков присутствуют между

i) аминокислотным остатком HC res25 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res S25) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res51 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res I51) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res92 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res C96) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res26 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res S25) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res49 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res Y51) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res88 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res C90) и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3;

и b) по меньшей мере 9 аминокислотных остатков присутствуют между последним аминокислотным остатком натрийуретического пептида и

i) аминокислотным остатком HC res35a по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res M34) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res57 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res T58) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res106 по Кэботу (в тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 65, это соответствует res G111) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res 32 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res D34) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res57 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res G59) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res98 по Кэботу (в легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO 66, это соответствует res F102) в случае включения гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3.

Название перечисленных выше аминокислотных остатков относится к положению аминокислоты в исходной молекуле иммуноглобулина до включения гетерологичной аминокислотной последовательности. В контексте настоящего изобретения перечисленные выше аминокислотные остатки называются «эталонными аминокислотами» или «ссылочными аминокислотами». Эти эталонные аминокислотные остатки лежат на соединениях каркаса CDR или рядом с ними, но не обязательно соответствуют стандартным определениям границ CDR (стандартные определения границ CDR представляют собой аминокислотные остатки S25 и W36 для CDRH1; S49 и R67 для CDRH2; K98 и W108 для CDRH3; C22 и W37 для CDRL1; Y51 и G59 для CDRL2; C90 и F102 для CDRL3. Jarasch and Skerra, Proteins 2017 Jan; 85 (1): 65-71).

Ближайшая соседняя N-концевая эталонная аминокислота от вставленного натрийуретического пептида плюс аминокислотное удлинение, присутствующее между указанной эталонной аминокислотой и первым аминокислотным остатком, вставленного натрийуретического пептида, в настоящем документе обозначают как «N-концевой последовательностью». N-концевая последовательность содержит Ntls. Согласно частным вариантам осуществления N-концевая последовательность состоит из Ntls плюс соседней N-концевой эталонной аминокислоты.

Аминокислотное удлинение, присутствующее между аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида и ближайшей соседней эталонной C-концевой аминокислотой от вставленного натрийуретического пептида, плюс указанная эталонная аминокислота в настоящем документе обозначают как “C-концевая последовательность”. C-концевая последовательность содержит Ctls. Согласно частным вариантам осуществления C-концевая последовательность состоит из Ctls плюс соседней C- концевой эталонной аминокислоты.

Согласно частным вариантам осуществления, Ntls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4, или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4; последовательность согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21; или последовательность, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21. Ntls также может содержать любую комбинацию перечисленных выше аминокислотных последовательностей.

Согласно таким частным вариантам осуществления, Ntls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4, или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4; последовательность согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15 или 21; последовательность, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, или 21; или любую их комбинацию.

Согласно частным вариантам осуществления, Ctls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5, или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5; последовательность согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22; или последовательность, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22. Ctls также может содержать любую комбинацию перечисленных выше аминокислотных последовательностей.

Согласно частным вариантам осуществления, Ctls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5, или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5; последовательность согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 20 или 22; последовательность, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 20 или 22; или любую их комбинацию.

Согласно частным вариантам осуществления идентичность последовательности между последовательностью, содержащейся в Ntls и/или Ctls и любой из SEQ ID NO 1 - 22 составляет по меньшей мере 60%, в частности по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100%.

В контексте настоящего изобретения термин “GS линкерная последовательность” относится к пептидному линкеру, содержащему в основном глициновые и сериновые остатки. В частности, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% аминокислотных остатков GS линкерной последовательности согласно настоящему изобретению выбраны из глициновых и сериновых остатков. GS линкерная последовательность согласно настоящему изобретению может, например, содержать от 1 до 30 аминокислотных остатков в общем. В частности, GS линкерная последовательность согласно настоящему изобретению не содержит более 3, 2 или 1 аминокислотных остатков, отличных от глицина или серина.

В контексте настоящего изобретения термин “PN линкерная последовательность” относится к пептидному линкеру, содержащему в основном пролиновый и аспарагиновый остатки. В частности, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% аминокислотных остатков PN линкерной последовательности согласно настоящему изобретению выбраны из пролинового и аспарагинового остатка. PN линкерная последовательность согласно настоящему изобретению может, например, содержать от 1 до 30 аминокислотных остатков в общем. В частности, PN линкерная последовательность согласно настоящему не содержит более 3, 2 или 1 аминокислотных остатков, отличных от пролина или аспарагина. Другие аминокислотные остатки, которые могут присутствовать в PN линкерной последовательности согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, остатки лизина или глутаминовой кислоты.

Согласно частным вариантам осуществления линкерная последовательность, содержащаяся в Ntls и/или Ctls и выбранная из GS линкерной последовательности; PN линкерной последовательности; линкерной последовательности каркаса антитела IgG человека; последовательности каркаса fab домена IgG человека; последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности линкерной последовательности, последовательности каркаса fab домена IgG человека или последовательности согласно любой из SEQ ID NO: 1-5; и последовательности, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO: 6 - 22, содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков. Линкерная последовательность, содержащаяся в Ntls и/или Ctls, может, например, содержать до 30, 28, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислотных остатков.

В случае линкеров, содержащих последовательность каркаса антитела IgG человека или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, может быть особенно предпочтительно использована последовательность участка каркаса, которая примыкает к CDR, в которую включена гетерологичная аминокислотная последовательность. Например, Ntls и/или Ctls могут содержать линкер, содержащий аминокислотную последовательность, которая является частью каркасного участка FRH2 или FRH3 в случае, если гетерологическая аминокислотная последовательность включена в домен CDRH2. Подобным образом, Ntls и/или Ctls могут содержать линкер, содержащий аминокислотную последовательность, которая является частью каркасного участка FRL2 или FRL3 в случае, если гетерологическая аминокислотная последовательность включена в участок CDRL2.

Согласно частным вариантам осуществления, Ntls состоит из GS линкерной последовательности; PN линкерной последовательности; аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса антитела IgG человека или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4 или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4; последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21; последовательности, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21; или любой их комбинации.

Согласно частным вариантам осуществления Ctls состоит из GS линкерной последовательности; PN линкерной последовательности; аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5, последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5; последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22; последовательности, которая на по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22; или любой их комбинации.

Согласно частным вариантам осуществления, как Ntls, так и Ctls содержат по меньшей мере одну из вышеперечисленных линкерных последовательностей или любую их комбинацию. На самом деле, любая из вышеперечисленных линкерных последовательностей Ntls может быть комбинирована с любой из вышеперечисленных линкерных последовательностей Ctls. На самом деле, любая линкерная последовательность может быть комбинирована с GS линкером. В качестве неограничивающего примера GS Ctls линкер может быть комбинирован с Ntls линкером, содержащим последовательность согласно любой из SEQ ID NO 6, 9 или 15 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 9 или 15Другим неограничивающим примером является GS Ntls линкер, комбинированный с Ctls линкером, содержащим последовательность согласно SEQ ID NO 15 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей.

Вышеуказанные линкерные последовательности оказались особенно полезными для достижения хороших активностей натрийуретических пептидов при достаточной общей длине N-концевой и C-концевой фланкирующих последовательностей. Не желая быть связанными теорией, полагают, что указанные выше линкерные пептидные удлинения приводят к конформации/складке, которая способствует благоприятному состоянию системы при представлении биологически активного натрийуретического пептида соответствующему рецептору с минимальными стерическими затруднениями.

Согласно частным вариантам осуществления i) Ntls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; последовательность согласно SEQ ID NO 2, 4, 9, 11, 13 или 15; последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно SEQ ID NO 2, 4, 9, 11, 13 или 15; или любую их комбинацию, и ii) Ctls содержит GS линкерную последовательность; PN линкерную последовательность; последовательность согласно SEQ ID NO 3, 5, 12, 14, 15 или 20; последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно SEQ ID NO 3, 5, 12, 14, 15 или 20; или любую их комбинацию. Эти последовательности линкеров оказались особенно полезными, так как они не только для достижения высоких активностей натрийуретического пептида, хороших уровней экспрессии при рекомбинантной экспрессии и минимальной фрагментации белка или ее отсутствия, как показано в Таблице 9.

Эти линкерные последовательности оказались особенно полезными, поскольку они не только обеспечивают высокую активность натрийуретического пептида, но также обладают хорошими уровнями экспрессии при рекомбинантной экспрессии и не склонны к фрагментации белка при экспрессии (см. Таблицу 9).

Согласно частным вариантам осуществления, Ntls и Ctls каждая содержит GS линкерную последовательность; Ntls и Ctls каждая содержит PN линкерную последовательность; Ntls и Ctls каждая содержит аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно Ntls содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4, и Ctls содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 6 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 7 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 8 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 9 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 10 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 11 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 12 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 13 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 14 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 15 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 16 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 17 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 17 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 18 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 19 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 9 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 20 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; или Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 21 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 22 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей.

Согласно таким частным вариантам осуществления, Ntls и Ctls каждая содержит GS линкерную последовательность; Ntls и Ctls каждая содержит PN линкерную последовательность; Ntls и Ctls каждая содержит аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотную последовательность, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно Ntls содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4, и Ctls содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 6 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 7 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 8 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 9 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 10 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 11 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 12 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 13 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 14 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 15 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 9 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 20 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; или Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 21 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 22 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей.

Согласно таким частным вариантам осуществления, Ntls и Ctls каждая содержит GS линкерную последовательность; Ntls и Ctls каждая содержит PN линкерную последовательность; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 2 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 3 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 4 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 5 или последовательность, которая на по меньшей мере 80% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 11 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 12 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 13 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 14 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; Ntls и Ctls каждая содержит последовательность согласно SEQ ID NO 15 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей; или Ntls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 9 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей, и Ctls содержит последовательность согласно SEQ ID NO 20 или последовательность, которая на по меньшей мере 60% идентична ей. Эти комбинации линкеров оказались особенно полезными для достижения высоких активностей натрийуретического пептида, хороших уровней экспрессии при рекомбинантной экспрессии и минимальной фрагментации белка или ее отсутствия, как показано в Таблице 9.

Согласно частным вариантам осуществления, Ntls дополнительно содержит якорный элемент A1 на ее С-терминальном конце, и/или Ctls дополнительно содержит якорный элемент A2 на ее N-терминальном конце, где A1 и A2 преимущественно содержат глициновый и сериновый остатки. Согласно частным вариантам осуществления, A1 и/или A2 содержат по меньшей мере 1, 2, 3, 4, или 5 аминокислотных остатков. A1 и/или A2 могут содержать до 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислотных остатков в общем. Согласно частным вариантам осуществления, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или 100% аминокислотных остатков A1 и/или A2 выбраны из глициновых и сериновых остатков. В частности, A1 и/или A2 не содержит/содержат более 3, 2 или 1 аминокислотным остатков, отличных от глицина и серина

Согласно частным вариантам осуществления Ntls состоит из i) якорного элемента A1 на ее С-терминальном конце и ii) GS линкерной последовательности; PN линкерной последовательности; аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 2 или 4; последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21; последовательности, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 или 21; или любой их комбинацию.

Согласно частным вариантам осуществления, Ctls состоит из i) якорного элемента A2 на ее N-терминальном конце и ii) GS линкерной последовательности; PN линкерной последовательности; аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, в частности аминокислотной последовательности, которая является частью каркаса домена fab человеческого антитела IgG, или последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична ей, более конкретно последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5; последовательности, которая на по меньшей мере 80% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 1, 3 или 5; последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22; последовательности, которая на по меньшей мере 60% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 22; или любой их комбинацию.

Согласно частным вариантам осуществления, Ntls и/или Ctls содержат (содержит) по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков в общем. Ntls и/или Ctls могут, например, содержать до 30, 28, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислотных остатков в общем.

Согласно частным вариантам осуществления, аминокислотное удлинение, присутствующее между

i) аминокислотным остатком HC res25 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res51 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res92 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res26 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res49 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res88 по Кэботу и первым аминокислотным остатком натрийуретического пептида в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3

содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 26 - 38 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 26 - 38.

Согласно частным вариантам осуществления, аминокислотное удлинение, присутствующее между последним аминокислотным остатком натрийуретического пептида и

i) аминокислотным остатком HC res35a по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res106 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res 32 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res98 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3

содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 39 - 51 или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 39 - 51.

Согласно частным вариантам осуществления, гетерологичная аминокислотная последовательность состоит из Ntls, натрийуретического пептида и Ctls.

Согласно частным вариантам осуществления, аминокислотное удлинение, присутствующее между

i) аминокислотным остатком HC res25 по Кэботу и аминокислотным остатком HC res35a по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH1;

ii) аминокислотным остатком HC res51 по Кэботу и аминокислотным остатком HC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH2;

iii) аминокислотным остатком HC res92 по Кэботу и аминокислотным остатком HC res106 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRH3;

iv) аминокислотным остатком LC res26 по Кэботу и аминокислотным остатком LC res 32 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL1;

v) аминокислотным остатком LC res49 по Кэботу и аминокислотным остатком LC res57 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL2; и/или

vi) аминокислотным остатком LC res88 по Кэботу and аминокислотным остатком LC res98 по Кэботу в случае включения указанной гетерологичной аминокислотной последовательности в CDRL3

содержит последовательность согласно любой из SEQ ID NO 52 - 64, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или по меньшей мере 98% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 52 - 64.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент содержит по меньшей мере два натрийуретических пептида. Согласно частным вариантам осуществления, оба натрийуретических пептида содержатся в гетерологичной аминокислотной последовательности, дополнительно содержащей Ntls и Ctls, и включены в CDR участок указанного антитела или его фрагмента, как описано в настоящем документе. По меньшей мере два натрийуретических пептида могут быть включены в два соответствующих участка CDR двух легких цепей или двух тяжелых цепей, или по меньшей мере два натрийуретических пептида могут быть включены в два отдельных участка CDR. По меньшей мере два натрийуретических пептида могут быть одинаковы или различными. Согласно таким частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент содержит по меньшей мере два различных натрийуретических пептида, которые включены в по меньшей мере два CDR участка.

Из-за димерной структуры молекул антител включение одной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичную аминокислотную последовательность (Ntls-натрийуретический пептид-Ctls), в нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую или тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина, как правило, дает белок антитела, несущий два натрийуретических пептида, расположенных в соответствующих участках CDR двух идентичных легких или двух идентичных тяжелых цепей. Однако также предусматривается вставка двух нуклеиновых кислот, кодирующих натрийуретический пептид, в два разных CDR кодирующих участка последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующих легкую и/или тяжелую цепь, таким образом получая молекулу антитела с четырьмя натрийуретическими пептидами, расположенными в двух соответствующих парах CDR димерного антитела. Также охватываются димерные молекулы иммуноглобулинов, легкие цепи и/или тяжелые цепи которых не идентичны, например, включая димерные антитела, несущие один натрийуретический пептид, а также димерные антитела, несущие два разных натрийуретических пептида в двух соответствующих участках CDR двух легких или двух тяжелые цепей.

Согласно частным вариантам осуществления, натрийуретические пептиды вставлены в CDRH1 и CDRH2, CDRH1 и CDRH3, CDRH2 и CDRH3, CDRH1 и CDRL1, CDRH1 и CDRL2, CDRH1 и CDRL3, CDRH2 и CDRL1, или CDRH2 и CDRL2. Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент содержит одну ANP и одну BNP молекулу; одну ANP и одну CNP молекулу; или одну BNP и одну CNP молекулу.

Согласно частным вариантам осуществления, натрийуретический пептид, содержащийся в по меньшей мере одной гетерологичной аминокислотной последовательности, выключенной в по меньшей мере один участок CDR указанного антитела или его фрагмента, представляет собой ANP, и антитело или его фрагмент содержит по меньшей мере один дополнительный натрийуретический пептид. Согласно частным вариантам осуществления, по меньшей мере один дополнительный натрийуретический пептид также содержится в гетерологичной аминокислотной последовательности, дополнительно содержащей Ntls и Ctls и включенной в участок CDR указанного антитела или его фрагмента. Согласно частным вариантам осуществления, ANP и по меньшей мере один дополнительный натрийуретический пептид включены в два соответствующих участка CDR либо двух легких, либо двух тяжелых цепей антитела или его фрагмента. Согласно другим частным вариантам осуществления, ANP и по меньшей мере один дополнительный натрийуретический пептид включены в по меньшей два отдельных участка CDR. В частности, указанный по меньшей мере один дополнительный натрийуретический пептид выбран из ANP, BNP и CNP, более конкретно из BNP и CNP.

«Пустая» молекула антитела, не несущая гетерологичной аминокислотной последовательности, содержащей натрийуретический пептид, которая состоит из двух тяжелых цепей, имеющих последовательность согласно SEQ ID NO 65, и двух легких цепей, имеющих последовательность согласно SEQ ID NO 66, называется TPP-5657. Согласно частным вариантам осуществления молекула антитела, состоящая из двух тяжелых цепей, имеющих последовательность согласно SEQ ID NO 65, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичность последовательности с ними. и две легкие цепи, имеющие последовательность согласно SEQ ID NO 66, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности с ними, служит в качестве исходного или родительского антитела, в которое включают гетерологичную аминокислотную последовательность, включающую натрийуретический пептид. Согласно таким частным вариантам осуществления гетерологичная аминокислотная последовательность, содержащая натрийуретический пептид включена в CDR участок одной или обеих тяжелых цепей такой молекулы антитела.

Согласно таким частным вариантам осуществления, тяжелая цепь (цепи), содержащая (содержащие) по меньшей мере одну гетерологичную аминокислотную последовательность, включенную в по меньшей мере один из ее CDR участков, имеет последовательность согласно любой из SEQ ID NO 67 - 79, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 67 - 79. Согласно частным вариантам осуществления, антитело согласно настоящему изобретению состоит из двух идентичных тяжелых цепей, имеющих последовательность согласно любой из SEQ ID NO 67 - 79, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 67 - 79, и две идентичные легкие цепи, имеющие последовательность согласно SEQ ID NO 66, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична ей.

Согласно другим частным вариантам осуществления, гетерологичная аминокислотная последовательность, содержащая натрийуретический пептид, включена в CDR участок одной или обеих легких цепей такой молекулы антитела. Согласно таким частным вариантам осуществления, легкая цепь (цепи), содержащая (содержащие) по меньшей мере одну гетерологичную аминокислотную последовательность, включенную в по меньшей мере один из ее CDR участков, имеет (имеют) последовательность согласно любой из SEQ ID NO 80 или 81, последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 80 или 81. Согласно частным вариантам осуществления, антитело согласно настоящему изобретению состоит из двух идентичных легких цепей, имеющих последовательность согласно любой из SEQ ID NO 80 или 81, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентична последовательности согласно любой из SEQ ID NO 80 или 81, и две идентичные тяжелые цепи, имеющие последовательность согласно SEQ ID NO 65, или последовательность, которая на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичную им.

В таблице ниже показан состав тяжелой и легкой цепей примерных антител согласно настоящему изобретению.

Таблица 1: Примерные конструкции антитела с привитым натрийуретическим пептидом

TPP-число Тяжелая цепь Легкая цепь TPP-5661 SEQ ID NO 67 SEQ ID NO 66 TPP-10274 SEQ ID NO 68 SEQ ID NO 66 TPP-10282 SEQ ID NO 69 SEQ ID NO 66 TPP-10283 SEQ ID NO 70 SEQ ID NO 66 TPP-10290 SEQ ID NO 71 SEQ ID NO 66 TPP-10294 SEQ ID NO 72 SEQ ID NO 66 TPP-10765 SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 66 TPP-10845 SEQ ID NO 74 SEQ ID NO 66 TPP-10847 SEQ ID NO 75 SEQ ID NO 66 TPP-10992 SEQ ID NO 76 SEQ ID NO 66 TPP-13054 SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 66 TPP-13061 SEQ ID NO 78 SEQ ID NO 66 TPP-13230 SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 66 TPP-10355 SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 80 TPP-10361 SEQ ID NO 65 SEQ ID NO 81 TPP-9902 SEQ ID NO 442 SEQ ID NO 66 TPP-11156 SEQ ID NO 443 SEQ ID NO 66 TPP-18034 SEQ ID NO 444 SEQ ID NO 66 TPP-12897 SEQ ID NO 445 SEQ ID NO 447 TPP-12377 SEQ ID NO 445 SEQ ID NO 66 TPP-9465 SEQ ID NO 446 SEQ ID NO 66

Антитела согласно настоящему изобретению или их фрагменты включают природные очищенные продукты, продукты процедур химического синтеза и продукты, полученные с помощью рекомбинантных методов. В зависимости от происхождения антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может быть гликозилированным или негликозилированным.

Например, стандартные методики рекомбинантной ДНК можно использовать для приготовления и/или получения нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелую и легкую цепи, включения этих нуклеиновых кислот в экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяева для рекомбинантной экспрессии (см., например, Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989); Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990); and US 4,816,397 by Boss et al.).

Таким образом, согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте или смеси нуклеиновых кислот, кодирующей антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению. Эти последовательности нуклеиновых кислот могут быть оптимизированы в некоторых случаях для экспрессии в млекопитающих. Молекулы ДНК согласно настоящему изобретению не ограничиваются последовательностями, раскрытыми в данном документе, но также включают их варианты.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает конструкции рекомбинантных нуклеиновых кислот, содержащие одну или несколько последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Конструкция рекомбинантной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может, например, содержать вектор нуклеиновой кислоты, такой как плазмида, в который была вставлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению. Понятно, что на дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, влияют такие факторы, как выбор клетки-хозяина, желаемый уровень экспрессии белка и то, желательна ли конститутивная или индуцибельная экспрессия.

Полезные экспрессионные векторы для использования в бактериях конструируются путем вставки одной или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вместе с подходящими сигналами инициирования трансляции и терминации в функционирующую рамку считывания с функциональным промотором. Бактериальные экспрессионные векторы, как правило, содержат один или несколько фенотипически селектируемых маркеров и сайт инициации репликации, чтобы гарантировать поддержания вектора и, если требуется, обеспечить амплификацию в бактериальном хозяине. Бактериальные экспрессионные векторы могут содержать элементы, полученные из коммерчески доступных плазмид, как например, хорошо известный клонирующий вектор pBR322 (ATCC 37017). Ряд бактериальных экспрессионных векторов может быть успешно выбран в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемого антитела или его фрагмента. Например, если желательно большое количество такого антитела, могут быть желательны векторы, опосредующие высокий уровень экспрессии слитых белков антител, которые легко очищаются.

Конструкции рекомбинантных нуклеиновых кислот, предназначенные для экспрессии антител в эукариотической клетке-хозяине, могут содержать регуляторные последовательности, которые способны контролировать экспрессию открытой рамки считывания в эукариотической клетке, предпочтительно промотор и сигнал полиаденилирования. Промоторы и сигналы полиаденилирования предпочтительно выбираются так, чтобы они функционировали в пределах определенного типа клеток, предназначенных для экспрессии антител. Примеры подходящих промоторов включают, но не ограничиваются ими, промоторы цитомегаловируса (CMV), такие как сильный немедленно-ранний промотор CMV, вируса обезьян 40 (SV40), вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), как например промотор длинных концевых повторов ВИЧ (LTR), вируса Молони, вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)), полиомы и вируса саркомы Рауса (RSV), синтетический промотор CAG состоящий из элемента раннего энхансера CMV, промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы и акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика, а также промоторы из генов млекопитающих, таких как актин, миозин, гемоглобин, мышечный креатин и металлотионеин. Согласно конкретному варианту осуществления кассета эукариотической экспрессии содержит промотор CMV. В контексте настоящего изобретения термин «промотор CMV» относится к сильному немедленно-раннему промотору цитомегаловируса.

Примеры подходящих сигналов полиаденилирования включают, но не ограничиваются ими, сайт полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH), сигналы полиаденилирования SV40 и сигналы полиаденилирования LTR.

Кроме того, рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать одну или несколько энхансерных последовательностей. Энхансер может быть, например, энхансером актина, миозина, гемоглобина, мышечного креатина или вирусным энхансером млекопитающих, например, энхансер из CMV, RSV, SV40 или EBV. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, US 5,168,062 от Stinski, US 4,510,245 от Bell et al. и US 4,968,615 от Schaffner et al.

Регуляторные последовательности и кодоны, как правило, зависят от вида, поэтому для максимального увеличения продукции белка регуляторные последовательности и кодоны предпочтительно выбирают так, чтобы они были эффективными для видов /типов клеток, предназначенных для экспрессии антител. Специалист в данной области техники может получить молекулы рекомбинантной ДНК, которые являются функциональными у данного вида субъектов.

Рекомбинантные экспрессионные векторы млекопитающих могут также включать точки начала репликации и селектируемые маркеры (см., например, US 4,399,216, US 4,634,665 и US 5,179,017). Подходящие селективные маркеры включают гены, которые придают устойчивость к лекарственным средствам, как например G418, пуромицин, гигромицин, бластицидин, цеоцин/блеомицин или метотрексат, или селективный маркер, которые используют ауксотрофии, как например глютаминсинтетаза, на клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Например, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) придает устойчивость к метотрексату, ген neo обеспечивает устойчивость к G418, ген bsd из Aspergillus terreus придает устойчивость к бластидину, пуромицин-N-ацетилтрансферазу придает устойчивость к пуромицину, продукт гена Sh ble придает устойчивость к цеоцину, а устойчивость к гигромицину обеспечивается геном устойчивости к гигромицину E.coli (hyg или hph). Селектируемые маркеры, такие как DHFR или глютаминсинтетаза, также полезны для методов амплификации в сочетании с MTX и MSX.

Согласно некоторым вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи, вставлены в отдельные векторы. Согласно другим вариантам осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелые и легкие цепи, вставлены в один и тот же вектор. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные домены тяжелых и/или легких цепей, могут быть превращены, например, в полинуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные цепи антитела, Fab фрагменты или scFv. Фрагмент ДНК, кодирующий VL- или VH может быть функционально связан, (таким образом, что аминокислотные последовательности, закодированные двумя фрагментами ДНК, оказались в одной рамке считывания) к другому фрагменту ДНК, кодирующему, например, константный домен антитела или гибкий линкер. В качестве примера, чтобы создать полинуклеотидную последовательность, которая кодирует scFv, нуклеиновые кислоты, кодирующие VH и VL, могут быть функционально связаны с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, таким образом, чтобы последовательности VH и VL могли бы быть экспрессированы как белок с непрерывной единственной цепью с областями VL и VH, соединенными гибким линкером (см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al, Nature (1990) 348:552-554). Последовательности человеческих константных доменов тяжелой цепи и легкой цепи известны специалистам в данной области техники (см., например, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены стандартной амплификацией с помощью ПЦР.

Согласно частным вариантам осуществления, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую цепь, в которую гетерологичная аминокислотная последовательность, содержащая натрийуретический пептид, включена содержат последовательность согласно любой из SEQ ID NO 82 или 83 или последовательность, на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичную последовательности согласно любой из SEQ ID NO 82 или 83. Согласно таким частным вариантам осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, содержит последовательность согласно SEQ ID NO 84 или последовательность на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичную ей.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или смесь нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты», «трансформированные клетки», «трансфектанты», «трансфицированные клетки» и «трансдуцированные клетки», которые включают первично трансформированную/трансфицированную/трансдуцированную клетку и потомство, полученное из нее, независимо от количества пассажей. Потомство не может быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты в родительской клетке, и содержащаяся экзогенная нуклеиновая кислота может содержать мутации. В настоящую заявку включено мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, что и скринированные или отобранные в первоначально трансформированной клетке.

Трансфекцию экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно проводить с использованием стандартных методов, таких как электропорация, нуклеофекция, кальций-фосфатная преципитация, липофекция, трансфекция на основе поликатиона, такая как трансфекция на основе поликатиона, такая как трансфекция на основе полиэтиленимина (PEI) и трансфекция DEAE-декстраном.

Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки. Примерами прокариотических клеток-хозяев являются бактерии и включают, без ограничения, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium и различные виды в пределах родов Pseudomonas, Streptomyces и Staphylococcus.

Неограничивающие примеры эукариотических клеток-хозяев включают дрожжи, насекомые и клетки насекомых, растения и растительные клетки, трансгенных животных и клетки млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии антител включают яичник китайского хомячка (CHO клетки), такие как CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [включая dhfr- CHO клетки, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 и Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12, с применением DHFR селектируемого маркера, например, как описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621; и другие нокаутные клетки, примеры которых приведены в Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15], NS0 миеломные клетки, COS клетки, HEK293 клетки, HKB11 клетки, BHK21 клетки, CAP клетки, EB66 клетки, и SP2 клетки.

Экспрессия также может быть временной или полустабильной в экспрессионных системах экспрессии, таких как клетки HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 или CAP-T (например, Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9).

Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения антитела или его фрагмента, включающему культивирование клетки-хозяина согласно настоящему изобретению. В частности, клетку-хозяин согласно настоящему изобретению культивируют в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его фрагмента.

Экспрессия антител может быть конститутивной или регулируемой (например, индуцибельной). Для индуцибельной экспрессии антител клетку-хозяин согласно настоящему изобретению обычно выращивают до подходящей плотности клеток с последующей дерепрессией/индукцией выбранного промотора подходящими способами (например, температурным сдвигом или химической индукцией, такой как добавление или удаление низкомолекулярных индукторов, таких как тетрациклин в сочетании с системой Tet), и культивированием клетки-хозяина в течение дополнительного периода.

Согласно частным вариантам осуществления способ получения антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению дополнительно включает стадию выделения антитела или его фрагмента из культуры клеток-хозяев. Клетки можно, например, собирать центрифугированием, разрушать физическими или химическими средствами, а антитело или его фрагмент можно дополнительно очищать из полученного неочищенного экстракта. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессионный вектор сконструирован таким образом, что экспрессируемое антитело или его фрагмент секретируется в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. В этом случае антитело или его фрагмент можно непосредственно выделить из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белка.

Согласно частным вариантам осуществления способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает стадию очистки выделенного антитела или его фрагмента. В частности, антитело очищают (1) до более чем 90%, как определено, например, с помощью аналитической хроматографии или SDS-капиллярного гель-электрофореза(например, на приборе Caliper LabChip GXII, GX 90 или Biorad Bioanalyzer) и, более конкретно, очистка дает гомогенность антител по меньшей мере около 92,5%, 95%, 98% или 99%; альтернативно, антитело очищают (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или, желательно, серебряного красителя.

Антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур известными методами включающими, но не ограниченные этим: осаждением сульфатом аммония или этанолом, экстракцией кислотой, хроматография с использованием белка А, хроматография с использованием белка G, эксклюзионная хроматография по размеру, анионная или катионная ионообменная хроматография, хроматография на фосфоцеллюлозе, гидрофобная хроматография, аффинная хроматография, хроматография на гидроксиапатите и хроматография с использованием белка лектина. Высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ") может также использоваться для очистки (см., например, Colligan, Current Protocols in Immunology или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), например, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10).

согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению. В частности, композиция согласно настоящему изобретению представляет собой фармацевтическую композицию, подходящую для применения в способе лечения, где антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению содержится в количестве, эффективном для достижения намеченной цели, то есть предотвращения или лечения определенного болезненного состояния.

Композиция необязательно дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В контексте настоящего изобретения термин «вспомогательное вещество» относится к природному или синтетическому веществу, составленному вместе с активным ингредиентом в лекарственное средство. Подходящие вспомогательные вещества включают антиадгезивные вещества, связующие, покрытия, дезинтегрирующие вещества, ароматизаторы, красители, смазывающие вещества, глиданты, сорбенты, консерванты и подсластители. Конкретные примеры фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ включают, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу и воду. В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным компонентам и другим ингредиентам фармацевтических композиций, которые являются физиологически переносимыми и обычно не вызывают нежелательных реакций при введении млекопитающему (например, человеку). Термин «фармацевтически приемлемый» также может означать одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для использования у млекопитающих и, более конкретно, у людей.

Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать один или несколько дополнительных терапевтически активных агентов.

Фармацевтическая композиция может быть в форме раствора, суспензии, капсулы с энтеросолюбильным покрытием, лиофилизированного порошка или любой другой формы, подходящей для предполагаемого использования.

Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть составлены с использованием фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, известных специалистам в данной области техники, в дозировках, подходящих для перорального введения. Такие вспомогательные вещества позволяют фармацевтическим композициям быть сформулированными в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и т.п., для проглатывания пациентом.

Фармацевтические препараты для перорального использования могут быть получены путем комбинирования активных соединений с твердым вспомогательным веществом, при необходимости размалывая (гранулируя) получающуюся смесь, и перерабатывая смесь гранул после добавления подходящих вспомогательных средств при необходимости, чтобы получить таблетки или ядро драже. Подходящими вспомогательными веществами являются углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозы, такие как метил целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, или натрий карбоксиметилцеллюлоза; и камеди, включая гуммиарабик и трагакантовую камедь; и белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости могут быть добавлены вещества для улучшения распадаемости таблеток или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Ядра драже снабжаются подходящими покрытия, такими как концентрированные растворы сахаров, которые могут также содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, глазировочные растворы, и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты могут быть добавлены к таблеткам или покрытиям драже для идентификации продукта или характеризации количества активного соединения, то есть дозировку.

Фармацевтические препараты, которые могут использоваться перорально, включают твердые капсулы, приготовленные из желатина, так же как мягкие, герметические капсулы, приготовленные из желатина и покрытия такого как глицерин или сорбит.Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителем или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и при необходимости, стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или диспергированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль с или без стабилизаторов.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы терапевтически активных агентов. Для инъекции фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнка, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензий, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Дополнительно, суспензии активного агента могут быть получены в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды или липосомы. При необходимости, суспензии могут также содержать подходящие стабилизирующие агенты или агенты, которые повышают растворимость терапевтически активного агента, что позволяет получить препарат высококонцентрированных растворов.

Для местного или назального введения используются в композиции пенетранты, соответствующие конкретному барьеру, через который должен быть пройден. Такие пенетранты известны специалистам в данной области техники.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут производиться способом, который известен специалистам в данной области техники, например, посредством обычного смешивания, растворения, гранулирования, создания драже, отмачивания, эмульгирования, заключения в капсулу, включения или процессов лиофилизации.

Фармацевтическая композиция может обеспечиваться в виде соли и может быть сформирована с кислотами, включая, но не ограничиваясь этим: хлористоводородную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и т.д. Соли имеют тенденцию быть более растворимыми в водных или других протонных растворителях, которые являются соответствующими формами свободного основания. В других случаях предпочтительными препаратами могут быть лиофилизованные порошки в 1 мМ - 50 мМ гистидина, 0,1%-2% сахарозы, 2%-7% маннита в интервале рН от 4,5 до 7,5, которые объединяются с буфером пред использованием.

Дополнительные сведения о методах составления и введения можно найти в последнем выпуске Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

После приготовления фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, она может быть помещена в соответствующий контейнер и помечена для лечения указанного состояния. Для введения антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению такая маркировка будет включать количество, частоту и способ введения.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим упаковкам и наборам, содержащим один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами вышеупомянутых композиций согласно настоящему изобретению. С таким контейнером (контейнерами) может быть связано уведомление в форме, предписанной государственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических или биологических продуктов, отражающее одобрение агентством производства, использования или продажи продукта для введения человеку.

Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту согласно настоящему изобретению или композиции согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения.

В частности, такой способ лечения включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению. Субъект может быть человеком или животным, не являющимся человеком (например, кроликом, крысой, мышью, собакой, обезьяной или другим приматом более низкого порядка).

В контексте настоящего изобретения термин «терапевтически эффективное количество» определяется как количество антитела или его фрагмента в соответствии с настоящим изобретением, которое достаточно для предотвращения или облегчения симптомов любого из расстройств и заболеваний, упомянутых в настоящем документе - либо в виде разовой дозы, либо в соответствии с режимом множественного приема, отдельно или в комбинации с другими агентами. Согласно частным вариантам осуществления, указанное «терапевтически эффективное количество» токсикологически переносимо. Определение эффективной дозы находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Терапевтически эффективное количество терапевтического агента обычно в значительной степени зависит от конкретных характеристик пациента, таких как возраст, вес, пол и болезненное состояние, время, частота и способ введения, комбинация (комбинации) лекарственных средств и природа заболевания, которое лечат.Обычные дозировки антител варьируются от 0,1 до 100000 микрограммов, вплоть до общей дозы около 10 г, в зависимости от пути введения.

Общее руководство для его определения может быть найдено, например, в публикациях Международной конференции по вопросам гармонизации (International Conference on Harmonization) и в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp.484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Более тщательное определение терапевтически эффективного количества будет зависеть от таких факторов как токсичность и эффективность лекарства, которая может быть определена с использованием способов, известных специалистам в данной области техники и, которые можно найти в вышеупомянутых ссылках.

Вкратце, терапевтическая эффективность и токсичность терапевтических агентов могут быть определены в анализах клеточных культур или на животных моделях, например, как ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% населения) и LD50 (доза, летальная для 50% популяции), соответственно. Соотношение доз ED50 и LD50 является терапевтическим индексом.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению подходит для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых, почечных, легочных, скелетных, глазных, тромбоэмболических и фиброзных заболеваний и нарушений, карликовости, ахондроплазии, а также других нарушений, связанных с cGMP и/или натрийуретическим пептидом. Таким образом, согласно частному варианту осуществления, антитело или его фрагмент предназначен для использования для лечения и/или профилактики любого из этих расстройств и заболеваний или любой их комбинации.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению поэтому могут применяться в качестве лекарственных средств для лечения и/или профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, например, артериальной и легочной гипертензии, резистентной и рефрактерной гипертензии, острой и хронической сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца, синдрома облитерирующего бронхиолита (BOS), опухолевых и онкологических заболеваний, реакции трансплантат против хозяина, серповидно-клеточной анемии, стабильной и нестабильной стенокардии, периферических и сердечных сосудистых заболеваний, аритмии, нарушений ритма предсердий и желудочков, а также нарушений проводимости таких как, например, атриовентрикулярная блокада степени I-III (AB блок I-III), суправентрикулярной тахиаритмии, мерцательной аритмии, трепетания предсердий, фибрилляции желудочков, трепетания желудочков, вентрикулярной тахиаритмии, пируэтной тахикардии, экстрасистолы предсердий и желудочков, преждевременной деполяризации, исходящей из АВ соединения, синдрома слабости синусового узла, обморока, атриовентрикулярной узловой реципрокной тахикардии, синдрома Вольфа-Паркинсона-Уайта, острого коронарного синдрома (ACS), аутоиммунного заболевания сердца (перикардит, эндокардит, вальвулит, аортит, кардиомиопатии), шока, такого как шок кардиологического типа, септический шок и анафилактический шок, аневризмы, кардиомиопатии боксеров (преждевременное желудочковое сокращение (PVC)), кроме того, для лечения и/или профилактики тромбоэмболических заболеваний и ишемий, таких как миокардиальная ишемия, инфаркт миокарда, инсульт, гипертрофия сердца, транзисторные и ишемические атаки, преэклампсия, воспалительные сердечно-сосудистые заболевания, спазмы коронарных артерий и периферических артерий, образования отеков, таких как, например, отек легких, отек мозга, почечный отек или отек из-за сердечной недостаточности, нарушения периферического кровообращения, реперфузионные повреждения, артериальные и венозные тромбозы, микроальбуминурия, слабость сердечной мышцы, эндотелиальная дисфункция, микро- и макрососудистые повреждения (васкулит), а также для предотвращения рестенозов, например, после тромболитической терапии, чрескожно-транслюминальной ангиопластики (PTA), чрескожно-транслюминальной коронарной ангиопластики (PTCA), трансплантаций сердца и операций по шунтированию, а также микро- и макрососудистых повреждений (васкулит), повышенных уровней фибриногена и липопротеинов низкой плотности (LDL) и повышенных концентраций ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), а также для лечения и/или профилактики эректильной дисфункции и женской сексуальной дисфункции.

В контексте настоящего изобретения термин «сердечная недостаточность» включает в себя как острые, так и хронические формы проявления сердечной недостаточности, также как и специфические или родственные нозологические формы этого, такие как острая декомпенсированная сердечная недостаточность, недостаточность правых отделов сердца, недостаточность левых отделов сердца, глобальная сердечная недостаточность, ишемическая кардиомиопатия, дилатационная кардиомиопатия, гипертрофическая кардиомиопатия, идиопатическая кардиомиопатия, врожденный порок сердца, порок клапанов сердца, сердечная недостаточность при пороках клапанов сердца, стеноз митрального клапана, недостаточность митрального клапана, стеноз аортального клапана, недостаточность клапана аорты, трикуспидальный стеноз, недостаточность трехстворчатого клапана, стеноз клапана легочной артерии, недостаточность клапана легочной артерии, комбинированные пороки клапанов сердца, воспаление сердечной мышцы (миокардит), хронический миокардит, острый миокардит, вирусный миокардит, сердечная недостаточность, вызванная диабетом, токсическая алкогольная кардиомиопатия, кардиальные болезни накопления, а также диастолическая и систолическая сердечная недостаточность, сердечная недостаточность со сниженной фракцией выброса (HFrEF), сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) и острые фазы обострения существующей хронической сердечной недостаточности (обострение сердечной недостаточности).

Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также можно использовать для лечения и/или профилактики артериосклероза, заболевания периферических артерий (PAD), нарушения липидного обмена, гиполипопротеинемии, дислипидемии, гипертриглицеридемии, гиперлипидемии, гиперхолестеринемии, абеталипопротеинемии, ситостеролемии, ксантоматоза, болезни Танжера, ожирения, тучности и комбинированной гиперлипидемии и метаболического синдрома.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению дополнительно могут применяться для лечения и/или профилактики первичного и вторичного феномена Рейно, нарушений микроциркуляции, перемежающейся хромоты, периферических и автономных нейропатий, диабетических микроангиопатий, диабетической ретинопатии, диабетических язв на конечностях, гангрены, CREST-синдрома, эритематоза, оникомикоза, а также ревматических заболеваний, и для заживления ран.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также подходят для лечения и/или профилактики заболеваний мочеполовой системы, таких как, например, синдрома аденомы предстательной железы (BPS), гиперплазии предстательной железы (BPH), доброкачественной гиперплазии предстательной железы (BPE), нарушения опорожнения мочевого пузыря (BOO), симптомы со стороны нижних мочевыводящих путей (LUTS, включая кошачий урологический синдром (FUS)), нарушения мочеполовой системы, включая нейрогенный гиперактивный мочевой пузырь (OAB) и (IC), недержание мочи (UI), например, смешанное недержание мочи при напряжении, неотложное недержание мочи, стрессовое недержание мочи или недержание мочи от переполнения (MUI, UUI, SUI, OUI), боль в тазовой области, доброкачественные и злокачественные заболевания органов мужской и женской мочеполовой системы.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также подходит для лечения и/или профилактики заболеваний почек, в частности, острой и хронической почечной недостаточности, а также острого и хронического нарушения почек. В контексте настоящего изобретения термин «почечная недостаточность» охватывает как острые, так и хронические проявления почечной недостаточности, а также лежащие в основе или связанные с ними почечные нарушения, такие как почечная гипоперфузия, интрадиализная гипотензия, обструктивная уропатия, гломерулопатии, гломерулонефрит, острый гломерулонефрит, гломерулосклероз, тубулоинтерстициальные заболевания, нефропатические нарушения, такие как первичное и врожденное заболевание почек, нефрит, иммунологические заболевания почек, такие как отторжение трансплантата почки и иммунокомплексные заболевания почек, нефропатия, вызванная токсичными веществами, нефропатия, вызванная контрастными веществами, диабетическая и недиабетическая нефропатия, пиелонефрит, кисты почек, нефросклероз, гипертонический нефросклероз и нефротический синдром, которые можно охарактеризовать диагностически, например, аномально сниженным креатинином и/или экскрецией воды, аномально повышенными концентрациями в крови мочевины, азота, калия и/или креатинина, измененной активностью почечных ферментов, например глутамилсинтетазы, измененной осмолярностью или объемом мочи, повышенной микроальбуминурией, макроальбуминурией, поражением клубочков и артериол, расширением канальцев, гиперфосфатемией и/или необходимостью диализа. Настоящее изобретение также охватывает применение антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению для лечения и/или профилактики последствий почечной недостаточности, например, отека легких, сердечной недостаточности, уремии, анемии, электролитных нарушений (например, гиперкалиемии, гипонатриемии) и нарушений в костном и углеводном обмене.

Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также подходят для лечения и/или профилактики астматических расстройств, легочной артериальной гипертензии (PAH) и других форм легочной гипертензии (PH), включая болезнь левых отделов сердца, ВИЧ, серповидно-клеточную анемию, тромбоэмболии (CTEPH), саркоидоз, COPD или легочную гипертензию, связанную с фиброзом легких, хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), острое повреждение легких (ALI), дефицит альфа-1-антитрипсина (AATD), фиброз легких, эмфизему легких (например, эмфизема легких, вызванную сигаретным дымом). Синдром облитерирующего бронхиолита (BOS) и муковисцидоз (CF).

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также подходит для борьбы с расстройствами центральной нервной системы, характеризующимися нарушениями системы NO/cGMP. Оно подходит, в частности, для улучшения восприятия, концентрации, обучения или памяти после когнитивных нарушений, подобных тем, которые возникают, в частности, в связи с ситуациями/заболеваниями/синдромами, такими как легкие когнитивные нарушения, возрастные нарушения обучения и памяти, связанные с возрастом потери памяти, сосудистая деменция, черепно-мозговая травма, инсульт, деменция, возникающая после инсульта (постинсультная деменция), посттравматическая черепно-мозговая травма, общие нарушения концентрации, нарушения концентрации внимания у детей с проблемами обучения и памяти, болезнь Альцгеймера, деменция с тельцами Леви, деменция с дегенерацией лобные доли, включая синдром Пика, болезнь Паркинсона, прогрессирующий надъядерный паралич, деменцию с кортикобазальной дегенерацией, амиолатеральный склероз (ALS), болезнь Хантингтона, демиелинизацию, рассеянный склероз, таламическую дегенерацию, деменцию Крейцфельда-Якоба, деменцию при ВИЧ, шизофрению с деменцией психоз или корсаковский синдром. Оно также подходит для лечения и/или профилактики заболеваний центральной нервной системы, таких как состояния тревоги, напряжения и депрессии, сексуальных дисфункций и нарушений сна, связанных с ЦНС, а также для контроля патологических нарушений приема пищи, стимуляторов и веществ, вызывающих привыкание.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, кроме того, также подходит для контроля церебрального кровотока и, таким образом, представляет собой эффективные агенты для контроля мигрени. Оно также подходит для профилактики и контроля последствий церебрального инфаркта (Apoplexia cerebri), таких как инсульт, церебральная ишемия и черепно-мозговая травма. Его также можно использовать для контроля состояния боли и тиннитуса.

Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению обладает противовоспалительным действием и, следовательно, может использоваться в качестве противовоспалительных средств для лечения и/или профилактики сепсиса (SIRS), полиорганной недостаточности (MODS, MOF), воспалительных заболеваний почек, хронические кишечные воспаления (IBD, болезнь Крона, UC), панкреатита, перитонита, ревматоидных заболеваний, воспалительных заболеваний кожи и воспалительных заболеваний глаз.

Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может также применяться для лечения и/или профилактики аутоиммунных заболеваний.

Антитело или его фрагмент также подходит для лечения и/или профилактики фиброзных заболеваний внутренних органов, например, легких, сердца, почек, репродуктивной системы, костного мозга и, в частности, печени, а также дерматологических фиброзов и фиброзных поражений глаз. В контексте настоящего изобретения термин фиброзные заболевания включает, в частности, следующие термины: фиброз печени, цирроз печени, фиброз легких, эндомиокардиальный фиброз, нефропатия, гломерулонефрит, интерстициальный фиброз почек, фиброзное повреждение в результате диабета, миома матки, эндометриоз, фиброз костного мозга и подобные фиброзные расстройства, склеродермия, морфея, келоиды, гипертрофические рубцы (также после хирургических процедур), невусы, диабетическая ретинопатия, пролиферативная витроретинопатия и нарушения соединительной ткани (например, саркоидоз).

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению также подходит для борьбы с послеоперационными рубцами, например, в результате операций по поводу глаукомы.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно также использовать в косметических целях для стареющей и ороговевшей кожи.

Более того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению подходит для лечения и/или профилактики гепатита, новообразований, остеопороза, глаукомы и гастропареза.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, кроме того, подходит для лечения и/или профилактики глазных заболеваний, таких как офтальмологические заболевания, реагирующие на натрийуретический пептид, заболевания сетчатки, глаукома, включая первичную открытоугольную глаукому (POAG), закрытоугольную глаукому и врожденную/развивающуюся глаукому, ретинопатии, травмы глаза, невропатии зрительного нерва, глазную гипертензию, повышенное внутриглазное давление, диабетическую ретинопатию, дегенерацию желтого пятна (AMD), возрастные заболевания глаз, отек желтого пятна, склерит, увеит, сухость глаз, ссадина эпителия роговицы, язва роговицы.

Более того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению подходит для лечения заболеваний костей и хрящей, таких как заболевания костей и хрящей, чувствительные к натрийуретическим пептидам, артрит, дегенеративные заболевания хрящевой ткани, остеоартрит, дегенерация хряща, переломы костей, дисплазия скелета, ахондроплазия, остеопороз, несовершенный остеогенез, костная болезнь Педжета (PDB), метаболическое заболевание костей, возрастные заболевания костей, остеомиелит, остеонекроз, рахит, остеомаляция, травмы и заболевания пластин роста, дефекты, связанные с заменой суставов и костей, синдром Марфана, спортивные травмы, мышечные дистрофии, мышечная дистрофия Дюшенна.

Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению антитела или его фрагмент согласно настоящему изобретению для лечения и/или профилактики нарушений, в частности указанных выше нарушений.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению предназначено для применения в способе лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, стенокардии, гипертонии, легочной гипертензии, ишемии, сосудистых заболеваний, почечной недостаточности, тромбоэмболических расстройств, фиброзных расстройств, заболеваний скелета и костей, глазных заболеваний и артериосклероза.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики нарушений, особенно вышеупомянутых нарушений.

Согласно частным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, стенокардии, гипертензии, легочной гипертензии, ишемии, сосудистых расстройств, почечной недостаточности, тромбоэмболических расстройств, фиброзных нарушений, заболеваний с деменцией, артериосклероза, скелетных и костных заболеваний, глазных расстройств, карликовости, ахондроплазии и эректильной дисфункции.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики нарушений, в частности нарушений, упомянутых выше, с использованием эффективного количества по меньшей мере одного антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению.

Согласно частным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, стенокардии, гипертензии, легочной гипертензии, ишемии, сосудистых нарушений, почечной недостаточности, тромбоэмболических нарушений, фиброзных нарушений, опухолевых и онкологических заболеваний, заболеваний скелета и костей, глазных нарушений, карликовости, ахондроплазии и артериосклероза с использованием эффективного количества по меньшей мере одного антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению.

Антитело согласно настоящему изобретению или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно вводить как единственный фармацевтический агент или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, и в некоторых случаях само антитело может быть модифицировано. Например, антитело или его фрагмент могут быть конъюгированы с химическим соединением, например, для дальнейшего увеличения эффективности, стабильности и/или времени полужизни. В частности, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может быть ПЭГилирован и/или HESилирован.

Таким образом, согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению используют в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом в способе лечения, в частности для указанных выше целей.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические комбинации, содержащие по меньшей мере одно антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.

В контексте настоящего изобретения термин «фармацевтическая комбинация» используется, как известно специалистам в данной области техники, причем такая комбинация может быть фиксированной комбинацией, нефиксированной комбинацией или набором частей.

В контексте настоящего изобретения термин «фиксированная комбинация» используется, как известно специалистам в данной области, и определяется как комбинация, в которой, например, первый активный ингредиент, такой как одно или несколько антител или их фрагментов в соответствии с настоящим изобретением, и дополнительный активный ингредиент присутствует вместе в одной стандартной дозе или в одном единственном объекте, например, в составе одной дозы. Одним из примеров «фиксированной комбинации» является фармацевтическая композиция, в которой первый активный ингредиент и дополнительный активный ингредиент присутствуют в смеси для одновременного введения, например, в составе. Другим примером «фиксированной комбинации» является фармацевтическая комбинация, в которой первый активный ингредиент и дополнительный активный ингредиент присутствуют в одной единице, но не в смеси. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает такие фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одно антитело или его фрагмент и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, в частности, для использования при лечении и/или профилактики вышеупомянутых нарушений.

В контексте настоящего изобретения термины «нефиксированная комбинация» и «набор частей» используются, как известно специалистам в данной области, и определяются как комбинация, в которой первый активный ингредиент и дополнительный активный ингредиент присутствуют в более чем одной единице, например, в отдельных лекарственных формах. Одним из примеров нефиксированной комбинации или набора частей является комбинация, в которой первый активный ингредиент и дополнительный активный ингредиент присутствуют отдельно.

Компоненты нефиксированной комбинации или набора частей можно вводить отдельно, последовательно, одновременно, в одно и то же время или в хронологическом порядке.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно вводить одновременно с указанным дополнительным терапевтически активным агентом, до или после него. В контексте настоящего изобретения термин «одновременно с» означает введение антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению и, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтически активного агента в тот же день, более конкретно в течение 12 часов, более конкретно в течение 2 часов.

Согласно частным вариантам осуществления введение антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению и одного другого терапевтически активного агента происходит в течение восьми недель подряд, более конкретно в течение от одной до шести недель подряд. Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один другой терапевтически активный агент может вводиться одним и тем же путем или разными путями.

Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно, например, комбинировать с известными агентами той же группы лечения по показаниям, такими как агенты, используемые для лечения и/или профилактики заболеваний и/или состояний, связанных с гипертонией, сердечной недостаточностью, легочной гипертензией, COPD, астмой, муковисцидозом, ахондроплазией, гиперфосфатемией, хронической болезнью почек (CKD), кальцинозом мягких тканей, кальцинозом, связанным с хроническим заболеванием почек, кальцинозом, связанным с нехроническим заболеванием почек, медиальным кальцинозом, включая медиальный склероз Менкеберга, атеросклерозом, кальцинозом интимы, гипертрофией сердца, связанной с CKD, почечной дистрофией, связанной с CKD, остеопорозом, постменопаузальным остеопорозом, сахарным диабетом II, хроническим заболеванием почек, старением, гипофосфатурией, гиперпаратиреозом, нарушениями, связанными с витамином D, дефицитом витамина К, коагулянтами-антагонистами витамина К, болезнью Кавасаки, ACDC (артериальной кальцинозом в результате дефицита CD73), GACI (обобщенным артериальным кальцинозом младенцев), IBGC (идиопатическим кальцинозом подкорковых узлов), PXE (эластической псевдоксантомой), ревматоидным артритом, синдромом Синглтона-Мертена, P-талассемией, кальцификацией, гетеротрофной оссификацией, преждевременной кальцификацией плаценты, кальцинозом матки, фибромиомой матки с кальцинозом, болезнью Фара, микрокальцинатом и кальцинозом аортального клапана.

Предпочтительные примеры подходящих дополнительных терапевтических агентов для объединения с антителом или его фрагментом согласно настоящему изобретению:

органические нитраты и NO-донаторы, как, например, нитропруссид натрия, нитроглицерин, изосорбид мононитрат, изосорбод динитрат, мол-сидомин или SIN-1, а также ингалятивный NO;

соединения, которые ингибируют распад циклического гуанозинмонофос-фата (cGMP), например, ингибиторы фосфодиэстеразы (POE) 1, 2 и/или 5, в частности POE 5-ингибиторы, такие как силденафил, варденафил, тадала-фил, уденафил, дазантафил, аванафил, мироденафил, лоденафил или PF-00489791;

средства с антитромботическим действием, в качестве примера и предпочтительно, из группы ингибиторов агрегации тромбоцитов, антикоагулянтов или профибринолитических веществ;

активные вещества, снижающие кровяное давление, например, и предпочтительно, из группы антагонистов кальция, антагонистов ангиотензина AII, ингибиторов ACE, ингибиторов ACE, NEP-ингибиторов, ингибиторов вазопептидазы, антагонистов эндотелина, ингибиторов ренина, блокаторов альфа-рецепторов, блокаторов бета-рецепторов, антагонистов минералокортикоидных рецепторов, ингибиторов rho-киназы и диуретиков;

антиаритмические средства, в качестве примера и предпочтительно из группы блокаторов натриевых каналов, блокаторов бета-рецепторов, блокаторов калиевых каналов, антагонистов кальция, блокаторов If-каналов, дигиталиса, парасимпатолитиков (ваголитиков), симпатомиметиков и других антиаритмических средств, таких как аденозин, агонисты рецептора аденозина, а также вернакалант;

положительные инотропные средства, например, сердечный гликозид (дигоксин), бета-адренергические и допаминргические агонисты, такие как изопреналин, адреналин, норадреналин, допамин или добутамин;

антагонисты рецепторы вазопрессина, в качестве примера и предпочтительно из группы кониваптана, толваптана, ликсиваптана, мозаваптана, сатаваптана, SR-121463, RWJ 676070 или BAY 86-8050, а также соединений, описанных в WO 2010/105770, WO2011/104322 и WO 2016/071212;

активные вещества, изменяющие жировой обмен, в качестве примера и предпочтительно из группы агонистов тиреоидного рецептора, ингибиторов PCSK9, ингибиторов синтеза холестерина, таких как, например и предпочтительно, ингибиторы HMG-CoA-редуктазы или синтеза сквалена, ингибиторы ACAT, ингибиторы СЕТР, ингибиторы MTP, PPAR-альфа-, PPAR-гамма- и/или PPAR-дельта-агонисты, ингибиторы абсорбции холестерина, ингибиторы липазы, адсорберы полимерной желчной кислоты, ингибиторы реабсорбции желчных кислот и антагонисты липопротеина (а).

противовоспалительные средства, например и предпочтительно, из группы глюкокортикоидов, такие как, например и предпочтительно, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, триамцинолон, дексаметазон, бекломета-зон, бетаметазон, флунизолид, будесонид или флутиказон, а также нестеро-идные противовоспалительные агенты (NSAID), например и предпочтительно, ацетилсалициловая кислота (аспирин), ибупрофен и напроксен, производные 5-амино салициловой кислоты, антагонисты лейкотриена, ингибиторы TNF-альфа и антагонисты хемокинового рецептора, такие как ингибиторы CCR1, 2 и/или 5;

агенты, которые ингибируют каскад сигнальных трансдукций, например, и предпочтительно, из группы ингибиторов киназы, например и предпочтительно, из группы ингибиторов тирозинкиназы и/или серин/треонинкиназы;

средства, которые ингибируют деградацию и модификацию внеклеточного матрикса, например и предпочтительно, из группы ингибиторов матриксных металлопротеаз (MMP), например и предпочтительно, ингибиторы химазы, стромелизина, коллагеназ, желатиназ и аггреканаз (предпочтительно из группы MMP-1, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 и с-13), а также металлоэластазы (MMP-12) и нейтрофилэластаза (HNE), например, сивелестат или DX-890;

агенты, которые блокируют связывание серотонина с его рецептором, например, и предпочтительно антагонисты 5-HT2b-рецептора;

антифиброзные агенты, например и предпочтительно нинтеданиб, пирфенидон, антагонисты рецептора аденозина A2b, антагонисты сфингозин-1-фосфатного рецептора 3 (S1P3), ингибиторы аутотаксина, антагонисты рецептора 1 лизофосфатидной кислоты (LPA-1) и рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (LPA-2), ингибиторы лизилоксидазы (LOX), ингибиторы лизилоксидаза подобного белка-2, ингибиторы CTGF, антагонисты IL-13, антагонисты интегрина, антагонисты TGF-бета, ингибиторы передачи сигналов wnt, антагонисты CCR2;

агенты, которые действуют как бронходилататоры, например, предпочтительно антагонисты рецептора 5-HT2b; β2 («бета-два»)- адренергические агонисты (короткого и длительного действия), антихолинергические средства и теофиллин;

агенты, которые являются антагонистами цитокинов и хемокинов, например и предпочтительно антагонистами TGF-бета, CTGF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, IL-25, IL-33, TSLP и интегрины;

органические нитраты и NO-донаторы, как, например, нитропруссид натрия, нитроглицерин, изосорбид мононитрат, изосорбод динитрат, мол-сидомин или SIN-1, а также ингаляционный NO;

NO-независимые, однако гем-зависимые стимуляторы растворимой гуанилатциклазы, как например и предпочтительно соединения, раскрытые в WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301, WO 03/095451, WO 2011/147809, WO 2012/004258, WO 2012/028647 и WO 2012/059549;

NO-независимые, однако гем-зависимые активаторы растворимой гуанилатциклазы, как например и предпочтительно соединения, раскрытые в WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 и WO 02/070510;

агенты, стимулирующие синтез cGMP, например, модуляторы sGC, например и предпочтительно, риоцигуат, цинацигуат, верицигуат;

аналоги простациклина или агонисты IP-рецепторов, например и предпочтительно илопрост, берапрост, трепростинил, эпопростенол или селексипаг;

антагонисты рецепторов эндотелина, например и предпочтительно бозентан, дарузентан, амбрисентан или ситаксентан;

средства, которые ингибируют растворимую эпоксидгидролазу (sEH), например и предпочтительно, N,N'-дициклогексилмочевина, 12-(3-адамантан-1-ил-уреидо)-додекановая кислота или 1-адамантан-1-ил-3-{5-[2-(2-этоксиэтокси)этокси]пентил}-мочевина;

средства, которые влияют на метаболизмом глюкозы, например и предпочтительно, инсулин, бигуанид, тиазолидиндион, сульфонилмочевина, акарбоза, ингибиторы DPP4, аналоги GLP-1 или ингибиторы SGLT-1;

натрийуретические пептиды, например и предпочтительно, предсердный натрийуретический пептид (ANP), натрийуретический пептид типа B (BNP, Несиритид), натрийуретический пептид типа C (CNP) или уродилатин;

производные натрийуретических пептидов, например и предпочтительно, восоритид, цендеретид, PL 3994

активаторы сердечного миозина, например и предпочтительно, омекамтив мекарбил (CK-1827452);

кальций-сенсибилизаторы, например и предпочтительно, левосимендан;

средства, которые влияют на энергетический метаболизм сердца, например и предпочтительно, этомоксир, дихлорацетат, ранолазин или триметазидин, полные или частичные агонисты аденозиновых рецепторов A1, такие как GS-9667 (ранее известный как CVT-3619), кападенозон, неладенозон и не-ладенозон биаланат;

агенты, влияющие на частоту сердечных сокращений, например и предпочтительно, ивабрадин.

Под средствами с антитромботическим действием предпочтительно понимают соединения из группы ингибиторов агрегации тромбоцитов, антикоагулянтов или профибринолитических веществ.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором агрегации тромбоцитов, например и предпочтительно, аспирином, клопидогрелем, прасугрелем, тикагрелором, тиклопидином или дипиридамолом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором тромбина, таким как например и предпочтительно, ксимелагатран, дабигатран, мелагатран, бивалирудин или клексан.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с GPIIb/IIIa-антагонистами, такими как например и предпочтительно, тирофибан или абсиксимаб.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором фактора Ха, таким как например и предпочтительно, ривароксабан (BAY 59-7939), DU-176b, апиксабан, бетриксабан, отамиксабан, фидексабан, разаксабан, летаксабан, эрибаксабан, фондапаринукс, идапаринукс, PMD-3112, дарексабан (YM-150), KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 или SSR-128428.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с гепарином или производным гепарина с низкой молекулярной массой весом (LMW).

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом витамина К, таким как например и предпочтительно кумарин.

Под средствами, понижающими кровяное давление, предпочтительно понимают соединения из группы антагонистов кальция, антагонистов ангиотензина AII, ингибиторов фермента АСЕ, антагонистов эндотелина, ингибиторов ренина, блокаторов альфа-рецепторов, блокаторов бета-рецепторов, антагонистов мине-ралкортикоидных рецепторов, ингибиторов rho-киназы и диуретиков.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом кальция, таким как например и предпочтительно нифедипин, амлодипин, верапамил или дилтиазем.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с блокатором альфа-1-рецепторов, таким как например и предпочтительно празосин.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с блокатором бета-рецепторов, таким как например и предпочтительно пропранолол, атенолол, тимолол, пиндолол, альпренолол, окспренолол, пенбутолол, бупранолол, метипранолол, надолол, мепиндолол, каразалол, соталол, метопролол, бетаксолол, целипролол, бисопролол, картеолол, эсмолол, лабеталол, карведилол, адапролол, ландиолол, небиволол, эпанолол или бусиндолол.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом ангиотензина AII, таким как например и предпочтительно лосартан, кандесартан, валсартан, телмисартан или эмбусартан, или двойным антагонистом ангиотензина AII/ингибитором неприлизина, в качестве примера и предпочтительно с LCZ696 (валсартан/сакубитрил).

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором АСЕ, таким как например и предпочтительно эналаприл, каптоприл, лизиноприл, рамиприл, делаприл, фозиноприл, квиноприл, периндоприл или трандоприл.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом эндотелина, таким как например и предпочтительно бозентан, дарузентан, амбризентан или ситаксзентан.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором ренина, таким как например и предпочтительно алискирен, SPP-600 или SPP-800.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом минералкортикоидных рецепторов, таким как например и предпочтительно спиронолактон или эплеренон.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с петлевым диуретиком, например, фуросемидом, торасемидом, буметанидом и пиретанидом, с калийсберегающими диуретиками, например, амилоридом и триамтереном, с антагонистами альдостерона, например, спироно-лактоном, канреноатом калия и эплереноном, а также тиазидными диуретиками, например, гидрохлортиазидом, хлорталионом, ксипамидом и идапамидом.

Под средствами, изменяющими жировой обмен, понимают предпочтительно со-единения из группы ингибиторов СЕТР, агонистов тироидных рецепторов, ин-гибиторов синтеза холестерина, таких как ингибиторы HMG-CoA-редуктазы или синтеза сквалена, ингибиторов АСАТ, ингибиторов МТР, агонистов PPAR-альфа, PPAR-гамма и/или PPAR-дельта рецепторов, ингибиторов абсорбции хо-лестерина, полимерных адсорбентов желчной кислоты, ингибиторов реабсорбции желчной кислоты, ингибиторов липазы, а также антагонистов липопротеина (а).

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором СЕТР, таким как например и предпочтительно торсетрапиб (СР-529 414), JJT-705 или СЕТР-вакцина (Avant).

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с агонистом тироидных рецепторов, таким как например и предпочтительно D-тироксин, 3,5,3'-трийодотиронин (Т3), CGS 23425 или акситиром (CGS 26214).

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором HMG-CoA-редуктазы из класса статинов, таким как например и предпочтительно ловастатин, симвастатин, правастатин, флувастатин, аторвастатин, розувастатин или питавастатин.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором синтеза сквалена, таким как например и предпочтительно BMS-188494 или ТАК-475.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором АСАТ, таким как например и предпочтительно авазимиб, мелинамид, пактимиб, эфлусимиб или SMP-797.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором МТР, таким как например и предпочтительно имплитапид, BMS-201038, R-103757 или JTT-130.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с агонистом PPAR-гамма рецепторов, таким как например и предпочтительно пиоглитазон или росиглитазон.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с агонистом PPAR-дельта рецепторов, таким как например и предпочтительно GW-501516 или BAY 68-5042.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором абсорбции холестерина, таким как например и предпочтительно эзетимиб, тиквесид или памаквесид.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором липазы, таким как например и предпочтительно орлистат.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с полимерным адсорбентом желчной кислоты, в качестве примера и предпочтительно с холестирамином, колестиполом, колесолвамом, CholestaGel или колестимидом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором реабсорбции желчных кислот, в качестве примера и предпочтительно с ингибиторами ASBT (=IBAT), например, AZD-7806, S-8921, АК 105, BARI-1741, SC-435 или SC-635.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом липопротеина (а), в качестве примера и предпочтительно с гемкабеном кальцием (CI-1027) или никотиновой кислотой.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом липопротеина (а), в качестве примера и предпочтительно с гемкабеном кальцием (CI-1027) или никотиновой кислотой.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с модуляторами sGC, в качестве примера и предпочтительно с риоцигуатом, цинацигуатом или верицигуатом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации со средством, влияющим на метаболизм глюкозы, в качестве примера и предпочтительно с инсулином, сульфонилмочевиной, акарбозой, DPP4 ингибиторами, GLP-1 аналогами или SGLT-1 ингибиторами.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом TGFбета, в качестве примера и предпочтительно с пирфенидоном и фрезолимумабом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом CCR2, в качестве примера и предпочтительно с CCX-140.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистом TNFальфа, в качестве примера и предпочтительно с адалимумабом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором галектина-3, в качестве примера и предпочтительно с GCS-100.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором Nrf-2, в качестве примера и предпочтительно с бардоксолоном.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с агонистом BMP-7, в качестве примера и предпочтительно с THR-184.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором NOX1/4, в качестве примера и предпочтительно с GKT-137831.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с лекарственным средством, которое влияет на метаболизм витамина D, в качестве примера и предпочтительно с кальцитриолом, альфакальцидолом, доксеркальциферолом, максакальцитолом, парикальцитолом, холекальциферолом или паракальцитолом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с цитостатическим средством, в качестве примера и предпочтительно с циклофосфамидом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с иммуноподавляющим средством, в качестве примера и предпочтительно с циклоспорином.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с фосфатным связующим, в качестве примера и предпочтительно с колестиланом, севеламер гидрохлоридом и севеламер карбонатом, лантаном и карбонатом лантана.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с натрий-фосфатным со-транспортером почечного проксимального канальца, в качестве примера и предпочтительно с ниацином или никотинамидом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с кальцимиметиком для лечения гиперпаратиреоза.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации со средствами для лечения дефицита железа, в качестве примера и предпочтительно с продуктами железа.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации со средствами для лечения гиперурикемии, в качестве примера и предпочтительно с аллопуринолом или расбуриказом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с гликопротеиновым гормоном для лечения анемии, в качестве примера и предпочтительно с эритропоэтиом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с биологическими средствами для иммунной терапии, в качестве примера и предпочтительно с абатацептом, ритуксимабом, экулизумабом или белимумаом.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с антагонистами вазопрессина (группа ваптанов) для лечения сердечной недостаточности, в качестве примера и предпочтительно с толваптаном, кониваптаном, ликсиваптаном, мозаваптаном, сатаваптаном или релковаптаном.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибиторами Jak, в качестве примера и предпочтительно с рук-солитинибом, тофацитинибом, барицитинибом, CYT387, GSK2586184, лестаур-тинибом, пакритинибом (SB1518) или TG101348.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с аналогами простациклина для терапии микротромбов.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с щелочным лекарственным средством, в качестве примера и предпочтительно с бикарбонатом натрия.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором mTOR, в качестве примера и предпочтительно с эверолимусом или рапамицином.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором NHE3, в качестве примера и предпочтительно с AZD1722 или тенапанором.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с модулятором eNOS, в качестве примера и предпочтительно с сапроптерином.

Согласно частным вариантам осуществления, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором CTGF, в качестве примера и предпочтительно с FG-3019.

Антитело или его фрагмент для применения в способе лечения согласно настоящему изобретению может быть составлен любым обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно вводить любыми подходящими средствами, которые могут варьироваться в зависимости от типа заболевания, подлежащего лечению. Возможные пути введения включают энтеральное (например, пероральное), парентеральное (например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, внутрисердечное, внутрижелудочковое, интратекальное, интрамедуллярное, внутриочаговое), внутрилегочное и интраназальное введение. Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно вводить путем импульсной инфузии, например, с уменьшающимися дозами антитела или его фрагмента. Предпочтительно дозирование производят посредством инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, частично в зависимости от того, является ли состояние острым или хроническим. Вводимое количество будет зависеть от множества факторов, таких как клинические симптомы, пол, возраст и/или вес индивидуума, вводятся ли другие лекарства и других. Квалифицированному специалисту понятно, что путь введения будет варьироваться в зависимости от заболевания или состояния, которое необходимо лечить.

Способы парентеральной доставки включают местное, внутриартериальное, внутриопухолевое, внутримышечное, подкожное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение.

Согласно частным вариантам осуществления способ лечения включает однократное или многократное введение антитела или его фрагмента или фармацевтической композиции, содержащей его. Разовые дозы введений могут быть одинаковыми или разными. В частности, способ лечения включает 1, 2, 3, 4, 5 или 6 введений антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению, где предпочтительно множество введений происходит в течение от одного до шести последовательных месяцев. Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно, например, вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю, один раз каждые две недели или один раз каждые три недели, в зависимости от его времени полужизни и скорости выведения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Средние концентрации в плазме TPP-10992 и TPP-5661 после внутривенного введения 5 мг/кг крысе.

Фиг. 2. Средние концентрации в плазме TPP-12897 после внутрибрюшинного введения 5 мг/кг мышам.

Фиг. 3. Устойчивость ANP (A-C), TPP-10992 (D-F) и TPP-5661 (G-I) к протеолитическому расщеплению. Активность ANP, TPP-10992 и TPP-5661 тестировали на стабильной клеточной линии рецептора ANP крысы непосредственно (A, D, G) или после 4 ч инкубации при 37°C с 0,6 мкг/мл NEP (B, E, H) или 0,6 мкг/мл IDE (C, F, I).

Фиг. 4. Устойчивость BNP (A-C) и TPP-11155 (D-F) к протеолитическому расщеплению. Активность BNP и TPP-11155 тестировали на стабильной клеточной линии рецептора BNP крысы непосредственно (A, D), или после 4 ч инкубации при 37°C с 0,6 мкг/мл NEP (B, E) или 0.6 мкг/мл IDE (C, F).

Фиг. 5. Устойчивость CNP (A-C) и TPP-12897 (D-F) к протеолитическому расщеплению. Активность CNP и TPP-11155 тестировали на стабильной клеточной линии рецептора CNP крысы непосредственно (A, D), или после 4 ч инкубации при 37°C с 0,6 мкг/мл NEP (B, E) или 0.6 мкг/мл IDE (C, F).

Фиг. 6. Пептид ANP и TPP-10992 индуцировали кривые зависимости реакции вазодилатации от дозы в аортальных кольцах с PE-сокращением. Кривые "концентрация-ответ" (0,0001-10 мкМ; n=3 крысы) на пептид ANP (светлые кружки) и TPP-10992 (темные кружки) в аортальных кольцах эндотелий-интактных крыс, сокращенных фенилэфрином (1 мкМ). Экспериментальные значения были рассчитаны относительно максимальных изменений сокращения, производимого фенилэфрином в каждой ткани, которое было принято за 100%. Эффективность пептида ANP и TPP-10992 составляла -7,4 и -6,7, соответственно (значения logEC₅₀). Данные представляют собой среднее значение±S.E.M. для 2 экспериментов.

Фиг. 7. Пептид ANP и TPP-5661 индуцировали кривые зависимости реакции вазодилатации от дозы в аортальных кольцах с PE-сокращением. Кривые "концентрация-ответ" (0,0001-10 мкМ; n=3 крысы) на пептид ANP (светлые кружки) и TPP-5661 (темные кружки) в аортальных кольцах эндотелий-интактных крыс, сокращенных фенилэфрином (1 мкМ). Экспериментальные значения были рассчитаны относительно максимальных изменений сокращения, производимого фенилэфрином в каждой ткани, которое было принято за 100%. Эффективность пептида ANP и TPP-5661 составляла -7,4 и -6,5, соответственно (значения logEC₅₀). Данные представляют собой среднее значение±S.E.M. для 2 экспериментов.

Фиг. 8. Гемодинамический эффект ANP у крыс в сознании. Крысиный ANP вводили внутрибрюшинно в момент 0 часов. Доза 500 мкг ANP привела к снижению среднего артериального давления (MAP) примерно на 25% с продолжительностью эффекта около 6-8 часов.

Фиг. 9. Гемодинамический эффект TPP-5661 у крыс в сознании. TPP-5661 вводили внутрибрюшинно в момент 0 часов. Доза 15 мг/кг привела к снижению среднего артериального давления (MAP) примерно на 20% с продолжительностью эффекта более 6 дней.

Фиг. 10. Гемодинамический эффект PP-10992 у крыс в сознании. TPP-10992 вводили внутрибрюшинно в момент 0 часов. Доза 30 мг/кг привела к снижению среднего артериального давления (MAP) примерно на 20% с максимальным эффектом на момент времени 48 часов и продолжительностью эффекта более 6 дней

Фиг. 11. Активность конструкций антител с привитыми BNP на клетках hNPRA. Активность очищенных образцов соединений на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали путем сравнения с эталонными образцами TPP-5661 и TPP-5657. Образцы тестировали в серии разведений в четыре раза.

Фиг. 12. Различные изотипы человеческого IgG обеспечивают одинаково подходящие каркасы антител. Примерное определение активности соединений 9, 33, 65, 91, 127 и 191 IgG1 (TPP-10294, TPP-10277, TPP-10279, TPP-10282, TPP-10269 и TPP-10355, соответственно), изотипов IgG2 и IgG4. Активность очищенных образцов соединения на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали путем сравнения с контрольными образцами соединения 117 человеческого IgG1 TPP-5661 и соединения 209 человеческого IgG1 TPP-5657. Образцы тестировали в серии разведений в четыре раза

Фиг. 13. Одинаково подходящие каркасы антител IgG происходят из разных видов. Примерное определение активности соединения 117 человеческого IgG1 (TPP-5661) и соединения 9 человеческого IgG1 (TPP-10294) и их нечеловеческих аналогов IgG1. Активность очищенных образцов соединения на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали путем сравнения с контрольным образцом соединения 209 человеческого IgG1 (TPP-5657). Образцы тестировали в серии разведений в четыре раза.

Фиг. 14. Одинаково подходящие каркасы антител человека IgG происходят из различных последовательностей зародышевой линии. Активность очищенных образцов соединения на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали путем сравнения с эталонным образцом TPP-10992. Образцы тестировали в серии разведений в четыре раза.

Фиг. 15. Защитные эффекты TPP-12899 против LPS, IL-1β и проницаемости эндотелиального барьера, индуцированной тромбином, как оценено с помощью измерения импеданса в реальном времени.

Фиг. 16. Терапевтические эффекты TPP-13992 на выживаемость (A), прирост массы тела (B), соотношение белок/креатинин в моче (C) и массу левого предсердия (D); (n=8-12 (здоровый контроль, n=5), среднее±SEM, однофакторный дисперсионный анализ по сравнению с TPP-10155 (изотип-специфическое контрольное антитело).

Фиг. 17. Гемодинамическая оценка после введения плацебо, 0,1, 0,3 и 1,0 мг/кг TPP-10992. TPP-10992 показывает дозозависимое и длительное (>5 дней) снижение артериального давления. **p<0,01, ****p<0,0001 по сравнению с группой плацебо с использованием однофакторного теста ANOVA для повторных измерений с критерием множественного сравнения Тьюки.

Примеры

Пример 1. Конструкция кандидата TPP-5661

Кандидат TPP-5661 конструировали посредством слияния гетерологичной аминокислотной последовательности, содержащей Ntls, крысиный ANP дикого типа и Ctls, с C-концом HV 3-23 (SEQ ID NO 85) посредством замещения двух C-концевых остатков HV 3-23 на два N-концевых остатка гетерологичной аминокислотной последовательности, и с N-концом IGHJ1 (SEQ ID NO 86) посредством замещения девяти N-концевых остатков IGHJ1 на 9 C-концевых остатка гетерологичной аминокислотной последовательности. Соответствующая последовательность тяжелой цепи полной длины SEQ ID NO 67 дополнительно содержит аминокислотную последовательность Constant-H (SEQ ID NO 87).

Спаривание последовательности тяжелой цепи полной длины SEQ ID NO 67, несущей вставленный ANP крысы (rANP), с последовательностью легкой цепи полной длины SEQ ID NO 66, выполненное путем объединения последовательностей LV 1-40 (SEQ ID NO 88), IGLJ2 (SEQ ID NO 89) и Constant-L (SEQ ID NO 90) дает полный IgG кандидат TPP-5661 (см. Таблицу 1).

Ниже показана последовательность тяжелой цепи полной длины (SEQ ID NO 67); включенная гетерологичная аминокислотная последовательность (Ntls-rANP-Ctls) подчеркнута; последовательности, полученные из HV 3-23 и IGHJ1, выделены жирным шрифтом:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTSVHQETKKYQSSPDGGSGGSLRRSSCFGGRIDRIGAQSGLGCNSFRYGSYSYTYNYEWHVDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Сконструированная и синтезированная конструкция антитела была клонирована в соответствии с хорошо известными в данной области техники методами и подтверждена секвенированием ДНК с использованием плазмида-специфических олигонуклеотидов.

Пример 2. Вставка NP в участки CDR антитела приводит к увеличенному времени полужизни в сыворотке

Определение фармакокинетических параметров in vivo

Фармакокинетические параметры TPP-10992 (SEQ ID NO 76 и SEQ ID NO 66) и TPP-5661 (SEQ ID NO 67 и SEQ ID NO 66) определяли после внутривенного введения 5 мг/кг самцам крыс Wistar (n=3). TPP-10992 и TPP-5661 вводили в виде болюса через хвостовую вену. Образцы крови собирали из яремной вены через ранее имплантированные катетеры с временными интервалами до 14 дней (336 часов). Образованную EDTA-плазму хранили при -20°С до дальнейшего анализа

Количественное определение TPP-10992 и TPP-5661 в образцах плазмы проводили с использованием формата анти-IgG человека анализа ELISA(иммуноферментный анализ). Фармакокинетические параметры рассчитывали на основе временных профилей концентрации в плазме с использованием некомпартментного анализа данных.

Средние концентрации в плазме TPP-10992 и TPP-5661 после внутривенного введения с течением времени графически изображены на Фиг. 1.

Средний клиренс и время полужизни TPP-10992 и TPP-5661 приведены в Таблице 2 ниже.

Таблица 2. Средний клиренс (CL) и время полужизни (t_1/2) для TPP-10992 и TPP-5661 после внутривенного введения 5 мг/кг крысе.

Аналит ° TPP-5661 TPP-10992 CL [мл/ч/кг] 0.62 0.27 t_1/2 [ч] 297 184

Определение фармакокинетических параметров in vivo

Фармакокинетические параметры TPP-12897 определяли после внутрибрюшинного введения самкам мышей Balb/c (n=3). Образцы крови собирали в период от 15 минут до 72 часов после применения. Образованную EDTA-плазму хранили при -20°С до дальнейшего анализа. Количественное определение TPP-12897 в образцах плазмы проводили с помощью анти-IgG человека формата анализа ELISA (иммуноглобулин G).

Фармакокинетические параметры рассчитывали из временных профилей концентрации в плазме с использованием некомпартментного анализа данных.

Средние концентрации TPP-12897 в плазме после внутрибрюшинного введения с течением времени графически изображены на Фиг. 2.

Средняя площадь под кривой (AUC) и время полужизни TPP-12897 приведены в Таблице 3 ниже.

Таблица 3. Средняя площадь под кривой (AUC) и время полужизни (t_1/2) для TPP-12897 после внутрибрюшинного введения 5 мг/кг мышам.

Аналит ° TPP-12897 AUC [мг·ч/л] 7705 t_1/2 [ч] 194

Пример 3. In vitro, ex vivo и in vivo эффективность ANP-привитых антител

Данные по активности ANP-привитых антител на клеточной линии рецептора NPR-A

Клеточную линию крысиного рецептора ANP (NPR-A) на основе люминесценции получали, как описано ранее (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131). Соответственно, линия клеток крысиного рецептора ANP (NPR-A) на основе флуоресценции была получена путем котрансфекции линии клеток CHO, стабильно экспрессирующих флуоресцентный кальций-сенсорный белок GCaMP6, плазмидными конструкциями, кодирующими CNGA2 (биосенсор cGMP) и крысиный NPR-A.

Клетки GCaMP6 рецептора ANP культивировали в течение одного дня на черных 384-луночных микротитровальных планшетах с прозрачным дном (2500 клеток/лунка). После удаления среды для культивирования клеток репортерные клетки загружали в течение 20 мин с Tyrode (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂, 20 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 4,8 мМ NaHCO₃ при pH 7,4), содержащим черный маскирующий краситель, при 37°C и 5% CO₂. IBMX (0,2 мМ) использовали для предотвращения расщепления cGMP эндогенными фосфодиэстеразами.

Измерения флуоресценции (3 мин, кинетический режим) начинали сразу после добавления агониста. Рецепторные лиганды добавляли в Tyrode, содержащий черный маскирующий краситель и 0,1% BSA. Измерения проводили на FLIPR Tetra®.

ANP (Bachem, H-2100) стимулировал зависимые от концентрации сигналы флуоресценции на линии клеток NPR-A со значениями EC₅₀ 0,22 нМ. TPP-5661 и TPP-10992 стимулировали линию репортерных клеток рецептора ANP крысы со значениями EC₅₀ 17 нМ и 180 нМ, соответственно. Конструкция контрольного антитела TPP-5657 не стимулировала значимо клеточную линию NPR-A (тестировали до максимальной концентрации 460 нМ).

Чтобы определить чувствительность к протеолитической деградации, активность рецепторных лигандов также была охарактеризована после 4 часов инкубации с 0,6 мкг/мл нейтральной эндопептидазы (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) или 0,6 мкг/мл фермента, разрушающего инсулин (IDE, Merck, 407241-50UG) при 37°C.

На Фиг. 3 графически изображена стабильность ANP (A-C), TPP-10992 (D-F) и TPP-5661 (G-I) от протеолитического расщепления. Как показано на Фиг. 3, натрийуретический пептид ANP (Bachem, H-2100) показал высокую чувствительность к расщеплению NEP и IDE. Напротив, TPP-5661 и TPP-10992 показали высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению NEP и IDE.

Данные по активности BNP-привитых антител на клеточной линии рецептора NPR-A

Клеточную линию крысиного рецептора BNP (NPR-A) на основе люминесценции получали, как описано ранее (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131). Соответственно, линия клеток крысиного рецептора BNP (NPR-A) на основе флуоресценции была получена путем котрансфекции линии клеток CHO, стабильно экспрессирующих флуоресцентный кальций-сенсорный белок GCaMP6, плазмидными конструкциями, кодирующими CNGA2 (биосенсор cGMP) и крысиный NPR-A.

Клетки GCaMP6 рецептора BNP культивировали в течение одного дня на черных 384-луночных микротитровальных планшетах с прозрачным дном (2500 клеток/лунка). После удаления среды для культивирования клеток репортерные клетки загружали в течение 20 мин с Tyrode (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂, 20 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 4,8 мМ NaHCO₃ при pH 7,4), содержащим черный маскирующий краситель, при 37°C и 5% CO₂. IBMX (0,2 мМ) использовали для предотвращения расщепления cGMP эндогенными фосфодиэстеразами.

Измерения флуоресценции (3 мин, кинетический режим) начинали сразу после добавления агониста. Рецепторные лиганды добавляли в Tyrode, содержащий черный маскирующий краситель и 0,1% BSA. Измерения проводили на FLIPR Tetra®.

BNP (Bachem, H-5968) стимулировал зависимые от концентрации сигналы флуоресценции на линии клеток NPR-A со значением EC₅₀ 2,9 нМ. TPP-9902, TPP-11153, TPP-1154, TPP-11155, TPP-11156 и TPP-11157 стимулировали репортерную клеточную линию рецептора BNP крысы со значениями EC₅₀ 2,3 мкМ,>1,9 мкМ, 7 нМ, 12 нМ, 1,2 мкМ и 11 нМ, соответственно. Конструкция контрольного антитела TPP-5657 не стимулировала значимо клеточную линию NPR-A (тестировали до максимальной концентрации 460 нМ).

Чтобы определить чувствительность к протеолитическому расщеплению, активность рецепторных лигандов также была охарактеризована после 4 часов инкубации с 0,6 мкг/мл нейтральной эндопептидазы (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) или 0,6 мкг/мл фермента, разрушающего инсулин (IDE, Merck, 407241-50UG) при 37°C. Натрийуретический пептид BNP (Bachem, H-5968) показал высокую чувствительность к расщеплению NEP и IDE. Напротив, TPP-11155 и TPP-11157 показали высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению NEP и IDE.

На Фиг. 4 графически изображена устойчивость BNP (A-C) и TPP-11155 (D-F) к протеолитическому расщеплению.

Данные по активности CNP-привитых антител на клеточной линии рецептора NPR-B

Была создана линия репортерных клеток рецептора CNP крысы (NPR-B) на основе люминесценции, и измерения люминесценции были выполнены, как описано ранее (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131).

Клетки рецептора CNP (2500 клеток/лунка) культивировали в течение 1 дня на непрозрачных 384-луночных микротитровальных планшетах. После удаления среды для культивирования клеток клетки нагружали в течение 3 ч 2,5 мкг/мл целентеразина в не содержащем Ca²⁺Tyrode (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 1 мМ MgCl₂, 4,8 мМ NaHCO₃ при pH 7,4) при 37°C и 5% CO₂. Рецепторные лиганды добавляли в течение 10 мин в не содержащий Ca²⁺Tyrode, содержащий 0,1% BSA. IBMX (0,2 мМ) использовали для предотвращения расщепления cGMP эндогенными фосфодиэстеразами. Непосредственно перед добавлением ионов кальция (конечная концентрация 3 мМ) измерения люминесценции начинали с использованием камеры устройства с зарядовой связью (CCD) в светонепроницаемой коробке. Люминесценцию контролировали непрерывно в течение 50 с.

CNP (Bachem, H-1296) стимулировал зависимые от концентрации сигналы люминесценции на клеточной линии NPR-B крыс со значением EC₅₀ 0,024 нМ. TPP-9465, TPP-12377, TPP-12378, TPP-12897 и TPP-12899 стимулировали линию репортерных клеток рецептора CNP крысы со значениями EC₅₀ 5,2 нМ, 4,1 нМ, 25 нМ, 10 нМ и 3,2 нМ, соответственно. TPP-12374 стимулировал репортерную клеточную линию рецептора CNP крысы со значениями EC₅₀ 150 нМ, а TPP-12375, TPP-12376 показали лишь слабое указание активности.

Чтобы определить чувствительность к протеолитическому расщеплению, активность рецепторных лигандов также была охарактеризована после 4 часов инкубации с 0,6 мкг/мл нейтральной эндопептидазы (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) или 0,6 мкг/мл фермента, разрушающего инсулин (IDE, Merck, 407241-50UG) при 37°C

В отличие от натрийуретического пептида CNP (Bachem, H-1296), TPP-12377, TPP-12897 и TPP-12899 показали высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению под действием NEP и IDE.

На Фиг. 5 графически изображена устойчивость CNP (A-C) и TPP-12897 (D-F) к протеолитическому расщеплению.

Данные по активности антител, привитых ANP, определяли с выделенными аортными кольцами крыс

Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами и одобрены местным комитетом по экспериментам на животных. Самцов крыс Sprague-Dawley (весом 250-300 г) анестезировали пентобарбиталом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), умерщвляли декапитацией и обескровливали. Грудную аорту вырезали и помещали в ледяной буфер Кребса следующего состава: 130 мМ NaCl, 14,9 мМ NaHCO₃, 5,5 мМ декстрозы, 4,7 мМ KCl, 1,18 мМ KH₂PO₄, 1,17 мМ MgSO₄7H₂O и 1,6 мМ CaCl₂2H₂O. Сосуд вставляли в чашку Сильгарда Петри, наполненную охлажденным раствором Кребса, очищали от жира и соединительной ткани и разрезали на кольцевые сегменты длиной примерно 3-4 мм. аортные кольца устанавливали вертикально в камеры объемом 50 мл (ADIinstruments), содержащей раствор Кребса, при 37°C, непрерывно барботируемый смесью 95% O₂ и 5% CO₂. Изменения изометрической силы регистрировали с помощью системы сбора данных PowerLab (программное обеспечение Lab Chart 7.0)

После периода уравновешивания аортные кольца обрабатывали 80 мМ KCl для проверки жизнеспособности ткани. Затем определяли целостность эндотелия препаратов путем проверки чувствительности к ацетилхолину (ACh, 1 мкМ) в сосудах, предварительно сокращенных фенилэфрином (PE, 1 мкМ). После вымывания и периода уравновешивания использовали фенилэфрин (PE, 1 мкМ) для индукции сокращения, после чего натрийуретический пептид и IgG, привитые натрийуретическим пептидом, оценивали на вазорелаксацию. Пептид крысиного ANP (ADH-GM-10057T, Santai Labs) использовали в качестве эталона.

Как показано на Фиг. 6, как пептид ANP, так и TPP-10992 индуцировали дозозависимую вазодилатацию в PE-сокращенных аортных кольцах.

Как показано на Фиг. 7, как пептид ANP, так и TPP-5661 индуцировали дозозависимую вазодилатацию в PE-сокращенных аортных кольцах.

Данные по активности антител, привитых ANP, полученные на крысах в сознании

Артериальное давление и частоту сердечных сокращений контролировали у свободно движущихся находящихся в сознании животных с помощью радиотелеметрии (Data Sciences International). Для этих исследований использовали самок крыс со спонтанной гипертензией (SHR/N Crl BR, Charles River) с массой тела 210-300 г.Всех животных содержали в индивидуальных клетках при температуре окружающей среды 22-24°C и поддерживали 12-часовой цикл свет/темнота со свободным доступом к стандартному лабораторному корму для крыс и воде. Имплантацию телеметра (HD-10, DSI) проводили как минимум за 14 дней до того, как животных использовали для измерения артериального давления. Операция проводилась в асептических условиях. После бритья брюшной стенки был сделан разрез брюшной полости по средней линии, и сенсорный катетер, заполненный жидкостью, был вставлен выше по ходу потока в обнаженную нисходящую аорту между подвздошной бифуркацией и почечными артериями. Согласно рекомендациям DSI, кончик телеметрического катетера располагали каудально по отношению к почечным артериям и закрепляли тканевым клеем. Корпус передатчика прикрепляли к внутренней брюшной стенке перед закрытием брюшной полости. Для послеоперационной защиты от инфекций и против боли вводили разовую дозу антибиотика (Oxytetracyclin® 10%, 60 мг/кг подкожно, 0,06 мл/100 г массы тела, Beta-Pharma GmbH & Co, Германия) и анальгетика (Rimadyl®, 4 мг/кг подкожно, Pfizer, Германия). Сбор телеметрических данных выполнялся с помощью программного обеспечения DSI, которое было предопределено для выборки гемодинамических данных в течение 10 секунд, повторяемых каждые 5 минут.Сбор данных был начат менее чем за 2 часа до введения лекарственного средства и закончен после завершения циклов измерения. Данные выражены в% от базовых значений±SEM для по меньшей мере 4 животных на группу. Базальное значение для каждого животного рассчитывали как среднее значение, измеренное за два часа до применения вещества (7:00 - 9:00 утра). Затем данные выражали как среднее значение каждые полчаса, начиная с 15 минут после применения. Всем животным вводили однократное внутрибрюшинное (ip) введение тестируемых веществ, растворенных в фосфатно-солевом буфере (PBS). Введение лекарственного средства проводили в момент времени 9:00 утра (0 часов).

Гемодинамический эффект пептида ANP графически изображен на Фиг. 8. Гемодинамический эффект TPP-5661 графически изображен на Фиг. 9. Гемодинамический эффект TPP-10992 графически изображен на Фиг. 10

Пример 4. Получение различных конструкций антитела, привитого NP

Для конструкций с включением натрийуретического пептида в участок CDR, отличный от CDRH3, предположительно функционально нейтральный CDRH3 был сконструирован путем слияния удлинения из трех остатков Leu Thr Gly (IGHD7-27*01) с С-концом HV 3-23 и N-концом IGHJ1 (по сравнению с Примером 1). Соответствующая последовательность тяжелой цепи полной длины SEQ ID NO 65 дополнительно содержит аминокислотную последовательность Constant-H (SEQ ID NO 87).

Спаривание последовательности тяжелой цепи полной длины SEQ ID NO 65 без какой-либо вставки натрийуретического пептида с последовательностью легкой цепи полной длины SEQ ID NO 66, описанной в примере 1, дает синтетический и предположительно нейтральный IgG отрицательный контроль TPP-5657.

Сконструированная и синтезированная конструкция антитела была клонирована в соответствии с хорошо известными в данной области техники методами и подтверждена секвенированием ДНК с использованием плазмидоспецифичных олигонуклеотидов.

Исходя из этого каркаса антитела были созданы следующие конструкции антител с привитыми ANP.

Таблица 4. Конструирование конструкций антитела, привитого ANP

Соеди-нение TPP Сайт вставки SEQ ID NO, содержа-щаяся в Ntls SEQ ID NO, содержа-щаяся в Ctls # aa
N-конце-вая¹ # aa
C-конце-вая² 1 TPP-13057 CDRH1 6 2 2 TPP-13056 CDRH1 9 5 3 TPP-13055 CDRH1 12 8 4 TPP-13054 CDRH1 15 11 5 TPP-12545 CDRH1 18 10 6 TPP-10454 CDRH1 19 17 7 TPP-10453 CDRH1 19 17 8 TPP-11172 CDRH1 6 20 17 9 TPP-10294 CDRH1 23 14 10 TPP-12547 CDRH1 23 14 11 TPP-11171 CDRH1 6 24 13 12 TPP-10841 CDRH2 3 3 13 TPP-10842 CDRH2 7 7 14 TPP-11009 CDRH2 8 9 15 TPP-11008 CDRH2 10 11 16 TPP-11018 CDRH2 11 14 17 TPP-10775 CDRH2 12 8 18 TPP-10767 CDRH2 13 12 19 TPP-11012 CDRH2 9 14 9 20 TPP-10774 CDRH2 13 14 14 10 21 TPP-11007 CDRH2 14 11 22 TPP-11179 CDRH2 14 14 23 TPP-10773 CDRH2 13 14 15 10 24 TPP-10770 CDRH2 1 1 15 12 25 TPP-10766 CDRH2 15 14 26 TPP-10772 CDRH2 13 14 16 11 27 TPP-11005 CDRH2 16 11 28 TPP-11006 CDRH2 16 11 29 TPP-11017 CDRH2 16 14 30 TPP-11169 CDRH2 9 10 16 15 31 TPP-11181 CDRH2 16 15 32 TPP-11182 CDRH2 16 17 33 TPP-10277 CDRH2 9 10 17 11 34 TPP-12553 CDRH2 9 10 17 11 35 TPP-12554 CDRH2 9 10 17 11 36 TPP-12555 CDRH2 9 10 17 11 37 TPP-12542 CDRH2 9 10 17 11 38 TPP-12543 CDRH2 9 10 17 11 39 TPP-12544 CDRH2 9 10 17 11 40 TPP-13058 CDRH2 9 10 17 11 41 TPP-13059 CDRH2 9 10 17 11 42 TPP-13060 CDRH2 9 20 17 11 43 TPP-13061 CDRH2 9 20 17 11 44 TPP-13062 CDRH2 9 10 17 11 45 TPP-13063 CDRH2 9 10 17 11 46 TPP-13064 CDRH2 9 10 17 11 47 TPP-13065 CDRH2 9 10 17 11 48 TPP-13066 CDRH2 9 10 17 11 49 TPP-12546 CDRH2 9 10 17 11 50 TPP-10452 CDRH2 13 14 17 12 51 TPP-10846 CDRH2 4 5 17 12 52 TPP-10852 CDRH2 17 12 53 TPP-10851 CDRH2 6 17 13 54 TPP-10769 CDRH2 1 1 17 14 55 TPP-10765 CDRH2 17 14 56 TPP-11180 CDRH2 17 15 57 TPP-11177 CDRH2 17 17 58 TPP-11178 CDRH2 17 17 59 TPP-11176 CDRH2 17 18 17 17 60 TPP-10278 CDRH2 9 10 18 12 61 TPP-10847 CDRH2 4 5 18 13 62 TPP-11004 CDRH2 18 13 63 TPP-10844 CDRH2 2 3 18 13 64 TPP-10853 CDRH2 18 13 65 TPP-10279 CDRH2 9 10 18 13 66 TPP-11170 CDRH2 9 10 18 13 67 TPP-11010 CDRH2 9 18 13 68 TPP-11011 CDRH2 9 18 13 69 TPP-10764 CDRH2 18 14 70 TPP-11183 CDRH2 18 17 71 TPP-11175 CDRH2 16 17 18 17 72 TPP-11016 CDRH2 15 19 12 73 TPP-11015 CDRH2 15 19 14 74 TPP-10451 CDRH2 13 14 19 14 75 TPP-10768 CDRH2 1 1 19 14 76 TPP-10848 CDRH2 4 5 19 14 77 TPP-11003 CDRH2 19 14 78 TPP-11002 CDRH2 19 14 79 TPP-10843 CDRH2 2 3 19 14 80 TPP-10845 CDRH2 2 3 19 14 81 TPP-10284 CDRH2 19 14 82 TPP-10446 CDRH2 11 12 19 14 83 TPP-10447 CDRH2 19 14 84 TPP-10854 CDRH2 19 14 85 TPP-11014 CDRH2 15 19 15 86 TPP-10849 CDRH2 6 6 19 15 87 TPP-10850 CDRH2 6 19 15 88 TPP-11013 CDRH2 20 14 89 TPP-10771 CDRH2 1 1 20 15 90 TPP-10287 CDRH2 1 1 20 15 91 TPP-10282 CDRH2 20 15 92 TPP-10285 CDRH2 20 15 93 TPP-10286 CDRH2 20 15 94 TPP-10283 CDRH2 20 15 95 TPP-11168 CDRH2 9 10 20 15 96 TPP-10857 CDRH2 20 15 97 TPP-10856 CDRH2 20 15 98 TPP-10855 CDRH2 20 15 99 TPP-10281 CDRH3 10 3 100 TPP-10280 CDRH3 10 8 101 TPP-10583 CDRH3 12 10 102 TPP-10582 CDRH3 7 14 12 103 TPP-10270 CDRH3 7 8 15 18 104 TPP-10264 CDRH3 7 8 16 14 105 TPP-10581 CDRH3 16 14 106 TPP-10263 CDRH3 7 8 17 15 107 TPP-10271 CDRH3 7 8 17 18 108 TPP-10262 CDRH3 7 8 18 16 109 TPP-10272 CDRH3 7 8 18 18 110 TPP-10261 CDRH3 7 8 19 17 111 TPP-10289 CDRH3 19 17 112 TPP-10273 CDRH3 7 8 19 18 113 TPP-10260 CDRH3 7 8 20 17 114 TPP-10275 CDRH3 9 10 20 17 115 TPP-10580 CDRH3 20 18 116 TPP-10274 CDRH3 7 8 20 18 117 TPP-5661 CDRH3 7 8 20 18 118 TPP-13226 CDRH3 7 8 18 16 119 TPP-13227 CDRH3 7 8 18 16 120 TPP-13228 CDRH3 7 22 20 18 121 TPP-13229 CDRH3 7 22 20 18 122 TPP-13230 CDRH3 21 22 20 18 123 TPP-13231 CDRH3 21 22 20 18 124 TPP-10276 CDRH3 9 10 20 18 125 TPP-10290 CDRH3 20 18 126 TPP-10445 CDRH3 11 12 20 18 127 TPP-10269 CDRH3 7 8 20 18 128 TPP-10288 CDRH3 2 3 20 18 129 TPP-10265 CDRH3 7 8 20 19 130 TPP-10268 CDRH3 7 8 21 19 131 TPP-10593 CDRH3 19 22 20 132 TPP-11174 CDRH3 6 12 22 20 133 TPP-10266 CDRH3 7 8 22 20 134 TPP-11173 CDRH3 6 12 22 20 135 TPP-10444 CDRH3 11 12 22 20 136 TPP-10267 CDRH3 7 8 24 22 137 TPP-10443 CDRH3 11 12 24 22 138 TPP-11163 CDRL1 6 16 14 139 TPP-10360 CDRL1 19 13 140 TPP-10462 CDRL1 20 18 141 TPP-10460 CDRL1 21 19 142 TPP-10461 CDRL1 21 19 143 TPP-11161 CDRL1 6 6 21 19 144 TPP-11162 CDRL1 6 21 19 145 TPP-10359 CDRL1 23 14 146 TPP-10824 CDRL2 1 6 147 TPP-10825 CDRL2 5 10 148 TPP-11019 CDRL2 12 16 149 TPP-11021 CDRL2 13 17 150 TPP-11020 CDRL2 13 17 151 TPP-10789 CDRL2 14 14 152 TPP-11022 CDRL2 15 19 153 TPP-10829 CDRL2 4 5 16 15 154 TPP-10835 CDRL2 16 15 155 TPP-10788 CDRL2 16 16 156 TPP-10571 CDRL2 15 15 17 16 157 TPP-10830 CDRL2 4 5 17 16 158 TPP-10790 CDRL2 17 16 159 TPP-10573 CDRL2 19 17 16 160 TPP-10827 CDRL2 2 3 17 16 161 TPP-10572 CDRL2 19 17 16 162 TPP-10836 CDRL2 17 16 163 TPP-10834 CDRL2 6 17 17 164 TPP-10787 CDRL2 18 16 165 TPP-10831 CDRL2 4 5 18 17 166 TPP-10828 CDRL2 2 3 18 17 167 TPP-10826 CDRL2 2 3 18 17 168 TPP-10837 CDRL2 18 17 169 TPP-10361 CDRL2 19 17 170 TPP-11023 CDRL2 11 12 19 18 171 TPP-10838 CDRL2 19 18 172 TPP-10840 CDRL2 19 18 173 TPP-10839 CDRL2 19 18 174 TPP-10832 CDRL2 6 19 19 175 TPP-10833 CDRL2 6 19 19 176 TPP-11024 CDRL2 11 12 20 19 177 TPP-10353 CDRL3 2 2 178 TPP-10780 CDRL3 14 9 179 TPP-10786 CDRL3 16 10 180 TPP-10779 CDRL3 16 11 181 TPP-10778 CDRL3 16 13 182 TPP-10783 CDRL3 11 12 17 11 183 TPP-10785 CDRL3 18 12 184 TPP-10776 CDRL3 18 13 185 TPP-10777 CDRL3 18 13 186 TPP-10784 CDRL3 18 14 187 TPP-10782 CDRL3 11 12 19 13 188 TPP-10352 CDRL3 7 8 19 14 189 TPP-10356 CDRL3 19 14 190 TPP-10354 CDRL3 19 14 191 TPP-10355 CDRL3 19 14 192 TPP-10781 CDRL3 11 12 19 15 193 TPP-10436 CDRL3 7 8 20 14 194 TPP-10440 CDRL3 11 12 20 14 195 TPP-10442 CDRL3 20 14 196 TPP-10351 CDRL3 7 8 20 15 197 TPP-10348 CDRL3 7 8 20 15 198 TPP-10358 CDRL3 20 15 199 TPP-11167 CDRL3 6 12 21 15 200 TPP-10438 CDRL3 11 12 21 15 201 TPP-10439 CDRL3 11 12 21 15 202 TPP-10441 CDRL3 21 15 203 TPP-10349 CDRL3 7 8 21 16 204 TPP-10350 CDRL3 7 8 22 17 205 TPP-10437 CDRL3 11 12 23 17 206 TPP-11166 CDRL3 6 12 24 18 207 TPP-10362 CDRL3 6 6 24 20 208 TPP-10363 CDRL3 6 6 24 20 209 TPP-5657 no na na

¹ Число аминокислотных остатков, присутствующих между соответствующим N-концевым эталонным аминокислотным остатком и первой аминокислотой вставленного натрийуретического пептида;

² Число аминокислотных остатков, присутствующих между последней аминокислотой вставленного натрийуретического пептида и соответствующим C-концевым эталонным аминокислотным остатком.

Таблица 4 (продолжение). Конструирование конструкций антитела с привитым ANP

Соеди-нение TPP N-концевая последовательность³ C-концевая последовательность⁴ 1 TPP-13057 SGFTFSS YAM 2 TPP-13056 SGFTFGSGSG GSGSGM 3 TPP-13055 SGFTFGSGSGSGS SGSGSGSGM 4 TPP-13054 SGFTFGSGSGSGGSGG GGSGGSGSGSGM 5 TPP-12545 SGFTFGSGSGSGSGGGSGG GSGSGGSGSGM 6 TPP-10454 SPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFVVAM 7 TPP-10453 SGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFVVAM 8 TPP-11172 SSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGREVPISNGSGFVVAM 9 TPP-10294 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM 10 TPP-12547 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM 11 TPP-11171 SGFTFSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGSGSGSGSGSGM 12 TPP-10841 ISGS GGST 13 TPP-10842 ISGSGSGS GSGSGGST 14 TPP-11009 ISGSGSGSG GSSGSGSGST 15 TPP-11008 ISGSGSGSGSG GSSGSGSGSGST 16 TPP-11018 ISGSGSGSGSGG GEKEKEKVSTAVGST 17 TPP-10775 ISGSAVVNGGSGG GKIAIGGST 18 TPP-10767 ISGPNPNKNPNPGG GSNENPNPNPGST 19 TPP-11012 ISGSVVVTSHGGSGG GGSGSGSGST 20 TPP-10774 ISGSAVVNVRGGSGG GGDKIAIGGST 21 TPP-11007 ISGSGSGSGSGSSGG GSSGSGSGSGST 22 TPP-11179 ISGLAVQIRRGGSGG GGSGRETLTLYVGST 23 TPP-10773 ISGSAVVNVRAGGSGG GGDKIAIGGST 24 TPP-10770 ISGSYAMSWVRGGSGG GSYAMSWVRQGST 25 TPP-10766 ISGPNPNKNPNPNPGG GSNPNENPNPNPGST 26 TPP-10772 ISGSAVVNVRADGGSGG GSGDKIAIGGST 27 TPP-11005 ISGSGSGSGSPDGGSGG GSSGSGSGSGST 28 TPP-11006 ISGSGSGSGSGSGGSGG GSSGSGSGSGST 29 TPP-11017 ISGSGSGSGSGSGGSGG GEKEKEKVSTAVGST 30 TPP-11169 ISGSVVVTSHQAPGSGG GSGEKKKLKSLAYGST 31 TPP-11181 ISGRYNILKIQKVGSGG GGSGEYLITYQIMGST 32 TPP-11182 ISGRQLLFCRVTLGSGG GGSGEQAYPEYLITYGST 33 TPP-10277 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 34 TPP-12553 ISGVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 35 TPP-12554 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLGST 36 TPP-12555 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 37 TPP-12542 ISGVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 38 TPP-12543 ISGSVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 39 TPP-12544 ISGSVTSHQAPGEGGSGG GEKKKGKSGGST 40 TPP-13058 ISVVVTSHQAPGSGGSGG GEKKKLKSLAST 41 TPP-13059 ISVVVTSHQAPTSGGSGG GEKKKLKSLAST 42 TPP-13060 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GGSTPLKSLAST 43 TPP-13061 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GGSTPLKSLAST 44 TPP-13062 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GSTPKLKSLAST 45 TPP-13063 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GEKKKLKSLAST 46 TPP-13064 ISVVVTSHPTPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 47 TPP-13065 ISVVVTSHQAPSPGSTGG GEKKKLKSLAST 48 TPP-13066 ISVVVTSHQANGSGGSGG GEKKKLKSLAST 49 TPP-12546 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 50 TPP-10452 ISGSAVVNVRAPDGGSGG GSKGDKIAIGGST 51 TPP-10846 ISTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGST 52 TPP-10852 ISGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFST 53 TPP-10851 ISSALLKSKLRALLTAPG GGSGSGSGSGSGST 54 TPP-10769 ISGSYAMSWVRQAGGSGG GSSSYAMSWVRQGST 55 TPP-10765 ISGPNPNKNPNPNPGSGG GSNPNENPNPNPGST 56 TPP-11180 IHPLQNRWALWFFKGSGG GGSGNLRLISKFDTVT 57 TPP-11177 ISGSVTIFSLATNEGSGG GGSGKTTWHRISVFGGST 58 TPP-11178 IYLEGKIDYGEYMDGSGG GGSNVRRQATTIIADNIT 59 TPP-11176 ISGSVQGIINFEQKGSGG GGSGPVKVWGSIKGGGST 60 TPP-10278 ISGVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAGST 61 TPP-10847 ISGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGST 62 TPP-11004 ISGSGSGSGSGSPDGGSGG GSSGSGSGSGSGST 63 TPP-10844 ISGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGST 64 TPP-10853 ISGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGST 65 TPP-10279 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST 66 TPP-11170 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKPKPKPLAYGST 67 TPP-11010 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GSSGSGSGSGSGST 68 TPP-11011 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GSGSGSGSGSGGST 69 TPP-10764 ISGPNPNKNPNPNPGGSGG GSNPNENPNPNPGST 70 TPP-11183 ISGDIYLAINITNGEGSGG GGSGDIYLAINITNGEST 71 TPP-11175 ISGSATKAVSVLKGDGSGG GGSGVQGIINFEQKGGST 72 TPP-11016 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSGSGSGSGSGST 73 TPP-11015 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSGSGSGSGSGSGST 74 TPP-10451 ISGSSGAVVNVRAPDGGSGG GSKGDKIAIWTTGST 75 TPP-10768 ISGSYAMSWVRQAPDGGSGG GSSSYAMSWVRQGST 76 TPP-10848 ISGSTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGGST 77 TPP-11003 ISGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGSGST 78 TPP-11002 ISGSGSGSGSGSSPDGGSGG GSYSGSGSGSGSGST 79 TPP-10843 ISTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEPKST 80 TPP-10845 ISGSTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGST 81 TPP-10284 ISGPNPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPNPGST 82 TPP-10446 ISAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNST 83 TPP-10447 ISGFILPIEVYFKPDGGSGG GSPRKVRFDYDLFST 84 TPP-10854 ISGSGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGGST 85 TPP-11014 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSYGSGSGSGSGSGST 86 TPP-10849 ISDRSALLKSKLRALLTAPR GSDRSALLKSKLRAST 87 TPP-10850 ISDRSALLKSKLRALLTAPG GGSGSGSGSGSGSGST 88 TPP-11013 ISGSSDKTHTSPPSPDGGSGG GSKTHTSPPSPGGST 89 TPP-10771 ISGSYAMSWVRQASPDGGSGG GSYSSYAMSWVRGGST 90 TPP-10287 ISGSYAMSWVRQASPDGGSGG GSYSSYAMSWVRQGST 91 TPP-10282 ISGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGST 92 TPP-10285 ISGSPNPNPNPNPSPDGGSGG GSYPNPNPNPNPSGST 93 TPP-10286 ISGPNPNKNPNPNSPDGGSGG GSYNPNENPNPNPGST 94 TPP-10283 ISGPNPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPNPGST 95 TPP-11168 ISGSVVVTSHQAPGGSGGSGG GSGEKKKLKSLAYGST 96 TPP-10857 ISGSVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGST 97 TPP-10856 ISGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGST 98 TPP-10855 ISPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFST 99 TPP-10281 CAKSPDGGSGG GSYG 100 TPP-10280 CAKSPDGGSGG GSYQHWGQG 101 TPP-10583 CAKVHQETGGSGG GSWHVQHWGQG 102 TPP-10582 CAKVHQETPDGGSGG GSYEWHVQHWGQG 103 TPP-10270 CTSVHQETKKYQSSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 104 TPP-10264 CTSVHQETSSPDGGSGG GSYSYEWHVDVWGQG 105 TPP-10581 CAKTHTSPPSPDGGSGG GSSPPSPYFQHWGQG 106 TPP-10263 CTSVHQETKSSPDGGSGG GSYSNYEWHVDVWGQG 107 TPP-10271 CTSVHQETKKYQSSPDGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 108 TPP-10262 CTSVHQETKKSSPDGGSGG GSYSYNYEWHVDVWGQG 109 TPP-10272 CTSVHQETKKYQSSGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 110 TPP-10261 CTSVHQETKKQSSPDGGSGG GSYSYYNYEWHVDVWGQG 111 TPP-10289 CAKVHPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPHVDVWGQG 112 TPP-10273 CTSVHQETKKYQSSPDGGSG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 113 TPP-10260 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYYNYEWHVDVWGQG 114 TPP-10275 CAKLTVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAYFQHWGQG 115 TPP-10580 CAKSSDKTHTSPPSPDGGSGG GSKTHTSPPSPYFQHWGQG 116 TPP-10274 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 117 TPP-5661 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 118 TPP-13226 CAKVETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEVQHWGQG 119 TPP-13227 CAKVHTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYHVQHWGQG 120 TPP-13228 CAKLTVETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVQHWGQG 121 TPP-13229 CAKLTAETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYENYFQHWGQG 122 TPP-13230 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYAEYFQHWGQG 123 TPP-13231 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYDYVWGSYAYFQHWGQG 124 TPP-10276 CAKLTSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYYFQHWGQG 125 TPP-10290 CAKVHPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPHVDVWGQG 126 TPP-10445 CAKLTQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTYFQHWGQG 127 TPP-10269 CAKVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVQHWGQG 128 TPP-10288 CAKTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKAEYFQHWGQG 129 TPP-10265 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTTYNYEWHVDVWGQG 130 TPP-10268 CATSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVHWGQG 131 TPP-10593 CAKLTAEEWKKKYEKEKEKNKGS GGSGGSGGSGGAEYFQHWGQG 132 TPP-11174 CADSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 133 TPP-10266 CTSVHQETKKYQYQSSPDGGSGG GSYSYTYTYNYEWHVDVWGQG 134 TPP-11173 CAKLTDRSALLKSKLRALLTAPR GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 135 TPP-10444 CAKLTAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 136 TPP-10267 CTSVHQETKKYQSSYQSSPDGGSGG GSYSYTYSYTYNYEWHVDVWGQG 137 TPP-10443 CAKLTAVQVKLELGHRAQPDGGSGG GSPVNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 138 TPP-11163 SSSNIGSKLRALLTAPR GSGSGGSGGSGSGYD 139 TPP-10360 SGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGD 140 TPP-10462 SSLGQIQLTIRHSSPDGGSGG GSNKLIVVVHASRNLIGYD 141 TPP-10460 SPLGQIQLTIRHSSQPDGGSGG GSRNKLIVVVHASRNLIAYD 142 TPP-10461 SSLGQIQLTIRHSSQPDGGSGG GSRNKLIVVVHASRNLIGYD 143 TPP-11161 SSSNIGSALLKSKLRALLTAPR GSSDRSALLKSKLRALLTAD 144 TPP-11162 SSSNIGSALLKSKLRALLTAPR GSGSGGSGGSGGSGSGSGYD 145 TPP-10359 SSSNIGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGYD 146 TPP-10824 YG NSNRPSG 147 TPP-10825 YGGSGS GSGSNSNRPSG 148 TPP-11019 YGKTHTSPPSPGG GGKTHTSPPSPGNRPSG 149 TPP-11021 YGSGSGSGSGSGGG GGKTHTSPPSPSGNRPSG 150 TPP-11020 YGSKTHTSPPSPGG GGKTHTSPPSPSGNRPSG 151 TPP-10789 YGSGSGSGSGGGSGG GSGGSGSGSGNRPSG 152 TPP-11022 YGSSDKTHTSPPSPGG GGSGSGSGGSGSGSGNRPSG 153 TPP-10829 YTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGNRPSG 154 TPP-10835 YGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFNRPSG 155 TPP-10788 YGSGSGSGSGSGGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 156 TPP-10571 YGVPKEKEKEKVSTAVGG GSAPLEVPKEKEKEKVG 157 TPP-10830 YGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGNRPSG 158 TPP-10790 YGGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 159 TPP-10573 YGSGSGSGSGSGSGSGGG GSYEKEKEKNKTLKNVG 160 TPP-10827 YGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGNRPSG 161 TPP-10572 YGAEEWKKKYEKEKEKGG GSGSGSGSGSGSGSGSG 162 TPP-10836 YGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGNRPSG 163 TPP-10834 YGSALLKSKLRALLTAPG GSDGSGGSGSGSGNRPSG 164 TPP-10787 YGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 165 TPP-10831 YGGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGGNRPSG 166 TPP-10828 YGGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGNRPSG 167 TPP-10826 YTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEPKNRPSG 168 TPP-10837 YGGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGGNRPSG 169 TPP-10361 YGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGNRPSG 170 TPP-11023 YGSQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTSGNRPSG 171 TPP-10838 YPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFNRPSG 172 TPP-10840 YGGVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGNRPSG 173 TPP-10839 YGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGNRPSG 174 TPP-10832 YGSRSALLKSKLRALLTAPR GSDGSGSGGSGSGSGNRPSG 175 TPP-10833 YGSRSALLKSKLRALLTAPG GSDGSGSGGSGSGSGNRPSG 176 TPP-11024 YGSAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNSGNRPSG 177 TPP-10353 CQS VVF 178 TPP-10780 CGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGF 179 TPP-10786 CQSYDILPIEPDGGSGG GSRFDYDGVVF 180 TPP-10779 CGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGF 181 TPP-10778 CGSGSGSGSGSGGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 182 TPP-10783 CQSYDKLELGHPDGGSGG GSHLRSEKGVVF 183 TPP-10785 CQSYDILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDGVVF 184 TPP-10776 CGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 185 TPP-10777 CGSGSGSGSGSGSDGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 186 TPP-10784 CQSYDGFILPIEVYGGSGG GSKVRFDYDLFGVVF 187 TPP-10782 CQSYDKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKGVVF 188 TPP-10352 CQVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVF 189 TPP-10356 CGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGF 190 TPP-10354 CQSYDPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPSGVVF 191 TPP-10355 CAAWNPNPNPNPNPNGGSGG GSNPNPNPNPNPNVF 192 TPP-10781 CQSYDQVKLELGHRAGGSGG GSVNHLRSEKLTGVVF 193 TPP-10436 CQSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVF 194 TPP-10440 CQSYDQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTGVVF 195 TPP-10442 CQSYDGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGVVF 196 TPP-10351 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVF 197 TPP-10348 CQSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVVF 198 TPP-10358 CGGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGGF 199 TPP-11167 CQSYDSSALLKSKLRALLTAPR GSVNHLRSEKLTGVVF 200 TPP-10438 CQSAVQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTFNVF 201 TPP-10439 CQSYDQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTGVVF 202 TPP-10441 CQSYDGFILPIEVYFPDGGSGG GSRKVRFDYDLFGVVF 203 TPP-10349 CQSYVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVGVVF 204 TPP-10350 CQSYDVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVSGVVF 205 TPP-10437 CQSYDAVQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTFNGVVF 206 TPP-11166 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGGSVNHLRSEKLTGVVF 207 TPP-10362 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSDRSALLKSKLRALLTAVVF 208 TPP-10363 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPE GSDRSALLKSKLRALLTAVVF 209 TPP-5657

³ N-концевая последовательность соответствует ближайшей соседней N-концевой аминокислоте от вставленного натрийуретического пептида, плюс аминокислотное удлинение, присутствующее между указанной эталонной аминокислотой и первым аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида

⁴ C-концевая последовательность соответствует аминокислотному удлинению, присутствующему между последним аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида и ближайшей соседней C-концевой эталонной аминокислотой от вставленного натрийуретического пептида, плюс указанная эталонная аминокислота.

Кроме того, следующие конструкции человеческих антител IgG1 с привитыми BNP были получены на основе каркаса антител TPP-5657.

Таблица 5. Конструирование конструкций антитела, привитого BNP

Соеди-нение TPP Сайт вставки # aa
N-концевая¹ # aa
C-концевая² BNP Соответств. ANP соединение³ B1 TPP-9902 CDRH3 20 18 Hum28aa #117 B2 TPP-11153 CDRH3 22 19 Hum25aa B3 TPP-11154 CDRH3 20 18 Rat28aa #117 B4 TPP-11155 CDRH3 17 17 Rat32aa B5 TPP-11156 CDRH2 18 13 Hum28aa #65 B6 TPP-11157 CDRH2 18 13 Rat28aa #65 B7 TPP-18029 CDRH1 23 14 Hum28aa #9 B8 TPP-18031 CDRH2 3 3 Hum28aa #12 B9 TPP-18032 CDRH2 7 7 Hum28aa #13 B10 TPP-18033 CDRH2 19 14 Hum28aa #80 B11 TPP-18028 CDRH2 20 15 Hum28aa #94 B12 TPP-18034 CDRH3 20 18 Hum28aa #122 B13 TPP-18030 CDRL3 19 14 Hum28aa #191

¹ Число аминокислотных остатков, присутствующих между соответствующим N-концевым эталонным аминокислотным остатком и первой аминокислотой вставленного натрийуретического пептида;

² Число аминокислотных остатков, присутствующих между последней аминокислотой вставленного натрийуретического пептида и соответствующим C-концевым эталонным аминокислотным остатком

³Соответствующее ANP соединение относится к конструкции антитела с привитым ANP с тем же локусом вставки и содержащей ту же N-концевую и C-концевую последовательность.

Таблица 5 (продолжение). Конструирование конструкций антитела, привитого BNP

Соеди-нение TPP N-концевая последовательность³ C-концевая последовательность⁴ B1 TPP-9902 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG B2 TPP-11153 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGSG GGSYSYTYNYEWHVDVWGQG B3 TPP-11154 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG B4 TPP-11155 CTSVHQETKKYQSSPDGG SYSYTYNYEWHVDVWGQG B5 TPP-11156 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST B6 TPP-11157 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST B7 TPP-18029 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM B8 TPP-18031 ISGS GGST B9 TPP-18032 ISGSGSGS GSGSGGST B10 TPP-18033 ISGSTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGST B11 TPP-18028 ISGPNPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPNPGST B12 TPP-18034 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYAEYFQHWGQG B13 TPP-18030 CAAWNPNPNPNPNPNGGSGG GSNPNPNPNPNPNVF

³ N-концевая последовательность соответствует ближайшей соседней N-концевой аминокислоте от вставленного натрийуретического пептида, плюс аминокислотное удлинение, присутствующее между указанной эталонной аминокислотой и первым аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида

⁴ C-концевая последовательность соответствует аминокислотному удлинению, присутствующему между последним аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида и ближайшей соседней C-концевой эталонной аминокислотой от вставленного натрийуретического пептида, плюс указанная эталонная аминокислота

Кроме того, были получены следующие конструкции IgG1 человека с привитым CNP.

Таблица 6. Конструирование конструкций антител, привитых CNP

Сое-дине-ние TPP Сайт вставки SEQ ID NO, содержа- щаяся в Ntls SEQ ID NO, содержа- щаяся Ctls # aa
N-кон-цевая¹ # aa
C-кон-цевая² мкг/мл
pcs % чистоты pcs Соответст.ANP соединение³ C1 TPP-9465 CDRH3 7 8 21 23 69-242 97 C2 TPP-12374 CDRL3 11 12 20 20 212 C3 TPP-12375 CDRH3 7 8 21 23 6 C4 TPP-12376 CDRH3 7 8 20 22 7 C5 TPP-12377 CDRH3 8 21 23 7 C6 TPP-12378 CDRH2 9 10 19 18 3 C13 TPP-18036 CDRH1 23 14 259 100 #9 C14 TPP-18038 CDRH2 3 3 0 #12 C15 TPP-18039 CDRH2 7 7 301 100 #13 C16 TPP-18040 CDRH2 2 3 19 14 300 100 #80 C17 TPP-18035 CDRH2 20 15 243 100 #94 C18 TPP-18041 CDRH3 21 22 20 18 287 100 #122 C19 TPP-18037 CDRL3 19 14 246 100 #191 Соединения на основе TPP-12377: Отличие по сравнению с TPP-12377 C7 TPP-12895 LC_G99E C8 TPP-12896 LC_G99L 101-131 C9 TPP-12897 LC_S98D 198-304 C10 TPP-12898 LC_S98G 147-258 C11 TPP-12899 LC_A33Y 165-197 82 C12 TPP-12900 LC_A33E 109-195

¹ Число аминокислотных остатков, присутствующих между соответствующим N-концевым эталонным аминокислотным остатком и первой аминокислотой вставленного натрийуретического пептида;

² Число аминокислотных остатков, присутствующих между последней аминокислотой вставленного натрийуретического пептида и соответствующим C-концевым эталонным аминокислотным остатком

³Соответствующее ANP соединение относится к конструкции антитела с привитым ANP с тем же локусом вставки и содержащей ту же N-концевую и C-концевую последовательность

Таблица 6 (продолжение). Конструирование конструкций антител, привитых CNP

Соединение TPP N-концевая последовательность³ C-концевая последовательность⁴ C1 TPP-9465 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGS GSGGYGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C2 TPP-12374 CQSYDQVKLELGHRAGGSGGS GSGGSGSVNHLRSEKLTGVVF C3 TPP-12375 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGS GSGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C4 TPP-12376 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C5 TPP-12377 CTSVHQETKKYQSSPYKGANKK GSGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C6 TPP-12378 ISGSVVVTSHQAPGGGSGGS GSGGSGEKKKLKSLAYGST

³ N-концевая последовательность соответствует ближайшей соседней N-концевой аминокислоте от вставленного натрийуретического пептида, плюс аминокислотное удлинение, присутствующее между указанной эталонной аминокислотой и первым аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида

⁴ C-концевая последовательность соответствует аминокислотному удлинению, присутствующему между последним аминокислотным остатком вставленного натрийуретического пептида и ближайшей соседней C-концевой эталонной аминокислотой от вставленного натрийуретического пептида, плюс указанная эталонная аминокислота

Пример 5: In vitro активности полученных конструкций

Все конструкции были транзиентно экспрессированы в клетках HEK293 в соответствии с хорошо известными в данной области техники методами, с достижением плотности клеток около 2x10^6 клеток/мл, общей концентрации ДНК около 1 мкг/мл для двух плазмид, кодирующих легкую и тяжелую цепи, при 5-дневной инкубации для экспрессии.

Необработанные образцы (rcs) были экспрессированы в объеме культуры 0,4 мл, и супернатант, отделенный центрифугированием, был непосредственно использован для тестирования. Концентрацию соединения оценивали с помощью IgG-Fc количественного анализа ELISA в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами. Вкратце, супернатант, разведенный 1: 1500, и серия 2-кратных разведений контрольной сыворотки человека (Bethyl, RS-110-4), начиная с 400 нг/мл, были иммобилизованы на черных микротитровальных планшетах Maxisorp 384 (MTP), покрытых анти-человеческим Fc. [Sigma I2136] при разведении 1: 440 в 1x покрывающем буфере (Candor, 121125) в течение 1 часа, 37°C. После блокирования с помощью 100%-ного блока SMART (Candor, 113125) применяли анти-человеческий Fc-HRP [Sigma, A0170] при разведении 1: 10000 для обнаружения антител в rcs и эталонных образцах. Кривые зависимости от дозы эталонного образца использовали для количественной оценки концентраций соединений, показанных в таблицах 7 и 8, столбец «мкг/мл rcs». Все образцы применяли четыре раза.

Выделенные образцы соединений (ics) были получены одностадийной очисткой через белок-A из 6 мл экспрессионной культуры и в соответствии с хорошо известными в данной области техники способами. Кислотные элюаты нейтрализовали добавлением 8% (об./об.) 1 М Трис/HCl с pH 9,0, определяли количественно по абсорбции при 280 нм и нормализовали до концентрации 125 нМ.

Образцы очищенных соединений (pcs) были получены путем двухэтапной очистки через белок-А и последующей SEC в буфере PBS из экспрессионной культуры объемом по меньшей мере 35 мл. Значения, приведенные в таблицах 7 и 8, столбец «мкг/мл pcs», относятся к концентрации соединения в супернатанте экспрессионной культуры, определенной аналитической хроматографией на белке А.

Все активности, показанные в таблицах 7 и 8, были измерены на клетках с гетерологичной сверхэкспрессией человеческого NPRA (hNPRA) с использованием количественного анализа cGMP, проводимого в соответствии с инструкциями производителя (cisbio; 62GM2PEH). Вкратце, анализ количественно определяет cGMP в буферном растворе или супернатантах клеточной культуры на основе конкуренции между cGMP, продуцируемым клеткой в результате стимуляции NPRA через образец (натрийуретический пептид), и cGMP, меченным d2, за связывание с антителом, меченным криптатом. Образец cGMP и меченный d2 cGMP конкурируют за связывание с ограниченным количеством сайтов на анти-cGMP антителах, меченных криптатом, и, следовательно, специфический флуоресцентный сигнал HTRF® (т.е. перенос энергии) обратно пропорционален концентрации cGMP в образце.

Данные кривой доза-ответ были проанализированы с помощью GraphPad Prism (версия 7.00 для Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA) и EC50 были нанесены на график в соответствии с Y=дно+(вершина-дно)/(1+10^((LogEC50-X)*склон)) с применением ограничений для дна, вершины и склона (общее значение для всех наборов данных соответствующего эксперимента).

Активность необработанного образца соединения в отношении стабильных клеток hNPRA-CHO k1 сначала оценивали путем сравнения с отрицательным контролем TPP-5657 и с положительным образцом, в частности TPP-5661. Контроли и rcs тестировали с четырьмя повторениями в двух концентрациях с коэффициентом относительного разбавления 5, чтобы получить флуоресцентный сигнал (s) в динамическом диапазоне анализа. Окно анализа определялось как разница в сигнале неактивных (макс.сигнал, s_max) и высокоактивных образцов (мин. сигнал, s_min), и для обеих концентраций соединения активность в% была рассчитана как 100*(s_max - s) / (s_max - s_min). Значения, перечисленные в таблице 7, столбцы «активность rcs» и «stdev активность rcs», представляют собой среднее значение результатов для двух концентраций и соответствующее стандартное отклонение. Сигналы rcs, составляющие менее половины сигнала эталонного соединения TPP-5661 (36%), были оценены как неактивные (n.a.).

Активность нескольких необработанных образцов соединений на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 повторно оценивали путем сравнения с эталонным образцом TPP-5661 в серии 2,5-кратных разведений (8 концентраций), начиная с 5-кратного разведения. Подходящее значение «logEC50» в качестве меры активности rcs было установлено по отношению к соответствующему значению эталонного rcs TPP-5661 путем вычисления дельты «logEC50» _соединение - «logEC50» _TPP-5661; итоговые значения приведены в таблице 7, столбец «относительная активность rcs». Примечательно, что концентрации соединения в rcs не учитывались, и, следовательно, на указанные значения в равной мере влияют активность соединения и концентрация. Все образцы применяли четыре раза.

Активность выделенных образцов соединений на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали путем определения ЕС50 и сравнения с эталонным образцом TPP-5661. Образцы тестировали в серии 2,5-кратных разведений от 80 нМ до 0,13 нМ. Соответствующее значение logEC50 в качестве меры активности ics было установлено по отношению к соответствующему значению эталонного ics TPP-5661 (-8,8) путем вычисления дельты logEC50_compound - logEC50_TPP-5661; результирующие значения приведены в таблице 7, столбец «отн. logEC50 ics». Все образцы применяли четыре раза.

Активность очищенных образцов соединений на стабильных клетках hNPRA-CHO k1 оценивали в нескольких экспериментах путем определения ЕС50 и сравнения с эталонным образцом TPP-5661. Образцы испытывали в серии разведений по меньшей мере в четыре раза. Значения, указанные в таблице 7, столбцы «отн. logEC50 pcs 1, 3 и 4» являются результатом серии 5-кратных разведений (≥4 концентрации), начиная с 20 или 25 нМ. Значения приведены в таблице 7, столбец «отн. logEC50 pcs 2» являются результатом серии 10-кратных разведений (4 концентрации), начиная с 25 нМ. Значения, указанные в таблице 7, столбцы «отн. logEC50 pcs 5, 6, 7, 8 и 9» являются результатом серии 2,5-кратных разведений с 8 или 12 концентрациями, начиная с 40 до 200 нМ, соответственно. Соответствующее значение logEC50 в качестве меры активности pcs было установлено по отношению к соответствующему значению эталонного TPP-5661 в соответствующем эксперименте (в среднем -9,2, стандартное отклонение 0,5) путем вычисления дельты logEC50_compound - logEC50_TPP-5661.

Активность очищенных образцов соединения на транзиентных клетках hNPRA-HEK293 оценивали в трех экспериментах путем определения ЕС50 и сравнения с эталонным образцом TPP-5661. Образцы тестировали в серии 5-кратных разведений от 1000 нМ до 0,013 нМ. Подходящее значение logEC50 в качестве меры активности pcs устанавливали по отношению к соответствующему значению эталонного TPP-5661 в соответствующем эксперименте (среднее значение трех экспериментов -9,0, стандартное отклонение 0,4) путем вычисления дельты logEC50_compound - logEC50_TPP-5661; результирующие значения приведены в таблице 7, столбцы «отн. logEC50* pcs». Все образцы применяли дважды.

Обобщенная качественная оценка активности соединений приведена в графе «качественная активность», значения указаны в столбце «среднее отн. logEC50» рассчитывались как среднее данных относительных значений logEC50. Соединения, показывающие значения ЕС50>50 раз по сравнению с эталонным соединением TPP-5661, что означает среднее отн. logEC50>1,7, были качественно оценены как неактивные («-»), соединения, показывающие относительный logEC50 от 0,7 до 1,7, были оценены как активные («+»), соединения, показывающие относительное logEC50<0,7, были оценены как очень активные («++“); самые высокие активности наблюдались при относительном logEC50 ниже -0,7 («+++»). Соединения, показывающие активность в rcs без подтверждения, как ics или pcs, помечены единым «y», а соединения, оцененные как неактивные («na» в столбце «активность rcs»), вероятно, из-за их очень низкого уровня экспрессии (≤1 мкг / мл, «n.e.» в столбце «мкг/мл rcs»), отмечены соответствующим образом.

Таблица 7. Уровни экспрессии и активности конструкций антитела, привитого предсердным натрийуретическим пептидом

Не определено (n.d.), нет активности (n.a.), не экспрессируется (n.e.), не доступно (na)

соединение # aa N-конц.¹ # aa C-конц.² мкг/мл rcs мкг/мл pcs % чистота pcs Активность rcs stdev активность rcs Отн. активность rcs отн.
logE
C50
ics отн.
logE
C50
pcs 1 отн.
logE
C50
pcs 2 отн.
logE
C50
pcs 3 отн.
logE
C50
pcs 4 отн.
logE
C50
pcs 5 отн.
logE
C50
pcs 6 отн.
logE
C50
pcs 7 отн.
logE
C50
pcs 8 отн.
logE
C50
pcs 9 отн.
logE
C50
* pcs отн.
logE
C50*
pcs отн.
logEC
50*
pcs Качеств. Активность Среднее отн. logEC
50 #1 6 2 n.d. 225 93 n.d. n.a. n.a. n.a. - n.a. #2 9 5 n.d. 179 96 n.d. n.a. n.a. n.a. - n.a. #3 12 8 n.d. 196 97 n.d. 0,2 0,0 0,0 ++ 0,1 #4 15 10 n.d. 214 96 n.d. -0,7 -0,8 -0,8 ++ -0,8 #5 18 10 n.d. 229 93 n.d. -0,7 -0,4 -0,4 -0,5 ++ -0,5 #6 19 17 1,6 150 76 33% 18% y #7 19 17 n.e 117 70 22% 20% y #9 23 14 4,8 226 97 41% 27% -0,2 0,0 -0,5 -0,6 -0,4 ++ -0,3 #10 23 14 n.d. 265 96 n.d. 0,9 0,2 0,1 0,0 ++ 0,3 #12 3 3 42,0 n.d. n.d. n.a. - #13 7 7 12,0 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #14 8 9 14,0 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #15 10 11 6,6 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #16 11 14 9,8 n.d. n.d. n.a. - #17 12 8 7,2 n.d. n.d. 53% 3% y #18 13 12 12,0 290 98 n.a. -0,2 0,9 + 0,9 #19 14 9 9,5 n.d. n.d. 48% 11% y #20 14 10 9,9 n.d. n.d. 64% 3% y #21 14 11 5,8 n.d. n.d. 38% 18% 0,7 ++ 0,7 #22 14 14 23,0 n.d. n.d. 75% 9% y #23 15 10 2,6 n.d. n.d. 60% 35% y #24 15 12 n.e 83 52 26% 22% 0,6 ++ 0,6 #25 15 14 14,0 n.d. n.d. 25% 5% -1,0 0,8 + 0,8 #26 16 11 2,0 181 98 n.a. 1,9 - #27 16 11 17,0 n.d. n.d. 37% 23% 1,4 + 1,4 #28 16 11 9,1 n.d. n.d. 50% 9% -0,9 0,5 ++ 0,5 #29 16 14 7,0 n.d. n.d. n.a. - #30 16 15 35,0 n.d. n.d. 88% 13% y #33 17 11 2,3 229 79 73% 32% -0,9 -0,1 -1,1 -0,7 -0,9 -0,5 -0,8 ++ -0,7 #34 17 11 n.d. 226 87 n.d. -0,2 ++ -0,2 #35 17 11 n.d. 215 86 n.d. -0,6 ++ -0,6 #36 17 11 n.d. 217 86 n.d. -0,1 ++ -0,1 #37 17 11 n.d. 244 86 n.d. -0,8 +++ -0,8 #38 17 11 n.d. 233 88 n.d. -0,5 ++ -0,5 #39 17 11 n.d. 208 86 n.d. -0,6 ++ -0,6 #40 17 11 n.d. 154 85 n.d. -0,5 -0,3 -0,6 ++ -0,5 #41 17 11 n.d. 106 79 n.d. n.d. #42 17 11 n.d. 112 97 n.d. -0,6 -0,7 -0,7 ++ -0,7 #43 17 11 n.d. 141 96 n.d. -0,6 -0,8 -0,6 ++ -0,7 #44 17 11 n.d. 166 93 n.d. -0,7 -0,8 -0,8 +++ -0,8 #45 17 11 n.d. 135 90 n.d. -0,4 -0,2 -0,5 ++ -0,4 #46 17 11 n.d. 166 92 n.d. -0,5 -0,4 -0,6 ++ -0,5 #47 17 11 n.d. 123 83 n.d. -0,3 -0,3 -0,7 ++ -0,4 #49 17 11 n.d. 203 84 n.d. -0,6 -0,2 -0,1 -0,6 ++ -0,4 #50 17 12 9,0 87 97 66% 21% -1,0 0,0 -0,4 ++ -0,2 #51 17 12 6,4 n.d. n.d. 44% 39% y #52 17 12 7,6 n.d. n.d. 26% 20% y #53 17 13 n.d. n.d. n.d. 69% 5% y #54 17 14 n.e 75 n.d. n.a. n.e #55 17 14 8,8 271 95 72% 40% -0,9 -0,9 -0,4 0,2 ++ -0,4 #57 17 17 13,0 n.d. n.d. 48% 1% y #58 17 17 33,0 n.d. n.d. 45% 9% y #59 17 17 31,0 n.d. n.d. 87% 4% -1,1 0,0 ++ 0,0 #60 18 12 4,1 367 90 53% 31% 0,0 -0,5 ++ -0,3 #61 18 13 n.e 334 97 n.a. 0,0 -0,9 ++ -0,5 #62 18 13 11,0 n.d. n.d. 36% 14% 1,5 + 1,5 #63 18 13 9,5 239 96 70% 22% -0,1 ++ -0,1 #64 18 13 5,3 n.d. n.d. 51% 18% y #65 18 13 1,2 253 86 69% 17% -0,5 -0,3 -1,2 -0,9 +++ -0,7 #66 18 13 38,0 n.d. n.d. 87% 4% -0,5 0,2 ++ 0,2 #67 18 13 4,8 n.d. n.d. 35% 17% -1,1 0,7 ++ 0,7 #68 18 13 9,2 n.d. n.d. 48% 13% y #69 18 14 7,1 n.d. n.d. 66% 11% -1,0 0,3 ++ 0,3 #70 18 17 n.e n.d. n.d. 30% 2% y #71 18 17 27,0 n.d. n.d. 89% 2% -0,5 -0,6 ++ -0,6 #72 19 12 11,0 n.d. n.d. 82% 0% -1,5 0,1 ++ 0,1 #73 19 14 9,4 n.d. n.d. 71% 0% -1,4 -0,2 ++ -0,2 #74 19 14 3,8 142 97 67% 7% -1,0 0,0 0,3 ++ 0,2 #75 19 14 4,4 50 49 95% 8% -0,4 ++ -0,4 #76 19 14 11,0 299 97 56% 2% 0,2 -0,8 ++ -0,3 #77 19 14 13,0 n.d. n.d. 38% 6% 1,1 + 1,1 #78 19 14 14,0 n.d. n.d. 55% 38% 1,0 + 1,0 #79 19 14 5,5 n.d. n.d. 67% 26% y #80 19 14 5,4 214 95 67% 19% -0,4 -0,8 ++ -0,6 #81 19 14 6,2 n.d. n.d. 64% 10% y #82 19 14 1,6 n.d. n.d. 57% 9% y #83 19 14 n.e n.d. n.d. 22% 40% y #84 19 14 11,0 n.d. n.d. 45% 30% y #85 19 15 4,5 n.d. n.d. 74% 27% -1,2 -0,9 +++ -0,9 #87 19 15 42,0 n.d. n.d. 90% 13% y #89 20 15 n.e 85 n.d. n.a. n.e #90 20 15 n.e 68 50 52% 18% 0,9 0,5 0,4 ++ 0,6 #91 20 15 3,4 275 99 30% 26% 0,3 0,3 -0,2 0,1 0,2 ++ 0,1 #92 20 15 2,3 n.d. n.d. n.a. -0,3 0,6 ++ 0,6 #93 20 15 4,1 286 98 70% 4% -0,8 -0,8 +++ -0,8 #94 20 15 12,0 318 98 83% 17% -0,8 -0,8 +++ -0,8 #95 20 15 38,0 n.d. n.d. 81% 16% y #96 20 15 7,3 n.d. n.d. n.a. - #97 20 15 8,3 n.d. n.d. 26% 17% y #98 20 15 7,7 n.d. n.d. 40% 14% y #99 10 3 44,0 257 100 n.a. n.a. n.a. - n.a. #100 10 8 88,0 188 99 n.a. n.a. n.a. - n.a. #101 12 10 83,0 n.d. n.d. n.a. - #102 14 12 16,0 n.d. n.d. 20% 7% y #103 15 18 7,7 101 85 50% 8% 0,7 -0,1 ++ 0,3 #104 16 14 15,0 137 98 n.a. 1,0 2,3 ? 1,7 #106 17 15 30,0 n.d. n.d. 20% 2% y #107 17 18 8,8 n.d. n.d. 50% 19% y #108 18 16 37,0 n.d. n.d. 68% 7% y #109 18 18 4,6 n.d. n.d. 62% 20% y #110 19 17 34,0 238 100 45% 25% -0,4 1,1 ++ 0,4 #111 19 17 41,0 296 98 80% 3% -0,4 0,2 ++ -0,1 #112 19 18 3,9 n.d. n.d. 31% 30% y #113 20 17 44,0 n.d. n.d. 52% 2% y #114 20 17 26,0 219 76 94% 4% 0,5 0,1 ++ 0,3 #116 20 18 9,4 247 84 71% 11% -0,3 -0,2 0,0 -0,2 0,0 -0,1 ++ -0,1 #117 20 18 12,9 238 92 36% 30% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ++ 0,0 #118 18 16 n.d. 191 n.d. n.d. -0,1 ++ -0,1 #119 18 16 n.d. 171 n.d. n.d. -0,2 ++ -0,2 #120 20 18 n.d. 200 n.d. n.d. -0,3 ++ -0,3 #121 20 18 n.d. 253 n.d. n.d. -0,2 ++ -0,2 #122 20 18 n.d. 115 n.d. n.d. -0,3 ++ -0,3 #123 20 18 n.d. 153 n.d. n.d. -0,1 ++ -0,1 #124 20 18 41,0 n.d. n.d. 77% 23% y #125 20 18 18,0 320 99 84% 16% -0,8 -0,1 ++ -0,5 #126 20 18 17,0 203 90 80% 2% y #127 20 18 35,0 119 92 95% 2% 0,5 -0,7 -0,5 -0,5 -0,5 ++ -0,3 #128 20 18 64,0 291 96 93% 9% y #129 20 19 28,0 n.d. n.d. 78% 12% y #130 21 19 33,0 n.d. n.d. 89% 5% y #132 22 20 7,5 n.d. n.d. 68% 20% y #133 22 20 20,0 n.d. n.d. 75% 14% y #134 22 20 9,7 n.d. n.d. 75% 3% y #135 22 20 30,0 158 88 67% 9% 0,1 3,5 ? 1,8 #136 24 22 15,0 n.d. n.d. 65% 13% y #137 24 22 61,0 n.d. n.d. 81% 23% y #139 19 13 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #145 23 14 35,0 n.d. n.d. 73% 11% y #146 1 6 29,0 n.d. n.d. n.a. - #147 5 10 6,7 n.d. n.d. n.a. 0,8 + #151 14 14 13,0 n.d. n.d. 64% 23% -1,3 -0,4 ++ -0,4 #153 16 15 1,5 n.d. n.d. 40% 24% y #154 16 15 n.e n.d. n.d. 22% 21% y #155 16 16 7,8 n.d. n.d. 57% 17% -1,3 -0,7 ++ -0,7 #156 17 16 2,0 64 98 57% 33% -1,3 ++ #157 17 16 2,4 n.d. n.d. 23% 11% y #158 17 16 10,0 n.d. n.d. n.a. -0,6 ++ #159 17 16 4,9 n.d. n.d. 55% 22% -1,3 ++ #160 17 16 2,8 n.d. n.d. 34% 22% y #161 17 16 4,9 n.d. n.d. 34% 9% -0,7 ++ #162 17 16 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #163 17 17 n.d. 84 85 n.d. 0,6 ++ 0,6 #164 18 16 3,0 n.d. n.d. n.a. -0,8 -0,1 ++ -0,1 #165 18 17 3,5 n.d. n.d. 53% 28% y #166 18 17 4,1 n.d. n.d. 20% 34% y #167 18 17 n.e 48 n.d. 44% 13% y #168 18 17 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #169 19 17 2,8 78 99 20% 16% -0,1 -0,1 ++ -0,1 #170 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #171 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #172 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #173 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #174 19 19 n.d. 73 n.d. n.d. 1,3 + 1,3 #175 19 19 n.d. 105 82 n.d. 0,3 0,1 ++ 0,2 #176 20 19 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #177 2 2 41,0 262 100 n.a. n.a. n.a. - n.a. #178 14 9 16,0 n.d. n.d. 67% 33% y #179 16 10 51,0 n.d. n.d. n.a. - #180 16 11 18,0 n.d. n.d. 37% 6% y #181 16 13 21,0 n.d. n.d. 79% 7% y #182 17 11 2,5 n.d. n.d. 73% 19% y #183 18 12 36,0 n.d. n.d. 21% 16% y #184 18 13 10,0 100 100 50% 3% y #185 18 13 17,0 81 100 72% 1% y #186 18 14 20,0 77 96 45% 22% y #187 19 13 35,0 217 95 85% 10% -1,1 +++ -1,1 #188 19 14 15,0 n.d. n.d. 77% 8% y #189 19 14 16,0 102 99 59% 4% y #190 19 14 41,0 n.d. n.d. 64% 13% y #191 19 14 29,0 248 99 94% 8% 0,1 -0,6 0,2 -0,3 ++ -0,2 #192 19 15 70,0 n.d. n.d. 90% 14% -1,0 -1,0 +++ -1,0 #193 20 14 2,7 n.d. n.d. 33% 37% y #194 20 14 32,0 98 97 75% 3% y #195 20 14 20,0 43 97 34% 12% y #196 20 15 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #197 20 15 5,5 18 n.d. 54% 20% y #198 20 15 14,0 57 100 52% 21% y #199 21 15 7,3 n.d. n.d. 29% 12% y #200 21 15 33,0 97 n.d. 78% 7% y #201 21 15 51,0 134 97 87% 6% -0,3 0,1 -0,3 ++ -0,1 #202 21 15 16,0 29 n.d. 58% 3% y #203 21 16 3,1 17 n.d. 33% 2% y #204 22 17 5,7 20 n.d. 45% 17% y #205 23 17 34,0 n.d. n.d. 84% 19% y #206 24 18 11,0 n.d. n.d. 47% 33% y #207 24 20 12,0 115 95 59% 17% n.a. n.a. - n.a. #208 24 20 9,5 182 92 74% 11% 0,6 0,3 ++ 0,5 #209 na na 18,3 402 100 n.a. -