ИОНИЗИРУЕМЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2024 года по МПК C07C219/06 A61K9/127 A61K9/51 A61K31/7088 A61K31/7105 A61K47/18 B82Y5/00 

Описание патента на изобретение RU2823298C1

Настоящее изобретение относится к симметричным бинарным простоэфирным конъюгатам диацилглицеринов жирных кислот с триалкиламинами, содержащими терминальную гидроксильную группу на алкильном радикале, а именно, к новым диглицеридным производным, которые могут быть использованы в качестве ключевых компонентов липидной платформы - ионизируемых катионных липидов - для конструирования липидных наночастиц с нуклеиновыми кислотами (ЛНЧ-НК), способных при введении в организм вызывать или подавлять биосинтез целевых белков. ЛНЧ-НК могут найти применение как для вакцинотерапии при лечении вирусных инфекций, так и в генотерапии онкологических заболеваний.

Пандемия вируса SARS-CoV-2, охватившая мир в конце 2019 года, способствовала интенсивной разработке, стремительной коммерциализации и внедрению в клинику высокоэффективных профилактических вакцин на основе липидных наночастиц (ЛНЧ) и матричной РНК (мРНК) полноразмерного белка шипа вируса (S-белка) производства фирм Moderna [1,2] и Pfizer/BioNTech [3]. Эти вакцинные конструкции представляют собой супрамолекулярные системы - наночастицы, построенные из множества молекул липидов и молекул(ы) мРНК (например, обзоры [4,5]). Структурно-функциональная роль молекул липидов заключается в обеспечении компактизации длинноцепных молекул нуклеиновой кислоты, защите ее от деградации под действием внеклеточных ферментов, обеспечении транспорта наночастицы в клетку за счет эндоцитоза (фагоцитоза или пиноцитоза) и последующего выхода мРНК из эндосомы (фагосомы) в цитоплазму для осуществления трансляции и экспрессии белка с иммуногенными эпитопами. В связи с разнообразием функций, липидная платформа ЛНЧ с мРНК должна включать несколько классов липидов. Ключевым компонентом среди них являются ионизируемые катионные липиды, которые обеспечивают как компактизацию мРНК при формировании ЛНЧ, так и выход мРНК в цитоплазму. Структуры ионизируемых липидов в вакцинах обоих производителей очень близки, схемы их синтезов описаны в соответствующих патентах (US 20170210697 A1, 2017.07.27; WO 2017075531 A1, 2017.05.04; US 10166298 B2, 2019.01.01) [6-8]. В случае олигонуклеотидов - антисмысловых РНК или малых ннтерферирующих РНК - липидная платформа ЛНЧ также должна соответствовать описанным выше требованиям.

В обзоре [9] приведен большой ряд ионизируемых катионных липидов, предложенных для доставки нуклеиновых кислот. Общими элементами структуры в них являются наличие третичного амина и остатков жирных кислот или жирных спиртов, в том числе разветвленных и ненасыщенных. Основной недостаток представленных в публикациях ионизируемых липидов - присутствие в их молекулах разветвленных алкильных или ацильных цепей (так называемые «дендрипиды»), например: липиды Acuitas Therapeutics, Inc. (Ванкувер, Канада) WO 2017075531 A1, 2017.05.04, US 10166298 B2, 2019.01.01, US 10221127 B2, 2019.03.05 [7,8,10], один из которых (ALC-0315) входит в состав вакцины Pfizer/BioNTech; ModernaТХ, Inc. (Кембридж, Массачусетс, США) US 20170210697A1, 2017.07.27 [6]; Genevant Sciences GmbH (Базель, Швейцария) WO2020219941 A1, 2020.10.29 [11] и Genevant Sciences Со. (Ванкувер, Канада) [12]. Такие структуры нехарактерны для природных липидов и представляют потенциальные препятствия функции липаз. Липиды Arcturus Therapeutics, Inc. (Сан-Диего, Калифорния, США) US 9567296 B2, 2017.02.14, US9670152 B2, 2017.06. 06 [13], кроме того, содержат простые эфирные О- или S-связи, которые не гидролизуются в организме. Запатентован метод синтеза ионизируемых липидов с дисульфидной связью, способных легко восстанавливаться (расщепляться) в условиях пониженной кислотности в эндосомах, что облегчает внутриклеточную разгрузку комплекса ЛНЧ-НК после доставки (Generation Bio, Co., Кембридж, Массачусетс, США, US20220370357 A1, 2022.11.24) [14]. Однако описанные молекулы также содержат разветвленные алкильные радикалы. Указанные особенности структуры липидных аналогов затрудняют или препятствуют их биодеградации, образуются неэндогенные метаболиты, что в итоге может обусловить нежелательные эффекты, в том числе хроническую токсичность, в первую очередь, гепатотоксичность [15, 16]. В связи с этим следует отметить, что результатов долгосрочных клинических исследований последствий применения ЛНЧ на основе описанных в литературе ионизируемых липидов еще не накоплено. Еще одним недостатком известных ионизируемых катионных липидов, предназначенных для создания комплексов ЛНЧ-НК, являются сложные методы их получения. В патенте Nanovation Therapeutic Inc. (Ванкувер, Канада) WO2022246555 A1, 2022.12.01, предложен более технологичный метод синтеза ионизируемых липидов с использованием конденсации Кляйзена, который позволяет избежать использование дорогостоящих и взрывоопасных реагентов [17]. Следует отметить, что предложены варианты упрощения синтеза липида ALC-0315 (ключевого компонента липидной платформы мРНК-вакцины Pfizer/BioNTech) за счет сокращения числа стадий и применения менее дорогостоящих реагентов [18, 19].

Настоящее изобретение относится к ионизируемым катионным липидам, содержащим в гидрофобной части молекулы биодеградируемые диацилглицериновые (диглицеридные) радикалы, и к липидным наночастицам на их основе, которые способны к образованию комплексов с нуклеиновыми кислотами для применения в вакцинотерапии и генотерапии. Диацилглицерины входят в состав липидных молекул организма человека и являются естественными метаболитами, способными расщепляться липазами. Новая группа ионизируемых катионных липидов на основе диглицеридных производных третичных алкиламинов не содержит разветвленных алкильных радикалов в отличие от известных ионизируемых катионных липидов, благодаря чему обладает потенциально меньшей системной токсичностью. Кроме того, способ получения данной группы химических соединений отличается простотой и экономичностью использования реагентов. В литературе не описаны диглицеридные аналоги ионизируемых катионных липидов.

Технический результат по первому аспекту изобретения достигается путем синтеза бинарных диглицеридных производных третичных алкиламинов общей формулы

,

где

R обозначает алкильный остаток жирных кислот предельного ряда, n = 3, 4; m = 1, 3.

В одном из возможных вариантов выполнения настоящего изобретения диглицеридное производное третичного алкиламина содержит остатки каприновой кислоты (R = С9H19), n = 3, m = 3.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения диглицеридное производное третичного алкиламина содержит остатки каприловой кислоты (R = С7H15), n = 3, m = 3.

В третьем варианте выполнения настоящего изобретения диглицеридное производное третичного алкиламина содержит остатки лауриновой кислоты (R = С11H23), n = 3, m = 3.

В четвертом варианте выполнения настоящего изобретения диглицеридное производное третичного алкиламина содержит остатки лауриновой кислоты (R = С11H23), n = 3, m = 1.

В пятом варианте выполнения настоящего изобретения диглицеридные производные третичных алкиламинов содержат остатки каприновой кислоты (R = С9H19), n = 4, m = 1.

Другим аспектом настоящего изобретения является способность создания комплексов ЛНЧ-НК на основе липидной платформы, содержащей в качестве ключевых компонентов бинарные диглицеридные производные третичных алкиламинов по первому аспекту изобретения.

Сущность изобретения по первому аспекту заключается в разработке универсальной 4-стадийной методики синтеза бинарных диглицеридных производных третичных алкиламинов.

Универсальная методика синтеза на примере варианта выполнения настоящего изобретения с остатком каприновой кислоты (R = С9H19), n = 3, m = 3, выглядит следующим образом:

Стадия 1. Алкилирование солкеталя

Смешивают 18.39 г 1.5-дибромпентана, взятого в избытке (0.08 моль), и 2.64 г солкеталя (0.02 моль). Добавляют 35 мл диметилформамида. Через воронку при перемешивании присыпают порциями 0.8 г (0.02 моль) NaH (60% дисперсия в минеральном масле). Дожидаются прекращения выделения газа. Колбу с образовавшейся желтой мутной смесью закрывают хлоркальциевой трубкой и ставят на водяную баню при 60°C на 3 ч. Далее реакционную смесь выливают в воду и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракт высушивают над безводным Na2SO4, упаривают на роторном испарителе и наносят на колонку с силикагелем КСКГ 0,063-0,2 мм (30 × 2,6 см). Элюируют сначала 200 мл гексана (фракция 1, исходный дибромид), а затем 300 мл смеси гексан-этилацетат, 3:1 (фракция 2, продукт). Получено 2,079 г бесцветной прозрачной жидкости. Выход 38,8%. Регенерировано 5,347 г дибромида. ТСХ: проявление раствором Родамина-6G в этаноле, элюент - гексан-этилацетат, 4:1; продукт, Rf 0.7, исходный дибромид, Rf 0.95.

Стадия 2. Снятие изопропилиденовой зщиты

К алкилбромиду солкеталя (2,079 г, 7,39 ммоль) добавляют 20 мл ТГФ и 5 мл 4.6 н. раствора HCl. Перемешивают 1 ч. Реакционную смесь нейтрализуют, постепенно добавляя 5 мл водного раствора NaHCO3 (1.93 г соли). Контролируют нейтрализацию (pH=7) индикаторными полосками (например, Macherey-Nagel, Германия). Реакционную смесь упаривают на роторном испарителе, добавляют воду и экстрагируют этилацетатом. Экстракт упаривают. Контроль реакции осуществляют ТСХ (по исчезновению пятна исходного вещества). Продукт высушивают на лиофильной сушке 1,5 ч. Масса продукта 0,886 г, выход 53%.

1H-ЯМР в CDCl3: 1.54 (2H, м), 1.62 (2H, м), 1.89 (2H, м), 3.50 (7H, м), 3.59 (1H, м), 3.77 (1H, м).

Стадия 3.Этерификация по Штеглиху [20]

В круглодонную колбу на 10 мл, содержащую 0,1776 г сухого бромалкилдиола, полученного на предыдущей стадии, приливают 2 мл CH2Cl2, перегнанного над P2O5, добавляют 0,406 г каприновой кислоты, охлаждают до 0°C, добавляют диизопропилкарбодиимид (DIC) (двумя порциями по 184 мкл) и 19 мг 4-диметиламинопиридина (DMAP). Выделяется белый осадок диизопропилмочевины. Оставляют перемешиваться на ночь при комнатной температуре. Раствор упаривают на роторном испарители, растворяют в небольшом количестве петролейного эфира (ПЭ), фильтруют через воронку с плотно набитой хлопчатобумажной ватой, осадок еще раз промывают ПЭ и снова фильтруют. ТСХ в системе ПЭ-этилацетат, 5:1, проявитель - раствор Родамина 6G в этаноле. Каприновая кислота идет с Rf 0.25, продукт - с Rf 0.58. Финальная очистку продукта проводят хроматографией на колонке с силикагелем КСКГ 0,063-0,2 мм (24 × 2,6 см), элюент ПЭ-этилацетат, 5:1. Получено 0,3377 г продукта, выход 78,2%.

Стадия 4. Алкилирование амина

0,2468 г алкилбромида диацилглицерина растворяют в 2 мл сухого диметилформамида в круглодонной колбе на 25 мл, снабженной дефлегматором. Добавляют 0.069 г мелкодисперсного сухого карбоната калия, приливают 23 мкл бутаноламина, перемешивают и нагревают до кипения. Кипятят 2 ч до появления легкой желтой окраски раствора. Добавляют 20 мл воды, переносят в делительную воронку. Экстрагируют хлороформом 2×50 мл. Органическую фазу промывают водой, сушат над MgSO4 и упаривают. Остаток хроматографируют на колонке силикагелем КСКГ 0.063-0.2 мм (24 × 2.6 см), элюент CHCl3-MeOH, 8:2. Получено 0,112 г грубого продукта. Целевой продукт выделяют гель-хроматографией на колонке с сефадексом LH-20 (47 × 1.6 см) в системе CHCl3-MeOH, 1:1. Получено 65 мг, выход 30%.

Получение того или иного соединения определяется использованием конкретных жирной кислоты, дибромалкана и алканоламина.

Пример 1

Диглицеридное производное третичного амина с остатками каприновой кислоты (R = С9H19), n = 3, m = 3, бесцветное масло.

ЯМР 1H в CDCl3 (δ, м.д.): 0.89 (12H, м), 1.30 (36H, м), 1.61 (20H, м), 2.32 (8Н, м), 3.44 (4Н, м), 3.54 (4Н, м), 4.15 (2Н, м), 4.33 (2Н, м), 5.20 (2Н, м).

Пример 2

Диглицеридное производное третичного амина с остатками каприловой кислоты (R = С7H15), n = 3, m = 3, бесцветное масло.

ЯМР 1H в CDCl3 (δ, м.д.): 0.88 (12Н), 1.26 (54Н), 1.60 (20H), 2.31 (10), 3.43(4), 3.53(6), 4.15(2), 4.32 (2), 5.19 (2).

Пример 3

Диглицеридное производное третичного амина с остатками лауриновой кислоты (R = С11H23), n = 3, m = 3, бесцветное масло.

ЯМР 1H в CDCl3 (δ, м.д.): 0.86 (20Н, м), 1.24 (114Н, м), 2.29 (12Н, м), 3.42 (6Н, м), 3.51 (6Н, м), 4.05 (2Н, м), 4.15 (2Н, м), 4.30 (2Н, м), 5.17 (2Н, м).

Пример 4

Диглицеридное производное третичного амина с остатками лауриновой кислоты (R = С11H23), n = 3, m = 1, бесцветное масло.

ЯМР 1H в CDCl3 (δ, м.д.): 0.88 (24Н), 1.26 (120H, м), 1.61 (28Н, м), 2.30 (12Н, м), 3.43 (6Н, м), 3.54 (4Н, м), 4.07 (2Н, м), 4.16 (3Н, м), 4.33 (2Н, м), 5.20 (2Н, м).

Пример 5

Диглицеридное производное третичного амина с остатками каприновой кислоты (R = С9H19), n = 4, m = 1, бесцветное масло.

ЯМР 1H в CDCl3 (δ, м.д.): 0.86 (14Н, м), 1.25 (68Н, м), 1.59 (24Н, м), 2.29 (9Н, м), 3.42 (5Н, м), 3.51 (5Н, м), 4.13 (2Н, м), 4.30 (2Н, м), 5.17 (2Н, м).

Сущность настоящего изобретения по второму аспекту заключается в возможности использовать бинарные диглицеридные производные третичных алкиламинов вышеприведенной общей формулы в качестве ключевых компонентов липидной платформы при конструировании наноразмерных комплексов с нуклеиновыми кислотами для применения в вакцинотерапии и генотерапии.

Получение липидных наночастиц с мРНК

В качестве мРНК для инкапсулирования в липидные наночастицы, содержащие вышеописанные ионизируемые катионные липиды по первому аспекту изобретения, была выбрана репортерная мРНК, кодирующая секретируемую нанолюциферазу (NLuc, длина цепи ~ 900 нуклеотидов). Фермент NLuc способен катализировать реакцию, сопровождающуюся биолюминесценцией. Все эксперименты по конструированию (формулированию) комплексов мРНК с ЛНЧ проведены в сравнении с липидными композициями, используемыми в составе мРНК-вакцины Pfizer, в том числе был использован липид ALC-0315.

Процедура формулирования ЛНЧ с мРНК представляет собой процесс смешения этанольного раствора липидов и водного раствора мРНК в микрофлюидном канале установки Nanoassmblr Benchtop (Канада). Растворы мРНК и липидов смешивались в соотношении 3:1 по объему и скорости смешения. Содержание ионизируемого липида в общем объеме смеси липидов рассчитывалось по соотношению N/P = 6, исходя из количества вводимой в комплекс мРНК. Содержание остальных компонентов в смеси липидов составляло (в мольных процентах): ионизируемый липид : DSPC : Холестерин : DMG-PEG2000 = 46,3% : 9,4% : 42,7% : 1,6%, что соответствовало соотношению липидов в формуляции Pfizer. Структуры липидов приведены на рис. 1. Приведен пример ионизируемого липида в варианте выполнения настоящего изобретения с остатком каприновой кислоты, n = 3, m = 3, обозначенный как «Аналог 1». Полученные суспензии наночастиц подвергались диализу (против фосфатного буфера) для удаления спирта и замены буфера. Диализ проводили в течение 16 ч при пониженной температуре (в холодильнике). Были получены комплексы мРНК с ЛНЧ на основе синтезированного липида Аналог 1 и в таких же условиях - комплексы с липидом ALC-0315. Для каждого ионизируемого липида в одинаковых условиях были получены два образца мРНК-ЛНЧ. Размер частиц и загрузку мРНК определяли сразу после диализа и через 56 дней после приготовления наночастиц. Суспензии мРНК-ЛНЧ после приготовления хранились в холодильнике.

Анализ среднего размера частиц проводили методом динамического светорассеяния на установке Zetasizer Nano ZS (Malvern). По результатам 3 измерений рассчитывали: средний размер частиц и средний индекс полидисперсности.

Анализ загрузки РНК в ЛНЧ основан на измерении уровня флуоресцентного сигнала при окрашивании реагентом RiboGreen суспензии частиц до и после их разрушения. Для разрушения частиц использовали детергент Triton X-100. Концентрацию РНК до и после разрушения комплекса РНК-ЛНЧ определяют по калибровочным кривым, полученным на основе измерения уровня флуоресценции при окрашивании растворов РНК известной концентрации. Измерения флуоресценции проводились на планшетном мультимодальном ридере Varioskan LUX, Thermo Fisher Scientific при длинах волн возбуждения 495 нм и эмиссии 520 нм. Результаты анализа физико-химических характеристик полученных наночастиц представлены в табл. 1 и 2.

Частицы на основе липида Аналог 1 оказались несколько крупнее, чем частицы на основе АLС-0315, что может быть связано с большей молекулярной массой липида Аналог 1 (М.в. = 1026.58) по сравнению с АLС-0315 (М.в. = 766.29). В течение почти двух месяцев хранения размер частиц практически не изменился. Однако загрузка частиц РНК уменьшилась как для липида Аналог 1, так и для АLС-0315.

Тестирование эффективности мРНК-ЛНЧ in vitro

Клетки эмбриональной почки человека Hek293T растили при стандартных условиях, за день до эксперимента клетки рассевали в 48-луночный планшет (Costar) в плотности 7*105 клеток/мл. Через 24 ч клетки обрабатывались липидными наночастицами (ЛНЧ), содержащими 100 и 250 нг кепированной и полиаденилированной мРНК с полной заменой уридина на N1-метилпсевдоуридин, которая кодировала секретируемую нанолюциферазу (Nluc). После указанных промежутков времени, собирали по 5 мкл кондиционной среды и измеряли люциферазную активность с помощью стандартного набора Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) по уровню люминесценции продукта реакции при добавлении субстрата с использованием мультимодального планшетного ридера Feyond A300 (Allsheng). Эксперимент проводился в трех повторностях.

Тестирование эффективности мРНК-ЛНЧ in vivo

Препараты липидных наночастиц с Аналогом 1(1) и ALC-0315(1) (см. табл. 1 и 2), содержащие репортерную мРНК, кодирующую секретируемую нанолюциферазу Nluc, вводили внутримышечно мышам из расчета 0,5 мкг и 2,5 мкг мРНК на мышь. В качестве контроля использовали инъекцию фосфатного буфера на физиологическом растворе, рН 7.0 (PBS). В каждой группе использовали по 6 мышей, у каждых 3 мышей отбирали кровь через 4 ч после инъекции, и затем у всех мышей - через 24 ч после инъекции. Кровь отбирали из ретроорбитального синуса при помощи капилляра, получали сыворотку, и измеряли активность люциферазы с помощью стандартного набора для детекции нанолюциферазы Nano-Glo Luciferase Assay System (Promega) по уровню люминесценции продукта реакции при добавлении субстрата. Для одного измерения использовали 5 мкл сыворотки. Результаты эксперимента представлены на рис. 3. Они свидетельствуют о сравнимой эффективности доставки мРНК в организм мыши липидными наночастицами оригинального состава с липидом Аналог 1 и липидными наночастицами, приготовленными по протоколу Pfizer.

Таким образом, заявляемые ионизируемые катионные липиды могут быть использованы для создания комплексов ЛНЧ-НК с целью применения в вакцинотерапии и генотерапии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Baden L.R., El Sahly H.M., Essink B., Kotloff K., Frey S., Novak R., Diemert D., Spector S. A., Rouphael N., Creech C.B., McGettigan J., Khetan S. et al. // N. Engl. J. Med. 2021. V. 384. N 5. P. 403-416. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2035389.

2. Anderson E.J., Rouphael N.G., Widge A.T., Jackson L.A., Roberts P.C., Makhene M., Chappell J.D., Denison M.R., Stevens L.J., Pruijssers A.J., McDermott A.B., Flach B. et al. // N. Engl. J. Med. 2020. V. 383. N 25. P. 2427-2438. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2028436.

3. Polack F.P., Thomas S.J., Kitchin N., Absalon J., Gurtman A., Lockhart S., Perez J.L., Pérez Marc G., Moreira E.D., Zerbini C., Bailey R., Swanson K.A. et al. // N. Engl. J. Med. 2020. V. 383. N 27. P. 2603-2615. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2034577.

4. Schoenmaker L., Witzigmann D., Kulkarni J.A., Verbeke R., Kersten G., Jiskoot W., Crommelin D.J.A. // Int. J. Pharm. 2021. V. 601. P. 120586.

https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2021.120586.

5. Hou X., Zaks T., Langer R., Dong Y. // Nat. Rev. Mater. 2021. V. 6. P. 1078-1094. https://doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0.

6. Патент US 2017/0210697 A1 от 27.07.2017 “Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents” Benenato K.E., Kumarasinghe E.S., Cornebise M.

https://patentimages.storage.googleapis.com/42/10/72/5bef6f3bbd8644/US20170210697A1.pdf

7. Патент US10166298 B2 от 01.01.2019 “Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids” Ansell S.M., Du X.

https://patents.google.com/patent/US10166298B2/en

8. Патент WO2017075531 A1 от 04.05.2017 “Preparation of novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids” Ansell S.M., Du X. https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.Jsf?docId=WO2017075531

9. Han, X., Zhang, H., Butowska, K. et al. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun 12, 7233 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-27493-0.

10. Du, X.Y. & Ansell, S.M. Lipids and LipidNanoparticle Formulations for Delivery of Nucleic Acids. https://patents.google.com/patent/US10221127B2/en

11. Heyes, J., Judge, A., Lam, K.M. & Martin, A.D. Lipid Nanoparticles https:// patents.google.com/patent/WO2020219941A1/

12. K. Lam, A. Leung, A. Martin, M. Wood, P. Schreiner, L. Palmer, O. Daly, W. Zhao, K. McClintock, J. Heyes. Unsaturated, Trialkyl Ionizable Lipids are Versatile Lipid-Nanoparticle Components for Therapeutic and Vaccine Applications. Adv. Mater. 2023, 35, 2209624.

https://doi.org/10.1002/adma.202209624.

13. Payne, J.E. & Chivukula P. Ionizable Cationic Lipid for RNA Delivery.

https://patents.google.com/patent/US9670152B2/en

14. STANTON MATTHEW G, NOLTING BIRTE, FEINSTEIN GREGORY, LEBLANC MICHELLE, CHATTERTON JON EDWARD. Ionizable lipids and nanoparticle compositions thereof. https://patents.google.com/patent/US20220370357A1

15. EMA, Comirnaty Assessment Report, https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf (accessed: February 2022).

16. Arne Matteo Jörgensen, Richard Wibel, and Andreas Bernkop-Schnürch. Biodegradable Cationic and Ionizable Cationic Lipids: A Roadmap for Safer Pharmaceutical Excipients. Small 2023, 2206968. DOI: 10.1002/smll.202206968.

17. Marco A. Ciufolini, Fariba SAADATI, Anthony TAM, Daniel KUREK, Dominik WITZIGMANN, Jayesh Kulkarni. Method for producing an ionizable lipid. https://patents.google.com/patent/WO2022246555A1/en

18. Yan D., Xueming T. Patent CN 114249662 A, 2022.

19. Boldyrev I.A., Shendrikov V.P., Vostrova A.G., Vodovozova E.L. A Route to Synthesize Ionizable Lipid ALC-0315, a Key Component of the mRNA Vaccine Lipid Matrix. Russ J Bioorg Chem. 2023; 49(2): 412-415. doi: 10.1134/S1068162023020061.

20. B. Neises, W. Steglich (1978). "Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids". Angew. Chem. Int. Ed. 17 (7): 522-524.

Таблица 1. Диаметр частиц (D) и индекс полидисперсности (PDI) для образцов мРНК-ЛНЧ с разными ионизируемыми липидами (Аналог 1 и АLС-0315) сразу после получения и через 56 дней хранения при +6-+8°С. Приведены средние значения трех измерений. Время, дни Аналог 1
(1-й образец)
Аналог 1
(2-й образец)
АLС-0315
(1-й образец)
АLС-0315
(2-й образец)
D, нм, ± SD PDI ± SD D, нм, ± SD PDI± SD D, нм, ± SD PDI± SD D, нм, ± SD PDI± SD 0 79.9±0.1 0.186±0.008 90.1±0.05 0.157±0.016 76.0±0.5 0.143±0.009 74.9±1.2 0.153±0.01 56 101.8±0.12 0.233±0.01 98.8±0.07 0.141±0.015 73.1±0.4 0.102±0.005 74.0±1.1 0.140±0.01

Таблица 2. Изменение загрузки мРНК (нг/мкл) в ЛНЧ с течением времени для образцов мРНК-ЛНЧ с разными ионизируемыми липидами (Аналог 1 и АLС-0315). Время, дни Аналог 1
(1-й образец)
Аналог 1
(2-й образец)
АLС-0315
(1-й образец)
АLС-0315
(2-й образец)
0 83.9 40.6 88.5 71.2 56 49.8 28.9 68.5 64.7

Подписи к иллюстрациям

Рисунок 1. Структурные формулы использованных липидов.

Рисунок 2. Эффективность доставки мРНК секретируемой нанолюциферазы липидными наночастицами в клетках Hek293T. По оси ординат представлены значения люминесценции в относительных единицах. 4hmock, 24hmock - PBS контроль без наночастиц, 4 часа и 24 часа; ALC - мРНК-ЛНЧ с липидом ALC-0315 (Pfizer), зеленые столбики; Analog1 - мРНК-ЛНЧ с липидом Аналог 1, желтые столбики. Дозы мРНК - 100 нг и 250 нг.

Рисунок 3. Эффективность доставки мРНК нанолюциферазы липидными наночастицами в организм мыши. По оси ординат представлены значения люминесценции в относительных единицах. PBS - контроль без наночастиц, ALC-0315 - мРНК-ЛНЧ с липидом ALC-0315 (Pfizer), 2 - мРНК-ЛНЧ с липидом Аналог 1. Дозы мРНК: 0,5 мкг (ALC-0315-0,5 и 2-0,5) и 2,5 мкг (ALC-0315-2,5 и 2-2,5).

Похожие патенты RU2823298C1

название год авторы номер документа
Мультиэпитопный полипептид для иммунизации против Mycobacterium tuberculosis 2023
  • Иванов Роман Алексеевич
  • Решетников Василий Владимирович
  • Муслимов Альберт Радикович
RU2824195C1
КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ НА ОСНОВЕ СОРАФЕНИБА 2022
  • Сергеева Ольга Владимировна
  • Абакумова Татьяна Олеговна
  • Ветошева Полина Игоревна
  • Зацепин Тимофей Сергеевич
RU2800071C1
ПРОТИВОРАКОВЫЕ РНК-ВАКЦИНЫ 2017
  • Велиант, Николас
  • Эшберн, Тед
  • Хопсон, Кристен
RU2768829C2
ЛИПИДНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА IN VIVO И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2020
  • Ли Хёкчжин
  • Ким Минджон
  • Чон Хансэм
  • Квон Хёкён
  • Со Юнми
  • Чон Микаэла
RU2799045C1
ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИНТЕРЛЕЙКИН-12 (IL12), И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ 2017
  • Фредерик Джошуа
  • Хьюитт Сюзанна
  • Бай Айлинь
  • Хоуг Стефен
  • Пресняк Владимир
  • Макфадин Айан
  • Бененато Керри
  • Кумарасингх Эллалахеваж Сатхияджит
RU2769316C2
СОСТАВЫ НЕВИРУСНЫХ БЕСКАПСИДНЫХ ДНК-ВЕКТОРОВ НА ОСНОВЕ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ 2018
  • Котин, Роберт Майкл
  • Алкан, Озан
  • Керр, Дуглас Энтони
  • Малакиан, Ара Карл
  • Симмонс, Мэтью Джон
  • Стантон, Мэтью Дж.
  • Су, Джи
  • Райт, Тереза Л.
RU2778407C2
ЛИПИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ И КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ 2021
  • Чжан, Билл Билян
  • Чжао, Хаотин
  • Вэнь, Цзянь
RU2825571C1
РНК-ЧАСТИЦЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ПОЛИСАРКОЗИН 2019
  • Барц, Маттиас
  • Вебер, Беньямин
  • Хаас, Хайнрих
  • Хеллер, Филипп
  • Ногуэйра, Сара
  • Шлегель, Анне
RU2792644C2
СОСТАВЫ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО НУКЛЕОЗИДА, НУКЛЕОТИДА И НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ 2012
  • Де Фужеролль Антонин
  • Вуд Кристи М.
  • Эльбашир Зайда М.
  • Афеян Ноубар Б.
  • Валенсия Педро
  • Шрам Джейсон П.
RU2649364C2
Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом клещевого энцефалита, на основе мРНК 2024
  • Гинцбург Александр Леонидович
  • Логунов Денис Юрьевич
  • Гущин Владимир Алексеевич
  • Долгушин Сергей Анатольевич
  • Шалаев Павел Владимирович
  • Вердиев Бахтияр Исраилоглы
  • Иванов Роман Алексеевич
  • Клейменов Денис Александрович
  • Быконя Евгения Николаевна
  • Мазунина Елена Петровна
  • Джаруллаева Алина Шахмировна
  • Почтовый Андрей Андреевич
  • Синявин Андрей Эдуардович
  • Усачев Евгений Валерьевич
  • Васина Дарья Владимировна
  • Кузнецова Надежда Анатольевна
  • Дмитриев Сергей Евгеньевич
  • Иванов Игорь Андреевич
  • Тутыхина Ирина Леонидовна
  • Ремизов Тимофей Андреевич
  • Захарова Анастасия Андреевна
  • Семихин Александр Сергеевич
  • Государев Андрей Игоревич
  • Егорова Дарья Андреевна
  • Щербинин Дмитрий Николаевич
  • Токарская Елизавета Александровна
  • Лубенец Надежда Леонидовна
  • Тухватулина Наталья Михайловна
  • Руссу Леонид Иванович
  • Марчук Елизавета Владимировна
  • Кириллова Людмила Александровна
  • Усачева Ольга Викторовна
  • Шаталов Алексей Генрихович
RU2823754C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 823 298 C1

Реферат патента 2024 года ИОНИЗИРУЕМЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Изобретение относится к бинарным диглицеридным производным третичных алкиламинов указанной ниже общей формулы, которые могут быть использованы в качестве ионизируемых катионных липидов для конструирования липидных наночастиц для доставки РНК в клетки и организм. В указанной общей формуле R обозначает неразветвленный алкильный остаток жирных кислот предельного ряда С7H15, С9H19, С11H23; n = 3, 4; m = 1, 3. Изобретение относится также к липидной наночастице для доставки РНК в клетки и организм, содержащей РНК и указанные бинарные диглицеридные производные третичных алкиламинов, и к ее применению для доставки и экспрессии мРНК в клетки и организм. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 823 298 C1

1. Бинарные диглицеридные производные третичных алкиламинов общей формулы

,

где R обозначает неразветвленный алкильный остаток жирных кислот предельного ряда С7H15, С9H19, С11H23; n = 3, 4; m = 1, 3.

2. Липидная наночастица для доставки РНК в клетки и организм, содержащая РНК и бинарные диглицеридные производные третичных алкиламинов по п. 1 в качестве основного компонента липидной платформы.

3. Применение липидной наночастицы по п. 2 для доставки и экспрессии мРНК в клетки и организм.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2823298C1

Способ получения цианистых соединений 1924
  • Климов Б.К.
SU2018A1
CN 114249662 A, 29.03.2022
Способ получения продуктов конденсации фенолов с формальдегидом 1924
  • Петров Г.С.
  • Тарасов К.И.
SU2022A1
КАТИОННЫЙ ЛИПИД 2019
  • Мацумото, Сатору
  • Омори,
  • Минео, Масахиро
  • Саваи, Ясухиро
  • Какимото, Нодзому
  • Хоаси, Ясутака
RU2784335C2
ЛИПИДЫ ДЛЯ КОМПОЗИЦИЙ ДЛЯ ДОСТАВКИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ АГЕНТОВ 2013
  • Пейн Джозеф И.
  • Годетт Джон А.
  • Хоу Женг
  • Ахмадиан Мохаммед
  • Йу Лей
  • Кнопов Виктор
  • Акопян Виолетта
  • Кармали Прийа
  • Витте Ричард П.
  • Сафарзадех Неда
  • Йинг Венбин
  • Жанг Йун
RU2658007C2
НОВЫЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ 2011
  • Стэнтон Мэттью Дж.
  • Бадзик Брайан В.
  • Бьютнер Грегори Л.
  • Ляо Хунбяо
RU2617641C2
Незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения для доставки нуклеиновых кислот in vitro 2020
  • Шмендель Елена Васильевна
  • Маслов Михаил Александрович
  • Зенкова Марина Аркадьевна
RU2747559C1

RU 2 823 298 C1

Авторы

Болдырев Иван Александрович

Шендриков Валерий Павлович

Кислова Светлана Олеговна

Андреев Дмитрий Евгеньевич

Потешнова Мария Викторовна

Рубцова Мария Петровна

Рубцов Юрий Петрович

Водовозова Елена Львовна

Даты

2024-07-22Публикация

2023-11-14Подача