Область техники
Изобретение относится к катионным липидам для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro и in vivo, способу их получения, а также к их применению. Предложенные варианты катионных липидов, а также липидные частицы на их основе могут применяться для разработки профилактических и терапевтических препаратов на основе РНК.
Уровень техники
Открытия двух последних десятилетий позволили рибонуклеиновой кислоте (РНК) стать многообещающим инструментом в области разработки профилактических и терапевтических препаратов. Использование РНК обладает рядом преимуществ по сравнению с другими технологическими платформами для разработки лекарственных препаратов. Средства на основе РНК могут быть разработаны и протестированы в короткие сроки. Технология позволяет синтезировать белки непосредственно в организме, устраняя необходимость очистки и долговременной стабилизации белка. Природные свойства РНК позволяют избежать противовекторного иммунитета, таким образом обеспечивая возможность многократного введения препарата. Препараты, полученные на основе РНК, способны индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Возможность получения РНК в бесклеточных системах позволяет организовать масштабируемое и экономически эффективное производство.
Однако физико-химические и биологические свойства РНК создают трудности для ее доставки непосредственно в клетки. РНК не способна проходить через клеточную мембрану из-за своего отрицательного заряда, гидрофильности и большой молекулярной массы, а также может быстро разрушаться ферментами. Следовательно, возникает настоятельная необходимость в использовании систем доставки, чтобы безопасно, эффективно и многократно вводить РНК в целевые ткани. Такая система доставки должна обладать целевой специфичностью, обеспечивать защиту от ферментативной деградации, гарантировать внутриклеточное поглощение РНК и выход из эндосомы или лизосомы в цитозоль.
Первоначально были разработаны вирусные системы доставки РНК, однако эффективность этих подходов в некоторых случаях была ограничена ранее существовавшим иммунитетом, иммуногенностью, индуцируемой вирусом, нежелательной геномной интеграцией, ограничениями по размеру полезной нагрузки, невозможностью повторной дозы, осложнениями, связанными с увеличением масштаба, а также дорогостоящим производством векторов [Paunovska, K., Loughrey, D. & Dahlman, J.E. Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nat Rev Genet 23, 265-280 (2022). https://doi.org/10.1038/s41576-021-00439-4].
Поиск более безопасных альтернатив привёл к созданию систем для эффективной и целевой доставки РНК на основе наночастиц. Наночастицы представляют собой субмикроскопические коллоидные частицы в диапазоне нанометровых размеров, по крайней мере с одним измерением до 100 нм, которые могут захватывать или адсорбировать молекулы лекарств, белки или нуклеиновые кислоты. Небольшой размер облегчает движение наночастиц в тонких капиллярных слоях тканей, тем самым приводя к доставке захваченной терапевтической молекулы в различные ткани организма. Более того, наночастицы могут легко поглощаться клетками и, таким образом, могут использоваться для доставки лекарств к внутриклеточным мишеням. Существует широкий спектр химических соединений, которые могут участвовать в формировании наночастиц для доставки РНК.
Первая проблема, которую необходимо преодолеть при доставке РНК, заключается в предотвращении агрегации комплексов во внеклеточной среде и получении размера, который может быть интернализован клетками. Включение полиэтиленгликоля (ПЭГ) или молекул сахара, например, циклодекстрина и гиалуроновой кислоты (ГК) на поверхности наночастиц, выполняется для предотвращения агрегации [Bartlett D.W., Su H., Hildebrandt I.J., Weber W.A., Davis M.E. 2007. Impact of tumor-specific targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles measured by multimodality in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 104:15549-15554].
Второе препятствие при доставке РНК связано с ее размером и наличием полианионных зарядов. Из литературных данных известно об использовании проникающих в клетки пептидов (CPP) и холестерина для усиления интернализации РНК [Moschos S.A., Jones S.W., Perry M.M., Williams A.E., Erjefalt J.S., Turner J.J. et al. 2007. Lung delivery studies using siRNA conjugated to TAT(48-60) and penetratin reveal peptide induced reduction in gene expression and induction of innate immunity. Bioconjug Chem. 18:1450-1459. Muratovska A, Eccles MR. 2004. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells. FEBS Lett. 558:63-68]. Известны различные поликатионные формулы, включающие хитозан, полиаргинин, полилизин, гистидилированные полилизиновые пептиды, полиэтиленимин (ПЭИ) и полиамидоаминовые дендримеры [Malhotra M., Kulamarva A., Sebak S., Paul A., Bhathena J., Mirzaei M., Prakash S. 2009. Ultrafine chitosan nanoparticles as an efficient nucleic acid delivery system targeting neuronal cells. Drug Dev Ind Pharm. 35:719-726. Malhotra M., Lane C., Tomaro-Duchesneau C., Saha S., Prakash S. 2011. A novel method for synthesizing PEGylated chitosan nanoparticles: strategy, preparation, and in vitro analysis. Int J Nanomedicine. 6:485-494. Malhotra M., Tomaro-Duchesneau C., Prakash S. 2013a. Synthesis of TAT peptide-tagged PEGylated chitosan nanoparticles for siRNA delivery targeting neurodegenerative diseases. Biomaterials. 34:1270-1280. Malhotra M., Tomaro-Duchesneau C., Saha S., Kahouli I., Prakash S. 2013b. Development and characterization of chitosan-PEG-TAT nanoparticles for the intracellular delivery of siRNA. Int J Nanomedicine. 8:2041-2052. Malhotra M., Tomaro-Duchesneau C., Saha S., Prakash S. 2013c. Systemic siRNA Delivery via Peptide-Tagged Polymeric Nanoparticles, Targeting PLK1 Gene in a Mouse Xenograft Model of Colorectal Cancer. Int J Biomater. 2013:252531].
Следующим критическим этапом в процессе доставки мРНК в цитозоль является выход из эндосомы. Одной из стратегий, которую используют для эндосомального побега, является применение катионных полимеров, например, полиамидоаминовых дендримеров или полилизина, что приводит к физическому разрушению отрицательно заряженной эндосомальной мембраны из-за его прямого взаимодействия с катионным полимером [Zhang Z.Y., Smith B.D. 2000. High-generation polycationic dendrimers are unusually effective at disrupting anionic vesicles: membrane bending model. Bioconjug Chem. 11:805-814]. Другие стратегии предполагают использование либо восстановительно-чувствительных, либо pH-чувствительных полимеров.
Полиэтиленимины (ПЭИ) являются наиболее широко исследованными полимерами для доставки мРНК. Благодаря обилию аминогрупп ПЭИ могут обеспечивать высокую плотность положительных зарядов для комплексообразования мРНК и выхода из эндосомы. Согласно гипотезе «протонной губки», буферная способность ПЭИ приводит к осмотическому набуханию и разрыву эндосом, что приводит к высвобождению РНК в цитоплазму [Akinc A. Thomas M. Klibanov A.M. Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. J. Gene Med. 2005; 7: 657-663]. Благодаря этому системы доставки на основе ПЭИ успешно применяются для доставки РНК in vitro. Однако, при доставке in vivo существуют серьезные ограничения, связанные в первую очередь с неудовлетворительным профилем безопасности. ПЭИ с высокой молярной массой демонстрируют значительную эффективность доставки нуклеиновых кислот, но страдают серьезной цитотоксичностью, в то время как ПЭИ с низкой молярной массой минимально токсичны, однако обладают сниженной эффективностью доставки РНК.
Другим известным техническим решением, является использования производных полиаспартамида (поли(PAsp(DET)), которые обеспечивают эффективный эндосомальный выход РНК за счет pH-зависимого протонирования N-(2-аминоэтил)-2-аминоэтильных групп в боковой цепи PAsp(DET) [Kim H.J., Ishii A., Miyata K., Lee Y., Wu S., Oba M. et al. 2010. Introduction of stearoyl moieties into a biocompatible cationic polyaspartamide derivative, PAsp(DET), with endosomal escaping function for enhanced siRNA-mediated gene knockdown. J Control Release. 145:141-148]. Блок-сополимеры диметиламиноэтилметакрилата (DMAEMA) и пропилакриловой кислоты (PAA), которые подвергаются структурным перестройкам из-за кислого pH эндосом, также исследуются для доставки РНК [Convertine AJ, Benoit DS, Duvall CL, Hoffman AS, Stayton PS. 2009. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J Control Release. 133:221-229]. Блок состоит из PAA и катионного компонента комплексообразования, который опосредует гидрофильный-гидрофобный переход при эндосомальном pH, вызывая разрушение мембраны. Другой стратегией доставки РНК является использование термочувствительных катионных полимерных нанокапсул. Данные нанокапсулы могут вызывать физическое разрушение эндосомы из-за температурно-индуцированного набухание (~119 нм при 37°C и ~412 нм при 15°C) [Lee S.H., Choi S.H., Kim S.H., Park T.G.. 2008. Thermally sensitive cationic polymer nanocapsules for specific cytosolic delivery and efficient gene silencing of siRNA: Swelling induced physical disruption of endosome by cold shock. J Control Release. 125:25-32].
Известно техническое решение RU 2617641 C2 (опубл. 25.04.2017), в котором описаны новые низкомолекулярные катионные липиды с одной короткой липидной цепью, которые способны усиливать эффективность доставки миРНК in vivo. В изобретении раскрыто применение указанных катионных липидов в комбинации с другими липидными компонентами, такими как холестерин и PEG-липиды, для формирования липидных наночастиц с олигонуклеотидами. В частном случае, олигонуклеотиды могут представлять собой миРНК.
В патенте RU 2718053 C2 (опубл. 30.03.2020) описан ряд триалкилкатионных липидов, липидные частицы, содержащие один или более триалкилкатионный липид, способы получения липидных частиц, а также способы доставки и/или введения липидных частиц (например, для лечения заболеваний у млекопитающих).
В заявке RU 2020124751 A (опубл. 28.01.2022) описан ряд катионных липидов, липидные частицы на их основе, а также композиция для введения нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую кислоту и указанную липидную частицу. Существует вариант изобретения, в котором нуклеиновая кислота представляет собой РНК. При этом РНК представляет собой мРНК или миРНК.
В патенте RU 2747559 C1 (опубл. 06.05.2021) описан незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения и применение для доставки нуклеиновых кислот in vitro. Способ получения композиции характеризуется тем, что липидную пленку, состоящую из соответствующих поликатионного амфифила, нейтрального фосфолипида и незаряженного липида, гидратируют в воде, затем полученную эмульсионно-дисперсионную систему подвергают ультразвуковой обработке. Данный незаряженный липид может найти применение для доставки протяженных и коротких нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих.
В изобретении RU 2577983 C2 (опубл. 20.03.2016) описан ряд новых липидов для доставки мРНК, а также липосомы на их основе. Показано, что в данные липосомы может быть инкапсулирована РНК, кодирующая целевой полипептид. Кроме того, в патенте раскрыта фармацевтическая композиция для повышения иммунной реакции у позвоночного, содержащая вышеуказанную липосому, а также способ повышения защитной иммунной реакции у позвоночного.
В патенте RU 2440380 C2 (опубл. 20.04.2017) описан катионный липополимер, включающий полиэтилениминную биодеградируемую группу и относительно гидрофобную группу «липо» группу, а также его комплекс с биомолекулой, при этом биомолекулой является нуклеиновая кислота. В изобретении также раскрыт способ доставки биомолекулы к эукариотической клетке, включающий контактирование клетки с полимером по п.1 для доставки биомолекулы в клетку. Также раскрыт способ доставки биомолекулы дополнительно включающий перемещение клетки.
В патенте RU 2738060 C2 (опубл. 25.01.2012) описана группа изобретений касающихся водной липосомной дисперсии, содержащей липосомы, содержащие DOPE и по меньшей мере один катионный липид, выбранный из группы, состоящей из DOTMA и DOTAP, и по меньшей мере один регулятор рН, причем водный состав характеризуется значением рН между 2 и 5,5, где указанные липосомы являются катионными при физиологическом рН. Группа изобретений также касается способа получения водной липосомной дисперсии; набора для получения фармацевтической композиции, где указанный набор содержит водную липосомную дисперсию и, в отдельном контейнере, фармацевтически активную нуклеиновую кислоту; фармацевтической композиции для доставки лекарственного средства.
К настоящему времени разработано несколько препаратов на основе РНК, в которых реализованы различные стратегии доставки. В препаратах на основе миРНК: Leqvio® (инклизиран), GIVLAARI™ (гивосиран), Oxlumo™ (люмазиран) и AMVUTTRA™ (вутризиран) используется N-ацетилгалактозамин (GalNAc), конъюгированный с миРНК. GalNAc высокоселективно связывается с азиалогликопротеином (ASGPR), который в изобилии экспрессируется в клетках гепатоцитов, что приводит к быстрому эндоцитозу [Nair, J.K., Willoughby, J.L.S., Chan, A., Charisse, K., Alam, M. R., Wang, Q. et al. (2014). Multivalent N-acetylgalactosamine-conjugated siRNA localizes in hepatocytes and elicits robust RNAi-mediated gene silencing. J. Am. Chem. Soc. 136 (49), 16958-16961. doi:10.1021/ja505986a. Crooke, S.T., Witztum, J.L., Bennett, C.F., and Baker, B.F. (2018). RNA-targeted therapeutics. Cell Metab. 27 (4), 714-739. doi:10.1016/j.cmet.2018.03.004. Jeon, J.Y., Ayyar, V.S., and Mitra, A. (2022). Pharmacokinetic and pharmacodynamic modeling of siRNA therapeutics - a minireview. Pharm. Res. 39 (8), 1749-1759. doi:10.1007/s11095-022-03333-8. Zhang L., Liang Y., Liang G., Tian Z., Zhang Y., Liu Z., Ji X. The therapeutic prospects of N-acetylgalactosamine-siRNA conjugates. Front Pharmacol. 2022 Dec 14;13:1090237. doi: 10.3389/fphar.2022.1090237. PMID: 36588695; PMCID: PMC9794871].
В препарате на основе миРНК: ONPATTRO® (патисиран), а также в вакцинах против COVID-19 на основе мРНК: Spikevax (эласомеран) производства Moderna и Comirnaty® (тозинамеран) производства Pfizer/BionTech использована технология доставки на основе липидных наночастиц (LNP). Все три препарата имеют много общего в своей формуле. Они состоят из четырех типов липидов: ионизированного липида, фосфолипида, холестерина и ПЭГ-липида. Все 3 ионизируемых липида имеют третичную аминогруппу с pKa 6,0-6,7. Эти липиды переключают свой заряд с нейтрального на катионный в зависимости от нейтрального pH в крови и кислого pH в эндосомах. Все 3 ПЭГ-липида имеют диалкильные цепи длиной 14 атомов углерода, которые важны для быстрой диссоциации с поверхности LNP после попадания внутрь организма [Mui B.L., Tam Y.K., Jayaraman M., Ansell S.M., Du X., Tam Y.Y., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2013;2(12):e139]. Все 3 ионизируемых липида имеют третичные аминогруппы, а именно Dlin-MC3-DMA (MC3), pKa 6,44 [Jayaraman M., Ansell S.M., Mui B.L., Tam Y.K., Chen J., Du X., et al. Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing InVivo. Angew Chem Int Ed. 2012; 51 (34): 8529-8533] или pKa 6,35; ALC-0315, pKa 6,09; и SM-102, pKa 6,68. В отличие от MC3, ALC-0315 и SM-102 имеют эфирные связи в липидном хвосте.
Все три препарата имеют различное биораспределение в тканях, что зависит как от состава липидных частиц, так и от способа введения. Патисиран вводится внутривенно и исследование на крысах с использованием меченого 14 C ионизируемого липида ( 14 C-MC3) показало, что при однократной внутривенной дозе примерно 90% введенной радиоактивности было обнаружено в печени через 4 часа после введения. Что касается Тозинамерана, исследование на крысах с использованием меченого 3 H холестерингексадецилового эфира (3 H-CHE) показало, что при однократной внутримышечной дозе концентрация радиоактивности была самой высокой в месте инъекции между 15 минутами и 48 часами после введения. Помимо этого, общая скорость восстановления радиоактивности для дозы была самой высокой в печени (до 18%) через 8-48 часов после введения. Кроме того, было показано, что все три препарата имеют различный профиль безопасности. Так, было показано, что несмотря на выдающуюся эффективность доставки миРНК, длительное сохранение MC3 в тканях может вызвать неожиданные побочные эффекты и затруднить его дальнейшее применение при повторном и хроническом введении. R. Ma, Y. Li, Y. Wei, J. Zhou, J. Ma, M. Zhang, J. Tu, J. Jiang, S. Xie, W. Tan, X .Liu. The dynamic process of mRNA delivery by lipid nanoparticles in vivo. Nano Today, V. 57, 2024, https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102325]. Также сообщалось о ряде нежелательных эффектов у пациентов, связанных с вакцинацией эласомераном и тозинамераном. Анализ результатов клинических исследований данных препаратов показал, что в совокупности риск нежелательных побочных эффектов у реципиентов мРНК вакцин был повышен на 16%. Помимо острых реакций, связанных с реактогенностью препаратов (лихорадка, головная боль, усталость, миалгия, артралгия, озноб и т. д.), в ряде случаев наблюдались тяжелые воспалительные/аутоиммунные реакции в костном мозге, печени, опорно-двигательном аппарате, эндокринной и нервной системах [B. Igyarto,Z Qin. The mRNA-LNP vaccines - the good, the bad and the ugly? Front. Immunol., 08 February 2024, Sec. Vaccines and Molecular Therapeutics Volume 15 - 2024 https://doi.org/10.3389/fimmu.2024.1336906].
Таким образом, разработка средств на основе РНК является перспективным направлением развития фармацевтической промышленности. При этом одним из основных факторов, обеспечивающих эффективность данной категории препаратов, являются системы доставки вектора на основе РНК в клетку. Было показано, что использование различных ионизируемых и катионных липидов может приводить как к изменению эффективности доставки, так и к изменению тропности препарата к различным тканям. Разработка новых терапевтических и профилактических препаратов требует более высокоспецифичной доставки мРНК и минимизации нецелевых эффектов. Поэтому в уровне техники существует потребность в разработке новых композиций для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo.
Раскрытие изобретения
Целью данного изобретения является расширение арсенала средств для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих.
Технический результат заключается в создании катионного липида, который способен образовывать липидные частицы в комплексе с нуклеиновой кислотой и обеспечивает ее эффективную доставку как in vitro, так и in vivo.
Указанный технический результат достигается тем, что создан катионный липид, имеющий структурную формулу (1):
где R - первичные алкильные группы с длиной цепи от 7 до 17 атомов углерода,
Q - линкерная группа структуры -C(O)NH-, или -C(O)O-, или -OC(O)-,
X - аминогруппа или диметиламиногруппа.
При этом в частном варианте катионный липид имеет структурную формулу (2):
(2)
Также разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (3):
(3)
Кроме того, разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (4):
(4)
В другом варианте выполнения изобретения катионный липид имеет структурную формулу (5):
(5)
Также разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (6):
(6)
Существует вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (7):
(7)
Также разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (8):
(8)
Кроме того, разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (9):
А также разработан вариант выполнения изобретения, в котором катионный липид имеет структурную формулу (10):
Также технический результат достигается тем, что разработан способ получения катионного липида общей формулы (1), содержащий стадии модификации гетероцикла третбутоксикарбонильным производным аминокислоты, последующим ацилированием соединениями, содержащими алкильные заместители, дальнейшим деблокированием и восстановительным аминированием аминогрупп аминокислоты.
Кроме того, технический результат достигается тем, что предложено применение катионного липида общей формулы (1) для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro.
Также технический результат достигается тем, что предложено применение катионного липида общей формулы (1) для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vivo.
Осуществление изобретения
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлены результаты оценки экспрессии EGFP в клетках НЕК293 после добавления к ним вариантов полученных липидных частиц с упакованной мРНК-EGFP.
1. Липидные частицы, содержащие К331.
2. Липидные частицы, содержащие К301.
3. Липидные частицы, содержащие К336.
4. Липидные частицы, содержащие К330.
5. Липидные частицы, содержащие К302.
6. Липидные частицы, содержащие К303.
7. Липидные частицы, содержащие К304.
8. Липидные частицы, содержащие К305.
9. Липидные частицы, содержащие К306.
10. Интактные клетки.
На фиг.2 представлены результаты оценки экспрессии EGFP в клетках НЕК293 после добавления к ним вариантов полученных липидных частиц с упакованной pCMV-EGFP.
1. Липидные частицы, содержащие К331.
2. Липидные частицы, содержащие К301.
3. Липидные частицы, содержащие К336.
4. Липидные частицы, содержащие К330.
5. Липидные частицы, содержащие К302.
6. Липидные частицы, содержащие К303.
7. Липидные частицы, содержащие К304.
8. Липидные частицы, содержащие К305.
9. Липидные частицы, содержащие К306.
10. Интактные клетки.
На фиг.3 представлены результаты измерения люминесценции in vivo у животных, которым внутримышечно вводили липидные частицы, содержащие катионные липиды, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин, мРНК-luc
1. Липидные частицы, содержащие К330
2. Липидные частицы, содержащие К331.
3. Липидные частицы, содержащие К336.
На фиг.4 представлены результаты измерения люминесценции in vitro в клетках НЕК 293 после добавления липидных частиц, содержащих заявленные катионные липиды, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем.
1. Липидные частицы, содержащие К331.
2. Липидные частицы, содержащие К301.
3. Липидные частицы, содержащие К336.
4. Липидные частицы, содержащие К330.
5. Липидные частицы, содержащие К302.
6. Липидные частицы, содержащие К303.
7. Липидные частицы, содержащие К304.
8. Липидные частицы, содержащие К305.
9. Липидные частицы, содержащие К306.
На фиг.5 представлены результаты измерения люминесценции in vivo у животных, которым внутримышечно вводили липидные частицы, содержащие катионные липиды, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин, липид, связанный с полиэтиленгликолем мРНК-luc
1. Интактные животные.
2. Группа животных, которым вводили липидные частицы, содержащие К330.
3. Группа животных, которым вводили липидные частицы, содержащие К331.
На фиг.6 представлены результаты измерения люминесценции in vitro в клетках ТНР-1 после добавления липидных частиц, содержащих катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид), мРНК luc.
1. 5%К331.
2. 15%К331.
3. 30%К331.
4. 50%К331.
5. 100%К331.
На фиг.7 представлены результаты измерения люминесценции in vitro в клетках НЕК293 после добавления липидных частиц, содержащих катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид), рCMV-luc (ДНК).
1. 5%К331.
2. 15%К331.
3. 30%К331.
4. 50%К331.
5. 100%К331.
На фиг.8 представлены результаты измерения люминесценции in vivo у животных, которым внутримышечно вводили липидные частицы, содержащие катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315 и SM-102, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид), мРНК-luc.
1. Интактные животные.
2. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы.
На фиг.9 представлены результаты измерения люминесценции in vivo у животных, которым внутримышечно вводили липидные частицы, содержащие катионный липид К331, ионизируемый липид SM-102, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем, мРНК-luc.
1. Интактные животные.
2. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 0%К331, повтор 1.
3. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 0%К331, повтор 2.
4. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 2,5%К331, повтор 1.
5. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 2,5%К331, повтор 2.
На фиг.10 представлены результаты измерения объема опухоли у животных с мелономой В16, которым вводили липидные частицы, ALC-0315, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем, мРНК-М30.
1. Интактные животные.
2. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 1%К336.
3. Животные, которым вводили исследуемые липидные частицы, содержащие 0%К336.
На фиг.11 представлены результаты интраназального введения разработанных липидных частиц.
1. Интактные животные.
2. Экспериментальные животные.
На фиг.12 представлены результаты подкожного введения разработанных липидных частиц.
1. Интактные животные.
2. Экспериментальные животные.
А - 430 нг/мышь,
В - 860 нг/мышь
С - 1,72 мкг/мышь.
На фиг.13 представлены результаты внутрибрюшинного введения разработанных липидных частиц.
1. Интактные животные.
2. Экспериментальные животные.
На фиг.14 представлены результаты внутривенного введения разработанных липидных частиц.
1. Интактные животные.
2. Экспериментальные животные.
Катионные липиды являются амфифилами со структурами, аналогичными природным фосфолипидам. Разница заключается в наличии катионного заряда на молекуле, в отличие от любого природного фосфолипида. Катионные липиды являются амфифильными из-за наличия длинных углеводородных цепей, а гидрофильность обеспечивается заряженной группой из-за первичного или третичного азота. Для создания липидных частиц способных обеспечивать эффективную доставку нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo был выбран катионный липид, имеющий структурную формулу (1):
где R - первичные алкильные группы с длиной цепи от 7 до 17 атомов углерода,
Q - линкерная группа структуры -C(O)NH-, или -C(O)O-, или -OC(O)-,
X - аминогруппа или диметиламиногруппа.
Катионный липид состоит из 3 базовых элементов: гидрофобная часть (хвосты), спейсер, катионная часть (голова).
Спейсер, который связывает гидрофобную и головную заряженную группу, представляет собой насыщенный, не ароматический азотосодержащий гетероцикл с пятью или шестью атомами, содержащий 2 радикала в мета-положении относительно атома азота, по которым присоединяются жирнокислотные остатки, тогда как головная заряжаемая группа присоединена по атому азота. Использование насыщенного гетероцикла в качестве спейсерной группы создает оптически активные центры в местах присоединения алкильных липофильных боковых радикалов. Близкое взаимное расположение боковых липофильных радикалов в сочетании с возможностью комбинации цис-присоединения одной жирной группы и транс-присоединения соседней жирной группы относительно плоскости насыщенного циклического спейсера приводит к увеличению объема липофильной части относительно катионной головы липида (в противоположность параллельному расположению жирных хвостов, например, в триглицеридах, и наподобие получения объемной липофильной части липида через использовании разветвленных жирных хвостов).
Гидрофобная часть созданного катионного липида состоит из алкильных цепей длиной от 8 до 18 атомов углерода. Липофильные хвосты в виде алкил-аминов, алкил-спиртов или алкил-карбоновых кислот присоединяются к спейсеру через боковые радикалы гетероцикла - гидроксильные, карбоксильные или амино- группы. В целом более высокая эффективность доставки нуклеиновых кислот наблюдалась для липидов с более короткими алкильными цепями, что по всей видимости обусловлено снижением жесткости и повышением текучести мембранного бислоя. Однако катионные липиды, содержащие менее 12 атомов углерода, были менее эффективными в доставке нуклеиновых кислот за счет снижения стабильности липидных частиц.
Гидрофобная часть созданного катионного липида связана со спейсером через сложноэфирную, либо амидную связь, либо их комбинацию. При этом использование симметричной структуры с парой сложноэфирных или амидных связей упрощает синтез через уменьшение количества стадий синтеза и снижает вероятность накопления сложно-отделяемых примесей со сходными с целевой молекулой физико-химическими свойствами при окончательной очистке. Использование био-разлагаемых сложноэфирной и амидной химических связей, подверженных внутриклеточному ферментативному расщеплению, позволяет снизить цитотоксичность липидных частиц, что важно для in-vivo применения. Преимуществом сложноэфирной связи является ее чувствительность к изменениям рН в эндосомах, а также гидролиз под действием клеточных эстераз. Внутриклеточная деградация лабильных амидных и сложноэфирных связей приводит к лучшему разрушению комплекса с нуклеиновой кислотой после проникновения в клетку и лучшему выходу нуклеиновых кислот из эндосомы.
Головная заряженная группа представляет собой остаток диаминокарбоновой кислоты. Целевая функциональность достигается любым взаимным расположением аминогрупп в ди-амино-кислот. Также функциональность сохраняется при использовании любых оптических изомеров ди-амино-кислот L и D. С точки зрения повышения биосовместимости липидных частиц предпочтительными являются катионные головные группы на основе L-α-амино-орнитина и L-α-амино-лизина, которые являются естественными для организма аминокиcлотами. Аминогруцпы могут быть как свободными (первичные аминогруппы), так и модифицированными с сохранением возможности приобретения положительного заряда, например, метилированными (моно, ди или три-метилированными), что позволяет также варьировать pKa аминогрупп. Ди-амино-кислоты присоединены к спейсерной группе - гетероциклу - по атому азота через пептидную связь с использованием карбоксильной группы ди-амино-кислоты для сохранения функциональности (возможности положительного заряда) обеих аминогрупп.
Катионный липид был создан путем модификации гетероцикла третбутоксикарбонильным производным аминокислоты с последующим ацилированием соединениями, содержащими алкильные заместители, дальнейшим деблокированием и восстановительным аминированием аминогрупп аминокислоты. При этом было создано 9 вариантов катионного липида, укладывающихся в общую формулу соединения, а именно:
1. Катионный липид К331, который имеет структурную формулу (2):
(2)
2. Катионный липид К301, который имеет структурную формулу (3):
(3)
3. Катионный липид К336, который имеет структурную формулу (4):
(4)
4. Катионный липид К330, который имеет структурную формулу (5):
(5)
5. Катионный липид К302, который имеет структурную формулу (6):
(6)
6. Катионный липид К303, который имеет структурную формулу (7):
(7)
7. Катионный липид К304, который имеет структурную формулу (8):
(8)
8. Катионный липид К305, который имеет структурную формулу (9):
9. Катионный липид К306, который имеет структурную формулу (10):
Из-за своей амфифильной природы созданный катионный липид способен инкапсулировать нуклеиновые кислоты. В экспериментальной работе было показано, что все варианты созданного катионного липида способны образовывать липидные частицы в комплексе с нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновая кислота может представлять как ДНК, так и РНК. Кроме того, было показано, что смесь (композиция) катионных липидов со структурными липидами (например, с фосфатидилхолином и холестерином) и ПЭГ-липидом также способна инкапсулировать нуклеиновые кислоты с образованием липидных частиц. Также было показано, что смесь (композиция) катионных липидов с ионизируемыми липидами, структурными липидами (например, с фосфатидилхолином и холестерином) и ПЭГ-липидом также способна инкапсулировать нуклеиновые кислоты с образованием липидных частиц. При этом добавление катионного липида в композицию может улучшать эффективность доставки нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих. Все вышеперечисленные липидные частицы способны сливаться с клеточной мембраной и обеспечивать выход нуклеиновой кислоты из эндосомы.
Таким образом, результаты экспериментов показали, что все перечисленные выше липидные частицы, состоящие из катионного липида, а также содержащие катионный липид в смеси с другими липидами, обеспечивают эффективную доставку нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo.
Разработанные липидные частицы могут осуществлять доставку в клетки млекопитающих нуклеиновой кислоты, кодирующей ген белка патогена. После доставки нуклеиновой кислоты в клетках начинается синтез белка патогена, к которому в дальнейшем формируется иммунный ответ. Таким образом липидные частицы, которые доставляют данную нуклеиновую кислоту, будут являться профилактическим средством. В настоящее время разрабатываются препараты для профилактики COVID-19, гриппа, бешенства, клещевого энцефалита.
Кроме того, созданные липидные частицы могут применяться для разработки профилактических средств. Например, для создания препарата против меланомы. В данном случае нуклеиновая кислота содержит открытую рамку считывания, кодирующую ген антигена меланомы. После доставки нуклеиновой кислоты в клетках начинается синтез антигена меланомы, к которому в дальнейшем формируется иммунный ответ. Специалисту среднего уровня очевидно, что, таким образом, нуклеиновая кислота может кодировать антигены, характерные и для других опухолевых заболеваний. В другом случае нуклеиновая кислота может содержать открытую рамку считывания, кодирующую ген антитела. После доставки нуклеиновой кислоты в клетки с помощью липидных частиц начинается синтез соответствующих специфических антител. При этом антитела могут распознавать различные белки патогенов, токсины, а также блокировать ингибирующие контрольные точки. Таким образом, созданные липидные частицы могут использоваться для терапии широкого спектра заболеваний.
Осуществление изобретения раскрывается в следующих примерах.
Пример 1. Получение экспрессионного вектора на основе мРНК
Для иллюстрации возможности упаковки мРНК в липидные наночастицы был разработан дизайн нескольких последовательностей мРНК:
1) мРНК-S, содержащая 5’-НТО из мРНК гистона h1.2 человека, усиленный TISU консенсусом (SEQ ID NO:1); открытую рамку считывания, кодирующую S белок вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:2); 3’-НТО из мРНК альфа-субъединицы гемоглобина (SEQ ID NO:3); поли(А) последовательность. Данный экспрессионный вектор на основе мРНК является модельным профилактическим агентом, так как он может использоваться в качестве средства для профилактики COVID-19.
2) мРНК-M30, содержащая 5’-НТО из поздних аденовирусных РНК (TPL) (SEQ ID NO:4); открытую рамку считывания, кодирующую пептид М30 меланомы B16 (SEQ ID NO:5); 3’-UTR из мРНК альфа цепи цитохрома b-245 (SEQ ID NO:6); поли(А) последовательность. Данный экспрессионный вектор на основе мРНК является модельным терапевтическим агентом, так как он может использоваться в качестве средства для терапии меланомы B16.
3) мРНК-EGFP, содержащая 5’-НТО из поздних аденовирусных РНК (TPL) (SEQ ID NO:4); открытую рамку считывания, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (SEQ ID NO:5); 3’-НТО из мРНК альфа-субъединицы гемоглобина (SEQ ID NO:3); поли(А) последовательность. Данная конструкция позволяет оценивать экспрессию целевого белка in vitro.
4) мРНК-luc, содержащая 5’-НТО из поздних аденовирусных РНК (TPL) (SEQ ID NO:4); открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу светлячка (SEQ ID NO:5); 3’-НТО из мРНК альфа-субъединицы гемоглобина (SEQ ID NO:3); поли(А) последовательность. Данная конструкция позволяет качественно и количественно детектировать экспрессию целевого белка как in vitro, так и in vivo.
На основании дизайна мРНК была разработан дизайн последовательности матричной ДНК, которая затем была получена с помощью методов генной инженерии. Далее полученная матричная ДНК, которая представляла собой плазмиду, была линеаризована с использованием рестриктазы BsmBI-v2 (New England Biolabs) при температуре 55°C в течение 3 часов. После этого матричную ДНК очищали из реакционной смеси осаждением смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1), насыщенной 20 мМ Трис-HCl рН 7.9 (ФХ).
Далее проводили реакцию транскрипции in vitro. Для этого в пробирку добавляли: ДНК-матрицу, буфер для T7-транскрипции, ДТТ, смесь рНТФ, T7 РНК-полимеразу, ингибитор РНКаз, стерильную воду. Далее проводили инкубацию в течение 1,5 часов при температуре 37°C. Для удаления ДНК-матрицы в реакционную смесь добавляли ДНКазу (из расчета 1 е.а. на 1 мкг ДНК-матрицы) и инкубировали 10 минут при температуре 37°С. Очистку мРНК из реакционной смеси проводили путем ВЭЖХ.
Кэпирование мРНК проводили пост-транскрипционно с использованием коммерческого набора Vaccinia Capping System и фермента 2'-O-Метилтрансферазы (New England BioLabs) инкубируя реакционную смесь в течение 60 мин при 37°С. Перед добавлением в ферментативную смесь мРНК денатурировали в стерильной mQ при температуре 65°C в течение 5 мин, после чего пробирку помещали на лед на 5 мин.
Проверку подлинности полученных препаратов мРНК проводили методом секвенирования.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено 3 варианта экспрессионного вектора на основе мРНК:
1) вектор мРНК-S, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую S белок вируса SARS-CoV-2;
2) вектор мРНК-M30, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую пептид М30 меланомы B16;
3) вектор мРНК-EGFP, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок.
4) вектор мРНК-luc, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую люциферазу светлячка.
Пример 2. Получение экспрессионного вектора на основе ДНК
В данной работе в качестве модельного экспрессионного вектора на основе ДНК использовалась плазмида рCMV-EGFP, pCMV-luc (из коллекции ФГБУ «НИЦЭМ» им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России). Данная плазмида содержит ген люциферазы светлячка под контролем СMV промотора (промотор/энхансер IE1 цитомегаловируса человека).
Наращивание клеток E. Coli, трансформированных плазмидной ДНК, проводилось в жидкой среде 2xYT (1,6% Триптон, 1% Дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl) или на твердой среде 2xYT + 2% агар, с антибиотиком. Плазмидная ДНК выделялась из ночной культуры E. сoli объемом 4 мл с помощью QIAGEN Plasmid Midi Kit (100) (QIAGEN: 12143) или QIAGEN Plasmid Maxi Kit (25) (QIAGEN: 12163) по стандартному протоколу, предложенному производителем. После выделения плазмидной ДНК измеряли её концентрацию на флуориметре Qubit®4.0 (Invitrogene, США) с использованием реагентов из коммерческого набора Qubit®dsDNA High Sensitivity Assay Kits (Life Technologies: Q32854) по стандартному протоколу, предложенному производителем. Подлинность плазмидной ДНК подтверждалась методом ПЦР.
Таким образом, в результате работы было получено два экспрессионных вектора на основе ДНК рCMV-EGFP, pCMV-luc, которые позволяют качественно и количественно оценить экспрессию целевого белка как in vitro, так и in vivo.
Пример 3. Получение катионного липида К 331 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида)
Получение катионного липида К 331 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида.
3. К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 18 г миристиламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 52 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 17 г N-орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристатамида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 331 (N-орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристатамида дигидрохлорида).
Пример 4. Получение катионного липида К 301 (N-(Nα,Nα,Nδ,Nδ-Тетраметил-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 301 (N-(Nα,Nα,Nδ,Nδ-Тетраметил-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата.
3. К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 18 г миристилового спирта и 23 г TFFH в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, затем 1 г диметиламинопиридина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 50 г N-(ди-бок-орнитил)- пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата а в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 16 г N-орнитил-3,4-дигидроксипирролидина димиристатата дигидрохлорида в виде белого порошка.
5. N-(Nα,Nα,Nδ,Nδ-Тетраметил-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида.
5 г N-орнитил-3,4-дигидроксипирролидина димиристатамида дигидрохлорида растворили в смеси 100 мл сухого тетрагидрофурана и 100 мл метанола, прибавили 1 мл триэтиламина, затем прибавили 5 мл водного раствора формальдегида и 2 г пиколин-боранового комплекса. Реакционную массу перемешивали 3 часа, затем упарили, остаток растворили в хлороформе, промыли 5% раствором бикарбоната натрия, затем высушили и упатили под вакуумом. Полученный остаток хроматографировали в системе хлороформ-метанол-триэтиламин 40:2:1, фракции содержащие целевой продукт упарили, перерастворили в тетрагидрофуране, затеп прибавили 6М раствора хлористого водорода в диоксане до нейтрального pH, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 2.2 г N-(Nα,Nα,Nδ,Nδ-Тетраметил-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 301 (N-(Nα,Nα,Nδ,Nδ-Тетраметил-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид).
Пример 5. Получение катионного липида К 336 (N-орнитил-гидроксипролинола димиристата дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 336 (N-орнитил-гидроксипролинола димиристата дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение Ди-бок-орнитина оксисукцинимидный эфира.
Смесь 33.2 г ди-бок орнитина и 12 г гидроксисукцинимида растворили при перемешивании в 500 мл сухого тетрагидрофурана, охладили до 5 С на водяной бане и прибавили 21.7 г дициклогексилкарбодиимида, затем реакционную массу перемешивали 12 часов, после чего выпавший осадок отфильтровали, фильтрат упарили. Остаток перекристаллизовали из изопропанола и высушили под высоким вакуумом, получив 40 г (93%) продукта в виде белого кристаллического порошка.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-дигидроксипирролидина.
К раствору 15 г 3,4-дигидроксипирролидина гидрохлорида и 10.6 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-орнитил)-3,4-дигидроксипирролидина в виде желтоватой вязкой жидкости.
3. Получение N-(ди-бок-орнитил)- дигидроксипирролидина димиристата.
К раствору 21.5 г N-(ди-бок-орнитил)-3,4-дигидроксипирролидина и 15 г диизопропилэтиламина в 500 мл сухого хлористого метилена при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 25 г миристоил хлорида, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем экстраировали водой, затем 2% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 34 г N-(ди-бок-орнитил)-3,4-дигидроксипирролидина димиристата в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-орнитил-гидроксипролинола димиристата дигидрохлорида.
34 г N-(ди-бок-орнитил)-3,4-дигидроксипирролидина димиристата растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 19 г N-орнитил-3,4-дигидроксипирролидина димиристата дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 336 (N-орнитил-гидроксипролинола димиристата дигидрохлорид).
Пример 6. Получение катионного липида К 330 (N-Орнитил-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 330 (N-Орнитил-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты.
К раствору 16 г пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида.
К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты, 18 г миристиламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 52 г N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
3. Получение N-Орнитил-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 17 г N-орнитил- пиперидин-3,5- дикарбоновой кислоты димиристатамида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 330 (N-Орнитил-пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид).
Пример 7. Получение катионного липида К 302 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 302 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновая кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г (81%) N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата.
3. К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 18 г миристилового спирта и 23 г TFFH в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, затем 1 г диметиламинопиридина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 50 г N-(ди-бок-орнитил)- пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата а в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 16 г N-орнитил-3,4-дигидроксипирролидина димиристатата дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 302 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристата дигидрохлорид).
Пример 8. Получение катионного липида К 303 (N-Лизил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 303 (N-Лизил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновая кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-лизина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 33 г N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида.
3. К раствору 20 г N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 18 г миристиламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 50 г N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-Лизил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-лизил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 16 г N-лизил-3,4-дигидроксипирролидина димиристатамида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 303 (N-Лизил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид).
Пример 9. Получение катионного липида К 304 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 304 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г (81%) N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида.
К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 14 г октиламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 42 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
3. Получение N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 17 г N-орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 304 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты диоктиламида дигидрохлорид).
Пример 10. Получение катионного липида К 305 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 305 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида дигидрохлорид) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновая кислоты.
К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-орнитина в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-орнитил)- пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида.
3. К раствору 20 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 14 г стеариламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 42 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
4. Получение N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-орнитил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 17 г N-орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 305 (N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты дистеариламида дигидрохлорид).
Пример 11. Получение катионного липида К 306 (N-диаминопропаноил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорид)
Получение катионного липида К 306 (N-диаминопропаноил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида) проводили в несколько стадий.
1. Получение N-(ди-бок-диаминопропаноил)-пирролидин-3,4-дикарбоновая кислоты. К раствору 16 г пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты и 15 г карбоната натрия в 250 мл воды прибавили при перемешивании раствор 45 г оксисукцинимидного эфира ди-бок-диаминопропановой кислоты в 400 мл ацетона, перемешивали 12 часов, затем отогнали ацетон при пониженном давлении, водную фазу закислили 2% раствором лимонной кислоты до pH 3, экстрагировали продукт 3*300 мл этилацетата. Органическую фазу высушили над сульфатом аммония, упарили, получив 35 г(81%) N-(ди-бок-диаминопропаноил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты.
2. Получение N-(ди-бок-диаминопропаноил)- пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида.
К раствору 20 г N-(ди-бок-диаминопропаноил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты, 18 г миристиламина и 28 г TBTU в смеси 300 мл сухого метилтетрагидрофурана и 200 мл ацетонитрила при перемешивании и охлаждении по каплям прибавили 36 мл диизопропилэтиламина, реакционную массу перемешивали 12 часов, затем реакционную массу упарили, перерастворили в смеси 500 мл этилацетата и 500 мл 1% раствора лимонной кислоты, ограническую фазу отделили и промыли 1% раствором лимонной кислоты, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу упарили, остаток хроматографировали на силикагеле, элюировали хлористым метиленом. Фракции, содержащие продукт, упарили, получив 52 г N-(ди-бок-диаминопропаноил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида а в виде вязкой маслянистой жидкости.
3. Получение N-диаминопропаноил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида.
30 г N-(ди-бок-диаминопропаноил)-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида растворили в 300 мл сухого тетрагидрофурана, прибавили 100 мл 6М раствора хлористого водорода в диоксане, перемешивали на механической мешалке 12 часов, затем из полученной суспензии отогнали растворитель, остаток ресуспендировали в диэтиловом эфире, отфильтровали, промыли на фильтре диэтиловым эфиром и высушили под вакуумом, получив 17 г N-диаминопропаноил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристатамида дигидрохлорида в виде белого порошка.
Таким образом, был получен катионный липид К 306 (N-диаминопропаноил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристатамида дигидрохлорид).
Пример 12. Получение липидов в виде свободного основания
Разработанные катионные липиды были получены в виде дигидрохлоридов, перед упаковкой в липидные частицы получали свободное основание.
Например, 1 г N-Орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида дигидрохлорида растворили в 50 мл хлороформа, прибавили 100 мл 2% раствора карбоната калия, перемешивали на механической мешалке 5 минут, затем слои разделили, органический слой сушили над безводным карбонатом калия, упарили под вакуумом, получив 0.6 г свободного основания N-орнитил-пирролидин-3,4-дикарбоновой кислоты димиристамида.
Аналогичным образом получали другие липиды в виде свободного основания.
Пример 13 Применение липидных частиц на основе заявленных катионных липидов, которые дополнительно содержат дистеароилфосфатидилхолин и холестерин для доставки РНК в клетки млекопитающих in vitro
Липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 30,1:14,3:55,6 (катионный липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин). Раствор мРНК (мРНК-EGFP) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты липдных частиц при +4°C до использования.
Характеристики полученных липидных частиц представлены в таблице 1.
Таблица 1. Характеристики липидных частиц
Далее проверяли способность полученных частиц доставлять мРНК in vitro. Для этого использовали клеточную линию НЕК293 (клетки эмбриональной почки человека).
Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. За сутки до эксперимента клетки рассевали на 96 луночный планшет. Липидные частицы добавляли из расчета 100 нг упакованной мРНК/лунку. Результат оценивали через 6 часов по экспрессии зеленого флуоресцентного белка. На фиг.1 фотографии клеток, которые были сделаны под цифровым инвертированным микроскопом в ультрафиолетовом свете. Как видно из представленных данных, во всех экспериментальных лунках планшета в клетках наблюдаются высокие уровни экспрессии белка EGFP.
Пример 14. Применение липидных частиц на основе заявленных катионных липидов, которые дополнительно содержат дистеароилфосфатидилхолин и холестерин для доставки ДНК в клетки млекопитающих in vitro
Липиды растворяли в 96% этаноле при молярных соотношениях 30,1:14,3:55,6 (катионный липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин). Раствор ДНК (pCMV-EGFP) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора ДНК. Раствор липидов объединяли с раствором ДНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты при +4°C до использования.
Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. За сутки до эксперимента клетки рассевали на 96 луночный планшет. Липидные частицы добавляли из расчета 100 нг упакованной ДНК/лунку. Результат оценивали через 6 часов по экспрессии зеленого флуоресцентного белка. На фиг.2 фотографии клеток, которые были сделаны под цифровым инвертированным микроскопом в ультрафиолетовом свете. Как видно из представленных данных, во всех экспериментальных лунках планшета в клетках наблюдаются высокие уровни экспрессии белка EGFP.
Пример 15. Применение липидных частиц на основе заявленных катионных липидов, которые дополнительно содержат дистеароилфосфатидилхолин и холестерин для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo
Липиды растворяли в 96% этаноле при молярных соотношениях 30,1:14,3:55,6 (катионный липид (К330, или К331, или К336): дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин). Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Полученные липидные частицы однократно внутримышечно вводили мышам линии Balb/c 18-20 г, в дозе 8,6 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили люциферин (vivoGlo, Promega) в дозе 1 мкг на мышь. Люминесценцию измеряли in vivo с помощью IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на Фиг.3. Результаты эксперимента показали, что у всех экспериментальных животных наблюдается экспрессия люциферазы через 3 часа после внутримышечного введения полученных частиц.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих in vivo.
Пример 16. Применение липидных частиц на основе заявленных катионных липидов, которые дополнительно содержат дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем для доставки РНК в клетки млекопитающих in vitro
Липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 30,1:12,2:55,6:2,1 (катионный липид: дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль 2000).
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты при +4°C до использования.
Далее проверяли способность полученных частиц доставлять мРНК in vitro. Для этого использовали клеточную линию НЕК293 (клетки эмбриональной почки человека).
Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. За сутки до эксперимента клетки рассевали на 96 луночный планшет. Липидные частицы добавляли из расчета 100 нг упакованной мРНК/лунку. Через 3 часа измеряли активность люциферазы с помощью набора Promega Luciferase Assay System. Полученные результаты представлены на Фиг.4.
Как видно из представленных данных, во всех экспериментальных лунках, в клетках к которым добавляли разработанные липидные частицы наблюдалась экспрессия люциферазы.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих in vitro.
Пример 17. Применение липидных частиц на основе заявленных катионных липидов, которые дополнительно содержат дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo
Липиды растворяли в 96 % этаноле при молярных соотношениях 30,1:12,2:55,6:2,1 (катионный липид (К330, К331): дистеароилфосфатидилхолин (DSPC): холестерин: ПЭГ-липид (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль 2000).
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) в течение ночи при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты при +4°C до использования.
Полученные липидные частицы однократно внутримышечно вводили мышам линии Balb/c 18-20 г, в дозе 8,6 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили люциферин (vivoGlo, Promega) в дозе 1 мкг на мышь. Люминесценцию измеряли in vivo с помощью IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на Фиг.5. Результаты эксперимента показали, что у всех экспериментальных животных наблюдается экспрессия люциферазы через 3 часа после внутримышечного введения полученных частиц.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих in vivo.
Пример 18. Применение липидных частиц, которые содержат катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид) для доставки РНК в клетки млекопитающих in vitro
Липиды растворяли в 96% этаноле, молярные соотношения представлены в таблице 3.
Таблица 3. Содержание липидов в смеси
В качестве ионизируемого липида использовали ALC-0315 (((4-гидроксибутил)азанедиил)бис(гексан-6,1-диил)бис(2-гексилдеканоат)), в качестве PEG (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид).
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты при +4°C до использования.
Характеристики полученных липидных представлены в таблице 1.
Таблица 1. Характеристики липидных частиц
PDI
Далее проверяли способность полученных частиц доставлять мРНК in vitro. Полученные липидные частицы добавляли к клеткам ТНР-1 в лунки 96 луночного планшета до концентрации мРНК 5 мкг/мл. Через 6 часов измеряли люминесценцию с помощью набора Promega Luciferase Assay System. Полученные результаты представлены на Фиг.6.
Как видно из представленных данных, во всех экспериментальных лунках наблюдалась экспрессия люциферазы.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять РНК в клетки млекопитающих in vitro.
Пример 19. Применение липидных частиц, которые содержат катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид) для доставки ДНК в клетки млекопитающих in vitro
Липиды растворяли в 96 % этаноле молярные соотношения представлены в таблице 3.
Таблица 3. Содержание липидов в смеси
В качестве ионизируемого липида использовали ALC-0315 (((4-гидроксибутил)азанедиил)бис(гексан-6,1-диил)бис(2-гексилдеканоат)), в качестве PEG (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид).
Раствор ДНК (pCMV-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) из стокового раствора ДНК. Раствор липидов объединяли с раствором ДНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты при +4°C до использования.
Далее проверяли способность полученных частиц доставлять ДНК in vitro. Полученные липидные частицы добавляли к клеткам НЕК 293 в лунки 96 луночного планшета до концентрации мРНК 5 мкг/мл. Через 6 часов измеряли люминесценцию с помощью набора Promega Luciferase Assay System. Полученные результаты представлены на Фиг.7.
Как видно из представленных данных, во всех экспериментальных лунках наблюдалась экспрессия люциферазы.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих in vitro.
Пример 20. Применение липидных частиц, которые содержат катионный липид К331, ионизируемый липид ALC-0315 и SM-102, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид) для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo
Липиды растворяли в 96 % этаноле молярные соотношения
К 336 - 2,5 % моль
ALC-0315 - 35,9 % моль
SM-102- 10,0 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Мышам линии Balb/c 18-20г однократно внутримышечно вводили полученные липидные наночастицы в дозе 8,6 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили люциферин (in vivo Glo, Promega) в дозе 1 мкг на мышь. Люминесценцию измеряли in vivo с помощью IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences) Полученные результаты представлены на Фиг.8. Результаты эксперимента показали, что липидные частицы, которые содержат катионный липид К331, ионизируемые липиды ALC-0315 и SM-102, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид) для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo.
Пример 21. Применение липидных частиц, которые содержат катионный липид К331, ионизируемый липид SM-102, дистеароилфосфатидилхолин, холестерин и липид, связанный с полиэтиленгликолем (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль) для доставки РНК в клетки млекопитающих in vivo
Целью данного эксперимента являлась проверка способности разработанного катионного липида К336 липидов формировать липидные частицы совместно с ионизируемым липидом SM-102; липидом-хелпером; стеролом; липидом, связанным с полиэтиленгликолем (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль) и инкапсулировать мРНК.
В экспериментальной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 331 - 2,5 % моль
SM-102- 45,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль - 1,6% моль
В контрольной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 331 - 0 % моль
SM-102- 46,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-метоксиполиэтиленгликоль - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Мышам линии Balb/c 18-20г однократно внутримышечно вводили полученные липидные наночастицы в дозе 8,6 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили люциферин (in vivo Glo, Promega) в дозе 1 мкг на мышь. Люминесценцию измеряли in vivo с помощью IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences) Полученные результаты представлены на Фиг.9. Результаты эксперимента показали, что добавление в липидную частицу катионного липида в несколько раз повышает эффективность доставки мРНК.
Таким образом, результаты эксперимента показали, что разработанные липидные частицы способны эффективно доставлять нуклеиновые кислоты in vivo.
Пример 22. Применение липидных частиц для профилактики заболеваний
Целью данного эксперимента являлась проверка способности разработанного катионного липида К336 в композиции с другими структурными липидами включать мРНК, кодирующую ген антигена, обеспечивать доставку и экспрессию мРНК и таким образом оценивалась возможность использования данных частиц в качестве профилактического препарата.
В качестве мРНК, кодирующей ген антигена, использовали мРНК-S, кодирующую ген S белка вируса SARS-CoV-2.
В экспериментальной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 336 - 1,0 % моль
ALC-0315 - 45,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
В контрольной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 336 - 0 % моль
ALC-0315 - 46,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-S) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Мышей линии Balb\c двукратно с интервалом 21 день иммунизировали полученными липидными частицами, содержащими мРНК-S. Через 2 недели после последней иммунизации у животных отбирали кровь и получали сыворотку. Далее оценивали титр антител к S белку методом ИФА.
В Таблице 4 приведен титр антител к S белку через 3 недели после последней иммунизации животных.
Результаты эксперимента показали, что титр антител в экспериментальной группе значительно выше, чем в контрольной группе.
Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают способность разработанного катионного липида в композиции с другими структурными липидами включать мРНК, кодирующую ген антигена, обеспечивать доставку и экспрессию мРНК и подтверждают возможность использования данных частиц в качестве профилактического препарата.
Пример 23. Применение липидных частиц для терапии заболеваний
Целью данного эксперимента являлась проверка способности разработанного катионного липида К336 в композиции с другими структурными липидами включать мРНК, кодирующую ген пептида М30 меланомы В16, обеспечивать доставку и экспрессию мРНК и таким образом оценивалась возможность использования данных частиц в качестве терапевтического препарата (для лечения меланомы).
В качестве мРНК, кодирующей ген антигена, использовали мРНК-М30, кодирующую ген пептида М30 меланомы В16.
В экспериментальной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 336 - 1,0 % моль
ALC-0315 - 45,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
В контрольной группе липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 336 - 0 % моль
ALC-0315 - 46,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-М30) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
В эксперименте использовалась клеточная линия B16-F10 сингенная меланома мышей линии С57bl/6. Клетки культивировали в 75 см2 культуральных флаконах в среде DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина, стрептомицина и L-глутамина в инкубаторе с содержанием 5% CO2 при температуре 37°С. По достижению 70-80% монослоя, клетки открепляли трипсином и переносили в центрифужные пробирки. А затем осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Затем к осадку добавляли однократный фосфатно-солевой буфер, перемешивали и осаждали на центрифуге при 1000 оборотах, 10 минут. Промывку фосфатно-солевым буфером проводили дважды. Клетки разводили в однократном фосфатно-солевом буфере в концентрации 2×106 клеток в миллилитре.
Перед введением опухолевых клеток мышей линии С57bl/6 подвергали ингаляционному наркозу (3% Изофлуран). Клетки вводили подкожно в правый бок мыши по 100 мкл (2×105 клеток на мышь) шприцом на 1 мл с иглой диаметром 22G.
Исследуемый препарат или контрольный препарат вводили на следующие сутки после инокуляции опухолевых клеток из расчета 20 мкг мРНК (общее количество пропорционально делили количество мРНК векторов) на мышь инсулиновым шприцом с иглой 29G. Препарат вводили каждые 4 дня внутримышечно.
На 8 день исследования определяли размер опухоли и рассчитывали ее объем. Полученные данные представлены на Фиг.10. Как видно из результатов эксперимента, введение обоих препаратов приводит к ограничению роста опухолевых клеток, однако введение экспериментального препарата (содержащего 1%К336) приводит к более эффективному противоопухолевому иммунному ответу.
Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают способность разработанного катионного липида в композиции с другими структурными липидами включать мРНК, кодирующую ген опухолевого антигена, обеспечивать доставку и экспрессию мРНК и подтверждают возможность использования данных частиц в качестве терапевтического препарата.
Пример 24. Применение липидных частиц, при котором они вводятся внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрибрюшинно, интраназально и интратрахеально
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных липидных частиц доставлять нуклеиновую кислоты при различных вариантах введения.
Для этого использовали мРНК (мРНК-luc) кодирующую ген люциферазы святлячка.
Липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
К 336 - 1,0 % моль
ALC-0315 - 45,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-luc) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Отношение ионизируемых атомов азота в ионизируемом липиде к количеству фосфатных групп в мРНК (соотношение N:P) равно 6 для каждой композиции. Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Животным вводили полученные липидные частицы интраназально в объеме 5 мкл в дозе 215 нг/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора люциферина (1 мг/мл). Люминесценцию измеряли in vivo с помощью прибора IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на фиг.11.
Также животным вводили полученные липидные частицы подкожно в объеме 5, 10, 20 мкл в дозе 430 нг мРНК/мышь, 860 нг мРНК/мышь и 1,72 мкг мРНК/мышь, соответственно. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора люциферина (1 мг/мл). Люминесценцию измеряли in vivo с помощью прибора IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на фиг.12.
Также животным вводили полученные липидные частицы внутрибрюшинно в дозе 8,6 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора люциферина (1 мг/мл). Люминесценцию измеряли in vivo с помощью прибора IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на фиг.13.
Также животным вводили полученные липидные частицы внутривенно в дозе 4,3 мкг мРНК/мышь. Через 3 часа животным внутрибрюшинно вводили 100 мкл раствора люциферина (1 мг/мл). Люминесценцию измеряли in vivo с помощью прибора IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Полученные результаты представлены на фиг.14.
Результаты эксперимента показали, что липидные наночастицы эффективно доставляют нуклеиновую кислоту in vivo всеми перечисленными выше способами.
Пример 25. Исследование токсичности
В данном эксперименте использовали мРНК (мРНК-М30), кодирующую антиген меланомы В16.
Липиды растворяли в 96 % этаноле в следующих молярных соотношениях:
Препарат 1.
К 336 - 1,0 % моль
ALC-0315 - 45,9 % моль
DSPC - 9,3 % моль
Cholesterol - 42,2 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Препарат 2
К 331 - 2,5 % моль
ALC-0315 - 45,2 % моль
DSPC - 9,2 % моль
Cholesterol - 41,6 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Контрольный препарат
ALC-0315 - 46,3 % моль
DSPC - 9,4 % моль
Cholesterol - 42,6 % моль
2-[(полиэтиленгликоль)-2000]-N,N-дитетрадецилацетамид - 1,6% моль
Раствор мРНК (мРНК-М30) с рабочей концентрацией 0,2 мг/мл готовили смешением воды Molecular biology grade, 10x цитратного буфера (pH 3,0) и стокового раствора мРНК. Раствор липидов объединяли с раствором мРНК (0,2 мг/мл) в объемном соотношении 3:1 (водный раствор: спиртовой раствор), используя микрожидкостное смешивание в системе Nanoassmblr Benchtop (Precision NanoSystems). Полученные формуляции подвергали диализу против раствора PBS (pH 7,2) в диализных кассетах 20 kDa Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific) overnight при слабом перемешивании буферного раствора на магнитной мешалке в холодильной камере при +4°. По завершению диализа шприцом отбирали суспензию липидных наночастиц из диализной кассеты, фильтровали через 0,2 мкм Acrodisk фильтр (Supor membrane, Pall corporation) и хранили препараты ЛНЧ при +4°C до использования.
Животным вводили полученные липидные частицы интраназально в объеме 1 мл в дозе 30 мкг мРНК/мышь.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Промышленная применимость
Разработанные липидные наночастицы могут применяться в качестве реагентов для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro и in vivo, а также могут использоваться в составе профилактических и терапевтических препаратов.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Тринуклеотидный кэпирующий реагент, способ его получения и применение | 2024 |
|
RU2829515C1 |
| Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом клещевого энцефалита, на основе мРНК | 2024 |
|
RU2823754C1 |
| Вектор на основе мРНК для увеличенной продукции целевого белка в клетках млекопитающих (варианты) | 2022 |
|
RU2792231C1 |
| Иммунобиологическое средство для терапии онкологических заболеваний на основе мРНК вектора. | 2024 |
|
RU2828631C1 |
| Способ формирования системы иммунного надзора за опухолевыми клетками в организме млекопитающих | 2024 |
|
RU2828654C1 |
| ИОНИЗИРУЕМЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2023 |
|
RU2823298C1 |
| Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса гриппа и его применение | 2024 |
|
RU2838904C1 |
| ИОНИЗИРУЕМЫЕ ЛИПИДЫ И ИХ КОМПОЗИЦИИ В ФОРМЕ НАНОЧАСТИЦ | 2020 |
|
RU2836646C1 |
| РНК-ЧАСТИЦЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ПОЛИСАРКОЗИН | 2019 |
|
RU2792644C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА | 2012 |
|
RU2647476C2 |
Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к катионным липидам, имеющим структурную формулу (1), для доставки нуклеиновой кислоты, способу их получения, их применению для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro и in vivo. Предложенные варианты катионных липидов, а также липидные частицы на их основе могут применяться для разработки профилактических и терапевтических препаратов на основе РНК. В общей формуле (1), где R - первичные алкильные группы с длиной цепи от 7 до 17 атомов углерода, Q - линкерная группа структуры -C(O)NH-, или -C(O)O-, или -OC(O)-, X - аминогруппа или диметиламиногруппа. Использование группы изобретений обеспечивает создание катионного липида, который способен образовывать липидные частицы в комплексе с нуклеиновой кислотой и обеспечивать ее эффективную доставку как in vitro, так и in vivo. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 25 пр.
1. Катионный липид для доставки нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих, имеющий структурную формулу (1):
где R - первичные алкильные группы с длиной цепи от 7 до 17 атомов углерода,
Q - линкерная группа структуры -C(O)NH-, или -C(O)O-, или -OC(O)-,
X - аминогруппа или диметиламиногруппа.
2. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (2):
(2)
3. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (3):
(3)
4. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (4):
(4)
5. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (5):
(5)
6. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (6):
(6)
7. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (7):
(7)
8. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (8):
(8)
9. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (9):
10. Катионный липид по п.1, имеющий структурную формулу (10):
11. Способ получения катионного липида по п.1, содержащий стадии модификации гетероцикла третбутоксикарбонильным производным аминокислоты, последующим ацилированием соединениями, содержащими алкильные заместители, дальнейшим деблокированием и восстановительным аминированием аминогрупп аминокислоты.
12. Применение катионного липида по п.1 для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vitro.
13. Применение катионного липида по п.1 для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих in vivo.
| Станок для шереховки стыков велокамер | 1935 |
|
SU46694A1 |
| ТРИАЛКИЛОВЫЕ КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ | 2013 |
|
RU2718053C2 |
| КАТИОННЫЕ ЛИПИДЫ | 2018 |
|
RU2782218C2 |
| Незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения для доставки нуклеиновых кислот in vitro | 2020 |
|
RU2747559C1 |
| WO 2012031046 A2, 08.03.2012. | |||
