Область техники, к которой относится изобретение
Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и может быть использована для производства лекарственных средств на основе аполипопротеина А-I человека, способных снижать проявления эндокринно-метаболических нарушений при сахарном диабете 2 типа, ожирении и связанных с ними функциональных нарушений различных органов и систем.
Уровень техники
Увеличивающаяся частота заболеваемости сахарным диабетом 2 типа (СД2), проявляющемся в виде гипергликемии и инсулинорезистентности, является глобальной проблемой колоссальных масштабов как в мире в целом, так и в Российской Федерации, основным виновником заболеваемости и смертности пациентов и основным экономическим бременем [Tinajero M.G., Malik V.S. Endocrinol Metab Clin North Am. 2021. Vol. 50. N. 3. P.337-355.; Дедов И.И. и др. Сахарный диабет. 2021. T. 24. N.3. C. 204-221.]. Хотя лечение СД2 значительно улучшилось за последние годы, его результаты по-прежнему не достигают своих целей или пациенты испытывают нежелательные побочные эффекты.
Данные литературы указывают на то, что показатели липидного обмена при классическом течении СД2 меняются в сторону увеличения риска развития сердечно-сосудистых осложнений. Известно, что у больных СД2 происходит увеличение общего холестерина. При этом частицы липопротеинов низкой плотности, переносящие холестерин, обладают меньшим размером и большей плотностью. Отмечается снижение холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП-ХС) и увеличение концентрации триглицеридов [Воробьев, С. В., Петровская, Е. Ю. Медицинский вестник Юга России, 2012. N. 3. C. 25-28.; Sabahelkhier M. K. et al. Nova Journal of Medical and Biological Sciences, 2016. Vol. 5. N. 2, P. 1-9].
Лица с СД2 страдают избыточной массой тела, характеризуются хронической гипергликемией (повышенным содержанием глюкозы в крови), развивающейся в результате нарушения механизмов взаимодействия инсулина с клетками тканей (инсулинорезистентностью) или его секреции. СД2 связан также с системным нарушением функций различных органов и систем, снижающих качество и продолжительность жизни, включающих нарушение функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной и когнитивной функций.
Заболевание сахарным диабетом часто сопровождается деструктивными изменениями опорно-двигательного аппарата. Считается, что избыточное накопление конечных продуктов гликирования провоцирует повреждение околосуставных тканей и суставов (хайроартропатия), что в свою очередь приводит к ограничению подвижности суставов, как правило, в отсутствие болевого синдрома и как следстие, органичению физической (локомоторной) активности [Паневин Т. С. и др. Научно-практическая ревматология. 2020. №3; Alabdali, Login Ahmed S., et al. / BMC Fam. Pract. 2019. Vol. 20. N. 1. P. 98.]. Синдром ограничения подвижности суставов ассоциирован с другими поздними осложнениями СД и может значимо нарушать функциональную активность, самообслуживание и ухудшать качество жизни [Panevin, T.S., et al. Osteoporosis and Bone Diseases 2019.Vol. 22. N.3. P.19-26.]. При этом нарушение локомотрной функции отягощается состоянием ожирения, при котором физическая активность снижается вследствии увеличения физической, а также психоэмоциональной нагрузки при совершении любой двигательной активности. Неадекватное мышечное поглощение глюкозы у людей с инсулинорезистентностью [Defronzo R.A., Tripathy D. Diabetes Care. 2009. Vol. 32. Suppl 2. S157–S163.] приводит к гипергликемии и повышенному риску мышечной усталости.
На сегодняшний день существуют убедительные данные, что при СД2 обнаруживается как снижение общей оценки когнитивных функций, так и нарушения в отдельных когнитивных сферах. Статистика указывает на то, что отклонения от возрастной нормы обнаруживаются у 20–40 % пациентов с СД2. В подавляющем большинстве случаев когнитивный дефект остается незначительным, хотя способен негативно влиять на качество жизни пациентов. Особенностью нейропсихологического профиля у пациентов с СД является преобладание нейродинамических и регуляторных нарушений, выявляемых в тестах на внимание, скорость психомоторных реакций, речевую активность, способность к переключению, концептуальному мышлению и т.д [Левин, О. С. Современная терапия в психиатрии и неврологии 2015. №4. С.18-25]. Исследование зависимости когнитивных нарушений от уровня гликемии, указывает на то, что именно это основное метаболическое отклонение у больных СД может быть причиной когнитивных нарушений. Показано, что быстрый подъем уровня глюкозы, в том числе после приема пищи, напрямую сопряжен у больных с СД2 со снижением внимания и других нейродинамических функций. Острая гипогликемия может снижать регионарную перфузию мозга и нарушать осмотическое равновесие в церебральных нейронах [ Ermatov U. European Multidisciplinary Journal of Modern Science 2022. N. 4. P. 698-703; MacKnight C. et al. Dement Geriatr Cogn Disord. 2002. Vol. 14. N. 2. P. 77-83.].
Нарушению когнитивной функции могут способствовать и другие осложнения СД, например, ишемическая болезнь сердца, а также сопутствующие факторы риска, такие как артериальная гипертензия, недостаточная физическая активность, дислипидемия, ожирение [Левин, О. С. Современная терапия в психиатрии и неврологии 2015. N.4. C. 18-25.; Xue M. et al. Ageing research reviews 2019. Vol. 55. P. 100944.].
Печень как ключевой орган регулирующий углеводный обмен, является мишенью патологического действия сахарного диабета. Такой диагноз как неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП) ставят больным с наиболее частыми нарушениями обмена веществ, такими как ожирение, метаболический синдром и СД2. Данное осложнение имеет несколько форм и включает жировую дистрофию печени (стеатоз), неалкогольный стеатогепатит и фиброз/цирроз, что в конечном итоге может привести к терминальной стадии печеночной недостаточности или гепатоцеллюлярной карциноме. Недавние исследования показывают, что пациенты с выраженной инсулинорезистентностью ассоциируются с состоянием НЖБП и ее ускоренным прогрессированием, что увеличивает риск сердечно-сосудистых и почечных заболеваний, связанных с сахарным диабетом 2 типа, и подтверждает критическую роль инсулинорезистентности [Dewidar B. et al. Metabolism. 2020 Vol.111S. P.154299.; Shehri Z. Biomedical Research and Therapy. 2017. Vol. 4. N. 11. P. 1760-1774.].
Костный мозг является одной из тканей, пораженных осложнениями сахарного диабета. Исходные данные доклинических и клинических исследований показали, что СД2 вызывает количественные и качественные нарушения в циркулирующих стволовых клетках, например в сосудах. Однако первоначальное повреждение происходит непосредственно на уровне костного мозга, прежде чем клетки мобилизуются в периферическое кровообращение, из-за значительного ремоделирования всех компонентов костномозговой ниши. При диабете поражается сам костный мозг, так как в нем могут развиваться микроангиопатия и нейропатия, сходные с другими тканями организма. Невропатия приводит к нарушению мобилизации стволовых клеток из костного мозга, так называемой мобилопатии. Эти изменения приводят к нарушению гомеостаза стволовых клеток, обеспечивая дополнительный механизм для объяснения и интерпретации периферических осложнений [Mangialardi G., Madeddu P. Curr Diab Rep. 2016. Vol. 16. N.5. P.43].
Селезенка играет важную роль в возникновении и развитии диабета, развитии селезеночной недостаточности при ожирении, несмотря на то, что до сих пор имеется мало данных о связанных механизмах [Zhang J. et al. Stem Cells Dev. 2017. Vol. 26. No 24. P. 1749-1758.; Wang K. et al. Randomized Controlled Trial. Zhongguo Zhen Jiu. 2016. Vol. 36. No. 3. P.225-230; Tarantino G. et al. World J Gastroenterol 2013. Vol. 19. N. 23. P. 3534-3542.].
Андрогены играют решающую роль в развитии мужских половых органов, таких как придатки яичек, семявыносящие протоки, семенные пузырьки, предстательная железа и половой член. Высокий уровень интратестикулярного тестостерона, секретируемого клетками Лейдига, необходим для сперматогенеза [Dohle G.R. et al. World J. Urol. 2003. Vol. 21. N. 5. P. 341-345.]. Показано, что секреция тестостерона у больных сахарным диабетом 2 типа существенно снижена [Spark R.F. Curr Urol Rep. 2007. Vol. 8. N. 6. P.467-471.].
Известно, что для больных СД2 характерны специфические патологические изменения сердечно сосудистой системы, характеризующиеся гипертрофией левого желудочка и диастолической дисфункцией на ранней стадии вплоть до явной сердечной недостаточности со снижением систолической функции на поздних стадиях (диабетическая кардиомиопатия) [Paolillo S. et alHeart Fail Clin. 2019. 15(3):341-347.].
Разработанные в предшествующую эпоху антидиабетические средства не обладают достаточными лечебными эффектами в отношении связанных с гипергликемией и/или инсулинорезистентностью заболеваний и нарушений функций органов и тканей. Однако в последние годы всё большее внимание привлекают для этих целей нативные и синтетические белки аполипопротеины. Аполипопротеины являются структурными компонентами липопротеинов сыворотки крови, выполняющих важные транспортные и регуляторные функции в организме. Преимуществом их применения в качестве лекарственных средств является их природное происхождение, т.к. они не являются чужеродными для иммунной системы организма. Исследуется возможность применения различных типов аполипопротеинов, их функциональных фрагментов и реконструированных на их основе липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В настоящее время идентифицировано свыше 10 аполипопротеинов. Согласно АВС-номенклатуре отдельные классы аполипопротеинов (АпоА, АпоВ, АпоС и т.д.) представляют собой семейства, состоящие из нескольких индивидуальных белков, обозначаемых с помощью римских цифр - АпоАI, АпоАII, АпоАIV и др. АпоА, АпоВ представляют собой транспортные апопротеины. Основными представителями группы регуляторных апопротеинов являются апопротеины Е (АпоЕ) и АпоС. Однако разделение на транспортные и регуляторные аполипопротеины носит условный характер, т.к. у них обнаруживаются многофункциональные свойства. Липопротеины (ЛП), содержащие АпоВ, являются участниками транспорта эндогенного холестерина (ХС) в составе ЛП частиц от печени к периферическим тканям, который принято называть прямым или эфферентным, тогда как ЛП, структурным белком которых являются АпоА, участвуют в обратном или афферентном транспорте ХС – движении ХС от периферических тканей через компоненты плазмы крови к печени. АпоЕ участвует в переносе жирных кислот в клетки тканей и транспорте холестерина в печень [Бойко Е.Р., Канева А.М. УСПЕХИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК, 2009, том 40, № 1, с. 3-15; Bolanos-Garcia V.M., Miguel R.N. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 2003. N. 83. P. 47–68]. АпоM является переносчиком липидного медиатора сфингозин-1-фосфата в крови, и его полиморфные замены T-855C и T-778C связаны с развитием ожирения в результате нарушенного регулирования ЛПВП [Kurano et al. Atheroscler Thromb. 2018. Vol. 25. N. 1. P.16-26.].
В публикации WO2019238934 A1 раскрыто применение АпоМ или кодирующей его молекулы нуклеиновой кислоты для лечения резистентности к инсулину путем введения субъекту, страдающему ожирением или СД2, терапевтически эффективного количества полипептида АпоМПри этом публикация не касается влияния АпоМ на функциональные нарушения органов и систем при резистентности к инсулину, СД2, ожирении.
В публикации WO2012100010 A1 предложен аполипопротеин A-IV (АпоA-IV) как антидиабетический пептид и способ лечения СД2 и снижения уровня глюкозы в крови у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества апоA-IV или его биологически активного, в том числе, рекомбинантного аналога. Эффект АпоA-IV продемонстрирован в отношении толерантности к глюкозе у мышей с нокаутом по АпоA-IV и у мышей с СД2 и ожирением, а также в отношении увеличения синтеза инсулина в культуре β-клеток островков человека, т.е. влияния АпоA-IV на углеводный обмен. Публикация не касается эффекта, оказываемого АпоA-IV на массу тела мышей, а также на функциональных нарушений органов и систем и качества жизни страдающих СД2.
ЛПВП и его основная белковая составляющая, аполипопротеин А-I (АпоА-I) выполняют важную функцию в транспорте и метаболизме холестерина и других липидов в кровотоке и, как считается, предотвращают атеросклероз и сердечно-сосудистые заболевания, способствуя оттоку холестерина у пациентов с атеросклерозом [Gille A. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2018. Vol. 38. N. 4. P. 953–963; Rosenson R.S. et al., Nat Rev Cardiol. 2016. Vol. 13. N. 1. P. 48–60; Gibson C.M. et al., Am Heart J. 2021. N. 231. P. 121-127.
В статье Kalayci A. et al. Current Atherosclerosis Reports. 2022. Vol. 24. N. 7. P. 585-597 показано, что терапия восстановленным АпоА-I (CSL112) у больных, перенесших острый инфаркт миокарда, снижает повторы сердечно-сосудистых катастроф. Однако, исследование ограничено констатацией указанной связи, при этом в данной работе не изучено влияние АпоА-I на нарушения функций других органов и систем у больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями, при гиперпгликемии и/или инсулинорезистентности.
AпoA-I также участвует в регуляции контроля уровня глюкозы [Siebel A.L. et al. Front Pharmacol. 2015. N.6. P. 258; Liu J. et al. Diabetes. 2017. Vol. 66. N.11.P. 2915–2926]. Это позволило предположить, что AпoA-I может быть важной связью между диабетом и сердечно-сосудистыми заболеваниями при нарушениях углеводного обмена. Однако, остается пока неизученным влияние AпoA-I на нарушение других метаболических процессов и функций органов при гипергликемии.
В статье Cochran B.J. et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2014;34:2261–2267 показано, что ЛПВП и АпоА-I плазмы крови усиливают синтез и секрецию инсулина в изолированных панкреатических островках и клональных β-клеточных линиях Однако, в данной работе осталось неизученным влияние АпоА-I в целостном организме на метаболические процессы и нарушения функций других органов (кроме поджелудочной железы) при гипергликемии и инсулинорезистентности.
Аналогичный эффект ЛПВП и АпоА-I плазмы крови получен в отношении клеток островков Лангерганса поджелудочной железы крыс Wistar в статье Панина Л.Е. и др. Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2010. Т. 30. № 2. С.28-32], а также в статье Усынина И.Ф. и др. Биомедицинская химия. 2018. Т. 64. № 2.С. 195-200]. Однако, в этих работах не изучено влияния АпоА-I in vivo на нарушение функций других органов и систем при СД2, когда гипергликемия может быть связана с инсулинорезистентностью при нормальном уровне синтеза инсулина поджелудочной железой.
В статье Stenkula K.G. et al. Diabetologia. 2014. Vol. 57. N. 4. P.797–800 на модели мышей, получавших диету с высоким содержанием жиров, показано, что нативный человеческий АпоА-I и миланский вариант АпоА-I с заменой одной аминокислоты в позиции 173 (Arg173Cys) в одинаковой степени улучшают секрецию инсулина, толерантность к глюкозе, снижают уровень глюкозы по инсулинозависимому и инсулинонезависимому механизму. Однако, указанные исследования ограничены изучением углеводного обмена, и осталось не изученным влияние АпоА-I на нарушение функций других органов и систем при гипергликемии и инсулинорезистентности.
В статье Domingo-Espin J. et al. Diabetes. 2016. Vol. 65. P. 1838–1848 на модели мышей с гипергликемией, созданной путем мгновенной и преходящей блокады секреции инсулина, показано, что нативный АпоА-I в равной степени усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина и действует как активатор инсулин-независимого поглощения глюкозы в периферической ткани (сердечные и скелетные мышцы). Анализы также идентифицируют сердце как важную ткань-мишень для АпоА-I-стимулированного поглощения глюкозы с потенциальными последствиями при диабетической кардиомиопатии. Однако исследование эффектов нативного АпоА-I в данной работе ограничено углеводным обменом, в том числе в мышечной ткани, при этом не изучено влияние АпоА-I на нарушение функций других органов и систем при гипергликемии.
В статье Drew B.G. et al. Circulation. 2009. Vol. 119. N. 15. P. 2103–2111 у пациентов, больных СД2, которым вводили внутривенно восстановленный ЛПВП, содержащий АпоА-I, и при изучении его эффектов на первичных культурах клеток скелетных мышц, полученных от данных пациентов, показано снижение уровня глюкозы за счет повышения уровня инсулина под действием восстановленных ЛПВП in vivo и активации АМФ-активируемой протеинкиназы в скелетных мышцах. Сделано заключение о роли терапии, повышающей уровень ЛПВП, помимо атеросклероза, для лечения сахарного диабета 2 типа. Однако исследование эффектов ЛПВП, содержащих АпоА-I, ограничено углеводным обменом, при этом не изучено влияния ЛПВП на нарушение функций других органов и систем у больных СД2.
В статье Lehti M. et al. Circulation. 2013. Vol. 128. N. 22. P. 2364–2371 на генетических моделях с повышенным уровнем ЛПВП (повышенное содержание АпoA-I) и сниженным уровнем ЛПВП (дефицит АпоА-I) проверено, модулирует ли ЛПВП митохондриальную биоэнергетику в скелетных мышцах. Установлено, что увеличение использования глюкозы скелетными мышцами у мышей с повышенными уровнями ЛПВП и АпоА-I, предотвращало нарушение гомеостаза глюкозы, вызванное диетой с высоким содержанием жиров. Принимая во внимание, что сходное нарушение функции митохондрий и снижение уровня ЛПВП наблюдается при СД2, сделано предположение, что терапия, повышающая уровень ЛПВП, может сохранять функцию митохондрий в мышцах и решать ключевые аспекты СД2 типа, связанные с гипергликемией и опосредованными ею нарушениями функций мышц, выраженных в снижении выносливости в тесте на утомление при физической нагрузке. Осталось не изученным влияние избытка или недостатка уровней ЛПВП и АпоА-I на нарушение функций других органов и систем, связанных с гипергликемией.
В статье Tang S. et al. Scientific Reports. 2019. Vol. 9. N. 1. P. 1350 при инкубации первичных клеток скелетных мышц человека с АпоА-I последний увеличивает инсулинозависимое и инсулиннезависимое поглощение глюкозы в зависимости от времени и концентрации, при этом АпоА-I увеличивает утилизацию глюкозы в скелетных мышцах путем активации пути передачи сигнала IR/IRS-1/PI3K/Akt/AS160. По результатам влияния АпоА-I на гипергликемию и инсулинорезистентность в изолированных скелетных мышцах авторы сделали предположение о возможности использования терапевтических средств, повышающих уровень АпоА-I, для улучшения гликемического контроля у людей с СД2, т.е. для коррекции углеводного обмена. Осталось неизученным использование АпоА-I на организменном уровне, в том числе для коррекции других функций органов и систем, нарушенных при гипергликемии и инсулинорезистетности.
В статье Feng X. et al. Lipids in Health and Disease. 2017. Vol.16. N. 1.P. 69. установлена отрицательная связь между содержанием АпоА-I крови и резистентностью к инсулину у 108 пациентов Китая с нарушением толерантности к глюкозе, однако не исследовано применение АпоА-I в качестве лечебного средства для снижения резистентности к инсулину у данных пациентов с нарушением толерантности к глюкозе.
Поскольку содержание АпоА-I в сыворотке крови человека весьма невелико, что ограничивает применение донорской крови для его получения и использования для медицинских целей, в патенте РФ № 2573930 на основе рекомбинантного штамма бактерий E. сoli получены рекомбинантный зрелый AпoA-I человека (rApoA-I), включающий полную последовательность из 243 аминокислот, а также его усеченный вариант, соответствующий аминокислотам 3-243. Показано сходство биологических свойств rApoA-I с природным белком апоА-I человека по способности проникновения в ядра клеток млекопитающих и стимуляции в них скорости биосинтеза ДНК и образованию специфичных антител при иммунизации животных. При этом в указанном патенте не изучалась возможность применения rApoA-I для лечения гипергликемии и/или инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем.
В статье Dalla-Riva J. et al. J. Lipid Res. 2013. Vol. 54. N.5. P. 1275–1282 установлено, что дискоидальные ЛПВП и фрагмент апоА-I, включающий последовательность аминокислот № 190–243, являются мощными агонистами (индукторами) инсулиннезависимого поглощения глюкозы в скелетных мышцах, а С-концевое α-спиральное содержание АпоА-I может быть важной детерминантой этого процесса. Однако установленные эффекты ограничены демонстрацией влияния заявленных средств на углеводный обмен в культивируемых мышечных трубках мыши и человека. Не изучены его эффекты на целостном организме при гипергликемии и инсулинорезистентности, что не позволяет оценить влияние указанных средств на другие нарушения функций органов и систем.
В статье Peterson S.J. et al. J. Lipid Res. 2009. Vol. 50. N.7. P. 1293–1304 изучали возможности применения пептида L-4F, имеющего аминокислотную последовательность D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F-NH2, синтезированную из L-аминокислот, и являющегося миметиком AпоА-I, для профилактики инсулинорезистентности. На мышах с ожирением и диабетом показано уменьшение содержания висцерального жира с реципрокным увеличением адипонектина, снижение содержания липидов в печени, улучшение чувствительности к инсулину т.е. снижение инсулинорезистентности. Недостатком является отсутствие исследований влияния указанного миметика AпоА-I на другие функциональные нарушения органов и систем, связанные с инсулинорезистентностью, выходящие за пределы нарушений углеводного и жирового обмена.
В статье Edmunds S.J. et al. Diabetologia. 2019. Vol. 62. N. 7. P. 1257-1267 изучено применение пептида RG54, являющегося короткой пептидной последовательностью, полученной из АпоA-I и включающего 54 аминокислоты его С-концевой области, в качестве антиатеросклеротического и антидиабетического средства. Показано, что синтетический пептид RG54 индуцирует поглощение глюкозы в миотрубках культивируемых мышц крысы в той же степени, что и инсулин, а также праймирует клональные бета-клетки поджелудочной железы для улучшения секреции инсулина, стимулируемой глюкозой. Результаты были проверены на индуцированных диетой инсулинорезистентных мышах и мышах с диабетом Leprdb, что совместно подтвердило полученный эффект заявленного функционального фрагмента АпоA-I на показатели углеводного обмена в культивируемых мышцах и культивируемых бета-клетках поджелудочной железы. Недостатком является отсутствие исследований на уровне целого организма при гипергликемии и/или инсулинорезистентности с точки зрения влияния эффекта АпоA-I на жировой обмен, массу тела субъекта, функциональные нарушения печени, костного мозга, локомоторную и когнитивную активность, связанные с гипергликемией и/или инсулинорезистентностью.
Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является техническое решение из публикации US2015353626 A1, где раскрыты полипептид, содержащий фрагмент АпоА-I; фармацевтическая композиця, включающая указанный полипептид, а также способ лечения заболеваний, характеризующихся гипергликемией и/или инсулинорезистентностью, включающий введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества вышеуказанного полипептида. Полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: а) фрагмента аминокислотной последовательности С-концевой части АпоA-I, соответствующей аминокислотам 190-243; б) биологически активного варианта последовательности а), содержащего, по меньшей мере, 70% идентичности вышеуказанной последовательности; и в) биологически активного фрагмента а) или б), где фрагмент содержит, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислот фрагмента а), при этом указанный полипептид имеет длину менее 100 аминокислот, и при этом указанная биологическая активность представляет собой индукцию поглощения глюкозы клетками Фармацевтическая композиция дополнительно может содержать второй активный ингредиент для лечения метаболического заболевания и/или сердечно-сосудистого заболевания, выбранный из группы известных лекарственных средств. К заболеваниям и нарушениям, связанным с гипергликемией и/или инсулинорезистентностью, в данной публикации относят, в частности, метаболические нарушения и заболевания, выбранные из группы: сахарный диабет 2 типа, ожирение, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии, гиперхолестеринемии, сердечно-сосудистые заболевания (атеросклероз, ишемические и другие заболевания сердца).
Недостатком указанного наиболее близкого аналога является то, что его применение ограничено коррекцией эндокринно-метаболических нарушений при гипергликемии и/или инсулинорезистентности, включающих нарушения липидного и углеводного обмена при сахарном диабете и ожирении. Остались неизученными эффекты раскрытого полипептида на функциональные нарушения печени, почек, костного мозга и селезенки, локомоторную и когнитивную активность, связанные с гипергликемией и/или инсулинорезистентностью.
Таким образом, технической проблемой, решение которой обеспечивается при осуществлении или использовании настоящего изобретения, является расширение показаний к применению полипептида на основе аполипопротеина А-I для коррекции функционального состояния субъекта, страдающего гипергликемией и инсулинорезистентностью.
Раскрытие сущности изобретения
Общим техническим результатом является расширение спектра функциональных нарушений, поддающихся коррекции у субъекта, страдающего гипергликемией и инсулинорезистентностью.
К частным техническим результатам относятся следующие: снижение функциональных нарушений печени, почек, костного мозга и селезенки, органов репродуктивной системы, улучшение сократительной функции миокарда, улучшение локомоторной активности и когнитивной функции и связанное с этим улучшение качества жизни.
Изобретение относится к средству для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, включающему в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
В одном варианте осуществления, заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы: ожирение, сахарный диабет 2 типа.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивной функции.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоза макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8, повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
В одном варианте осуществления указанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка ( rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1, и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор.
Изобретение также относится к применению вышеуказанного средства для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем.
В одном варианте осуществления заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
В одном варианте осуществления применение для лечения заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивной функции.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и, повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
Изобретение также относится к способу лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту вышеуказанного средства.
В одном варианте осуществления заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
В одном варианте осуществления способ предназначен для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией иинсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функции печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
В одном варианте осуществления указанное средство включает в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
В одном варианте осуществления указанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1. и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте фармацевтическая композиция предназначена для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор.
В одном варианте осуществления введение вышеуказанного средства осуществляют местно или парентерально.
В одном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют внутривенно или внутримышечно.
В одном варианте осуществления местное введение осуществляют подкожно.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Динамика массы тела мышей в контрольных и опытной группах мышей с 1 по 16 неделю эксперимента.
К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши линии мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243. * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+) .
Фиг. 2. Сравнение размера тела мышей db/db J в контрольной и опытной группах.
А – мыши db/db, положительный контроль К(+), Б – мыши db/db, получавшая инъекцию rАпоА-I-3-243 (опытная группа rАпоА-I-3-243). 16 –я неделя эксперимента.
Фиг. 3. Изменение концентрации глюкозы в плазме крови контрольных и опытной групп мышей.
Т0 – показатели перед началом эксперимента, Т1–Т5 – контрольные точки измерения глюкозы. К(-) – интактные здоровые мыши ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243. * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к К(+).
Фиг. 4. Динамика уровня инсулина в плазме крови контрольных и опытной групп мышей.
Т0 – показатели перед началом эксперимента, Т1 - 2 недели после начала эксперимента, Т2 - 4 недели после начала эксперимента, Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db J (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243. * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Фиг. 5. Динамика уровня холестерина в плазме крови контрольных и опытной групп мышей.
Т0 – показатели перед началом эксперимента, Т1 - 2 недели после начала эксперимента, Т2 - 4 недели после начала эксперимента, Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(-) – контрольная группа интактных здоровых животных ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I. * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Фиг. 6. Динамика уровня триглицеридов в плазме крови контрольных и опытной групп мышей.
Т0 – показатели перед началом эксперимента, Т1 - 2 недели после начала эксперимента, Т2 - 4 недели после начала эксперимента, Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243.
Фиг.7. Динамика уровня лактата в плазме крови контрольных и опытной групп мышей.
Т0 – показатели перед началом эксперимента, Т1 - 2 недели после начала эксперимента, Т2 - 4 недели после начала эксперимента, Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR , К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243 . * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Фиг. 8. Фото селезенки мышей, пятая контрольная точка (Т5)
А – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR (К-), Б – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), К(+), В – опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243 .На рис. Б овалом показана зона некроза.
Фиг.9. Уровень тестостерона в плазме крови контрольной и опытной групп мышей db/db через 2 недели после начала эксперимента (Ме±m).
Т1 - 2 недели после начала эксперимента. * - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Осуществление изобретения
Аполипопротеин A-I (АпоА-I) — нативный (природный) аполипопротеин плазмы крови, входящий в состав липопротеинов высокой плотности (ЛПВП).
Гипергликемия - клинический симптом, обозначающий увеличение содержания глюкозы в сыворотке крови по сравнению с нормой. Хроническая гипергликемия при сахарном диабете сопровождается повреждением, дисфункцией и недостаточностью различных органов и систем.
Гиперинсулинемия – это клинический синдром, который характеризуется высоким уровнем инсулина в крови.
Диабетическая кардиомиопатия - специфические патологические изменения сердечно сосудистой системы у пациентов с диабетом, характеризующиеся гипертрофией левого желудочка и диастолической дисфункцией на ранней стадии вплоть до явной сердечной недостаточности со снижением систолической функции на поздних стадиях [Paolillo S. et al. Heart Fail Clin. 2019. 15(3):341-347].
Дислипидемия (ДЛП) - состояния, когда концентрации липидов и липопротеидов крови выходят за пределы нормы, могут быть вызваны как приобретенными (вторичными), так и наследственными (первичными) причинами.
Иммунорегуляторный индекс или отношение CD4/CD8 – это характеристика общей дисфункции иммунной системы цитотоксических Т лимфоцитов CD8+ и T хэлперов CD 4+ , где цитотоксические Т лимфоциты CD8+ - это Т-лимфоциты (тип белых кровяных телец), которые убивают поврежденные клетки; T хэлперы CD 4+ - это вид Т-клеток, которые выполняют функции регулирования процессов работы других клеток иммунной системы (Т-киллеров, B-лимфоцитов, макрофагов, NK-клеток), распознают антигены и «принимают решения» о запуске или остановке процессов функционирования механизмов приобретённого клеточного иммунного ответа. Основным фенотипическим признаком Т-хелперов служит наличие на поверхности клетки молекулы CD4, цитотоксических Т лимфоцитов - наличие на поверхности клетки молекулы CD8. CD4 - мономерный трансмембранный гликопротеин надсемейства Ig, CD8 – трансмембранный гликопротеин, служащий корецептором Т-клеточных рецепторов.
Инсулинорезистентность – снижение чувствительности клеточных структур к инсулину при его достаточной концентрации в крови, приводящее к хронической компенсаторной гиперинсулинемии.
Качество жизни – это отражение влияние заболевания и результатов лечения на локомоторную и когнитивную функции, массу тела, биохимические, иммунологические и другие показатели, отражающие функциональное состояние различных органов и систем.
Положительное влияние лекарственной терапии на любой из выше представленных критериев рассматривается как улучшение качества жизни.
Когнитивные функции – это сложные функции головного мозга, с помощью которых в рамках заявленного изобретения осуществляется процесс рационального познания структурированного пространства, в которое помещены экспериментальные животные, и обеспечивается их целенаправленное взаимодействие с ним.
Локомоторная активность – вид двигательной деятельности, связанный с активным перемещением субъекта в пространстве, осуществляемое мышечной и скелетной системами организма, которое требует расхода энергии.
Ожирение – это хроническое заболевание, характеризующееся избыточным накоплением жировой ткани в организме, представляющим угрозу здоровью, и являющееся основным фактором риска ряда других хронических заболеваний, включая СД 2 и сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ).
Сахарный диабет (СД) – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся хронической гипергликемией, которая является результатом нарушения секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов
Сахарный диабет 2 типа (инсулиннезависимый сахарный диабет, СД2) — это нарушение углеводного обмена, вызванное преимущественной инсулинорезистентностью или относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным нарушением секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без нее. Сахарный диабет 2 типа выражается в хроническом повышении концентрации глюкозы в крови (гиперкликемией).
Рекомбинантный АпоА-I – белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью природного АпоА-I, полученный генно-инженерным способом путем помещения гена зрелого белка АпоА-I в генетический материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, эти микроорганизмы могут использоваться как продуценты АпоА-I для медицинских, научно-исследовательских целей
Терапевтически эффективное количество – это доза заявленного средства при введении субъекту, достаточная для получения результата, направленного на лечение или профилактику гипергликемии и/или инсулинорезистентности и/или связанных с ними заболеваний и/или функциональных нарушений органов и систем.
Фармацевтически приемлемый носитель означает, что носитель должен являться совместимым с другими ингредиентами композиции и не наносить вреда его реципиенту, то есть быть нетоксичным для клеток или млекопитающих в тех дозах и концентрациях, в которых его применяют.
Изобретение относится к средству для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем включает в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
Цельная молекула АпоА-I человека имеет аминокислотную последовательность размером 243 а.о. молекулярной массой 28,5 кДа (аминокислотные остатки 1-243). Нативный АпоА-I человека является компонентном липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) плазмы крови.
Нативный АпоА-I человека (аминокислотные остатки 1-243, АпоА-I-1-243) может быть получен согласно Mills G.L. et al. [Guidebook to Lipoprotein Techniques. Edited by R. H. Burden and P. H. van Knippenberg. – Amsterdam: Elsevier, 2000. – 475 р.] путем выделения ЛПВП из плазмы крови человека с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе КВr с последующими делипидированием ЛПВП [Cham B. E., Knowlee B. R. J. Lipid. Res. - 1976. - Vol. 17, No. 2. P. 176–181] и очисткой [Пыхтина М.Б. и др. Биофармацевтический журнал. - 2012. - Т. 4. - № 6. - С. 37-45].
Рекомбинантный АпоА-I человека SEQ ID NO 1 (аминокислотные остатки 3-243, rАпоА-I-3-243) может быть получен с помощью методов генной инженерии путем конструирования рекомбинантной ДНК, обеспечивающей в составе плазмидного вектора экспрессию синтетического гена, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный АпоА-I человека, в клетках E.coli, например, по патенту РФ № 2573930, с последующим получением зрелого rАпоА-I-3-243 человека путем кислотного гидролиза соответствующего химерного белка, но не ограничивающихся указанным методом.
В одном варианте осуществления заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
В одном варианте осуществления средство предназначено для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивной функций.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышение доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
В одном варианте осуществления указанное средство включает в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка размером 241 а.о. с молекулярной массой 28,3 кДа (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
В одном варианте осуществления вышеуказанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей rАпоА-I-3-243, и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте фармацевтическая композиция предназначена для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает rАпоА-I-3-243 человека и воду для инъекций.
Изобретение также относится к применению rАпоА-I-3-243 человека для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем.
В одном варианте осуществления заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и, сахарного диабета 2 типа.
В одном варианте осуществления предложено применение указанного средства для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушение функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
В одном варианте осуществления указанное средство включает в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка размером 241 а.о. с молекулярной массой 28,3 кДа (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
В одном варианте осуществления вышеуказанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей rАпоА-I-3-243, и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает rАпоА-I-3-243 человека и воду для инъекций.
Изобретение также относится к способу лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту указанного средства в терапевтически эффективном количестве.
В одном варианте осуществления заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа. Основными признаками указанных заболеваний являются нарушения липидного и углеводного обмена. При этом нарушения липидного обмена включают избыточную массу тела, повышенное содержание триглицеридов и холестерина липопротеинов низкой плотности в плазме крови. Нарушения углеводного обмена включают повышенный уровень инсулина и/или глюкозы в плазме крови.
В одном варианте осуществления способ предназначен для лечения или профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
В одном варианте осуществления нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
В одном варианте осуществления нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозг
В одном варианте осуществления нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
В одном варианте осуществления нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
В одном варианте осуществления нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
В одном варианте осуществления функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
В одном варианте осуществления указанное средство включает в качестве активного компонента рекомбинантный АпоА-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка размером 241 а.о. с молекулярной массой 28,3 кДа (rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1.
В одном варианте осуществления вышеуказанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей rАпоА-I-3-243 SEQ ID NO 1., и фармацевтически приемлемый носитель.
В одном варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция включает rАпоА-I-3-243 человека и воду для инъекций.
В одном варианте осуществления введение заявленного средства осуществляют местно или парентерально..
В одном варианте осуществления парентеральное введение осуществляют внутривенно или внутримышечно.
В одном варианте осуществления местное введение осуществляют подкожно.
Продолжительность введения и терапевтически эффективное количество вводимого заявленного средства может широко варьироваться в зависимости от множества факторов, включая выраженность гипергликемии и, следовательно, выраженность резистентности к инсулину, ожирения, функциональных нарушений органов и систем, параметров субъекта, включая размер, вес, возраст, и другие факторы, хорошо известные специалисту в данной области техники.
Субъектом с признаками гиперинсулинемии и инсулинорезистентности исвязанными с ними заболеваниями и функциональными нарушениями органов и систем, является млекопитающее.
ПРИМЕРЫ
Все примеры осуществления изобретения выполнены с применением rАпоА-I-3-243) SEQ ID NO 1, имеющего аминокислотную последовательность АпоА-I-1-243 человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка (rАпоА-I-3-243).
Пример 1. Получение rАпоА-I-3-243 человека
rАпоА-I-3-243, соответствующий аминокислотам 3-243 АпоА-I человека (SEQ ID NO 1) (далее – «rАпоА-I-3-243») получали генно-инженерным способом, как описано в патенте РФ № 2573930. В частности, рекомбинантную ДНК, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный АпоА-I, и обеспечивающую его синтез в клетках E.coli, клонировали в составе плазмидного вектора. Химерный АпоА-I выделяли и очищали. Для получения rАпоА-I-3-243 химерный белок АпоА-I подвергали кислотному гидролизу.
Пример 2. Описание экспериментов.
Описание линии мышей, использованных для экспериментального осуществления заявленного изобретения
Осуществление изобретения показано в Примерах 3-11 на экспериментальной модели гипергликемии и инслинорезистентности, в качестве которой использовали мышей линии BKS.Cg-Dock7mLeprdb/+/+/J (далее - мыши db/db). Для осуществления изобретения использовали мышей db/db c гиперинсулинемией, инсулинорезистентностью, СД2, ожирением и интактных здоровых мышей ICR в качестве отрицательного контроля.
В качестве одного из контролей использовали аутбредных (нелинейных) лабораторных мышей ICR, которые являются наиболее часто используемыми исследовательскими объектами в области онкологии, токсикологии, тератология, при разработке вакцин, изучении старения и для общих целей.
Мыши db/db являются широко используемой моделью для изучения ожирения и СД2. Они несут генетическую мутацию в рецепторе лептина. Используемые в исследовании гомозиготные мыши данной линии характеризуются прогрессирующим ожирением в возрасте от трех - четырех недель и развитием СД2, выраженной гипергликемией с 4–8-й недели жизни и развитием органных поражений после 8–10-й недели. Повышение уровня инсулина в плазме крови начинается в возрасте от 10 до 14 дней. Экзогенный инсулин не контролирует уровень глюкозы в крови, и активность ферментов глюконеогенеза возрастает. Заживление ран замедляется, а эффективность обмена веществ повышается. Гомозиготные особи женского пола характеризуются снижением массы матки и яичников, снижением секреции гормонов яичниками и выраженными включениями липидов в фолликулах и эндометрии. Нарушения клеточного иммунитета у мышей db/db и контрольной группы ICR исследованы как in vivo, так и in vitro. Наблюдается значительное подавление замедленного отека подушечек стопы и времени отторжения первого и второго установленных кожных аллотрансплантатов. Кроме того, синтез ДНК в клетках селезенки после неспецифической стимуляции митогеном заметно подавлен. Животные с СД2 со средним уровнем глюкозы в крови 512 ± 101 мг / 100 мл не реагируют на экзогенную инсулинотерапию снижением уровня глюкозы в крови, т.е. характеризуются инсулинорезистентностью. У мышей db/db заметно подавлены клеточно-опосредованные иммунные механизмы [Yoon J.W. et al. Diabetes. 1988. 37(9):1287-93.; Mandel M.A. et al. J Immunol. 1978. 120(4):1375-1377. ; Do, O.H. et al. Diabetologia. 2016. 59, 1222-1230. -; Conn P.M. Academic Press, Elsevier Inc. 2017:1175].
Таким образом, у мышей db/db согласно вышеуказанным данным исследований в указанные выше сроки от рождения развиваются гиперинсулинемия, обусловленная генетической мутацией, инсулинорезистентность и связанные с этим ожирение и СД2.
Для изучения эффективности заявленного средства использовали интактных здоровых мышей ICR и мышей db/db в возрасте 6 недель на момент начала эксперимента.
Данные об экспериментальных мышах приведены в таблице 1.
Таблица 1.Данные об экспериментальных животных
8 недель
8 недель
Средство
В качестве средства применяли rАпоА-I-3-243, полученный в Примере 1, составленный в виде фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента rАпоА-I-3-243, и фармацевтически приемлемый растворитель, в которой в качестве фармацевтически приемлемого растворителя применяли воду для инъекций.
Методика эксперимента
Мышей db/db, как и интактных здоровых мышей ICR кормили обычной пищей, со свободным доступом к воде.
Были сформированы три группы экспериментальных животных:
К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR, 10 особей;
К(+) - контрольная группа мышей db/db c гипергликемией, инсулинорезистентностью, и развитием в течение нескольких недель после рождения ожирения, СД2.
Группа rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db c гипергликемией, инсулинорезистентностью, и развитием в течение нескольких недель после рождения ожирения, СД2.
Контрольным мышам подкожно (в зону холки) вводили физраствор в эквивалентном объеме относительно опытной группы rАпоА-I.
Опытной группе rАпоА-I-3-243 вводили подкожно (в зону холки) rАпоА-I-3-243 в дозе 7 мг/кг массы тела, при этом rАпоА-I вводили в составе фармацевтической композиции, в которой в качестве фармацевтически приемлемого носителя использовали воду для инъекций, при концентрации rАпоА-I-3-243 в растворе 1,2 мг/мл.
Опытная и контрольные группы мышей db/db включали по 23 особи в каждой группе. Животные распределены по группам случайным образом.
В таблице 2 приведен график манипуляций и инъекций rАпоА-I-3-243 опытным мышам db/db или физраствора контрольным мышам данной линии.
В таблице 2 приведены точки забора биоматериалов для оценки показателей функций органов и систем. В качестве точек измерения биохимических показателей крови помимо исходной (Т0), были взяты точки забора биоматериала Т1 - через 2 недели, Т2 - через 4 недели, Т3 – через 8 недель, Т4 – через 12 недель и Т5 – через 16 недель после начала эксперимента.
По результатам еженедельного взвешивания определяли динамику массы тела опытных и контрольных мышей в течение 1-16 недель эксперимента (пример 3).
Образцы крови забирали из хвостовой вены для определения содержания в плазме крови глюкозы, инсулина (пример 4), холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП-ХС), триглицеридов (пример 5), аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина (пример 7), лактата (пример 6), тестостерона (пример 10). Точки измерения биохимических показателей крови указаны в таблице 2.
Образцы костного мозга использовали для оценки пролиферации, апоптоза клеток костного мозга (пример 8).
Селезенку и её образцы использовали для оценки органной целостности селезенки, общего количества макрофагов, апоптоза макрофагов, иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 (пример 9).
Методы и результаты оценки локомоторной и когнитивной активности описаны в примере 6.
Сократительную функцию миокарда изучали на модели изолированного сердца (пример 11).
Таблица 2
(еженедель-но, указан номер недели с начала эксперимен-та)
(через 2 недели)
забор биоматериала (кровь, костный мозг, селезенка)
(через 16 недель)
Пример 3. Влияние rАпоА-I-3-243 на массу тела мышей db/db
Оценку массы тела проводили еженедельно на весах Navigator Ohaus, США в течение всего эксперимента. Данные представлены в виде M±m.
Поскольку мыши db/db несут спонтанную генетическую мутацию в рецепторе лептина, то увеличение массы тела происходит преимущественно за счет прироста жировой ткани [Do O.H. et al. Diabetologia. 2016. Vol. 59, P. 1222-1230; Conn P.M.Animal Models for the Study of Human Disease (Second Edition), Academic Press, Elsevier Inc. 2017:1175]. В связи с этим состояние ожирения фиксировали по приросту массы тела относительно интактных здоровых животных ICR (Фиг.1).
Оценивали динамику массы тела относительно точки начала эксперимента. В результате показано, что динамика массы тела в течение всего эксперимента имела линейную восходящую в обеих экспериментальных группах мышей db/db : контрольной группе К(+) и опытной группе rАпоА-I-3-243. При этом уже после первой недели эксперимента масса животных в опытной группе rАпоА-I-3-243 была достоверно ниже на 7% относительно контрольной группы интактных здоровых животных ICR. Данная тенденция сохранялась на протяжении всего эксперимента и к 16 недели снижение в опытной группе rАпоА-I-3-243 составило 15,2% относительно группы К(+).
На фигуре 2. Представлен внешний вид мышей db/db :
А – К(+), Б – группа rАпоА-I-3-243. 16-я неделя эксперимента. Визуально видно, что мышь из группы rАпоА-I меньше по размерам.
Таким образом, показано что введение rАпоА-I-3-243 в дозировке 7 мг/кг в течение всего эксперимента приводило к снижению массы тела мышей db/db.
Пример 4. Влияние rАпоА-I-3-243 на состояние гипергликемии и гиперинсулинемии
Контроль глюкозы проводили спектрофотометрическим методом, используя наборы компании ВекторБест, Россия.
Мониторинг уровня инсулина проводили методом ИФА ELISA, ВекторБэст, Россия. Эксперимент начинали с животными в возрасте 8 недель после подтверждения гипергликемии и гиперинсулинемии.
В качестве точек измерения концентрации глюкозы в плазме крови помимо исходной (Т0), были взяты точки забора биоматериала Т1, Т2 и Т5, а также две промежуточные точки Т3, Т4 (Фиг. 3). Оценка показателя концентрации глюкозы в плазме крови мышей db/db показала достоверное снижение в опытной группе rАпоА-I-3-243 в точках Т1 и Т2 на 64% и 37% соответственно по отношению к контрольной группе мышей (положительный контроль К(+)). Однако эти показатели были выше соответствующих показателей интактных здоровых животных ICR (К(-)). Во временном интервале точки Т1 и Т2 соответствуют 2 и 4 неделям. Стоит отметить, что в опытной группе rАпоА-I-3-243 были выявлены животные с концентрацией глюкозы в пределах 6,7-8,2, тогда как к группе К(+) таких эффектов не наблюдалось.
Состояние гиперинсулинемии фиксировали относительно интактных здоровых мышей ICR (Фиг.4). В исходной точке Т0 уровень инсулина у мышей db/db в 6,7 раз превышал таковой в группе интактных мышей ICR. В динамике уровень инсулина у мышей db/db в обеих группах имел плавное снижение и к 16 неделе был ниже на 10% относительно исходного, однако состояние гиперинсулинемии сохранялось.
Таким образом, можно сделать вывод, что rАпоА-I-3-243 способствует снижению гипергликемии за счет увеличения поглощения глюкозы у мышей db/db в обход механизма инсулинорезистентности.
Пример 5. Влияние rАпоА-I-3-243 на показатели липидного обмена
Оценка уровня холестерина в плазме крови показала достоверное снижение в группе rАпоА-I-3-243 на 8,6% относительно К(+) в первой контрольной точке (Т1) (Фиг.5.). Однако затем показатель плавно возрастал и на 16 неделе в группе rАпоА-I-3-243 был выше на 11,3% относительно К(+).
При этом по сравнению с контрольной группой интактных здоровых мышей ICR К(-) в обеих группах мышей db/db (контрольная группа К(+) и опытная группа rАпоА-I-3-243) холестерин был выше практически в 2 раза на протяжении всего эксперимента.
Оценку холестерина ЛПНП производили однократно на 16 неделе. Показано, что данный показатель в контрольной группе интактных здоровых животных ICR К(-) составил 1,02±0,063 мМоль/л. Данные опытной группы rАпоА-I-3-243 показали 1,11±0,098мМоль/л, что было на 8,2% выше относительно К(-). При этом в контрольной группе мышей db/db К(+) холестерин ЛПНП был 1,395±0,079мМоль/л, что было на 26,9% выше относительно К(-) и на 20,5% относительно опытной группы rАпоА-I-3-243. Таким образом, rАпоА-I-3-243 способствует снижению уровня холестерина ЛПНП в плазме крови мышей db/db.
Изменение в течение всего эксперимента уровня триглицеридов (ТГ) представлено на Фиг. 6. Показано, что в контрольной и опытной группах мышей db/db показатель значительно превышает данные в контрольной группе интактных здоровых животных ICR К(-) во всех контрольных точках. Сравнение опытной группы rАпоА-I-3-243 и контрольной группы К(+) показало, что в первой контрольной точке (Т1) уровень ТГ в группе rАпоА-I-3-243 достоверно выше на 16,9% относительно К(+). Затем идет снижение в обеих группах, а в Т3 уровень ТГ в группе rАпоА-I-3-243 на 23,8% ниже значения в К(+).
Таким образом, введение rАпоА-I-3-243 мышам db/db в дозировке 7 мг/кг оказывает положительное влияние на уровень триглицеридов и холестерин ЛПНП при длительном применении.
Исходя из данных о снижении уровня триглицеридов, холестерина ЛПНП и увеличения общего холестерина в группе мышей rАпоА-I-3-243, можно утверждать, что увеличение общего холестерина происходит за счет увеличения объема фракции ЛПВП. Данный эффект rАпоА-I-3-243 можно рассматривать как антиатерогенный, кардиопротекторный.
Результаты изучения липидного обмена позволяют сделать заключение о снижении нарушений липидного обмена у мышей db/db под действием rАпоА-I-3-243.
Пример 6. Влияние rАпоА-I-3-243 на локомоторную и когнитивную функции
В таблице 3 представлено влияние rAпоА-I-3-243 на показатели локомоторной функции мышей db/db. Показано, что опытная группа rАпоА-I-3-243 и контрольная К(+) группа мышей db/db имеют нарушение локомоторной функции по всем показателям относительно контрольной группы здоровых мышей К(-). При этом в группе К(+) имеется 4 позиции с полным отсутствием проявления признака, тогда как в группе rАпоА-I-3-243 только две. Далее сравнение групп мышей db/db выявило следующие отличия. Мыши группы rАпоА-I-3-243 в три раза быстрее начинали первое движение. Они в 2,17 раза посетили больше квадратов, и в данной группе были единичные пристеночные стойки, тогда как в группе К(+) они вовсе отсутствовали. Эти данные говорят о том, что введение rАпоА-I-3-243 способствует улучшению локомоторной функции мышей db/db. Мыши группы rАпоА-I-3-243 имели более частый выход обратно к центру и в 1,73 раза больше посещений условных норок, что указывает на улучшение когнитивных способностей.
Таблица 3. Показатели локомоторной и когнитивной функций в контрольных и опытной группе мышей через 16 недель эксперимента.
квадратов, количество раз
количество раз
количество раз
количество раз
Примечание: К(-) – интактных здоровых мыши ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db , получавшие rАпоА-I
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+)
# - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(-)
Косвенным подтверждением данных об улучшении локомоторной функции является показатель уровня лактата в плазме крови. На фиг.7 показано, что уровень лактата в группах мышей db/db практически в 1,5 раза ниже относительно К(-). При этом сравнение между опытной группой rАпоА-I-3-243 и контрольной группой К(+) показывает расщепление двух кривых начиная с Т2 в пользу опытной группы rАпоА-I-3-243. К 16 неделе эксперимента происходит достоверное увеличение данного показателя на 14,4% в опытной группе rАпоА-I-3-243 относительно контрольной группы К(+), что подтверждает улучшение локомоторной функции.
Пример 7. Влияние rАпоА-3-243 на биохимические показатели функционального состояния печени и почек
Анализ биохимических показателей функции печени (таблица 4) указывает на то, что обе группы мышей db/db имеют нарушения функции печени по всем показателям. Сравнение опытной группы rАпоА-I-3-243 и контрольной группы К(+) мышей db/db между собой выявило некие особенности. При одинаковом уровне аспартатаминотрансферазы (АСТ), показатель аланинаминотрансферазы (АЛТ) в опытной группе rАпоА-I-3-243 был на 25,6% ниже относительно контрольной группы К(+). Так же на 33,4% был снижен показатель гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ). При этом активность щелочной фосфатазы в опытной группе rАпоА-I-3-243 была на 37,8% выше относительно контрольной группы К(+). Эти данные говорят о том, что функция печени у мышей db/db в опытной группе rАпоА-I-3-243 менее нарушены в сравнении с контрольной группой К(+). Показатель щелочной фосфатазы требует более детального изучения, поскольку данный фермент имеет отношение помимо функции печени так же к повреждению или функциональной перестройке костной ткани.
Показатель креатинина в крови (таблица 4) указывает на нарушения со стороны почек в обеих мышей db/db. При этом в опытной группе rАпоА-I-3-243 данный показатель был на 26,18% ниже относительно контрольной группы К(+). Это свидетельствует о менее выраженном нарушении функции почек в опытной группе rАпоА-I-3-243 относительно контрольной группы К(+).
Таблица 4. Влияние rАпоА-I-3-243 на биохимические показатели плазмы крови мышей через 16 недель после начала эксперимента - Т5
Примечание: К(-) – интактные здоровые мыши ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль К(+)), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243 .
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+), # - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(-).
Таким образом, rАпоА-I-3-243 обладает гепатопротекторным и нефропротекторным действием, снижая таким образом функциональные нарушения печени и почек.
Пример 8. Анализ функционального состояния и качественного состава костного мозга.
Патологические явления, влияющие на костный мозг, способствуют сердечно-сосудистым осложнениям у людей с диабетом. Фадини и его коллеги продемонстрировали, что уровни циркулирующих проангиогенных клеток, полученных из костного мозга, обратно коррелируют с осложнениями в коронарной, периферической и цереброваскулярной областях у больных с диабетом [Fadini G.P. et al. Stem Cells 2017. Vol. 35. N.1. P. 106–116.].
Известно, что сердечно-сосудистые факторы риска, включая СД2, могут оказывать негативное влияние как на количество, так и на набор циркулирующих клеток-предшественников (ПК). Недавние данные свидетельствуют о том, что менее дифференцированные CD133 (+) ПК способствуют заживлению миокарда и являются многообещающими кандидатами для терапии. Показано, что СД2 не только ограничивает количество CD133(+) после острого инфаркта миокарда, но и ограничивает их активацию. Это может быть объяснено более низкой устойчивостью CD133(+) к окислительному стрессу [Vöö S. et al. J Intern Med. 2009. Vol. 265. N.2. P.238-249.].
CD133 – это маркер, который часто обнаруживается на мультипотентных клетках-предшественниках, включая незрелые гемопоэтические стволовые и клетки-предшественники. CD133 выбран в качестве одного из маркеров, выявляющих нарушения в костном мозге при сахарном диабете и оценке эффективности заявленного средства для снижения этих нарушений.
Для анализа влияния заявленного средства - rАпоА-I-3-243 на костный мозг мышей db/db указанным мышам вводили rАпоА-I подкожно по схеме, представленной в Таблице 2. В указанные временные сроки животных выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации спинного мозга в шейном отделе. Костный мозг выделяли стандартным методом из бедренной кости [Гольдберг Е.Д. и др., Методы культуры ткани в гематологии. Томск. - 1992.]. Кости промывали в холодном фосфатном буфере (PBS), отсекали эпифизы и осторожно вымывали костный мозг при помощи шприца в пробирки, содержащие PBS с 2% эмбриональной сывороткой теленка (ЭТС). Клетки бережно суспендировали в 1мл данного буфера, осаждали центрифугированием (300 g, 7 мин). Осадок ресуспендировали в буфере PBS и использовали для окрашивания моноклональными антителами для определения стволовых клеток костного мозга и макрофагов. Для определения пролиферативной активности кеток костного мозга (ККМ), полученные клетки фиксировали холодным 70% этанолом до момента окрашивания не менее 4 часов. После фиксации клетки осаждали центрифугированием (400 g, 7 мин), отмывали PBS, инкубировали 5 минут в гипотоническом буфере экстракции низкомолекулярной ДНК для определения пика апоптозных клеток . После отмывки клетки окрашивали в темноте в течении 30 минут в буфере окраски -50 µg/mL йодида пропидия (PI, Sigma, США) и 200 µg/mLРНКазы-А (Invitrogen, США). Оценивали количество клеток с различным содержанием ДНК в фазах клеточного цикла SubG1, G0/G1, S, G2/M методом проточной цитометрии, измеряя флуоресценцию иодита пропидия при λEm = 670 нм.
Суспензию клеток костного мозга анализировали методом проточной цитометрии («CYTOFLEX S100», «BeckmanCoulter», США), используя моноклональные антитела PE/Cy7 anti CD117 (ab95576 Аbcam, United Kingdom);) APC anti-mouse CD133 (397906, BioLegend, USA) и Per CP5.5 anti – mouse Sca-1 (108124, BioLegend, USA), FITC anti – mouse F4/80 (123108, BioLegend, USA). Пробы клеток (2х106) в 100мкл окрашивали флуоресцентно меченными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре, в темноте. Дважды отмывали PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре. Собирали не менее 10 000 событий на пробу. Погибшие клетки (апоптоз, дебрис) определяли анализируя цитограммы проточной цитометрии в координатах FSC/SSC выделяя гейты (популяции клеток) исходя из параметров размер/гранулярность, клетки расположенные вблизи нулевой точки и образующие мелкодисперсный пул считали погибшими. Также процент апоптозных клеток определяли по пику гиподиплоидов при анализе клеточного цикла.
Показано, что количество клеток костного мозга с маркером CD133 в опытной группе rАпоА-I-3-243 в 5,7 выше отностельно контрольной группы К(+) (таблица 5). При этом апоптоз CD133 клеток в опытной группе rАпоА-I-3-243 на 11,1 % ниже относительно контрольной группы К(+), однако эти данные не имеют достоверных отличий. Данные Т2 и Т3 отсутствуют ввиду того, что в этих точках значения были на уровне нуля в обеих группах. Эти данные указывают на то, что rАпоА-I-3-243 на ранних сроках терапии проявляет стимулирующее действие на пролиферацию стволовых клеток.
Таблица 5. Изменение данных общего количества клеток и клеток в апоптозе популяции CD133 в костном мозге мышей, в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m).
Примечание: К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
В качестве второго маркера, позволяющего выявить нарушения в костном мозге при СД2, выбран Sca-1. Известно, что Sca-1 является маркером стволовых клеток. Показано, что Sca-1-содержащие резидентные сосудистые стволовые клетки являются регенеративным пулом для кардиомиоцитов, а также участвуют в качестве регенераторных клеток гладкой мускулатуры сосудов [Shizuka U., et al. Stem Cell Reports. 2013. Vol. 1. N.5. P. 397-410.; Tang J. et al. Cell Stem Cell. 2020. Vol. 26. N.1. P. 81-96.]. Известно, что высокий уровень глюкозы запускает апоптоз клеток-предшественников Sca1+ в зависимости от дозы и времени [Yang P. et al Biochem Biophys Res Commun. 2017. Vol. 482. N. 4. P. 575-581].
В проведенном исследовании в первой точке количество Sca-1 содержащих клеток костного мозга в группе rАпоА-I-3-243, было на 87,5% выше относительно группы К(+) (таблица 6).
Таблица 6. Изменение данных общего количества клеток и клеток в апоптозе популяции, Sca-1 в костном мозге мышей, данные представлены в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m).
Примечание: Т1, - 2 недели после начала эксперимента; Т2, - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db , которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
В точке Т2 наблюдается снижение прироста Sca-1 содержащих клеток костного мозга до 20,4%. В пятой контрольной точке – Т5 разница в количестве Sca-1 содержащих клеток костного мозга так же была в пользу группы rАпоА-I-3-243 и составила 52,6%. Таким образом, на протяжении всего эксперимента rАпоА-I-3-243 поддерживал пул Sca-1 содержащих клеток костного мозга на более высоком уровне. Данный факт позволяет предполагать, что rАпоА-I-3-243 через стимуляцию Sca-1-положительных клеток может оказывать протекторное влияние на сердечно-сосудистую систему при СД 2 типа.
В качестве третьего маркера, позволяющего выявить нарушения в костном мозге при СД2, выбран CD117+ (c-kit). Нарушение ангиогенеза является общим признаком сахарного диабета, тогда как повреждение CD117+ клеток костного мозга может быть причиной такого осложнения. CD117+ (c-kit) является рецептором фактора стволовых клеток (SCF) и играет важную роль в раннем гемопоэзе. Популяцию клеток CD117+ считают пригодной для регенерации органов, включая сердце и поджелудочную железу [Liu Yunying et al. Cell Regeneration 2013. Vol. 2. N.1.P. 1-12.; Marino F. et al. Frontiers in endocrinology/ 2019. N.10. P.371.]. CD117+ (c-Kit) является рецептором колониестимулирующего фактора роста (CSF).
В результате проведенного исследования показано, что rАпоА-I-3-243 оказывает явно выраженное стимулирующее влияние на количество клеток с экспрессией рецептора SCF, что в свою очередь может оказывать положительное влияние на регенераторные процессы в миокарде, а также в поджелудочной железе. При этом доcтоверное отличие в Т1 составило 1,6 раза, в Т2 - 1,3, а в Т5 - 1,36 раза в пользу rАпоА-I-3-243. Таким образом, данный эффект сохранялся на протяжении всего эксперимента.
Полученные данные относительно апоптоза CD117+ в первых двух контрольных точках показали, что количество клеток в состоянии апоптоза в группе rАпоА-I-3-243 было в 1,53 раза достоверно меньше относительно К(+). Но в Т3 этот показатель в группе rАпоА-I-3-243 в 1,23 раза был достоверно выше по отношению к К(+).
Снижения количества апоптотических клеток CD117+ можно оценивать как цитопротекторный эффект, который оказывает положительное влияние на регенераторные процессы в миокарде, а так же в поджелудочной железе у мышей с ожирением и СД2 (таблица 7.).
Таблица 7. Изменение данных общего количества клеток и клеток в апоптозе популяции CD117+, в костном мозге мышей db/db, в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m).
Примечание: Т1 - 2 недели после начала эксперимента; Т2 - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
В качестве четвертого маркера, позволяющего выявить нарушения в костном мозге при СД2, выбраны макрофаги F4/80+. Известно, что общее количество клеток и иммунная функция макрофагов F4/80+ значительно нарушены у мышей с длительным воздействием диабетической среды, что может быть механизмом, ответственным за увеличение осложнений, связанных с макрофагами, у пациентов с диабетом, таких как высокая распространенность инфекций и смертность от сердечно-сосудистых заболеваний [Ma H. J Mol Med (Berl). 2008. Vol. 86. N.4. P.391-400.].
При исследовании влияния заявленного rАпоА-I-3-243 на макрофаги F4/80+ костного мозга мышей db/db получены следующие результаты.
Количество макрофагов в опытной группе rАпоА-I-3-243 было достоверно выше относительно контрольной группы К(+) (таблица 8). Увеличение составило в Т1-308%, Т2 - 180,3% и Т5 - 164,8% (Табл. 7). При этом значения количества макрофагов в состоянии апоптоза в первых точках Т1 и Т2 в группе rАпоА-I-3-243 было в 1,53 раза достоверно меньше относительно К(+). Тогда как в Т3 значения в rАпоА-I-3-243 и в К(+) сравнялись.
Известно, что снижение количества макрофагов в костом мозге негативно влияет на систему кроветворения [Klei Th.R.L. et al. Frontiers in Immunology. 2017. N.8. P. 73.]. Полученные данные указывают на то, что rАпоА-I-3-243 может оказывать протекторное действие на систему кроветворения у мышей db/db с ожирением и СД2.
Таблица 8. Изменение данных общего количества клеток и клеток в апоптозе популяции F4/80+ в костном мозге мышей, данные представлены в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m)
Примечание: Т1 - 2 недели после начала эксперимента; Т2 - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Оценка фаз клеточного цикла общего пула клеток костного мозга с использованием пропидий йодида показала, что у мышей опытной группы rАпоА-I-3-243 фазы клеточного цикла были выше по сравнению с контрольной группой К(+). Увеличение составило в G1 на 24,6%, в S на 59,6%, в G2/Mт на 42,2% (таблица 9). Тогда как апоптоз (SubG1) в группе rАпоА-I-3-243 достоверно ниже в 1,42 раза в сравнении с К(+).
Этот факт так же объясняет более высокое количество клеток, несущих стволовые маркеры в группе rАпоА-I-3-243. Полученные данные указывают на то, что rАпоА-I-3-243 оказывает стимулирующие влияние на пролиферативные процессы в клетках костного мозга мышей db/db с ожирением и СД2, снижая таким образом функциональные нарушения костного мозга..
Таблица 9. Фазы клеточного цикла клеток костного мозга, % от общего пула исследуемых клеток на 16 неделе эксперимента (Т5), (M±m)
Примечание: К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Пример 9. Анализ функционального состояния и качественного состава селезенки
Для анализа влияния заявленного rАпоА-I-3-243 на селезенку мышей db/db с СД2 типа из эксперимента животных выводили методом краниоцервикальной дислокации и извлекали селезенку животных целиком, фотографировали и производили взвешивание. Суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку мягким раздавливанием в стеклянном гомогинезаторе в холодном буфере PBS содержащем 2% ЭТС. Эритроциты удаляли осмотическим шоком, для подготовки проб для окрашивания антителами. Суспензию клеток селезенки (2х106 клеток) анализировали методом проточной цитометрии («CYTOFLEX S100», «BeckmanCoulter», США), используя моноклональные антитела FITC anti – mouse F4/80 (123108, BioLegend, USA), PE anti – mouse CD8 (ab95772, Аbcam, United Kingdom), APC anti – mouse CD4 (ab18280, Аbcam, United Kingdom), VP450 anti active cas3(BD biosciences, США), CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent производства Мolecular Probes (США). Оценку погибших клеток, включая апоптозные клетки и дебрис, проводили аналогично анализу клеток костного мозга (Пример 7). Дополнительно в точке Т2 определяли клетки с экспрессией каспаз 3,7. В точке Т3 определяли клетки с активной каспазой 3 на всех спленоцитах, на Т лимфоцитах и макрофагах.
На фиг. 8. Представлены фотографии селезенки животных в пятой контрольной точке (16-я неделя эксперимента). При внешнем рассмотрении было отмечено, что органы в обеих группах мышей db/db были достоверно меньше по отношению к селезёнке контрольной группы интактных здоровых мышей ICR.
Сравнение между собой мышей db/db, групп rАпоА-I-3-243 и К(+) указывает на то, что в группе rАпоА-I-3-243 селезенка имеет достаточно однородную, гладкую структуру, нормального (алого) цвета, тогда как в группе К(+) селезенка более сухая, бледная с черными участками (предположительно некроз).
Сравнение по массе показало, что селезенка в группе rАпоА-I-3-243 на 35,85% была больше относительно группы К(+) (таблица 10). Эти данные указывают на то, что в группе rАпоА-I-3-243 способствует сохранению органной целостности и функции селезенки у мышей db/db с ожирением и СД2.
Таблица 10. Динамика массы селезенки опытной группы rАпоА-I-3-243 и контрольных групп мышей, (M±m)
Примечание: Т1, - 2 недели после начала эксперимента; Т2, - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента; К(-) – контрольная группа интактных здоровых мышей ICR, К(+) – контрольная группа мышей db/db (положительный контроль К(+)), опытная группа rАпоА-I-3-243 – мыши db/db, получавшие rАпоА-I-3-243 .
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+);
# - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(-).
Анализ пула макрофагов в селезенке показал, что во всех трех точках количество макрофагов в группе rАпоА-I-3-243 было достоверно выше в первых двух контрольных точках относительно группы К(+) (таблица 11). Увеличение составило в Т1 -220,3%, в Т2 – 148,6%. В точке Т5 увеличение составило 122,8%, однако из-за большого разброса значений не было достоверным. При этом значения количества макрофагов в состоянии апоптоза в точках Т1 и Т2 Т3 в группе rАпоА-I-3-243, по сравнению с контрольной группой К(+), было ниже в 2,1, 1,63 и 1,69 раза, соответственно.
Таким образом, rАпоА-I-3-243 на протяжении всего эксперимента стимулирует макрофагальную систему селезёнки, что в свою очередь может оказывать регенераторное, противовоспалительное и иммуномодулирующее действие на организм животных с ожирением и СД2.
Таблица 11. Изменение данных общего количества клеток и клеток в апоптозе популяции F4/80+ макрофагов в селезенке мышей, в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m)
Примечание: Т1, - 2 недели после начала эксперимента; Т2, - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
В таблице 12 представлены результаты определения активной каспазы 3 в лимфоцитах и макрофагах селезенки, которая играет центральную роль в клеточном апоптозе, у контрольных и опытных мышей db/db через 16 недель после начала эксперимента.
Данные отражают значительную разницу по количеству цитотоксических лимфоцитов и макрофагов с активной каспазой 3 в контрольной и опытной группах мышей db/db. Количество цитотоксических клеток положительных по каспазе 3 в группе rАпоА-I-3-243 было достоверно ниже относительно группы К(+) как для лимфоцитов, так и для макрофагов.
Таблица 12. Процентное содержание цитотоксических Т лимфоцитов CD8+, T хэлперов CD 4+ и макрофагов F4/80+, несущих активной каспазу 3 (cas3), в контрольной и опытной группах мышей db/db через 16 недель после начала эксперимента
содержание клеток, несущих активную cas3, %
содержание клеток, несущих активную cas3, %
Примечание: К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243. СD4+ - маркер Т-лимфоцитов, СD8+ - маркер Т-хэлперов (разновидность Т-лимфоцитов) ; F4/80+ - маркер макрофагов.
Введение rАпоА-I-3-243 на протяжении всего эксперимента способствует не только снижению количества цитотоксических клеток с активной каспазой 3 и апоптоза клеток селезенки, но и сохраняет некий средний уровень выраженности признака как для Т лимфоцитов, так и для макрофагов. В группе контроля на 16 неделе эксперимента появились животные с тотальной гибелью клеток, определяемой по высокому процентному содержанию цитотоксических Т лимфоцитов и макрофагов, несущих активную каспазу 3. В группе мышей с введением белка rАпоА-I-3-243 на этом сроке присутствует незначительный процент клеток с активной каспазой 3. Таким образом rАпоА-I-3-243 поддерживает жизнеспособность спленоцитов, снижая процентное содержание клеток с выраженной активной каспазой 3, и следовательно способствуя сохранению селезенки как важного иммунного и лимфодренажного органа.
Иммунорегуляторный индекс или отношение CD4/CD8 в значительной степени характеризует общую дисфункцию иммунной системы. Данный показатель может использоваться как биомаркер прогрессирования заболевания или ответа на лечение. Снижение CD4/CD8 говорит о развитии воспалительных процессов в организме. Показано, что в точке Т1 CD4/CD8 на 5% выше в группе rАпоА-I-3-243 относительно группы К(+). В точке Т2 показатели обеих групп практически сравнялись, а в точке Т5 в группе К(+) показатель был ниже единицы, что указывает на смещение иммунного ответа в сторону цитотоксических (воспалительных) процессов. Показатель CD4/CD8 в группе rАпоА-I-3-243 имел вектор в сторону воспаления, однако в Т5 был больше единицы и в 1,33 раза выше относительно группы К(+) (таблица 13).
Таблица 13. Изменение данных общего количества клеток популяции CD4/CD8 в селезенке мышей, данные представлены в % от общего пула исследуемых клеток, (M±m)
Примечание: Т1, - 2 недели после начала эксперимента; Т2, - 4 недели после начала эксперимента; Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db, rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Полученные данные свидетельствуют о том, что rАпоА-I-3-243 может оказывать иммуномодулирующее и противовоспалительное действие у мышей db/db при ожирении и СД 2 типа, снижая, таким образом, функциональные нарушения селезенки.
Пример 10. Оценка влияния rАпоА-I-3-243 на уровень тестостерона в плазме крови как показатель репродуктивной функции
В результате исследования, проведенного на мышах db/db, показано, что уровень тестостерона в плазме крови в группе rАпоА-I-3-243 был в 5 раз выше относительно группы К(+) в Т1 (Фиг. 9). Данные Т2 и Т3 не были получены в полном объёме.
Результаты по точке Т1 свидетельствуют о том, что rАпоА-I-3-243 на ранних сроках применения способствует сохранению уровня тестостерона у мышей db/db с ожирением и СД2, снижая таким образом функциональные нарушения репродуктивной системы.
Пример 11. Исследование сократительной функции миокарда как допольнительного фактора кардиопротективной функции rАпоА-I-3-243
На мышах db/db изучена сократительная функция миокарда и возможность её коррекции с помощью заявленного rАпоА-I-3-243.
Экперименты проводили на модели изолированного сердца.
Описание метода оценки резервной сократительной функции миокарда
После декапитации головы у животных удаляли кожный покров с грудной клетки и производили доступ к сердцу посредством билатеральной трансабдоминальной торакотомии. Затем сердце быстро извлекали и помещали в чашку Петри с буфером Кребса-Хензелайта, содержащим (в mM): NaCl - 118, KCl - 4,7, CaCl2 - 3, MgSO4 - 1,2, KH2PO4- 1,2, NaHCO3 - 25, ЭДТА-Na2 - 0,5, глюкозу – 5, рН (7,4), температура раствора - 25ºС. Далее производили оценку следующих параметров: время до первого удара (секунды), продолжительность сокращения (мин), ЧСС (уд/мин). Данные выражали в M±m.
В таблице 14 представлены результаты оценки сократительной функции миокарда у контрольных и опытных мышей db/db. Параметр времени первого сокращения сердца введен потому, что в контрольной групе К(+) у 30% выделенные сердца останавливались еще до помещения в буфер Кребса Хензелайта, а после помещения в буфер начиналось сокращение. Показано, что в группе rАпоА-I-3-243 время до первого сокращения в 2,8 раза короче по отношениюв группе К(+). Показатель продолжительности сокращения значительно варьировал в обеих группах. При этом разница в данном показателе была 2,2 раза в пользу животных группы rАпоА-I-3-243. Параметр ЧСС отличался незначительно.
Таблица 14. Показатели сократительной функции миокарда у мышей db/db в группах К(+) и rАпоА-I-3-243 через 16 недель после начала эксперимента
Примечание: Т5 – 16 недель после начала эксперимента. К(+) – контрольная группа мышей db/db; rАпоА-I-3-243 – опытная группа мышей db/db, которым вводили rАпоА-I-3-243.
* - р<0,05 - достоверное отличие по отношению к группе К(+).
Полученные данные указывают на то, что rАпоА-I-3-243 увеличивает сократительную функцию мышцы сердца и проявляет кардиопротекторное действие у мышей линии db/db с СД2 и ожирением.
Таким образом, заявленное средство позволяет у субъекта с гипергликемией и инсулинорезистентностю снизить не только нарушения липидного и углеводного обмена, массу тела, но функциональные нарушения печени, почек, костного мозга и селезенки, органов репродуктивной системы, улучшить сократительную функцию миокарда, локомоторную активность и когнитивную функцию и связанное с этим качество жизни субъекта.
Работы выполнены с использованием оборудования ЦКП ФИЦ ФТМ «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2021-691) и ЦКП ФИЦ ФТМ «Спектрометрические измерения».
--->
<?xml version=”1.0” encoding=“UTF-8”?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC “-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN” “ST26SequenceListing_V1_3.dtd”>
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень аминокислотной
последовательности рекомбинантного АпоА-I .xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-05-09">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode/>
<ApplicationNumberText/>
<FilingDate>2023-07-24</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2023119562</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр
фундаментальной и трансляционной медицины» (ФИЦ ФТМ) </ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Budget Scientific Institution
Federal Research Center of Fundamental and Translational Medicine
(FRC FTM)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ лечения и профилактики
гипергликемии и/или инсулинорезистентности и снижения связанных с
ними функциональных нарушений органов и систем и средство для его
осуществления</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>241</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..241</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>PPQSPWDRVKDLATVYVDAVKDSGRDYVAQFEASALGKQLNLKLLDNWDSLS
STVTKLREQIGPVTQEFWDNLEKETEVLRQEMSKDLEEVKQKVQPYLDDFQKKWQEEVELYRQKVAPLGS
ELREGARQKLQELQEKLSPLGEELRDRARTHVDALRAQLAPYSDDLRERLAARLQALKEGGGASLAEYHA
RASEQLSALGEKARPALQDLRQGLLPVLESFKVSLLAAIDEATKKLNAQ</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ лечения черепно-мозговой травмы и средство для его осуществления | 2023 |
|
RU2826364C1 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К НИМ | 2018 |
|
RU2765286C2 |
| СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ОЖИРЕНИЯ АБДОМИНАЛЬНОГО ТИПА И МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА | 2021 |
|
RU2761727C1 |
| СПОСОБ КОРРЕКЦИИ УРОВНЯ САХАРА КРОВИ И ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ВТОРОГО ТИПА С КОГНИТИВНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ | 2011 |
|
RU2467749C1 |
| Состояние воздержания от пищи в качестве диетического лечения диабета | 2014 |
|
RU2672594C2 |
| Способ создания трансляционной модели диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности | 2023 |
|
RU2817822C1 |
| Состояние воздержания от пищи в качестве диетического лечения диабета | 2014 |
|
RU2727960C2 |
| ВЕЩЕСТВО И СПОСОБ МОДУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕГУЛЯТОРНЫХ, СТВОЛОВЫХ И ДРУГИХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК | 2014 |
|
RU2620069C2 |
| ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ ДЛЯ ДИАБЕТИКОВ | 2005 |
|
RU2380983C2 |
| Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени при помощи диеты, насыщенной фруктозой | 2019 |
|
RU2728418C1 |
Группа изобретений относится к области биотехнологии и медицины. Предложены средство для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, его применение и способ лечения и профилактики с его использованием. Средство содержит рекомбинантный аполипопротеин А-I человека (rАпоА-I-3-243), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Функциональные заболевания и нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из ожирения, сахарного диабета 2 типа, нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций. Введение указанного средства нуждающемуся в этом субъекту в терапевтически эффективных дозах осуществляют местно или парентерально. Изобретения обеспечивают коррекцию функционального состояния субъекта, страдающего гипергликемией и инсулинорезистентностью, снижают функциональные нарушения печени, почек, костного мозга и селезенки, органов репродуктивной системы, улучшают сократительную функцию миокарда, улучшают локомоторную активность и когнитивную функцию у субъекта. 3 н. и 39 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл., 11 пр.
1. Средство для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, включающее в качестве активного компонента рекомбинантный аполипопротеин А-I человека, представляющий собой аминокислотную последовательность АпоА-I человека, укороченную с N-конца на 2 аминокислотных остатка (rАпоА-I-3-243), SEQ ID NO: 1.
2. Средство по п.1, где заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
3. Средство по п.1 для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
4. Средство по любому из пп.1-3, где функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
5. Средство по п.4, где нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
6. Средство по п.4, где нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
7. Средство по п.4, где нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
8. Средство по п.4, где нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
9. Средство по п.4, где нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
10. Средство по п.4, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
11. Средство по п.4, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
12. Средство по любому из пп.1-11, составленное в виде фармацевтической композиции, включающей в качестве активного компонента rАпоА-I-3-243 (SEQ ID NO: 1) и фармацевтически приемлемый носитель.
13. Средство по п.12, где фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор.
14. Применение средства по любому из пп.1-13 для лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем.
15. Применение по п.14, где заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
16. Применение по п.14 для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
17. Применение по любому из пп.14-16, где функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
18. Применение по п.17, где нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
19. Применение по п.17, где нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
20. Применение по п.17, где нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
21. Применение по п.17, где нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
22. Применение по п.17, где нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
23. Применение по п.17, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
24. Применение по п.17, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
25. Применение по любому из пп.14-24, где указанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей средство по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
26. Применение по п.25, где фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор.
27. Способ лечения и профилактики гипергликемии и инсулинорезистентности и связанных с ними заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту средства по любому из пп.1-13.
28. Способ по п.27, где заболевания, связанные с гипергликемией и инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из ожирения и сахарного диабета 2 типа.
29. Способ по п.27 для лечения и профилактики заболеваний и функциональных нарушений органов и систем, связанных с гипергликемией и инсулинорезистентностью.
30. Способ по любому из пп.27-29, где функциональные нарушения органов и систем, связанные с гипергликемией и/или инсулинорезистентностью, выбраны из группы, состоящей из нарушений функций печени и почек, костного мозга, селезенки, миокарда, репродуктивной системы, локомоторной активности и когнитивных функций.
31. Способ по п.30, где нарушения функций печени и почек выбраны из группы, состоящей из отклонений от нормы содержания в плазме крови аланинаминотрасферазы, аспартатаминотрансферазы, гамма-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, креатинина.
32. Способ по п.30, где нарушения функций костного мозга включают подавление пролиферации клеток костного мозга и апоптоз клеток костного мозга.
33. Способ по п.30, где нарушения функций селезенки выбраны из группы, состоящей из нарушения органной целостности селезенки, снижения общего количества и апоптоз макрофагов, снижения иммунорегуляторного индекса или отношения CD4/CD8 и повышения доли цитотоксических лимфоцитов и макрофагов.
34. Способ по п.30, где нарушения функций миокарда включают нарушение сократительной функции миокарда.
35. Способ по п.30, где нарушения функций репродуктивной системы включают снижение уровня тестостерона в сыворотке крови.
36. Способ по п.30, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения локомоторной активности субъекта.
37. Способ по п.30, где функциональные нарушения органов и систем включают нарушения когнитивных функций субъекта.
38. Способ по любому из пп.27-37, где указанное средство составлено в виде фармацевтической композиции, включающей средство по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
39. Способ по п.38, где фармацевтически приемлемый носитель представляет собой воду для инъекций или физиологический раствор.
40. Способ по любому из пп.27-39, где введение осуществляют местно или парентерально.
41. Способ по п.40, где парентеральное введение осуществляют внутривенно или внутримышечно.
42. Способ по п.40, где местное введение осуществляют подкожно.
| EP 2948162 A1, 02.12.2015 | |||
| EDMUNDS S.J | |||
| et al | |||
| ApoAI-derived peptide increases glucose tolerance and prevents formation of atherosclerosis in mice | |||
| Diabetologia | |||
| Станок для придания концам круглых радиаторных трубок шестигранного сечения | 1924 |
|
SU2019A1 |
| Способ крашения тканей | 1922 |
|
SU62A1 |
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| KORJIAN S | |||
| et al | |||
| Прялка для изготовления крученой нити | 1920 |
|
SU112A1 |
