Тринуклеотидный кэпирующий реагент, способ его получения и применение Российский патент 2024 года по МПК C07H21/00 C12N15/00 C12N15/11 C07H1/00 C07H1/04 A61K31/7125 A61K31/7088 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к новым реагентам для котранскрипционного кэпирования синтетической мРНК и способу их получения. Предложенный реагент может применяться для получения функциональной мРНК, содержащей аналог 5'-кэп структур.

Уровень техники

Технологический прорыв, связанный с мРНК, позволил открыть новую эру в разработке лекарственных средств. Ожидается, что препараты на основе мРНК уже в ближайшем будущем станут третьим основным классом лекарственных средств после низкомолекулярных препаратов и антител [D. Qiongyu , H. Tianyu , Z. Qiuxia , J. Xueying , C. Feng , Ch. Xiaodong. How far are the new wave of mRNA drugs from us? mRNA product current perspective and future development. Frontiers in Immunology, v. 13, 2022, doi=10.3389/fimmu.2022.974433, ISSN=1664-3224].

В настоящее время к применению разрешены два препарата на основе мРНК - вакцины против Covid-19 производства Moderna и Phizer/BioNTech. Обе вакцины показали высокую эффективность и используются во многих странах мира. Кроме того, на различных стадиях клинических исследований находятся вакцины против гриппа, СПИД, бешенства, лихорадки Зика, против цитомегаловирусной инфекции, против метапневмовирусной инфекции и других инфекционных заболеваний. Активно разрабатываются противоопухолевые лекарственные средства основе мРНК (против острого миелоидного лейкоза, колоректального рака, меланомы, глиобластомы, злокачественной мезотелиомы для лечения метастазов в печени и мозге и др.). Проводятся исследования терапевтических препаратов на основе мРНК для лечения генетических заболеваний (муковисцидоз, пропионовая ацидемия, метилмалоновая ацидемия, фенилкетонурия, гемофилия), аутоиммунных заболеваний, метаболических нарушений (диабет второго типа), сердечно-сосудистых заболеваний (гиперхолестеринемия, ишемия миокарда), фиброза (гипертрофические рубцы, фиброз печени, фиброз легких, первичный склерозирующий холангит, анемия) и др. [Xu S, Yang K, Li R, Zhang L. mRNA Vaccine Era-Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection. Int J Mol Sci. 2020 Sep 9; 21(18): 6582. doi: 10.3390/ijms21186582. PMID: 32916818; PMCID: PMC7554980; Qin S, Tang X, Chen Y, Chen K, Fan N, Xiao W, Zheng Q, Li G, Teng Y, Wu M, Song X. mRNA-based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 21; 7(1): 166. doi: 10.1038/s41392-022-01007-w. PMID: 35597779; PMCID: PMC9123296].

При разработке всех перечисленных лекарственных средств ключевой задачей является создание мРНК, структура которой будет имитировать ее созревание внутри клетки. Перед экспортом из ядра в цитозоль для трансляции белка эукариотическая РНК претерпевает несколько модификаций, первая из которых - присоединение к 5'-концу молекулы кэпирующей структуры (кэп, англ. cap). Данная структура обеспечивает эффективную трансляцию мРНК, направляет сплайсинг пре-мРНК и экспорт мРНК из ядра, ограничивает деградацию мРНК клеточными 5'→3' экзонуклеазами и позволяет распознавать чужеродные РНК. Минимальной кэпирующей структурой является m7GpppNp (7-метилгуанозин, соединённый 5',5'-трифосфатным мостиком с первым нуклеотидом РНК), который также называют кэп 0. Данная структура характерна для мРНК растений и грибов. Для мРНК животных более характерен кэп 1 (отличается от кэпа 0 метилированием первого нуклеотида транскрипта по 2'-O-положению рибозы) и кэп 2 (отличается от кэпа 0 метилированием первого и второго нуклеотидов транскрипта по 2'-O-положению рибозы).

В настоящее время для получения синтетических кэпированных РНК используются два метода: посттрнаскрипционное и котранскрипционное кэпирование. Первый метод предусматривает использование ферментов вируса осповакцины. Данный ферментный комплекс превращает 5'-трифосфатные концы транскриптов in vitro в структуры m7G-кэп. Система кэпирования вируса осповакцины включает три активности (РНК-трифосфатаза, гуанилилтрансфераза, гуанин-N7-метилтрансфераза), которые необходимы для образования полной структуры кэп 0 (m7Gppp5'N) с помощью GTP и донора метильной группы S-аденозилметионина. Дополнительно в ту же ферментативную реакцию можно включить 2'-O-метилтрансферазу, которая приводит к образованию структуры кэп 1, благодаря метилированию 2'-О-позиции следующего за кэпом нуклеотида, что является природной модификацией многих эукариотических мРНК.

При котранскрипционном кэпировании аналог кэпа вводится в реакцию транскрипции вместе с нуклеозидтрифосфатами и встраивается в РНК как первый нуклеотид синтезируемой молекулы. Наибольшее распространение получили: стандартный аналог кэпа - 7-метилгуанозин (m7G) и симметричный аналог кэпа (ARCA), также известный как 3'-O-me-7-meGpppG. Стандартный аналог кэпа m7G может встраиваться в молекулу РНК как в прямой, так и в обратной ориентации, что значительно снижает общий уровень трансляции целевого белка. ARCA метилирован по 3'-положению m7G, что позволяет встраивать этот аналог кэпа только в прямой ориентации и получать пул кэпированных мРНК, трансляционная активность которых составляет 100% [А.А. Загоскин, М.В. Захарова, М.О. Нагорных. Структурные элементы векторов на основе ДНК и РНК для доставки геномных редакторов в клетки высших эукариот in vitro и in vivo. Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 6, стр. 1023-1038].

Из уровня техники также известен ряд других синтетических аналогов кэпа с улучшенными свойствами, например, аналог кэпа CleanCap компании Trilink Biotechnology (США). Структурная формула данного реагента:

Из патента US 10519189 B2 известен комплекс, включающий инициирующий кэпированный олигонуклеотидный праймер и ДНК-матрицу, отличающийся тем, что инициирующий кэпированный олигонуклеотидный праймер содержит структуру:

в которой B1 и B2 независимо являются естественным, модифицированным или ненатуральным нуклеозидным основанием; и R1, R2 и R3 независимо представляют собой ОН или О-метил; отличающийся тем, что ДНК-матрица содержит промоторную область, содержащую сайт начала транскрипции, имеющий первый нуклеотид в нуклеотидном положении +1 и второй нуклеотид в нуклеотидном положении+2; и в котором инициирующий кэпированный олигонуклеотидный праймер гибридизован с ДНК-матрицей по меньшей мере в положениях +1 и +2 нуклеотида.

Из заявки на патент US 20220002716 A известен тринуклеотидный аналог кэпа, имеющий формулу

в которой B₃ выбирается из -OH, галогенов, красителей, -OR₁, в котором R₁ выбирается из пропаргила, трет-бутилдиметилсилила и метиленового мостика с 4 'C; B₄ выбирают из -OH, красителей и -OR₂, при этом R₂ выбирают из пропаргила и трет-бутилдиметилсилила; или R₁ соединяется с R₂ таким образом, что B₃ и B₄ образуют-2',3'-О-изопропилидин; при условии, что B₃ и B₄ оба не могут быть -OH. X выбирается из -H и -CH3; B₁ и B₂ независимо выбираются из аденина, гуанина, цитозина и урацила; R выбирается из H, связанного с линкером проникающего в клетки пептида, связанного с линкером проникающего в клетки пептида, ковалентно связанного с красителем, и связанного с линкером красителя.

Из патента US 11866754 B2 известен тринуклеотидный аналог кэпа, имеющий формулу:

или стереоизомер, таутомер или их соль, в которых

является

кольцо B1 является

в котором R1 представляет собой алкил C1; каждый из Ra и Rb равен H; и Rc - это H;

кольцо B2 и кольцо B3 выбираются независимо друг от друга из

где X₁ - это N или N+(R₅); R₅ представляет собой С1-С6 алкил, С2-С6 алкенил или С2-С6 алкинил, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из С6-С10 арилок, С6-С10 арилоксила, 5-10-членного гетероарила и 5 - до 10-членного гетероарилоксила, каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими галоген- и циано-; каждый из R_d и R_e независимо представляет собой H, C1-C6 алкил, или аминозащитную группу, или R_d и R_e вместе с атомом азота, к которому они присоединяются, образуют гетероциклоалкил, состоящий из 4-12 членов, -N=CH-R_u или -N=N-R_u, где R_B представляет собой фенил, а каждый из 4-12 членов - гетероциклоалкил. гетероциклоалкил и R_B необязательно замещают одним или несколькими заместителями, выбранными из OH, halo, oxo, C1-C6 алкилов, COOH, C(O)O-C1-C6 алкилов, циано, C1-C6 алкоксилов, амино, моно-C1-C6 алкиламино и ди-C1-C6 алкиламино; R_f представляет собой H, NH2 или C1-C6 алкил; или R_f и один из R_d и R_e вместе с двумя атомами азота, к которым они присоединяются, и атомом углерода, соединяющим два атома азота, образуют 5- или 6-членный гетероцикл, который необязательно замещен одним или несколькими из OH, halo, C1-C6 алкил, C2- С6 алкенил и С2-С6 алкинил; R_g - это Н или метил; R_h - это Н или метил; X₂ - это O; Y₂ - это (OP (O) R₄)_m , в котором m равно 1; R₂ представляет собой заблокированную нуклеиновую кислоту (LNA); R_2' является OR₃; R₃ - это H; каждый из R₄ и R_4' представляет собой OH; каждый из R₂₀, R₂₁, R₂₂ и R₂₃ представляет собой -Q₃-T₃, в котором Q₃ представляет собой связь, а T₃ представляет собой H; каждый из R₂₇ и R₂₈ является OR₂₉; и каждый R₂₉ равен H.

Shanmugasundaram M. и соавторы в своем обзоре также описывают ряд тринуклеотидных аналогов кэпа и особенности их синтеза [Shanmugasundaram M., Senthilvelan A., Kore A.R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines. Chem Rec. 2022 Aug; 22(8): e202200005. doi: 10.1002/tcr.202200005. Epub 2022 Apr 14. PMID: 35420257; PMCID: PMC9111249].

Несмотря на то, что данная область знаний в настоящий момент стремительно развивается, все известные мРНК с кэпом имеют ограничения в отношении их внутриклеточной стабильности, а также эффективности транскрипции in vitro. Таким образом, по-прежнему существует потребность в аналогах кэпа мРНК, которые могут обеспечить высокий уровень эффективности кэпа и улучшенную эффективность трансляции 5'-кэпированных мРНК.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей заявленного изобретения является расширение арсенала реагентов для кэпирования синтетических мРНК.

Технический результат заключается в создании аналога структуры кэпа мРНК, который включается в структуру мРНК котранскрипционно и обеспечивает улучшенную эффективность трансляции мРНК.

Указанный технический результат достигается тем, что создан тринуклеотидный кэпирующий реагент, представленный формулой:

где R означает H или Me, или его соль, приемлемая для реакции транскрипции.

Кроме того, технический результат достигается тем, что разработан комплекс для котранскрипционного кэпирования мРНК, включающий тринуклеотидный кэпирующий реагент по п.1 и ДНК- матрицу, которая содержит промоторную область, содержащую сайт начала транскрипции, имеющий первый нуклеотид в нуклеотидном положении +1 и второй нуклеотид в нуклеотидном положении +2; при этом тринуклеотидный кэпирующий реагент по п.1 гибридизован с ДНК-матрицей по меньшей мере в положениях нуклеотидов +1 и +2.

Также разработан способ получения тринуклеотидного кэпирующего реагента, содержащий следующие стадии:

(а) получение динуклеотида методом жидкофазного олигонуклеотидного синтеза по амидофосфитной методологии исходя из 2',3'-защищённого производного гуанозина и защищённого (2',6-диметил)аденизилфосфоамидита с последующим 5'-фосфорилированием;

(б) получение LNA-(3-метокси)гуанозиндифофата из LNA-(3-метокси)гуанозин-диола химическим фосфорилированием с оксохлоридом фосфора, с последующим получением активированного имидазолидного производного и конденсацией с ортофосфатом;

(в) получение P2-имидазолидного производного LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата путем селективного метилирования под действием диметилсульфата в контролируемом pH с последующим получением имидазолидного производного под действием дитиодипиридина;

(г) получение тринуклеотидного кэпирующего реагента по реакции P2-имидазолидного производного LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата с динуклеотид(2',6-диметил)аденизилгуанозин-5'-фосфатом при катализе солями двухвалентных металлов(кальция, магния, цинка, кадмия, кобальта).

Также технический результат достигается тем, что разработано применение тринуклеотидного кэпирующего реагента для котранскрипционного кэпирования мРНК.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены фотографии клеток, трансфицированных mRNA-GFP (А) и контрольных клеток (В). Изображения были сделаны под цифровым инвертированным микроскопом в ультрафиолетовом свете при 10-× увеличении.

На фиг. 2 представлены результаты оценки экспрессии люциферазы у мышей через 3 часа после внутримышечного введения вектора на основе мРНК, кэпированного разработанным (mRNA-luc) или известным реагентом (mRNA-AG-luc) и упакованного в липидные частицы.

Слева расположено контрольное животное, которому вводили буферный раствор.

По центру расположено животное, которому вводили вектор на основе мРНК, кэпированный разработанным реагентом (mRNA-luc), упакованный в липидные частицы.

Справа расположено животное, которому вводили вектор на основе мРНК, кэпированный известным реагентом (mRNA-AG-luc), упакованный в липидные частицы.

А - интенсивность люминесценции ~ от 0,1*10⁷ отн. ед. до 0,3*10⁷ отн. ед.;

В - интенсивность люминесценции ~ от 0,3*10⁷ отн. ед. до 0,6*10⁷ отн. ед.;

С - интенсивность люминесценции ~ от 0,6*10⁷ отн. ед. до 0,7*10⁷ отн. ед.

На фиг. 3 представлены результаты определения титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2 у животных, иммунизированных вектором на основе мРНК, кэпированного разработанным (mRNA-luc) или известным реагентом (mRNA-AG-luc) и упакованного в липидные частицы.

Ось ординат - титр антител к S белку вируса SARS-CoV-2/.

Ось абсцисс - экспериментальные группы, где:

А - животные, иммунизированные вектором на основе мРНК, кэпированным разработанным реагентом (mRNA-luc) и упакованным в липидные частицы.

В- животных, иммунизированные вектором на основе мРНК, кэпированным известным реагентом (mRNA-AG-luc) и упакованным в липидные частицы.

*Достоверность подсчитывали по критерию Манна-Уитни, p<0,05.

Осуществление изобретения

Синтез структурно сложных кэпов, особенно в больших масштабах, является сложной задачей. Множество функциональных групп, таких как первичные и вторичные гидроксильные группы в сахаре и аминогруппа в основной части нуклеозида/нуклеотида, делают химический синтез кэп-аналогов чрезвычайно сложным. Более того, известно, что эти нуклеозиды/нуклеотиды расщепляются в кислых/основных условиях [Kozarski M., Drazkowska K., Bednarczyk M., Warminski M., Jemielity J., Kowalska J. Towards superior mRNA caps accessible by click chemistry: synthesis and translational properties of triazole-bearing oligonucleotide cap analogs. RSC Adv. 2023 Apr 25; 13(19):12809-12824. doi: 10.1039/d3ra00026e. PMID: 37114020; PMCID: PMC10126820].

Авторами предложен тринуклеотидный кэпирующий реагент LNA-m7Gpppm6AmpG, отличающийся от ранее известных реагентов тем, что содержит одновременно и замкнутый сахарный остов производного 7-метилгуанонзина и диметилированное по положениям 6 и 2' производное аденозина по первому нуклеотиду. Наличие замкнутого сахарофосфатного остова увеличивает эффективность трансляции за счет повышения связывания транскрипционного фактора eIF4E, а наличие метилирования по 6 положению остатка аденозина ослабляет ингибирование кэп-зависимой трансляции в условиях клеточного стресса и увеличивает эффективность трансляции в профессиональных антиген-презентирующих клетках. Модификация сахарного остова метилированием по 2'гидроксилу остатка 7-метилгуанозина не влияет на эффективность трансляции, но может предотвращать включение реагента в обратной ориентации в процессе транскрипции in-vitro.

Кэпирующий реагент получается по реакции P2-имидазолидного производного LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата с динуклеотид(2',6-диметил)аденизилгуанозин-5'-фосфатом при катализе солями двухвалентных металлов (кальция, магния, цинка, кадмия, кобальта). Исходный динуклеотид получается методом жидкофазного олигонуклеотидного синтеза по амидофосфитной методологии исходя из 2',3'-защищённого производного гуанозина и защищённого (2',6-диметил)аденизилфосфоамидита с последующим 5'-фосфорилированием. LNA-(3-метокси)гуанозиндифофат получается из LNA-(3-метокси)гуанозин-диола химическим фосфорилированием с оксохлоридом фосфора, последующим получением активированного имидазолидного производного и конденсацией с ортофосфатом. P2-имидазолидное производное LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата получается селективным метилированием под действием диметилсульфата в контролируемом pH с последующим получением имидазолидного производного под действием дитиодипиридина.

Разработанный кэпирующий реагент может контранскрипционно включаться в структуру мРНК, при этом он включается только в прямой ориентации, что позволяет получать пул кэпированных мРНК, с высокой трансляционной активностью.

Осуществление изобретения раскрывается в следующих примерах.

Пример 1. Получение Dmt-2'-Ome-A(6-Me,Bz)-3'-CE фосфорамидита

Dmt-2'-OMe-A(Bz)-3'-CE фосфорамидит (1 ммоль, 888 мг), метилиодида (4 ммоль, 249 мкл) и дихлорметан (10 мл) помещают в одногорлую круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой. Одновременно, в отдельном стакане готовят 1М водный раствор гидроксида натрия (10 мл). Раствор охлаждают до комнатной температуры, после чего вносят тетрабутиламмоний бромид (1 ммоль, 322 мг) и перемешивают. Содержимое стакана переносят в круглодонную колбу с реакционной смесью. Продолжают интенсивное перемешивание реакционной смеси при комнатной температуре в течение 1 часа.

Затем вносят дихлорметан (100 мл) в колбу, тщательно взбалтывают и переносят в делительную воронку. Органический слой отделяют, а водный слой дополнительно экстрагируют хлористым метиленом (2×50 мл). Органические вытяжки объединяют и сушат над безводным сульфатом натрия в течение 20-30 мин. Полученную суспензию фильтруют и упаривают при пониженном давлении при температуре бани не более 35°C.

Остаток после упаривания очищают с помощью флэш-хроматографии силикагеле, элюируя в системе этилацетат-толуол-триэтиламин (1:5:0,18). Собирают фракции с продуктом (контроль ТСХ, элюент этилацетат-гексан, 2:1, R_f~0,8) и упаривают. Выход продукта после упаривания составляет 400 мг (44%).

Пример 2. Получение Dmt-защищённого динуклеотида

В колбу Шленка, снабженную магнитным мешальником, помещают в виде порошков N²-изобутирил-2',3'-диацетилгуанозин (0,75 ммоль, 1 экв.) и Dmt-2'-OMe-A(Bz)-3'-CE фосфорамидит (1,13 ммоль, 1,5 экв.). Колбу с реагентами вакуумируют на масляном насосе в течение 40 мин. Одновременно готовят раствор тетразола в ацетонитриле (8,5 мл, 4,5 экв. с концентрацией 0,4 М) в отдельной колбе в атмосфере аргона.

Колбу Шленка заполняют аргоном. Далее вносят приготовленный раствор тетразола в ацетонитриле в противотоке аргона. Колбу Шленка закрывают, перемешивают реакционную смесь в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 2-5 часов до исчезновения пятна исходного N²-изобутирил-2',3'-диацетилгуанозина (контроль ТСХ, элюент - дихлорметан-метанол, 100:5, R_f=0,29).

По окончании реакции вносят раствор йода в смеси пиридин-вода (7,5 мл, 4,5 экв. концентрацией 0,45 М, соотношение пиридина к воде: 98:2) и продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 60-90 минут (контроль ТСХ, элюент - дихлорметан-метанол, 100:5, R_f=0,37).

Реакционную смесь разбавляют этилацетатом (120 мл) и переносят в делительную воронку. Органической слой последовательно промывают насыщенным раствором Na₂SO₃ (1×50 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (1×50 мл) и насыщенным раствором NaCl (2×70 мл). Экстракт переносят и сушат над сульфатом натрия в течение 20 мин. Суспензию фильтруют. Фильтрат собирают и упаривают при пониженном давлении. Доупаривают реакционную смесь от пиридина с помощью смеси метанол-толуол (1:1) при температуре водяной бани 42-44°C.

Остаток после упаривания очищают с помощью флэш-хроматографии, используя градиентное элюирование в системе дихлорметан-метанол (от 100:1 до 100:7, прибл. 1,5 л) на силикагеле (50 г). Выход конечного продукта в среднем составил 85%.

¹H NMR (700 MHz, DMSO-d₆) δ 12,09 (d, J=4,8 Hz, 1H); 11,53 (s, 1H); 8,56 (d, J=9,3 Hz, 1H); 8,43 (d, J=7,2 Hz, 1H); 8,23 (d, J=4,3 Hz, 1H); 7,35-7,26 (m, 5H); 7,24-7,13 (m, 9H); 6,80 (ddd, J=14,7; 8,9; 6,5 Hz; 4H); 6,14-6,07 (m, 2H); 5,80 (ddd, J=24,0; 6,8; 5,8 Hz; 1H); 5,50 (dt, J=6,0; 3,5 Hz; 1H); 5,20 (q, J=6,9; 5,3 Hz; 1H); 4,91 (q, J=6,5 Hz, 1H); 4,49-4,33 (m, 4H); 4,26-4,14 (m, 2H); 3,71 (d, J = 8,5 Hz, 6H); 3,66 (d, J=1,0 Hz, 3H); 3,31-3,22 (m, 6H); 2,91-2,83 (m, 2H); 2,81-2,71 (m, 1H); 2,10 (d, J=11,6 Hz, 3H); 2,01 (d, J=5,6 Hz, 3H); 1,15-1,05 (m, 6H).

Пример 3. Получение защищённого динуклеотида

Динуклеотид (4,5 ммоль) растворяют в 80% водной уксусной кислоте (65 мл, конечная концентрация динуклеотида составляет 0,07 M). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 часов (контроль ТСХ, элюент - дихлорметан-этанол, 100:10, R_f=0,32).

По окончании реакционную смесь упаривают. Доупаривают реакционную смесь от уксусной кислоты и воды с помощью смеси метанол-толуол (1:1) при температуре водяной бани 42-44°C.

Остаток после упаривания очищают с помощью флэш-хроматографии, используя градиентное элюирование в системе дихлорметан-метанол (от 100:1 до 100:6, прибл. 2 л) на силикагеле (80 г). Выход конечного продукта 89%.

¹H NMR (700 MHz, DMSO-d₆) δ 12,10 (d, J=3,6 Hz, 1H), 11,55 (d, J=2,8 Hz, 1H); 8,71 (d, J=10,6 Hz, 1H); 8,59 (d, J=11,2 Hz, 1H); 8,25 (d, J=4,6 Hz, 1H); 7,37-7,31 (m, 3H); 7,26-7,20 (m, 2H); 6,11 (ddd, J=16,8; 6,9; 4,5 Hz, 2H); 5,82 (ddd, J=11,3; 6,8; 5,9 Hz; 1H); 5,52 (dd, J=5,9; 3,3 Hz, 1H); 5,31 (t, J=5,2 Hz, 1H); 5,20-5,08 (m, 1H); 4,76-4,64 (m, 1H); 4,51-4,38 (m, 3H); 4,31-4,19 (m, 3H); 3,67 (d, J=1,6 Hz, 3H); 3,64-3,54 (m, 2H); 3,28 (d, J=35,2 Hz, 3H); 2,97-2,90 (m, 2H); 2,76 (hept, J=6,8 Hz, 1H), 2,12 (d, J=9,0 Hz, 3H); 2,02 (d, J=5,8 Hz, 3H), 1,16-1,07 (m, 6H).

Пример 4. Получение защищённого динуклеотида фосфата

Динуклеотид (1 экв., 5,9 ммоль) и бис(2-цианоэтил) диизопропиламидофосфит (2 экв. 11,8 ммоль) помещают в колбу Шленка, снабженную магнитным мешальником. Колбу вакуумируют в течение 15-30 сек, после чего заполняют аргоном. Одновременно, готовят раствор тетразола в ацетонитриле (60 мл, 4 экв. с концентрацией 0,4 М) в отдельной колбе в атмосфере аргона.

Далее вносят приготовленный раствор тетразола в ацетонитриле в противотоке аргона. Колбу Шленка закрывают, перемешивают реакционную смесь в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3-5 часов до исчезновения пятна исходного динуклеотида (контроль ТСХ, элюент - дихлорметан-метанол, 100:5).

По окончании реакции вносят раствор йода в смеси пиридин-вода (60 мл, 4,5 экв. концентрацией 0,45М, соотн. 98:2) и продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа (контроль ТСХ, элюент - дихлорметан-этанол, 100:10). Затем реакционную смесь разбавляют этилацетатом (250 мл) и переносят в делительную воронку. Органической слой последовательно промывают насыщенным раствором Na₂SO₃ (1×100 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (1×100 мл) и насыщенным раствором NaCl (2×100 мл). Экстракт переносят и сушат над сульфатом натрия в течение 20 мин. Суспензию фильтруют. Фильтрат собирают и упаривают при пониженном давлении. Доупаривают реакционную смесь от пиридина с помощью смеси метанол-толуол (1:1) при температуре водяной бани 42-44°C.

Остаток после упаривания очищают с помощью флэш-хроматографии на коротком слое силикагеля (80 г), используя градиентное элюирование в системе дихлорметан-метанол (от 100:2 до 100:10, прибл. 2,5 л). Выход конечного продукта 70%.

¹H NMR (700 MHz, DMSO-d₆) δ 12,11 (d, J=3,6 Hz, 1H); 11,56 (d, J=5,1 Hz, 1H); 8,65 (d, J=10,9 Hz, 1H); 8,59 (d, J=10,5 Hz, 1H), 8,25 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,37-7,31 (m, 3H); 7,27-7,20 (m, 2H); 6,15 (dd, J=6,7; 5,4 Hz, 1H); 6,12 (dd, J=8,0; 6,8 Hz, 1H); 5,84-5,77 (m, 1H), 5,54-5,49 (m, 1H); 5,33-5,23 (m, 1H); 4,84 (dt, J=14,5; 5,8 Hz, 1H); 4,54-4,37 (m, 4H); 4,36-4,30 (m, 2H); 4,30-4,22 (m, 2H); 4,22-4,12 (m, 4H); 3,67 (d, J=2,5 Hz, 3H); 3,30 (d, J=38,0 Hz, 3H); 2,97-2,85 (m, 6H); 2,80-2,73 (m, 1H); 2,12 (d, J=15,5 Hz, 3H); 2,01 (d, J=5,2 Hz, 3H), 1,12 (dd, J=8,7; 6,9 Hz, 6H).

Пример 5. Получение свободного динуклеотида фосфата

Полностью защищённый динуклеотид фосфат (1 г) растворяют в 15 мл смеси водного аммиака-водного метиламина-метанола 3:3:1, помещают в автоклав, нагревают до 55°C и выдерживают при заданной температуре 30 минут. Далее реакционную массу упаривают на роторном испарителе, остаток дважды соупаривают с равным объёмом воды, полученный продукт растворяют в 50 мМ растворе бикарбоната триэтиламмония до финальной концентрации 20 г/л и очищают с помощью ионообменной хроматографии на колонке 50*150 HEMA S 1000 DEAE 20u. Элюирование производят в градиенте концентрации бикарбоната триэтиламмония 0,1-0,7 M в 10 CV со спектрофотометрическим детектированием на длине волны 254 нм. Фракции, содержащие целевой продукт упаривают при пониженном давлении (5-7 Торр) на роторном испарителе, остаток дважды повторно упаривают с небольшим (около 100 мл) объёмом воды, затем растворяют в минимальном объёме воды и прибавляют десятикратный объём ацетонитрила, полученную смесь упаривают, продукт суспендируют в безводном ацетонитриле, фильтруют через фильтр Шотта с пористостью 40, осадок сушат под вакуумом. Полученный продукт дополнительно сушат над пентаоксидом фосфора, получая целевой динуклеотид фосфат в виде бис триэтиламмонийной соли с выходом 88%.

Пример 6. Получение LNA-G 5'-монофосфата.

В начале синтеза готовится ди-фосфорилирующая смесь. В круглодонной колбе растворяют пирофосфат трибутиламмония (3,29 г, 1 экв.) в ацетонитриле (28 мл), после чего вносят трибутиламин (8,57 мл, 6 экв.), закупоривают колбу и тщательно взбалтывают, наблюдая образование двухфазной системы. Колбу убирают в морозилку (-20°C) и выдерживают не менее 1 часа.

Затем в колбу Шлёнка, снабженную магнитным мешальником, вносят LNA-гуанозин (2 г, 1 экв.), протонную губку (тетраметил-2,8-диаминонафталин, 1,28 г, 1 экв.) и триметилфосфат (22 мл) и включают перемешивание. Откачивают воздух из колбы, после чего заполняют аргоном. Исходные реагенты медленно растворяются в триметилфосфате при комнатной температуре, в связи с чем колбу Шлёнка помещают в водяную баню (50-60°C) и ожидают полного растворения осадка.

Далее колбу Шлёнка помещают в термостатируемую баню с холодной водой (-10°C) и перемешивают реакционную смесь приблизительно 30 мин до охлаждения. В противотоке аргона вносят первую порцию оксихлорида фосфора (620 мкл, 1,1 экв.) и продолжают перемешивание в течение 20 мин при тех же условиях. Затем вносят вторую порцию оксихлорида фосфора (390 мкл, 0,7 экв.) и продолжают перемешивание в течение 30 мин. В противотоке аргона вносят в сосуд Шленка ди-фосфорилирующую смесь, приготовление которой описано в первом абзаце. Смывают остатки ди-фосфорилирующей смеси со стенок колбы с помощью ацетонитрила (10-15 мл). Продолжают перемешивание реакционной смеси в течение 30 мин при тех же условиях.

Вносят дистиллированную воду (170 мл) в реакционную смесь и перемешивают в течение 40 мин при температуре водяной бани -10°C. Затем реакционную смесь переносят в делительную воронку и промывают дихлорметаном (4×100 мл). Органический (нижний) слой каждый раз отделяют и утилизируют.

Полученную водную эмульсию (верхний слой) переносят в круглодонную колбу и избавляются от остатков дихлорметана путем упаривания на роторном испарителе при пониженном давлении в течение 2-3 мин до образования прозрачного раствора при температуре бани не более 40°C. Реакционную смесь переносят в плоскодонную колбу и нейтрализуют с помощью насыщенного водного раствора аммиака (около 800 мкл) до pH 6,5. Колбу оставляют перемешиваться при 4°C в течение 8 часов, затем проверяют pH реакционной смеси; при необходимости - добавляют водный раствор аммиака до pH 6,5 (прибл. 400 мкл). Полученную смесь и хроматографировали на DEAE в системе вода-1М бикарбонат триэтиламмония в градиенте 5-50% в 10 объёмах колонки. Целевой пик, выходящий на 0,15 М, упарили и кристаллизовали из ацетонитрила, получив 2 г LNA-гуанозина 5'-монофосфата в виде триэтиламмонийной соли.

Пример 7. Получение имидазолида LNA-G 5'-монофосфата

В сосуд шлёнка объемом 100 мл, снабженный мешалкой, поместили 1,91 г LNA-гуанозин монофосфата триэтиламмонийной соли, 1 г имидазола, 1,1. г дитиодипиридина. Сосуд вакуумировали, затем заполнили аргоном, прибавили 25 мл сухого ДМФА, затем 500 мкл триэтиламина, перемешали и прибавили 1,3 г сухого трифенилфосфина. Далее реакционную массу перемешивали, в течение 1 часа наблюдалось полное растворение осадка. Далее реакционную массу перемешивали 20 часов, затем разбавили до 200 мл ацетоном и центрифугировали. Выпавший осадок промыли ацетоном трижды и высушили, получив 1,7 г (колич.) имидазолида в виде белого порошка.

Пример 8. Получение LNA-G 5'-дифосфата

В пробирку шлёнка объёмом 50 мл, снабжённую мешальником, поместили 1 г имидазолида LNA-гуанозина-5'-монофосфата, вакуумировали и заполнили аргоном, затем прибавили 25 мл сухого метилпирролидона. Перемешивали до полного растворения осадка, после чего к реакционной массе прибавили 700 мг ортофосфата трибутиламмония и 953 мг безводного хлорида цинка, реакционную массу перемешивали 12 часов. Реакционную массу разбавили 200 мл воды, содержащей 2,86 г ЭДТА и хроматографировали на DEAE в системе вода-1М бикарбонат триэтиламмония в градиенте 5-50% в 10 объёмах колонки. Целевой пик, выходящий на 0,4 М, упарили и кристаллизовали из ацетонитрила, получив 1 г LNA-гуанозина 5'-дифосфата в виде бис-триэтиламмонийной соли.

Пример 9. Получение LNA-m7G 5'-дифосфата

В трёхгорлую колбу, снабжённую мешалкой, капельной воронкой и pH электродом, поместили 5,22 г (10 ммоль) бис-триэтиламмонийной соли LNA-гуанозиндифосфата, прибавили 200 мл воды, затем оттитровали раствор до pH 4,0 уксусной кислотой. Далее к раствору прибавили 15 мл (158 ммоль, 15,8 экв) диметилсульфата, и при интенсивном перемешивании постепенно прибавили 150 мл 1M раствора гидроксида натрия, поддерживая pH раствора в диапазоне 3,8-4,2. Прибавление занимает суммарно около 3 часов. Далее реакционную массу экстрагировали трижды этилацетатом (250 мл), водную фазу подтитровали до pH 6,8-7,0 2 M раствором бикарбоната триэтиламмония, разбавили в 10 раз водой, 1/3 от полученного раствора нанесли на колонку Kronlab EcoPlus 50*250 мм, упакованную 200 мл собрента HEMA S 1000 DEAE 20um, уравновешенную 50 mM раствором бикарбоната триэтиламмония pH 7,6 и хроматографировали в градиенте концентрации раствора бикарбоната триэтиламмония 50-600 mM в 10 CV. Основной пик, выходящий в 0,3 M собрали, объединили. Объединённую целевую фракцию упарили под вакуумом при температуре бани 38°C, повторно соупарили с водой дважды, затем продукт залили сухим ацетонитрилом и оставили кристаллизоваться. Осадок отфильтровали на фильтре P4, высушили под вакуумом, затем под вакуумом над оксидом фосфора, получив 2,04 г (34%) LNA-7-метилгуанозина-5'-дифосфата триэтиламмонийной соли в виде белого пушистого порошка.

Пример 10. Получение имидазолида LNA-m7G 5′-дифосфата

В сосуд шлёнка объемом 100 мл, снабженный мешалкой, поместили 2,04 г LNA-7-метилгуанозина-5'-дифосфата триэтиламмонийной соли соли, 1 г имидазола, 1,1 г дитиодипиридина. Сосуд вакуумировали, затем заполнили аргоном, прибавили 25 мл сухого ДМФА, затем 500 мкл триэтиламина, перемешали и прибавили 1,3 г сухого трифенилфосфина. Далее реакционную массу перемешивали, в течение 1 часа наблюдалось полное растворение осадка. Далее реакционную массу перемешивали 20 часов, затем разбавили до 200 мл ацетоном и центрифугировали. Выпавший осадок промыли ацетоном трижды и высушили, получив 1,8 г(колич.) имидазолида в виде белого порошка.

Пример 11. Получение кэпирующего реагента LNA-m7Gpppm6AmpG

В пробирку шлёнка объёмом 50 мл, снабжённую мешальником, поместили 1 г имидазолида LNA-7-метилгуанозина-5'-дифосфата, вакуумировали и заполнили аргоном, затем прибавили 25 мл сухого метилпирролидона. Перемешивали до полного растворения осадка, после чего к реакционной массе прибавили 645 мг динуклеотидфосфата и 953 мг безводного хлорида цинка, реакционную массу перемешивали 12 часов. Реакционную массу разбавили 200 мл воды, содержащей 2.86 г ЭДТА и хроматографировали на DEAE в системе вода-1 М бикарбонат триэтиламмония в градиенте 5-60% в 10 объёмах колонки.

Пример 12. Реакция котранскрипционного кэпирования мРНК

Данный пример демонстрирует, что разработанный тринуклеотидный кэпирующий реагент LNA-m7Gpppm6AmpG может быть включен в мРНК in vitro. На первом этапе был разработан дизайн нескольких двуцепочечных ДНК-матриц, которые содержали гены различных целевых белков:

- ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP), или

- ген люциферазы (luc), или

- ген S белка вируса SARS-CoV-2,

а также все регуляторные элементы, необходимые экспрессии гена целевого белка.

ДНК была синтезирована ЗАО «Евроген».

Молекулу ДНК лианеризовали путем гидролиза рестриктазой bspQI (New England Biolabs Inc). Реакцию проводили согласно рекомендациям производителя.

Реакцию транскрипции проводили с использованием 25 мкг/мл транскрипционной матрицы, буфера для кэпирования, 1000 ед/мл ингибитора мышиной РНКазы (каталог New England Biolabs #M0314), 2 ед/мл неорганической пирофосфатазы (каталог New England Biolabs #M2403), 4000 единиц/мл РНК-полимеразы T7 (каталог New England Biolabs #M0251) и 6 мМ тринуклеотидного кэпирующего реагента, по 1,5 мМ GTP и по 7,5 мм каждого из ATP, CTP и UTP. Специалисту в данной области ясно, что другие полимеразы, такие как РНК-полимеразы T7, T3 или SP6, могут быть использованы вместо РНК-полимеразы T7 для выполнения той же функции с использованием их соответствующих промоторов. Реакционную смесь инкубировали при 37°C в течение 2 часов. В реакцию добавляли 10 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 2,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ CaCl₂ и 100 ед/мл ДНКазы I (каталог New England Biolabs #M0303) и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Полученную мРНК очищали с помощью набора RNeasy Maxi (каталог Qiagen №75162) в соответствии с инструкциями производителя. мРНК элюировали в воде и дефосфорилировали путем доведения раствора до 50 мМ бис-трис-пропановой HCl (pH 6,0), 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂ и 250 единиц/мг антарктической фосфатазы (каталог New England Biolabs #M0289). Реакцию инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Полученную мРНК очищали с помощью набора RNeasy Maxi (каталог Qiagen №75162) в соответствии с инструкциями производителя и растворяют в воде.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено 3 препарата РНК, кэпированных разработанным реагентом: mRNA-GFP (кодирующая последовательность зеленого флуоресцирующего белка), mRNA-luc (кодирующая последовательность люциферазы), mRNA-S (кодирующая последовательность S белка вируса SARS-CoV-2).

Одновременно, был получен ряд мРНК (mRNA-AG-luc, mRNA-AG-S), кэпированных коммерчески доступным реагентом - cap1 analog AG (Biolabmix, согласно инструкции производителя) и кодирующих последовательности люциферазы и S белка вируса SARS-CoV-2, соответственно.

Пример 13. Оценка трансляционной активности мРНК, несущей ген зеленого флуоресцирующего белка, в экспериментах in vitro

Трансляционную активность mRNA-GFP, кэпированной разработанным реагентом (см. пример 12) оценивали в культуре клеток эмбриональной почки человека (НЕК293). Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, L-глютамина, незаменимых аминокислот и пенициллина/стрептомицина при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Клетки трансфицировали 400 нг mRNA-GFP, смешанной с Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), согласно инструкции производителя. Через 24 часа оценивали экспрессию GFP. На фиг. 1 представлены фотографии клеток, трансфицированных mRNA-GFP и контрольных клеток. Изображения были сделаны под цифровым инвертированным микроскопом в ультрафиолетовом свете при 10-× увеличении. Как видно из представленных данных в клетках, трансфицированных mRNA-GFP, наблюдаются высокие уровни экспрессии белка GFP.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, разработанный реагент эффективно кэпирует мРНК в ходе транскрипции и обеспечивает ее трансляцию.

Пример 14. Упаковка молекул мРНК в липидные частицы

Препараты мРНК (mRNA-luc, mRNA-S и mRNA-AG-luc, mRNA-AG-S), получение которых описано в примере 12 инкапсулировали в липидные наночастицы (ЛНЧ) с использованием процесса микрофлюидного смешивания раствора мРНК (pH 3,0) с раствором липидов, растворенных в спирте. Для этого липиды растворяли в 96% этаноле при молярных соотношениях 46,3:9:42,7:1,6 (ионизируемый липид (ALC-0315): дистеароилфосфатидилхолин: холестерин: пегилированный липид (ПЭГ-липид)). Раствор липидов объединяли с 10 мМ цитратного буфера (pH 3,0), содержащим мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор:этанол), используя микрожидкостное смешивание с помощью Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Препараты подвергали диализу против раствора PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), pH 7,2, в диализных кассетах Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) в течение не менее 24 часов. Полученные формуляции затем стерилизовали через фильтр 0,22 мкм и хранили при 4°C (PBS) до использования. Размер и дзета-потенциал частиц измеряли с помощью динамического светорассеяния с использованием прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical). Инкапсуляция мРНК составляла около 90% (измерено с помощью анализа RiboGreen - Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Reagent, Thermo Fisher Scientific).

В результате проведенной работы было получено 4 препарата липидных частиц, содержащих мРНК, кэпированную разработанным реагентом (mRNA-luc, mRNA-S) или кэпированную известным реагентом cap1 analog AG, Biolabmix (mRNA-AG-luc, mRNA-AG-S). Полученные липидные частицы использовались для экспериментов in vivo.

Пример 15. Оценка трансляционной активности мРНК, несущей ген люциферина, в экспериментах in vivo

Цель данного эксперимента заключалась в оценке трансляционной активности мРНК, кэпированной разработанным реагентом. В качестве препарата сравнения использовалась мРНК, кэпированная известным реагентом cap1 analog AG, Biolabmix.

В эксперименте использовались мыши линии BALB/c (18-20 г), которые были разделены на 3 группы по 5 шт. Животным внутримышечно однократно вводились тестируемые препараты липидных частиц, содержащих мРНК (пример 14) в дозе 10 мкг/мышь или фосфатно-солевой буфер. Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) mRNA-luc,

2) mRNA-AG-luc,

3) фосфатно-солевой буфер.

Через 3 часа мышам вводили по 100 мкл раствора 15 мг/мл специфического субстрата люциферазы: D-люциферина (кат. № P1041, Promega, США). Через 5 минут после введения субстрата проводили измерение биолюминесценции на приборе Lumina II (Perkin Elmer, США). Полученные данные представлены на фиг. 2.

Как видно из результатов эксперимента, у животных, которым вводили мРНК, кэпированную разработанным реагентом, наблюдались более высокие уровни люминесценции по сравнению с мРНК, кэпированной известным реагентом.

Таким образом, результаты эксперимента показывают, что разработанный тринуклеотидный кэпирующий реагент обеспечивает улучшенную эффективность трансляции мРНК.

Пример 16. Иммунизация мышей мРНК, несущей ген белка Spike SARS-CoV2

Цель данного эксперимента заключалась в оценке трансляционной активности мРНК, кэпированной разработанным реагентом. В качестве препарата сравнения использовалась мРНК, кэпированная известным реагентом cap1 analog AG, Biolabmix.

В эксперименте использовались мыши линии BALB/c (18-20 г), которые были разделены на 3 группы по 10 шт. Животным внутримышечно двукратно (с интервалом 15 дней) вводились тестируемые препараты липидных частиц, содержащих мРНК (пример 14) в дозе 10 мкг/мышь или фосфатно-солевой буфер. Таким образом было получены следующие группы животных:

1) mRNA-S,

2) mRNA-AG-S,

3) фосфатно-солевой буфер.

Через 14 и 28 дней после первого введения препарата у животных отбирали образцы крови. Сыворотку крови в дальнейшем использовали для определения титра связывающих антител.

Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Методом 2-х кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены на фиг. 3.

Как видно из представленных данных титр антител в группе животных иммунизированных мРНК, кэпированной разработанным тринуклеотидным кэпирующим реагентом, был достоверно выше, чем в группе животных, иммунизированных мРНК, кэпированной известным кэпирующим реагентом.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что мРНК, кэпированная разработанным тринуклеотидным кэпирующим реагентом проявляет более высокую трансляционную активность, по сравнению с мРНК, кэпированной известным кэпирующим реагентом.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают способность разработанного тринуклеотидного кэпирующего реагента котранскрипционно включаться в структуру мРНК и обеспечивать улучшенную эффективность трансляции мРНК. Разработанный кэпирующий реагент может применяться в производстве профилактических и терапевтических препаратов на основе мРНК.

Изобретение относится к тринуклеотидному кэпирующему реагенту, представленному формулой, где R означает H или Me, или его соли, приемлемой для реакции транскрипции, а также к комплексу для котранскрипционного кэпирования мРНК, способу его получения и применению тринуклеотидного кэпирующего реагента для котранскрипционного кэпирования мРНК. Технический результат: получен новый тринуклеотидный кэпирующий реагент, который включается в структуру мРНК котранскрипционно и обеспечивает улучшенную эффективность трансляции мРНК. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 16 пр.

1. Тринуклеотидный кэпирующий реагент, представленный формулой

где R означает H или Me, или его соль, приемлемая для реакции транскрипции.

2. Комплекс для котранскрипционного кэпирования мРНК, включающий тринуклеотидный кэпирующий реагент по п.1 и ДНК-матрицу, которая содержит промоторную область, содержащую сайт начала транскрипции, имеющий первый нуклеотид в нуклеотидном положении +1 и второй нуклеотид в нуклеотидном положении +2; при этом тринуклеотидный кэпирующий реагент по п.1 гибридизован с ДНК-матрицей по меньшей мере в положениях нуклеотидов +1 и +2.

3. Способ получения тринуклеотидного кэпирующего реагента по п.1, содержащий следующие стадии:

(а) получение динуклеотида методом жидкофазного олигонуклеотидного синтеза по амидофосфитной методологии исходя из 2',3'-защищённого производного гуанозина и защищённого (2',6-диметил)аденизилфосфоамидита с последующим 5'-фосфорилированием;

(б) получение LNA-(3-метокси)гуанозиндифофата из LNA-(3-метокси)гуанозин-диола химическим фосфорилированием с оксохлоридом фосфора с последующим получением активированного имидазолидного производного и конденсацией с ортофосфатом;

(в) получение P2-имидазолидного производного LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата путем селективного метилирования под действием диметилсульфата в контролируемом pH с последующим получением имидазолидного производного под действием дитиодипиридина;

(г) получение тринуклеотидного кэпирующего реагента по реакции P2-имидазолидного производного LNA-7-метил-(3-метокси)гуанозиндифофата с динуклеотид(2',6-диметил)аденизилгуанозин-5'-фосфатом при катализе солями двухвалентных металлов.

4. Способ получения по п.3, где соли двухвалентных металлов выбраны из солей кальция, магния, цинка, кадмия или кобальта.

5. Применение тринуклеотидного кэпирующего реагента по п.1 для котранскрипционного кэпирования мРНК.