ПРИМЕНЕНИЕ СЕСКВИТЕРПЕНОВОГО ЛАКТОННОГО СОЕДИНЕНИЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ВЫЗВАННЫХ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/365 A61P39/00 A61P35/04 

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предшествующей заявке на патент №202011149717.4, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 23 октября 2020 года и озаглавленной «ПРИМЕНЕНИЕ СЕСКВИТЕРПЕНОВОГО ЛАКТОННОГО СОЕДИНЕНИЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ВЫЗВАННЫХ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ», и согласно заявке на патент №202111084087.1, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 14 сентября 2021 года и озаглавленной «ПРИМЕНЕНИЕ СЕСКВИТЕРПЕНОВОГО ЛАКТОННОГО СОЕДИНЕНИЯ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ОБЛЕГЧЕНИЯ ВЫЗВАННЫХ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ», которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов для лучевой терапии опухолей и, в частности, относится к применению сесквитерпенового лактонного соединения для получения лекарственного средства для облегчения вызванных лучевой терапией повреждений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Лучевая терапия опухоли (сокращенно лучевая терапия) представляет собой лечение рака облучением. Лучевая терапия разрабатывается уже более века. Рентгеновские лучи и радий применяли для клинического лечения злокачественных опухолей вскоре после того, как они были открыты Рентгеном и мадам Кюри, соответственно. До сих пор лучевая терапия остается важным местным методом лечения злокачественных опухолей. В настоящее время около 70% онкологических больных нуждаются в лучевой терапии в процессе лечения рака, и около 40% онкологических заболеваний можно вылечить с помощью лучевой терапии. Роль и статус лучевой терапии в лечении опухолей становятся все более заметными, а лучевая терапия стала одним из основных средств лечения злокачественных опухолей.

Однако в процессе клинической лучевой терапии лучи излучения неизбежно окажут определенное воздействие на нормальные ткани организма человека, тем самым вызывая определенные радиационные реакции и повреждения. Нормальные тканевые реакции, вызванные радиацией, обычно делятся на ранние первичные реакции и поздние вторичные реакции. Ранняя радиационная реакция обычно относится к повреждению самих тканевых клеток, вызванному излучением и, возможно, сопутствующему воспалению, такому как местное покраснение и отек слизистой оболочки, боль, нагноение, псевдомембранообразование и тому подобное, вызванные острыми радиационными реакциями слизистой оболочки полости рта и слизистой оболочки носа; острые сухие или влажные радиационные реакции кожи и тому подобное. Поздняя радиационная реакция относится к окклюзии мелких кровеносных сосудов и фиброзу соединительной ткани, вызванным излучением, например, сухость во рту, вызванная гипосекрецией желез, фиброз и сокращение легких, кожи и подкожных тканей и т.п., что влияет на функцию тканей и органов. Тяжелые радиационные повреждения могут привести к лучевой параплегии, некрозу головного мозга, остеонекрозу, некрозу кишечника и тому подобное. Клинические исследования показали, что радиация вызывает в организме некоторые химические реакции: выработку чрезмерно закисленных веществ, накопление в печени, высвобождение свободных радикалов, возникновение аллергических реакций. Эти факторы способствуют таким симптомам, как усталость, потеря аппетита, рвота, тошнота и тому подобное. Эти симптомы обычно появляются через несколько дней после лучевой терапии. Отдельные пациенты чувствительны к радиации, и когда доза облучения составляет всего половину или меньше, у них развивается недомогание и наблюдается снижение лейкоцитов (около или ниже нормальных значений, как показано при обычном обследовании крови). Эти симптомы обычно появляются через 2-3 недели после лучевой терапии и среди них преобладают снижение лейкоцитов и тромбоцитов. Из-за долгосрочной токсичности лучевой терапии, включая возникновение первичных и вторичных опухолей и бесплодия, пациенты, подвергшиеся лучевой терапии, должны быть защищены от побочных действий лучевой терапии, которые могут вызвать дальнейшие повреждения.

Метастатические опухоли головного мозга относятся к опухолевым клеткам, которые метастазируют внутрь черепа из других частей тела. Карциномы, саркомы и меланомы могут метастазировать внутрь черепа. Путь и место метастазирования связаны с локализацией первичной опухоли. Например, рак легких, рак молочной железы и рак кожи в основном метастазируют через кровоток и склонны к образованию нескольких метастатических раковых заболеваний в головном мозге, в то время как карцинома пищеварительного тракта с большей вероятностью метастазирует через лимфатическую систему и распространяется в мозговых оболочках. Метастазы в головной мозг из солидных опухолей являются основной причиной заболеваемости и смертности у онкологических пациентов. Вскрытие показало, что примерно 25% пациентов, которые умирают от опухолей, имеют внутричерепные метастазы. Клинические исследования показали, что у 2/3 пациентов с внутричерепными метастатическими опухолями симптомы развиваются в течение времени их выживания. По мере старения населения, с устойчивым увеличением заболеваемости и небольшим изменением показателей излечения опухоли, будет больше проблем, связанных с внутричерепными метастатическими опухолями.

В настоящее время изучено, что низкая доза яда скорпиона оказывает значительное стимулирующее действие на гемопоэтические клетки костного мозга мышей. Низкая доза полипептида яда скорпиона оказывает наиболее значительное стимулирующее действие на лейкоциты периферической крови и гемопоэтические клетки костного мозга мышей. Профилактика и лечение полипептидом яда скорпиона и ядом скорпиона оказывают значительное стимулирующее действие на восстановление индекса массы селезенки мышей после лучевой терапии. Сделан вывод о том, что полипептид яда скорпиона и яд скорпиона оказывают защитное действие на гемопоэтическую функцию костного мозга мышей после лучевой терапии. Также было изучено, что Beikeneng® может уменьшить миелосупрессию и сердечно-легочные повреждения, вызванные лучевой терапией, особенно у пожилых пациентов, и может активировать коферментную систему человеческого организма для улучшения метаболического уровня организма после проникновения в клетки и играть определенную защитную роль в лучевой терапии. Однако эти два способа не способны ингибировать внутричерепные метастатические опухоли.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Для решения проблем, описанных выше в уровне техники, в настоящем описании предложено применение сесквитерпенового лактонного соединения и стереоизомера, соединения с изотопной меткой, сольвата и полиморфа или фармацевтически приемлемой соли указанного соединения для получения лекарственного средства для облегчения вызванных лучевой терапией повреждений.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, сесквитерпеновое лактонное соединение представляет собой производное микелиолида.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения сесквитерпеновое лактонное соединение имеет следующую структуру:

.

В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, фармацевтически приемлемая соль включает кислотно-аддитивную соль, образованную из сесквитерпенового лактонного соединения и следующих неорганических кислот: например, соляной кислоты, фтороводородной кислоты, бромоводородной кислоты, иодоводородной кислоты, серной кислоты, пиросерной кислоты, фосфорной кислоты или азотной кислоты; или кислотно-аддитивную соль, образованную из сесквитерпенового лактонного соединения и следующих органических кислот: например, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, ацетоуксусной кислоты, пировиноградной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, капроновой кислоты, энантовой кислоты, ундекановой кислоты, лауриновой кислоты, бензойной кислоты, салициловой кислоты, 2-(4-гидроксибензоил)-бензойной кислоты, камфорной кислоты, коричной кислоты, циклопентанпропионовой кислоты, диглюконовой кислоты, 3-гидрокси-2-нафтойной кислоты, никотиновой кислоты, памовой кислоты, пектиновой кислоты, персерной кислоты, 3-фенилпропионовой кислоты, пикриновой кислоты, пивалиновой кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, итаконовой кислоты, сульфаминовой кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, додецилсульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, пара-толуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты, 2-нафталинсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, стеариновой кислоты, молочной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты, адипиновой кислоты, альгиновой кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, D-глюконовой кислоты, миндальной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюкогептоновой кислоты, глицерофосфорной кислоты, аспарагиновой кислоты, сульфосалициловой кислоты, гемисерной кислоты или тиоциановой кислоты. Специалистам в данной области техники будет понятно, что термин «соединение с изотопной меткой» включает, без ограничения, соединения, описанные в настоящем документе, меченые изотопами водорода, углерода, азота, кислорода, фтора, серы и хлора (например, ²Н, ³Н, ¹³С, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ¹⁸F, ³⁵S и ³⁶Cl). Соединение с изотопной меткой, описанное в настоящей заявке, может применяться для определения распределения в ткани соединений и их пролекарств и метаболитов; предпочтительные изотопы для таких определений включают ³Н и ¹⁴С. Кроме того, в некоторых случаях замена относительно тяжелыми изотопами (например, дейтерием (²Н или D)) может приводить к большей метаболической стабильности, что обеспечивает терапевтические преимущества, например, увеличение периода полувыведения in vivo или снижение требований к дозе. Соединение с изотопной меткой, описанное в настоящей заявке, в целом может быть получено путем замены реагента без изотопной метки на реагент с изотопной меткой в соответствии со способом, описанным в настоящей заявке.

Согласно некоторым вариантам реализации, указанное соединение с изотопной меткой содержит дейтерат сесквитерпенового лактонного соединения.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего описания фармацевтически приемлемая соль выбрана из следующей структуры:

.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, лучевая терапия включает лучевую терапию любых опухолей, включая солидные опухоли и метастатические опухоли.

«Солидная опухоль» относится к опухолям и/или метастатическим опухолям (где применимо), отличным от лимфом, таким как опухоли головного мозга или других центральных нервных систем (например, менингиома, энцефалома, опухоль спинного мозга, неврома черепных нервов и опухоли в других местах центральной нервной системы, например, глиобластомы или медуллобластомы); рак головы и/или шеи; опухоль молочной железы; опухоли системы кровообращения (например, опухоли сердца, средостения и плевры и других органов в пределах грудной клетки, гемангиомы и опухоли, связанные с сосудистой тканью); опухоли секреторной системы (например, почек, таза, мочеточника, мочевого пузыря, других и неуточненных мочевых органов); опухоли желудочно-кишечного тракта (например, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, ободочной кишки, ректосигмовидного соединения, прямой кишки, анального отверстия, анального канала) и опухоли печени и внутрипеченочных желчных протоков, желчного пузыря, других и неуточненных участков желчных путей, поджелудочной железы и других органов пищеварения; опухоли головы и шеи; опухоли полости рта (губ, языка, десен, дна рта, неба и других участков полости рта, околоушной железы и других участков слюнной железы, миндалин, ротоглотки, носоглотки, грушевидной пазухи, гипофаринкса и других участков губ, полости рта и глотки); опухоли репродуктивной системы (например, вульвы, влагалища, шейки матки, тела матки, матки, яичника и других участков женских репродуктивных органов, плаценты, полового члена, простаты, яичка и других участков мужских репродуктивных органов); опухоли дыхательных путей (например, носа и среднего уха, околоносовых пазух, гортани, трахеи, бронхов и легких, например, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого); опухоли скелетной системы (например, костного и суставного хряща конечностей, костно-суставного хряща и других участков); опухоли кожи (например, злокачественная меланома кожи, немеланомный рак кожи, базально-клеточный рак кожи, плоскоклеточный рак кожи, мезотелиома, саркома Капоши); и опухоли, затрагивающие другие ткани, включая периферическую и вегетативную нервную систему, соединительные и мягкие ткани, забрюшинное пространство и брюшину, глаза и придатки, щитовидную железу, надпочечники и другие эндокринные железы, и родственные структуры, вторичные и неуточненные злокачественные опухоли лимфатических узлов, вторичные злокачественные опухоли дыхательной и пищеварительной систем, а также вторичные злокачественные опухоли других локализаций.

«Метастатическая опухоль» относится к метастатической опухоли первичного органа или ткани и/или любого другого участка, независимо от местоположения опухоли и/или метастатической опухоли.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, вызванные лучевой терапией повреждения включают различные неблагоприятные побочные действия на организм, вызванные лучевой терапией, в том числе, без ограничения, следующие: (1) повреждения носоглотки, слизистой оболочки полости рта и кожи; (2) повреждения от облучения сердца; (3) лучевая пневмония; (4) лучевые повреждения костного мозга; (5) лучевые повреждения головного мозга, лучевой проктит, повреждения мочевого пузыря и тому подобное.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения лучевые повреждения, вызванные лучевой терапией, представляют собой радиационные повреждения, вызванные лучевой терапией, включая, без ограничения, радиационные повреждения, вызванные рентгеновским излучением, радиационные повреждения, вызванные облучением тяжелыми ионами, и тому подобное. Вызванные рентгеновским излучением повреждения и радиационные повреждения, вызванные облучением тяжелыми ионами, включают радиационные повреждения, вызванные рентгеновским излучением с низкой линейной передачей энергии (Low-LET) или рентгеновским излучением с высокой линейной передачей энергии (High-LET), и радиационные повреждения, вызванные облучением тяжелыми ионами, соответственно.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения, повреждения, вызванные лучевой терапией, представляют собой повреждения, вызванные лучевой терапией метастатических опухолей головного мозга. Следовательно, в настоящем описании предложено применение сесквитерпенового лактонного соединения для получения лекарственного средства для облегчения повреждений, вызванных лучевой терапией метастатической опухоли головного мозга.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено применение сесквитерпенового лактонного соединения для получения лекарственного средства для облегчения повреждений, вызванных лучевой терапией метастатической опухоли головного мозга, путем ингибирования активности пролиферации клеточной линии глиобластомы.

В настоящем изобретении дополнительно предложено применение сесквитерпенового лактонного соединения или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства с защитным действием по отношению к повреждениям, вызванным химиолучевой терапией.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения сесквитерпеновое лактонное соединение и фармацевтически приемлемые вспомогательные материалы входят в состав лекарственного средства.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой жидкий, газообразный, твердый или полутвердый состав.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой инъекционный состав.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения лекарственное средство представляет собой состав для перорального приема.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения состав для перорального приема представляет собой состав капсулы.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения состав для перорального приема представляет собой состав таблетки.

Положительные результаты

(1) В настоящем изобретении установлено, что сесквитерпеновые лактонные соединения, в частности, со структурой АСТ001, могут облегчать вызванные лучевой терапией повреждения и эффективно защищать нормальные клеточные ткани от поражения или повреждения в процессе лучевой терапии.

(2) В настоящем изобретении установлено, что сесквитерпеновые лактонные соединения могут дополнительно облегчать повреждения, вызванные лучевой терапией метастатической опухоли головного мозга, путем ингибирования активности пролиферации клеточной линии глиобластомы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 представлен график, демонстрирующий влияние АСТ001 при различных дозах облучения на выживаемость клеток U118-MG согласно примеру 1 настоящего изобретения;

На фиг. 2 представлен график, демонстрирующий влияние АСТ001 на время выживания мышей, подвергшихся лучевой терапии, согласно примеру 1 настоящего изобретения;

Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий изменение массы тела мышей перед лучевой терапией с АСТ001 согласно примеру 1 настоящего изобретения;

Фиг. 4 представляет собой сравнительный график, демонстрирующий влияние АСТ001 в сочетании с лучевой терапией или без нее на массу тела мышей согласно примеру 1 настоящего изобретения.

На фиг. 5 показан сравнительный график, демонстрирующий влияние АСТ001 в сочетании с лучевой терапией на выживаемость клеток рака легких (Н226) и нормальных клеток эпителия легких (BEAS2B) согласно примеру 1 настоящего изобретения.

На фиг. 6 показано влияние АСТ001 в сочетании с лучевой терапией на выживаемость клеток SY5Y согласно примеру 1 настоящего изобретения.

На фиг. 7 показан апоптоз нейронов мозговой ткани, полученных через 14 дней после лучевой терапии всего мозга (2 Гр×4, разовая доза 4 Гр) мышей BALB/c.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение подробно описано ниже со ссылкой на чертежи, и описание в этом разделе является только иллюстративным и пояснительным и не должно быть истолковано как каким-либо образом ограничивающее объем настоящего изобретения. Кроме того, признаки примеров, описанных в настоящем документе, и различные примеры специалисты в данной области техники соответственно могут комбинировать на основе описания в настоящем документе.

Пример 1

Сесквитерпеновое лактонное соединение, применяемое для получения лекарственного средства для облегчения повреждений, вызванных лучевой терапией метастатической опухоли головного мозга, имеет следующую структурную формулу: , которое также известно как АСТ001, с химическим названием фумарат (3R,3aS,9aR,9fS,9bS)-3-((диметиламино)-метил)-9-гидрокси-6,9-диметил-3,3а,4,5,7,8,9,9а-октагидроазулено[4,5-b]фуран-2(9bH)-она и представляет собой производное микелиолида.

Фармакологический и фармакодинамический эксперимент описан далее:

I. Эксперимент in vitro - антипролиферативная активность АСТ001

1. Цель эксперимента

Исследование влияния АСТ001 при различных дозах облучения на антипролиферативную активность клеточной линии U118-MG

2. Экспериментальные материалы

2.1 Тестируемые клетки

Линия клеток астробластомы головного мозга человека U118-MG, приобретена у банка клеток Китайской академии наук, Шанхайский институт биологических наук

2.2 Экспериментальные приборы и реагенты

3. Методика эксперимента

Культуральная среда для U118-MG представляла собой DMEM, и клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂.

Извлечение клеток U118-MG: криоконсервационную пробирку доставали из жидкого азота, помещали на водяную баню при 37°С для оттаивания криоконсервационного раствора и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надо садочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде и культивировали в условиях 37°С, 5% CO₂.

Когда 70-80% дна культурального сосуда было покрыто клетками, питательную среду отбрасывали путем пипетирования. Клетки промывали 2-3 мл буфера ФСБ и расщепляли 1-2 мл 0,25% панкреатина (достаточно для того, чтобы покрыть дно сосуда). Сразу после того, как клетка стала круглой после культивирования в инкубаторе в течение определенного периода времени, добавляли полную культуральную среду для остановки расщепления, и клеточные суспензии после расщепления объединяли и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде, осторожно пипетировали и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 2500 клеток/лунку, и клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 90 мкл/лунку.

Дозирование проводили на следующий день после высева клеток. Каждый планшет был разделен на холостую группу, отрицательную контрольную группу и 10 групп соединений, с 4-6 дублирующими лунками, установленными для каждой группы. В каждую лунку добавляли 10 мкл соединения. Через 3 ч каждая лунка получала соответствующую дозу облучения. Клетки культивировали при 37°С в течение 24 ч. После этого культуральную среду отбрасывали, добавляли соответствующую свежую культуральную среду и планшет инкубировали в течение 48 ч. В конце инкубации в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 (следя за тем, чтобы в лунках не образовывались пузырьки воздуха, которые бы влияли на показания оптической плотности (ОП)), и планшет инкубировали в инкубаторе в течение 1-4 ч. Значение ОП при 450 нм определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения EXCEL для расчета коэффициентов ингибирования при различных концентрациях, и значения IC50 получали путем статистической обработки SPSS. Среднее и стандартное отклонение значений IC₅₀, полученных троекратно, были рассчитаны с помощью SPSS.

Коэффициент ингибирования %={1-(значение ОП лунки соединения-значение ОП холостой лунки)/(значение ОП контрольной лунки-значение ОП холостой лунки)}×100%

4. Результаты экспериментов

Облучение проводили в Институте радиационной медицины Китайской академии медицинских наук. Результаты показаны ниже.

Как следует из Таблицы 2, с увеличением дозы облучения увеличиваются коэффициенты ингибирования как групп АСТ001 - 0 мкМ, так и групп АСТ001 - 20 мкМ. Когда доза облучения составляла 10 Гр, группа 20 мкМ показала значительное увеличение коэффициента ингибирования по сравнению с группой 0 мкМ, а когда доза облучения составляла 50 Гр, группа 20 мкМ показала очень значительное увеличение коэффициента ингибирования по сравнению с группой 0 мкМ. Как следует из Фиг. 1, АСТ001 - 20 мкМ может значительно усиливать ингибирующий эффект группы облучения на пролиферацию клеток U118-MG.

П. Эксперимент in vitro - влияние АСТ00 1 на нормальные клетки

1. Цель эксперимента

Исследование селективного действия защиты от лучевой терапии АСТ001 на нормальные клетки

2. Экспериментальные материалы

2.1 Тестируемые клетки

Линия клеток плоскоклеточного рака легкого человека Н226 и линия клеток нормального эпителия легкого человека BEAS2B, приобретены у банка клеток Китайской академии наук, Шанхайский институт биологических наук

2.2 Экспериментальные приборы и реагенты

3. Методика эксперимента

Культуральная среда для клеток Н226 и BEAS2B представляла собой DMEM, и клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂.

Извлечение клеток Н226 и BEAS2B: криоконсервационную пробирку доставали из жидкого азота, помещали на водяную баню при 37°С для оттаивания криоконсервационного раствора и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде и культивировали в условиях 37°С, 5% CO₂.

Когда 70-80% дна чашки для культивирования покрывали клетки, питательную среду отбрасывали. Клетки промывали 2-3 мл буфера ФСБ и расщепляли 1 мл 0,25% панкреатина (достаточно того, чтобы покрыть дно колбы). Сразу после того, как клетка стала круглой после культивирования в инкубаторе в течение определенного периода времени, добавляли полную культуральную среду для остановки расщепления, и клеточные суспензии после расщепления объединяли и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде, осторожно пипетировали и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 2500 клеток/лунку, и клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 90 мкл/лунку.

Дозирование проводили через 24 часа после высева клеток. Каждый планшет был разделен на холостую группу, отрицательную контрольную группу и группу введения АСТ001-10 мкМ, с 6 дублирующими лунками, установленными для каждой группы. В каждую лунку добавляли 10 мкл соединения и дозы облучения составляли 0 Гр, 2 Гр, 4 Гр и 6 Гр. Облучение проводили через 1 ч после дозирования, и клетки культивировали в течение 48 ч после облучения. В каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 (следя за тем, чтобы в лунках не образовывались пузырьки воздуха, которые бы влияли на показания ОП), и планшет инкубировали в инкубаторе в течение 1-4 ч. Значение ОП при 450 нм определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

4. Результаты экспериментов

Как следует из Фиг. 5, излучение может индуцировать гибель клеток Н226 и клеток BEAS2B, а АСТ001 может значительно снижать вызванные лучевой терапией повреждения клеток BEAS2B, но не оказывает защитного действия на опухолевые клетки Н226.

III. Эксперимент in vitro - Облегчение лучевых повреждений с помощью АСТ001

1. Цель эксперимента

Исследование облегчающего действия АСТ001 на индуцированную облучением гибель нейронных клеток

2. Экспериментальные материалы

2.1 Тестируемые клетки

Линия клеток нейробластомы человека SY5Y приобретена у Банка клеток Китайской академии наук, Шанхайский институт биологических наук

2.2 Экспериментальные приборы и реагенты

Таблица 4. Экспериментальные приборы и реагенты

3. Методика эксперимента

Культуральная среда для клеток SY5Y представляла собой DMEM, и клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°С с 5% СО₂.

Извлечение клеток SY5Y: криоконсервационную пробирку доставали из жидкого азота, помещали на водяную баню при 37°С для оттаивания криоконсервационного раствора и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде и культивировали в условиях 37°С, 5% CO₂.

Когда 70-80% дна чашки для культивирования покрывали клетки, питательную среду отбрасывали. Клетки промывали 2-3 мл буфера ФСБ и расщепляли 1 мл 0,25% панкреатина (достаточно для того, чтобы покрыть дно колбы). Сразу после того, как клетка стала круглой после культивирования в инкубаторе в течение определенного периода времени, добавляли полную культуральную среду для остановки расщепления, и клеточные суспензии после расщепления объединяли и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, и клетки ресуспендировали в полной культуральной среде, осторожно пипетировали и подсчитывали. Плотность клеток доводили до 2500 клеток/лунку, и клетки высевали в 96-луночный планшет в количестве 90 мкл/лунку.

Дозирование проводили через 24 часа после высева клеток. Каждый планшет был разделен на отрицательную контрольную группу и группы введения АСТ001 в дозах 1,25 мкМ, 2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ, с 6 дублирующими лунками, установленными для каждой группы. В каждую лунку добавляли 10 мкл соединения и дозы облучения составляли 0 Гр, 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр и 10 Гр. Облучение проводили через 1 ч после дозирования, и клетки культивировали в течение 48 ч после облучения. В каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8 (следя за тем, чтобы в лунках не образовывались пузырьки воздуха, которые бы влияли на показания ОП), и планшет инкубировали в инкубаторе в течение 1-4 ч. Значение ОП при 450 нм определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

4. Результаты экспериментов

Как следует из Фиг. 6, с увеличением дозы облучения повреждения клеток SY5Y, вызванные излучением, постепенно увеличиваются, но АСТ001 может значительно уменьшить повреждения клеток SY5Y, вызванные излучением. Поскольку клетки SY5Y используются в качестве клеточной модели нормальных нейронов, предполагается, что АСТ001 может уменьшить повреждения нейронов головного мозга, вызванные излучением, и оказать определенный эффект защиты от лучевой терапии.

IV. Эксперимент in vivo - влияние АСТ001 на выживаемость мышей, подвергшихся лучевой терапии

1. Цель эксперимента

Изучить, может ли АСТ001 улучшить выживаемость или продлить время выживания мышей BALB/C, подвергнутых лучевой терапии

2. Экспериментальные материалы

2.1 Тестируемый образец

Название: АСТ001; поставщик: Tianjin Accendatech Technology Co., Ltd.; внешний вид: белый порошок; чистота: 99,38%; номер партии продукта: С10553-16.

2.2 Устройство для лучевой терапии

Устройство для лучевой терапии от Института онкологии и больницы Тяньцзиньского медицинского университета

2.3 Экспериментальные животные и условия кормления

Взрослые мыши BALB/c, 18-19 г, 8 недель, самка, SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., номер сертификата животного: SCXK (Beijing) 2016-0002. Испытуемых животных разводили в общей среде экспериментального центра животных Института радиационной медицины Китайской академии медицинских наук, по 5 животных в каждой клетке. Наполнитель представлял собой специальной автоклавированный наполнитель для мышей, и мышей кормили специальным стерилизованным кормом, и они могли свободно пить очищенную воду. В лаборатории для животных поддерживали температуру около 25°С, относительную влажность поддерживали на уровне 40%-70%, а освещение обеспечивали в течение 12 часов ежедневно.

2.4 Выбор дозы облучения

В предварительном эксперименте по исследованию дозы облучения мышей подвергали облучению при 8 Гр, 10 Гр, 12 Гр и 14 Гр соответственно. Все животные умерли через 18 дней после облучения. Однако животные в группе 8 Гр выжили дольше, чем другие группы, поэтому доза облучения 8 Гр была выбрана для формального эксперимента.

3. Методика эксперимента и лечение лекарственным средством

3.1 Методика эксперимента

(1) Летальную дозу однократного облучения для мышей определяли путем предварительного эксперимента;

(2) мышей случайным образом группировали по массе тела;

(3) АСТ001 предварительно вводили в течение 17 последовательных дней, наблюдали за состоянием животных и измеряли массу тела ежедневно;

(4) мышей в группах (3) и (4) подвергали облучению в летальной дозе через 17 дней введения, и в день облучения АСТ001 вводили за 1 час до облучения;

(5) АСТ001 непрерывно вводили в течение пяти недель после облучения, наблюдали за состоянием выживаемости животных и измеряли массу тела ежедневно. Рассчитывали выживаемость и время выживания мышей в каждой группе.

3.2 Схема группировки

(1) Холостая контрольная группа

(2) Группа АСТ001 - 200 мг/кг

(3) Группа лучевой терапии - 8 Гр

(4) Группа АСТ001 - 200 мг/кг + лучевая терапия - 8 Гр

Всего в эксперименте было установлено 4 группы, по 10 животных в каждой группе.

3.3 Способ введения

АСТ001 (растворенный в физиологическом растворе) вводили внутрижелудочно один раз в сутки с перерывом один раз в неделю; равный объем физиологического раствора вводили внутрижелудочно холостой контрольной группе.

4. Обработка данных

Данные были выражены как±s; статистический анализ между группами проводили с помощью программы t-критерия в программном обеспечении EXCEL, а для оценки наличия статистической значимости в каждой группе мертвых животных использовали метод логрангового критерия хи-квадрат.

5. Результаты

АСТ001 вводили в течение 17 дней подряд после группировки, и животные находились в хорошем состоянии со стабильной массой тела. На 18 день после введения АСТ00 1 проводили лучевую терапию в группе лучевой терапии - 8 Гр и в группе АСТ001 - 200 мг/кг + лучевая терапия 8 Гр. В группе лучевой терапии 8 Гр смерть животного наступила на 24-й день после лучевой терапии, а медиана выживаемости была достигнута на 27-й день; все животные в этой группе умерли на 32-й день с выживаемостью 0%. В группе АСТ001 - 200 мг/кг + лучевая терапия - 8 Гр животные находились в хорошем состоянии, и смерть животного наступила на 15 день; дальнейшей гибели животных после смерти третьего животного в группе на 31 день не наблюдалось, при этом выживаемость составила 70%. Выживаемость группы АСТ001 - 200 мг/кг + лучевая терапия -8 Гр была значительно увеличена по сравнению с контрольной группой лучевой терапии - 8 Гр и статистически отличалась (Р<0,01). Результаты показывают, что АСТ001 в дозе 200 мг/кг может значительно улучшить выживаемость и продлить время выживания мышей, подвергшихся облучению.

Кривые выживаемости (кривые Каплана-Мейера) и данные мышей BABL/c подробно описаны в таблице 3, на фиг. 2, на фиг. 3 и на фиг. 4.

На фиг. 2 показан график, демонстрирующий влияние АСТ001 на время выживания мышей, подвергшихся лучевой терапии. Примечание: не было смертей животных как в холостой контрольной группе, так и в группе АСТ001-200 мг/кг, и две кривые были наложены. «**» указывает р<0,01 по сравнению с группой лучевой терапии 8 Гр.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий изменение массы тела мышей перед лучевой терапией.

На фиг. 4 показан график, демонстрирующий влияние АСТ001 в сочетании с лучевой терапией на массу тела мышей.

Как видно из таблицы 3 и фиг. 2-4, АСТ001 в дозе 200 мг/кг может улучшить выживаемость и продлить время выживания мышей, подвергшихся облучению. В эксперименте защитного действия на мышей, подвергшихся лучевой терапии, АСТ001 может значительно продлить время выживания животных и улучшить выживаемость животных.

V. Эксперимент in vivo - влияние АСТ001 на вызванные лучевой терапией повреждения у мышей

1. Цель эксперимента

Исследование влияния АСТ001 на вызванный облучением апоптоз нейронов у мышей

2. Экспериментальные материалы

2.1 Исследуемый образец

Название: АСТ001; поставщик: Tianjin Accendatech Technology Co., Ltd.; внешний вид: белый порошок; чистота: 99,38%; номер партии продукта: С10553-16.

2.2 Устройство для лучевой терапии

Устройство для лучевой терапии от Института радиационной медицины Китайской академии медицинских наук.

2.3 Экспериментальные животные и условия кормления

Взрослые мыши BALB/c, 18-19 г, 8 недель, самка, SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., номер сертификата животного: SCXK (Beijing) 2019-0010. Испытуемых животных разводили в барьерной среде экспериментального центра животных Института радиационной медицины Китайской академии медицинских наук, по 5 животных в каждой клетке. Наполнитель представлял собой специальной автоклавированный наполнитель для мышей, и мышей кормили специальным стерилизованным кормом, и они могли свободно пить очищенную воду. В лаборатории для животных поддерживали температуру около 25°С, относительную влажность поддерживали на уровне 40%-70%, а освещение обеспечивали в течение 12 часов ежедневно. 3. Методика эксперимента и лечение соединением

3.1 Способ введения

АСТ001 (растворенный в стерильном физиологическом растворе) вводили внутрижелудочно один раз в сутки;

равный объем стерильного физиологического раствора вводили контрольной группе модели;

Соединение для каждой группы готовили заново перед применением.

3.2 Экспериментальная группировка

(1) Контрольная группа модели

(2) Контрольная группа лучевой терапии (4 Гр)

(3) Группа АСТ001 - 200 мг/кг

(4) Группа АСТ001 - 200 мг/кг + 4 Гр

(5) Контрольная группа с низкой дозой лучевой терапии (2 Гр)

(6) Группа АСТ001 - 200 мг/кг + 2 Гр

По 10 животных в каждой группе, всего 60 животных.

3.3. Методика эксперимента

Мышей группировали случайным образом, по 10 мышей в каждой группе. АСТ001-200 мг/кг вводили за 48 ч до облучения, затем мышей анестезировали и подвергали лучевой терапии. Группы 4 Гр подвергали однократному облучению головного мозга; группы 2 Гр подвергали непрерывному облучению в течение 4 дней, один раз в день, а контрольную группу модели анестезировали в равной дозе в день облучения. На 14-й день после облучения весь мозг фиксировали в 4% параформальдегиде для окрашивания Tunel, чтобы определить повреждения нейронов мозга, вызванные излучением.

4. Обработка данных

Статистический анализ между группами проводили с помощью программы t-критерия в программном обеспечении EXCEL.

5. Результаты экспериментов

Как следует из фиг. 7, по сравнению с контрольной группой модели, как группа с множественным облучением 2 Гр, так и группа с однократным облучением 4 Гр могут индуцировать апоптоз нейронов в коре головного мозга; по сравнению с группами, включающими только облучение, облучение в сочетании с АСТ001-200 мг/кг может значительно снижать апоптоз нейронов, что указывает на то, что АСТ001 может защищать нормальные ткани мозга и уменьшать вызванное облучением повреждение нейронов у мышей.

Описанный выше пример представляет собой предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения, который, однако, не предназначен для ограничения вариантов реализации настоящего изобретения. Любые другие изменения, модификации, замены, комбинации и упрощения могут быть выполнены без отступления от сущности и принципа настоящего изобретения и должны быть эквивалентными заменами и включены в объем защиты настоящего изобретения.

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к облегчению повреждений, вызванных лучевой терапией, у онкологических больных. Раскрывается применение сесквитерпенового лактонного соединения формулы (I) для получения лекарственного средства для облегчения вызванных лучевой терапией повреждений. Использование изобретения позволяет эффективно облегчать повреждения, вызванные лучевой терапией, у онкологических больных и обеспечить защитное действие на нормальные клеточные ткани. 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 1 пр.

1. Применение сесквитерпенового лактонного соединения для получения лекарственного средства для облегчения вызванных лучевой терапией повреждений, где сесквитерпеновое лактонное соединение представляет собой следующее:

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что сесквитерпеновое лактонное соединение защищает нормальные клеточные ткани от поражения или повреждения в процессе лучевой терапии.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что лучевая терапия включает солидные опухоли и метастатические опухоли.

4. Применение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что повреждения, вызванные лучевой терапией, представляют собой радиационные повреждения, вызванные лучевой терапией, например, повреждения, вызванные рентгеновским излучением, и повреждения, вызванные облучением тяжелыми ионами.

5. Применение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что сесквитерпеновое лактонное соединение облегчает повреждения, вызванные лучевой терапией метастатической опухоли головного мозга, путем ингибирования активности пролиферации клеточной линии глиобластомы.

6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что сесквитерпеновое лактонное соединение и фармацевтически приемлемые вспомогательные материалы входят в состав лекарственного средства.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой жидкий, газообразный, твердый или полутвердый состав.

8. Применение по п. 6, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой инъекционный состав.

9. Применение по п. 6, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой состав для перорального приема.

10. Применение по п. 6, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой состав капсулы.