Способ идентификации значимых для сельского хозяйства грибов рода Trichoderma - T. harzianum, T. viride и T. atroviride на основе ПЦР-ПДРФ Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к молекулярно-генетическим методам идентификации представителей рода Trichoderma, таких как Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride и может быть использовано при определении этих грибов в составе коммерческих биопрепаратов. Грибы этого рода часто используются в качестве средств биологической защиты сельскохозяйственных растений. Важным является корректная таксономическая идентификация представителей данного рода, поскольку они могут иметь различную ценность и предназначение.

Представители рода Trichoderma имеют широкий спектр применения в сельском хозяйстве. Например, T. harzianum угнетает возбудителей корневых гнилей, Т. viride используют при производстве биологических пестицидов (Гупта В.К., Шмолл М., Эррера-Эстрелла А., Упадхьяй Р.С., Дружинина И., Туохи М.Г. 2014. Биотехнология и биология Trichoderma). Т. viride и Т. atroviride являются агентами биологической защиты растений (Шмолл М., Зайбот Б., Дружинина И., Кубичек СП. 2014).

Дифференциация конкретного представителя грибов рода Trichoderma является важным для сельского хозяйства, поскольку многое зависит от метаболической активности конкретного вида гриба, типа его взаимодействия с растениями и другими микроорганизмами. Данный род грибов имеет широкий спектр воздействия как на подземный микробном, так и на процессы колонизации ризосферы корня растений.

Известно изобретение «Идентификация дрожжеподобного гриба Candida auris» (патент 2791966 от 15.03.2023), который включает посев культуры на питательную среду и инкубацию при 37°С. Недостатком этого способа является длительность анализа и невозможность идентифицировать грибы рода Trichoderma.

Известен способ идентификации гриба Heterobasidion annosum (патент 2735911 от 10.11.2020). Изобретение представляет собой способ идентификации гриба Heterobasidion annosum, на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции) в реальном времени, включающий выделение ДНК из растительного субстрата или мицелия гриба и проведение амплификации ПЦР в реальном времени. Недостатком этого способа является невозможность идентифицировать грибы рода Trichoderma.

Известно изобретение «Определение грибковых патогенов с использованием реакций полимеризации цепи» (патент 2161196 от 27.12.2000), взятое за прототип. Способ основан на идентификации грибов методом ПЦР с визуализацией амплифицированных участков. Недостатком этого способа является невозможность идентифицировать грибы рода Trichoderma.

Задачей настоящего изобретения является разработка молекулярно-генетического метода идентификации потенциальных агентов биологической защиты сельскохозяйственных культур Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride.

Существенным преимуществом молекулярно-генетического метода идентификации грибов является точность, скорость и большая эффективность определения представителя рода гриба, в сравнении с морфологическим методом детекции, который осуществим только в присутствии высококвалифицированного специалиста.

Был разработан метод дифференциации грибов рода Trichoderma на основе ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции - полиморфизма длин рестрикционных фрагментов). Проведение анализа этим методом осуществляется путем расщепления эндонуклеазой рестрикции амплифицированного с помощью ПЦР участка ДНК с последующим анализом размера образующихся фрагментов с помощью гель-электрофореза.

Для анализа использовался участок, который амплифицируют праймеры ITS1 и ITS4. С целью выявления рестриктаз, способных формировать длины рестрикционных фрагментов, специфичных для каждого из видов Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride, был произведен биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей. Рестриктаза Bam HI формирует специфические фрагменты для каждого из исследуемых эукариотических микроорганизмов (Т. harzianum, Т. viride и T. atroviride) при проведении ПЦР-ПДРФ.

Технический результат - проведение идентификации грибов видов T. harzianum, T. viride и T. atroviride, без привлечения специалистов в области микробиологии стандартизированными методами молекулярной генетики, с возможностью проведения идентификационных процедур в течение 4,5-6 часов.

Технический результат достигается тем, что в способе идентификации значимых для сельского хозяйства грибов рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride на основе ПЦР-ПДРФ, включающем выделение ДНК из предварительно собранного биологического материала, последующее проведение ПЦР, рестрикцию продуктов ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле, согласно изобретению, ПЦР проводят с помощью праймеров: прямой ITS1, SEQ ID NO: 1 и обратный ITS4, SEQ ID NO: 2 согласно Перечню последовательностей, для идентификации при рестрикционном анализе используют рестриктазу Bam HI, образующую уникальные фрагменты рестрикции для трех грибов рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride, где наличие фрагментов ДНК длиной 430 п.н. и 178 п.н. указывает на принадлежность к виду грибов Т. atroviride, длиной 520 п.н. и 119 п.н. - на принадлежность к виду грибов Т. viride, длиной 620 п.н. - на принадлежность к виду грибов - Т. harzianum.

Способ идентификации грибов рода Trichoderma на основе рестрикционного анализа предварительно амплифицированного участка ДНК грибов реализуется следующим образом:

1. Отбирают нуждающиеся в идентификации микробиологические монопрепараты, содержащие предположительно грибы рода Trichoderma.

2. Производится выделение ДНК из полученных образцов, выделение ДНК можно проводить как с помощью коммерческих наборов отечественных и зарубежных производителей ("ДНК-технологии", "Синтол", "Zymo research", БиоСилика и др.), так и общепринятыми методами (фенол-хлороформная экстракция, ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид)-метод).

3. Проводится ПЦР. Используют следующие температурные циклы: 95°С 2 мин, далее 30 циклов вида: 95°С 30 сек - денатурация, 54°С 30 сек - отжиг праймеров, 72°С 45 сек - элонгация. После чего проводят инкубирование смеси - 72°С в течение 5 мин. В качестве праймеров для амплификации используются: прямой ITS1 (SEQ ID NO: 1) TCCGTAGGTGAACCTGCGG, обратный ITS4 (SEQ ID NO: 2) TCCTCCGCTTATTGATATGC.

4. Продукты ПЦР подвергают рестрикции по следующей схеме: в пробирке на 0,2 мл смешивают 10 мкл ПЦР продукта, 1,5 мкл 10Х реакционного буфера, 10 ед. рестриктазы. Объем доводят до 15 мкл деионизированной водой. Смесь инкубируют в течение 2 часов при 37°С, после чего фермент инактивируют нагревом до 65°С в течение 20 мин. После чего проводят анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликона. Результаты рестрикционного анализа фиксируются с помощью метода электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве рестриктазы используют Bam HI. Фермент рестрикции образует уникальные фрагменты для трех представителей рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride (фиг. 1).

На фиг. 1 приведена электрофореграмма продуктов рестрикции предварительно амплифицированных с помощью праймеров ITS1 (SEQ ID NO: 1) и ITS4 (SEQ ID NO: 2) продуктов ПЦР.

Пример 1

На электрофореграмме: Т.а. - участок ДНК грибов Т. artroviride из биопрепарата №1; Т.v. - участок ДНК грибов T. viride из биопрепарата №2; T.h. - участок ДНК грибов Т. harzianum из биопрепарата №3; K - продукт ПЦР до рестрикции; R - продукт ПЦР после рестрикции рестриктазой Bam HI; М - маркеры известной длины, значения выражены в пар нуклеотидов (п.н.).

При обработке рестриктазой Bam HI продукта ПЦР образцов ДНК, изолированных из T. harzianum, T. viride и T. atroviride, образовались фрагменты длиной 430 п.н. и 178 п.н. для T. atroviride, 520 п.н. и 119 п.н. для T. viride и наличие одного продукта размером 620 п.н. для T. harzianum. Следовательно, в биопрепарате №1 содержатся грибы T. harzianum, биопрепарате №2 грибы Т. viride и биопрепарате №3 грибы T. atroviride.

Предлагаемый способ идентификации значимых для сельского хозяйства представителей рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride на основе рестрикционного анализа амплифицированного отрезка ДНК является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым, универсальным для хозяйственно значимых грибов рода Trichoderma и экономичным. В зависимости от способа выделения ДНК из биологических образцов анализ занимает от 4,5 до 6 часов. Анализ можно проводить в лабораториях, имеющих термоциклер, центрифугу, камеру для электрофореза и сопутствующие реактивы и расходные материалы.

--->

Перечень последовательностей

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ

идентификации значимых для сельского хозяйства грибов рода

Trichoderma – T. harzianum, T. viride и T. atroviride на основе

ПЦР-ПДРФ.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-07-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>17/23</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-03</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

&quot;Воронежский государственный университет&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal&apos;noe gosudarstvennoe byudjetnoe

obrazovatel&apos;noe uchrejdenie vysshego obrazovaniya

&quot;Voronejskii gosudarstvennyi

universitet&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Сыромятников Михаил

Юрьевич</InventorName>

<InventorNameLatin>Syromyatnikov Mihail

YUr&apos;evich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ идентификации значимых для

сельского хозяйства грибов рода Trichderma - T. harzianum, T. viride

и T. atroviride на основе ПЦР-ПДРФ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Trichoderma spp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcctccgcttattgatatgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Trichoderma spp.</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccgtaggtgaacctgcgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области микробиологии. Описан способ молекулярно-генетической идентификации представителей рода Trichoderma, таких как Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride. Выделяют ДНК из предварительно собранного биологического материала. Проводят ПЦР, рестрикцию продуктов ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ампликона, проводят электрофорез в агарозном геле. При этом ПЦР проводят с помощью праймеров: прямой ITS1 SEQ ID NO: 1 и обратный ITS4 SEQ ID NO: 2. Для идентификации при рестрикционном анализе используют рестриктазу Bam HI, образующую уникальные фрагменты рестрикции для трех грибов рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride, где наличие фрагментов ДНК длиной 430 п.н. и 178 п.н. указывает на принадлежность к виду грибов Т. atroviride, длиной 520 п.н. и 119 п.н. - на принадлежность к виду грибов Т. viride, длиной 620 п.н. - на принадлежность к виду грибов - Т. harzianum. Технический результат - проведение идентификации грибов видов Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride без привлечения специалистов в области микробиологии стандартизированными методами молекулярной генетики, с возможностью проведения идентификационных процедур в течение 4,5-6 часов. 1 ил., 1 пр.

Способ идентификации грибов рода Trichoderma - Т. harzianum, Т. viride и Т. atroviride на основе ПЦР-ПДРФ, включающий выделение ДНК из биологического материала, проведение ПЦР, рестрикцию продуктов ПЦР, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что ПЦР проводят с помощью праймеров: прямой ITS1, SEQ ID NO: 1 и обратный ITS4, SEQ ID NO: 2, а также используют рестриктазу Bam HI, где наличие фрагментов ДНК длиной 430 п.н. и 178 п.н. указывает на принадлежность к виду грибов Т. atroviride, длиной 520 п.н. и 119 п.н. - на принадлежность к виду грибов Т. viride, длиной 620 п.н. - на принадлежность к виду грибов - Т. harzianum.