Питательная среда для культивирования почвенных микроорганизмов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно, к получению твердой питательной среды для выделения некультивируемого или не известного ранее микроорганизма из образца почвы.

Существует большое разнообразие питательных основ для выделения микроорганизмов из почвы. Для повышения разнообразия и числа КОЕ культивируемой части почвенного микробиома часто прибегают к изменению состава компонентов питательных сред или к модификации технологии культивирования. Одним из наиболее значимых компонентов, влияющих на культивируемость почвенных микроорганизмов, является желирующий агент в среде. В абсолютном большинстве случаев используют агар-агар вследствие его невысокой стоимости, относительной биологической инертности и простоты в приготовлении твёрдых сред. Несмотря на это, агар-агар имеет свои недостатки, такие как наличие примесных соединений, снижающих прозрачность образуемого геля [1], а также токсичность в отношении некоторых групп микроорганизмов [2, 3].

Поскольку неизвестно, как много таксономических или физиологических групп прокариот не способно расти в присутствии агар-агара, активно обсуждается вопрос о применении других образующих гели полисахаридов, таких как каррагиннан, изубгол и различные виды камеди [2]. Одним из наиболее перспективных заменителей агар-агара является геллановая камедь (gellan gum), представляющая собой смесь олигосахаридов, продуцируемых некоторыми видами рода бактерий Sphingomonas. Геллановая камедь формирует плотные прозрачные гели, потенциально менее токсична и позволяет культивировать термофильные виды прокариот вследствие высокой температуры плавления (~110°C).

В патенте на «Increased Efficiency and Diversity of Microbes Cultured from Environmental Samples» (EP 3436597 А1, МПК: C12N1/20; C12Q1/04, опубл. 2019-02-06.) [4] описаны методы выделения микробов из проб окружающей среды с использованием питательной среды, содержащей гуминовую кислоту, стимулирующую переход от некультивируемого в культивируемое состояние и родственные вещества. В одном примере выделенные микробы ранее не культивировались или ранее не были известны. Микроорганизмы, выделенные с помощью гуминовой кислоты, впоследствии можно культивировать на средах, не содержащих гуминовую кислоту.

Недостатком известного состава питательной среды является токсичность агар-агара для некоторых некультивируемых микроорганизмов, кроме того, не все почвенные микроорганизмы могут быть выведены из некультивируемого состояния добавлением гуматов.

Известна композиция твердой питательной среды - Solid nutrient media useful for isolating and identifying alkaliphilic bacteria (US8097447 (B2) МПК: C12N1/20; C12Q1/00; C12Q1/04, опубл. 12-01-17) [5], которая имеет щелочной pH, оптимальный для выделения и идентификации алкалофильных микроорганизмов. Состав среды состоит из 5-15 г источника углерода, 2,5-10 г пептона, 2,5-10 г дрожжевого экстракта, 0,5-1,5 г дикалий гидрофосфата. В одном литре дистиллированной воды содержится 0,1-0,5 г гептагидрата сернокислого магния, 30 мкл^-4 мл перенасыщенного раствора гидроксида натрия, 5-20 г хлорида калия и 10-30 г κ-каррагинана. Было обнаружено, что калиевая соль в сочетании с κ-каррагинаном в определенной пропорции является подходящей заменой агара для выделения и повышения биоразнообразия культивируемых алкалофильных бактерий. Питательную среду с высоким pH готовят с использованием каррагинана в качестве стабильного в таких условиях гелеобразователя. Известный состав является эффективным для выращивания бактерий-алкалифилов, но не является универсальным для культивирования микробного разнообразия объектов окружающей среды, таких как почва, оптимальными условиями которого, как правило, является нейтральный pH.

Известна жидкая микробиологическая питательная среда (RU2592682, МПК C12Q 1/04 (2006.01), C12N 1/00 (2006.01), опубликовано: 27.07.2016) [6], содержащая от 10 до 20 массовых частей дрожжевого экстракта, от 15 до 30 массовых частей пептона, от 35 до 75 массовых частей моносахаридов и дисахаридов, до 3 массовых частей минеральных веществ, 0,02 на 1 весовую часть геллановой камеди и воду. Среда предлагается к использованию в полужидком виде для проведения глубинных посевов и определения степени микробной контаминации. Недостатком данной среды для целей повышения культивируемого микробного биоразнообразия является высокое содержание питательных веществ и полужидкое агрегатное состояние.

Наиболее близкой к заявляемому составу является питательная среда Агар для подсчёта микроорганизмов в воде «R2A agar» (Merck 1.00416.0500) [7], принимаемая за прототип заявляемого изобретения, которая содержит при рН (25°С) 7,0-7,4:

протеозопептон 0,5 г/л

казеиновый гидролизат 0,5 г/л

глюкоза 0,5 г/л

крахмал растворимый 0,5 г/л

натрия пируват 0,3 г/л

дигидроортофосфат калия 0,3 г/л

магния сульфат безводный 0,024 г/л

агар-агар 15 г/л

Недостатком прототипа с точки зрения культивирования почвенной микробиоты является относительно высокое содержание питательных веществ и использование агар-агара в качестве желирующего агента.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническим результатом, достигаемым использованием заявляемой питательной среды, является увеличение числа КОЕ бактерий, растущих на твердых питательных средах при посеве почвенных образцов путем имитации олиготрофных почвенных условий за счет экстремально низкого содержания основных источников углерода: глюкозы, крахмала, пептона и дрожжевого экстракта, обеспечения дополнительного фактора роста для ауксотрофных микроорганизмов за счет введения казаминовых кислот, уменьшение токсичности, увеличение прозрачности при формировании плотного геля и уменьшения меньшее содержание примесных соединений за счет использования геллановой камеди.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда для культивирования почвенных микроорганизмов содержит желирующий агент, глюкозу, пируват натрия, сульфат магния MgSO₄ дигидроортофосфат калия K₂HPO, крахмал растворимый и соединение казамина.

Согласно изобретения, питательная среда содержит дополнительно дрожжевой экстракт, в качестве желирующего агента геллановую камедь, а в качестве соединения казамина - казаминовые кислоты при следующем соотношении исходных компонентов, г/л:

геллановая камедь - 20

дрожжевой экстракт - 0,005

казаминовые кислоты - 0,005

глюкоза - 0,005

крахмал растворимый - 0,005

K₂HPO₄ - 0, 3

пируват натрия - 0,003

пептон - 0,0025

MgSO4 - 0,024

Глюкоза, крахмал, пептон и дрожжевой экстракт являются основными источниками углерода. В предлагаемом составе они взяты в экстремально низких концентрациях (в 100 раз меньше в сравнении с прототипом) с целью имитации олиготрофных почвенных условий. Пируват натрия добавляется как дополнительный источник энергии, также в 100 раз меньше в сравнении с прототипом. Дополнительно вносится 0,005 г/л казаминовых кислот, присутствие которых в среде является дополнительным фактором роста для ауксотрофных (неспособность синтезировать факторы роста, такие как аминокислоты и витамины) микроорганизмов. Содержание минеральных солей не изменено в сравнении с прототипом. Агар-агар заменяется на геллановую камедь, которая является бактериальным, а не альгинатным полимером и имеет ряд преимуществ: меньшую токсичность, большую прозрачность при формировании плотного геля, меньшее содержание примесных соединений.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Достижение нового технического результата поясняется примерами выполнения составов питательной среды.

Чтобы оценить влияние геллановой камеди в качестве желирующего агента четыре вида питательных сред были приготовлены на основе агар-агара и на основе камеди, после чего на них производился высев почвенного разведения (порядка 10^-4), инкубация при t=25°C и учёт КОЕ на 10 сутки. Было использовано 3 олиготрофных питательных среды и 1 копиотрофная (с низким и высоким содержанием питательных веществ соответственно). В качестве олиготрофных питательных сред (сред с низким содержанием источников углерода) использовалась модифицированная среда R2A [7], модифицированная как описано (далее - R2A/100), среда на основе почвенного экстракта, «голодная среда» (среда без добавления питательных веществ). В качестве копиотрофной среды - среда на основе солодового экстракта [8] (далее - ME). Почва, из которой производился высев, была представлена чернозёмом южным. После учёта проводились оценка нормальности распределения и проверка значимости различий между группами соответствующим статистическим тестом в программном обеспечении R (v. 4.3.1).

Пример 1. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе геллановой камеди была приготовлена среда R2A, разбавленная в 100 раз (г/л):

геллановая камедь - 20

дрожжевой экстракт - 0,005

кеазаминовые кислоты - 0,005

глюкоза - 0,005.

растворимый крахмал - 0,005

K₂HPO₄ - 0, 3.

пируват натрия - 0,003

пептон - 0,0025

MgSO₄ - 0,024

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 2. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе геллановой камеди была приготовлена среда на основе почвенного экстракта, (г/л):

геллановая камедь - 20 г.

водный экстракт из почвенного материала (соотношение почвы к воде 1:100) - 1 литр.

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 3. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе геллановой камеди была приготовлена питательная среда на основе солодового экстракта, (г/л):

геллановая камедь - 20

солодовый экстракт - 1

дрожжевой экстракт - 0,4

глюкоза - 0,4.

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 4. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе агар-агара была приготовлена среда R2A, разбавленная в 100 раз (г/л):

агар-агар - 20

дрожжевой экстракт - 0,005

казаминовые кислоты - 0,005

глюкоза - 0,005

растворимый крахмал - 0,005

K₂HPO₄ - 0, 3

пируват натрия - 0,003

пептон - 0,0025

MgSO4 - 0,024

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 5. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе агар-агара была приготовлена среда на основе почвенного экстракта (г/л):

агар-агар - 20

водный экстракт из почвенного материала (соотношение почвы к воде 1:100) - 1 литр

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 6. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе агар-агара была приготовлена питательная среда на основе солодового экстракта, (г/л):

агар-агар - 20

солодовый экстракт - 1

дрожжевой экстракт - 0,4

глюкоза - 0,4

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 7. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе геллановой камеди была приготовлена питательная среда следующего состава (г/л):

геллановая камедь - 20

K₂HPO₄ - 0,3

MgSO₄ - 0,024

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Пример 8. Для оценки влияния желирующего агента на высеваемость почвенных микроорганизмов на основе агар-агара была приготовлена питательная среда следующего состава (г/л):

агар-агар - 20.

K₂HPO₄ - 0,3.

MgSO₄ - 0,024.

pH 7.2 ± 0.2 при t=25°C

Для посева использовалось разведение почвенного материала порядка 10^-4. Инкубация проводилась 10 суток при t=25°C, после чего производился учёт КОЕ. Показатели представлены в таблице 1.

Таблица 1. Число КОЕ на восьми вариантах питательных сред.

Примеры КОЕ R2A/100 + камедь 73,5 ± 7 SA + камедь 53 ± 5 ME + камедь 213 ± 16 Камедь 63 ± 2 R2A/100 + агар-агар 44,5 ± 15 SA + агар-агар 48 ± 7 ME + агар-агар 184 ± 23 Агар-агар 45 ± 10

Как следует из представленных выше данных, использование геллановой камеди в качестве альтернативы агар-агару в комбинации с олиготрофной питательной основой R2A/100 позволяет добиться значимого прироста КОЕ при посеве одного и того же материала. Следует отметить, что наблюдаемый эффект сохраняется на питательной среде общего назначения (среда МЕ) с большой концентрацией питательных веществ; это исключает потенциальную возможность того, что эффект вызван использованием микроорганизмами олигосахаридов в составе геллановой камеди в качестве источника углерода. На «голодных» питательных средах также наблюдается значимо меньшее число КОЕ, чем на соответствующих вариантах с низкой концентрацией питательных веществ (R2A, SA).

Для сравнения геллановой камеди и агара не только по количеству колоний, способных вырасти на соответствующих гелях, но и по таксономическому разнообразию микробиома, биомасса с 15 чашек сред R2A/100+камедь и R2A/100+агар-агар соответственно была смыта и использована для экстракции и секвенирования ДНК. Секвенировались все копии гена 16S рРНК. ДНК экстрагировалось набором FastDNA SPIN Kit for Soil. Метагеномные библиотеки были подготовлены в соответствии с протоколом "Preparation of 16S rRNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System". Амплификации подвергался регион V3-V4 гена 16S рРНК с использованием следующих прокариотных праймеров: прямой - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG; обратный - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGATACAGGTATCACCHG. Секвенирование проводилось на платформе MiSeq (Illumina) с реагентами v3 (600 циклов) в центре коллективного пользования КФУ. Контроль качества и удаление химер проводились с помощью программ FastQC, trimmomatic и vsearch. Классификация последовательностей проводилась с помощью kraken2 на базу гена 16S рРНК генов «SILVA».

Данные о содержании уникальных родов и индексы биоразнообразия представлены в таблице 2.

Таблица 2. Показатели разнообразия культуромов, выросших на средах с разными желирующими агентами.

Показатель R2A+камедь R2A+агар-агар Число родов 219 199 Число семейств 96 99 Число прочтений, классифицированных как «Uncultured» на уровне рода 1008 727 Среднее фиологенетическое разнообразие (ФР) 4,5 4,2 Индекс Шэннона 3,04 3,27 Индекс Пиелу 0,56 0,61

Число уникальных родов и число прочтений, которые не удалось классифицировать, выше в варианте с геллановой камедью, а число семейств ниже. При этом индексы Шэннона и Пиелу выше в варианте с агар-агаром. Из этого следует, что в культуроме агар-агара присутствует большее разнообразие уникальных (Индекс Шэннона 3,27 > 3,04), но филогенетически близких таксонов (ФР 4,2 < 4,5), которые представлены более равномерно (Индекс Пиелу 0,61 > 0,56), чем таксоны в культуроме среды на основе камеди. Действительно, анализ уникальных для двух вариантов опыта семейств прокариот показывает, что в культуроме камеди доминируют отдельные филогенетически далёкие от типичных культивируемых таксонов микроорганизмы (таблица 3). Уникальные для культурома агар-агара семейства укладываются в филумы, которые чаще всего высеваются из почв в лабораторных условиях: Pseudomonadota, Actinomycetota и Bacteroidota.

Таблица 3. Уникальные семейства и соответствующие бактериальные филумы для двух вариантов опыта.

Вариант Филум Семейство Число прочтений Камедь Chloroflexota JG30-KF-CM45 440 Камедь Deinococcota Deinococcaceae 59 Камедь Planctomycetota Isosphaeraceae 30 Камедь Actinomycetota Ilumatobacteraceae 27 Камедь Solirubrobacterales family 67-14 12 Агар-агар Bacteroidota Sphingobacteriaceae 159 Агар-агар Actinomycetota Beutenbergiaceae 43 Агар-агар Pseudomonadota Methylopilaceae 11

В варианте с камедью, однако, наблюдаются филумы Chloroflexota и Planctomycetota, которые, хотя и в большом количестве присутствуют в почвах, редко культивируются в лабораторных условиях. Наибольшее количество наблюдалось для семейства JG30-KF-CM45, представители которого не наблюдались в чистых культурах. Интересно, что ранее представленность данного семейства удавалось связать с активностью почвенных ферментов [9] и накоплением органического углерода [10]. Представители семейства Isosphaeraceae также являются обитателями почв [11] и не обнаружились на агаровой среде в данной работе. Наконец, представителей порядка Solirubrobacterales ранее уже удавалось выделить как на олиготрофных средах, так и на средах с добавлением супероксиддисмутазы [12]. Последнее особенно важно с учетом того, что автоклавирование агаровых сред с фосфатами генерирует активные формы кислорода [3]. Наша работа дополнительно подтверждает возможность выделения бактерий этой группы в предлагаемых условиях, что связано с созданием нами олиготрофных условий и использованием геллановой камеди вместо агара.

Таким образом, применение данной среды позволит выделять из почвы микроорганизмы, ранее считавшиеся некультивируемыми, и тем самым значительно расширять область скрининга бактерий с необходимыми функциями. Полученные микроорганизмы могут обладать качествами, не представленными у известных групп почвенных микроорганизмов, либо значительнее выраженными. Питательная среда подходит для поиска новых групп микроорганизмов для используемых в различных областях хозяйственной деятельности, в частности для поиска микроорганизмов, обладающей антимикробной активностью, разработки биологически безопасных методов борьбы, органических удобрений, поиска микроорганизмов, способных вступать в симбиотические отношения с хозяйственно-значимыми растениями, фунгицидов, регуляторов роста растений, антибиотиков и др. применений.

Источники информации:

1. Das N. et al. Progress in the development of gelling agents for improved culturability of microorganisms // Frontiers in microbiology. - 2015. - V. 6. - P. 698; p. 2.

2. Klein T. et al. Cultivation of ammonia-oxidizing archaea on solid medium // FEMS Microbiology Letters. - 2022. - V. 369. - №. 1. - P. fnac029.

3. Tanaka T. et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability // Applied and environmental microbiology. - 2014. - V. 80. - №. 24. - P. 7659-7666, p. 13.

4. EP 3436597 А1, МПК: C12N1/20; C12Q1/04, опубл. 2019-02-06.

5. US8097447 (B2), МПК: C12N1/20; C12Q1/00; C12Q1/04, опубл. 12-01-17.

6. RU2592682, МПК: C12Q 1/04 (2006.01), C12N 1/00 (2006.01), опубликовано: 27.07.2016.

7. Atlas R. M. Handbook of microbiological media (4th. ed.). - CRC press. - 2010. - P. 1472. - прототип.

8. Atlas R. M. Handbook of microbiological media (4th. ed.). - CRC press. - 2010. - P. 1001.

9. Yang S. et al. Response of soil biological properties and bacterial diversity to different levels of nitrogen application in sugarcane fields //AMB Express. - 2021. - Т. 11. - №. 1. - С. 172.

10. Zheng F. et al. Linking soil microbial community traits and organic carbon accumulation rate under long-term conservation tillage practices //Soil and Tillage Research. - 2022. - Т. 220. - С. 105360; p. 5.

11. Dedysh S. N., Ivanova A. A. Isosphaeraceae // Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. - 2015. - С. 1-5; p. 1.

12. Seki T. et al. Distribution and isolation of strains belonging to the order Solirubrobacterales // The Journal of Antibiotics. - 2015. - Т. 68. - №. 12. - С. 763-766; p. 765.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению твердой питательной среды для выделения некультивируемого или не известного ранее микроорганизма из образца почвы. Питательная среда содержит, г/л: геллановую камедь – 20, дрожжевой экстракт – 0,005, казаминовую кислоту – 0,005, глюкозу – 0,005, крахмал растворимый – 0,005, K₂HPO₄ – 0,3, пируват натрия – 0,003, пептон – 0,0025, MgSO₄ – 0,024. Изобретение позволяет увеличить число КОЕ бактерий, растущих на твердых питательных средах при посеве почвенных образцов, путем имитации олиготрофных почвенных условий за счет экстремально низкого содержания основных источников углерода: глюкозы, крахмала, пептона и дрожжевого экстракта, обеспечения роста для ауксотрофных микроорганизмов за счет введения казаминовых кислот, уменьшения токсичности, увеличения прозрачности при формировании плотного геля и уменьшения содержания примесных соединений за счет использования геллановой камеди. 3 табл., 8 пр.

Питательная среда для культивирования почвенных микроорганизмов, включающая желирующий агент, глюкозу, пируват натрия, сульфат магния MgSO₄, дигидроортофосфат калия K₂HPO₄, крахмал растворимый и соединение казамина, отличающаяся тем, что она содержит дополнительно дрожжевой экстракт, в качестве желирующего агента геллановую камедь, а в качестве соединения казамина - казаминовые кислоты, при следующем содержании исходных компонентов, г/л: геллановая камедь – 20, дрожжевой экстракт – 0,005, казаминовая кислота – 0,005, глюкоза – 0,005, крахмал растворимый – 0,005, K₂HPO₄ – 0,3, пируват натрия – 0,003, пептон – 0,0025, MgSO₄ – 0,024.