Экспрессный безреагентный термодеструкционно-фотометрический способ обнаружения белка в пробах порошкообразных материалов Российский патент 2024 года по МПК G01N21/75 G01N1/44 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к экспресс-способам обнаружения белка в порошкообразных материалах.

Все способы обнаружения любых веществ основываются на присущих материалам свойствах: химических, физико-химических.

Способов обнаружения белка в материалах, которым присущи те или иные химические и физико-химические свойства, известно достаточно много: колориметрические, хемилюминесцентный, флуоресцентный, масс-спектрометрический [1].

Колориметрические способы обнаружения белка в материалах основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя. К ним относят: биуретовый способ, способ Лоури, способ Бредфорда [2].

Биуретовый способ основан на образовании биуретового комплекса (имеющего фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. К достоинствам способа относят его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность. К недостаткам относятся: необходимость использования для обнаружения белоксодержащих материалов годных расходных материалов (реактивов); обнаружение белоксодержащих материалов проводится только в растворе [2].

Способ Лоури основан на образовании в щелочной среде комплекса ионов Cu²⁺ с пептидными связями с переходом в ионы Cu⁺, которые реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь. К достоинству способа относится хорошая чувствительность к белку. К недостаткам относятся: высокая чувствительность способа к наличию в растворе посторонних восстановителей (что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах); необходимость использования для обнаружения белоксодержащих материалов годных расходных материалов (реактивов); отсутствие производства реактива Фолина в стране (должна проводиться закупка за рубежом); обнаружение белоксодержащих материалов проводится только в растворе [2].

Способ Бредфорда основан на реакции красителя кумасси бриллиантовым синим (Coomassie Brilliant Blue G-250) с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками, который в связанной форме имеет голубую окраску. К достоинствам способа относится высокая чувствительность; способ менее «капризный» по сравнению со способом Лоури. К недостаткам относятся: необходимость использования для обнаружения белоксодержащих материалов годных расходных материалов (реактивов); отсутствие производства основного реактива (красителя кумасси бриллиантовый синий) в стране (должна проводиться закупка за рубежом); обнаружение белоксодержащих материалов проводится только в растворе [2].

Хемилюминесценция - это люминесценция (свечение) тел, вызванная химическим воздействием (например, свечение фосфора при медленном окислении), или при протекании химической реакции (например, каталитические реакции некоторых эфиров щавелевой кислоты с пероксидом водорода в присутствии люминофора) [3]. В СССР (РФ) распространение получила модификация этого способа, реализованная в автоматическом сигнализаторе аэрозолей ДСП [4]. Суть реакции заключается в том, что в щелочной среде люминол в присутствии перекиси водорода и гемина дает яркую вспышку голубой хемилюминесценции с максимумом излучения в области 430 нм. К достоинству способа относится низкий предел обнаружений - 10 мкг/мл и менее, что практически важно при определении следовых количеств белка. К недостаткам относятся: необходимость использования для обнаружения белоксодержащих материалов годных расходных материалов (реактивов); отсутствие производства реактива (люминола) в стране (должна производиться его закупка за рубежом); обнаружение белоксодержащих материалов проводится только в растворе [1].

Таким образом, основными недостатками вышеперечисленных способов являются: необходимость использования годных расходных материалов (реактивов); отсутствие производства реактивов в стране; при проведении реакции белоксодержащих материалов, требуется перевод образца в раствор.

Помимо способов, использующих реагенты, для обнаружения белоксодержащих материалов известны и безреагентные способы: флуоресцентный и масс-спектрометрический [1].

Флуоресцентный способ обнаружения основан на регистрации излучения атомов (молекул), которое появляется после поглощения ими кванта света, переходе их в возбужденное состояние и возвращения в основное состояние с одновременным расходованием избытка энергии в виде излучения на другой, как правило, большей длине волны. Является разновидностью люминесценции [3].

Флуоресцентный способ обнаружения белков применяется в спектрофлуориметре ОСПП-1, который предназначен для неспецифического обнаружения белоксодержащих примесей, отобранных из объектов окружающей среды, и переведенных в жидкость [5]. Достоинство способа -не требует реагентов (реактивов). К недостаткам относятся: возможность проведения анализа только жидких проб; необходимость иметь в качестве растворителя дистиллированной воды, а, соответственно, запаса чистой посуды для реализации способа [3].

Масс-спектрометрический способ - это способ, основанный на ионизации молекул образца, с последующим разделением осколков (ионов) по их отношению массы к заряду, и измерением интенсивности ионного тока [3].

Для идентификации белков распространение получила модификация способа, названная масс-спектрометрия MALDI-TOF. Это способ с «мягкой» ионизацией образца, обусловленной воздействием импульсов лазерного излучения на матрицу с анализируемой пробой и последующего разделения осколков в ионной ловушке [6]. Достоинствами способа являются: высокая чувствительность и специфичность, не сложная пробоподготовка, возможность работать с гетерогенными образцами. К недостаткам относятся: необходимость проведения анализа в вакууме, что усложняет конструкцию приборов; высокая стоимость приборов и анализа в целом [3].

Итак, реализация большинства способов обнаружения белоксодержащих материалов требует наличия реактивов и растворителей, которые имеют определенный срок годности, который, в основном, не превышает одного года [1]. Своевременное обновление реактивов для реализации способов - обязательное условие.

Помимо перечисленных способов, учитывающих химические и физико-химические свойства белоксодержащих материалов, им присущи еще физические свойства, к которым можно отнести обугливание при повышенных температурах с образованием сажи.

Известно, что все органические вещества (в том числе и белоксодержащие) при нагревании обугливаются с образованием сажи [7]. Это свойство органических веществ используется в пиролитическом способе анализа суммарного и индивидуального содержания углеводородов в образцах нефтеносных горных пород [8].

Из уровня техники известен патент РФ №2739138 «Аналитический комплекс и способ его работы для анализа суммарного и индивидуального содержания углеводородов в образцах нефтеносных горных пород методом пиролитической хроматографии», который относится к области анализа материалов, в частности, к способу и комплексу анализа суммарного и индивидуального содержания углеводородов в образцах нефтеносных горных пород. Одним из этапов способа анализа углеводородов является пиролиз (термодеструкция в вакууме) образца нефтеносной породы в пиролитической ячейке [8]. К достоинству способа относится высокая чувствительность и специфичность. К недостаткам относятся: необходимость проведения термодеструкции в вакууме, что усложняет конструкцию приборов; высокая стоимость приборов и анализа в целом. Данный пиролитический способ для обнаружения органических соединений, в том числе белков, не используется [1].

Разновидность пиролиза при атмосферном давлении называется термодеструкцией. Термодеструкция - реакция разрыва химических связей в молекуле под влиянием тепловой энергии [9].

Для обнаружения белков в порошкообразных пробах предлагается фотометрия отражения после стандартной процедуры термодеструкции. В основу термодеструкционно-фотометрического способа предложено заложить присущие органическим материалам различия в содержании атомов углерода. Так, в белках атомов углерода содержится 50-55%, в углеводородах - до 45%, в песчаных почвах - 0,1-3%, в глинистых - 3-5%, в черноземах - до 10%, в торфянистых - до 20%, в крахмале - до 90%, в ржаной муке - до 11%, в пшеничной - до 12%, в яичном порошке - до 90% [10]. Данные отличия вполне могут быть зарегистрированы путем измерения коэффициента отражения от обугленной пробы: чем больше атомов углерода в пробе, тем коэффициент меньше. В случае примерного равенства атомов углерода в пробе, коэффициент отражения должен быть одинаковым.

Суть предлагаемого термодеструкционно-фотометрического способа распознавания белоксодержащих материалов заключается:

в последовательной регистрации с помощью фотометра отражения потока света в видимой области спектра от поверхности металлической пластины с пробой вещества разной массы, подвергнувшейся термической деструкции в одинаковых условиях;

в расчете критерия распознавания белок содержащих материалов, в основу которого заложены зависимости коэффициентов отражения от пластин с обугленными в стандартных условиях пробами от их массы;

в сравнении рассчитанного критерия с ранее полученным в таких же условиях для принятого за стандарт (эталон) порошкообразного материала.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ определения способности пшеничной муки к потемнению (патент РФ №2296324), основанный на измерении коэффициента отражения пробы готовящегося из данной муки теста в течение времени протекания интенсивной ферментативной реакции, равного 30-35 минут, и расчете коэффициента отражения пробы теста после 6,0-6,5 часов отлежки по экспоненциальному закону с последующим определением способности пшеничной муки к потемнению по изменению коэффициента отражения теста до и после отлежки [11].

Предлагаемый термодеструкционно-фотометрический способ отличается от прототипа. Отличие заключается в том, что предварительно проводится термодеструкция белоксодержащего порошкообразного материала. Общим является использование фотометра отражения для определения коэффициента отражения исследуемой пробы после подготовительной стадии. Под подготовительной стадией в первом случае понимается процесс созревания теста, во втором - термодеструкция порошкообразного материала.

Сравнительный анализ полученных в эксперименте результатов распознавания порошкообразных белоксодержащих и белок не содержащих материалов, подвергшихся термической деструкции на металлической пластине показал, что имеется закономерность в коэффициенте отражения, регистрируемого фотометром. Наличие белка в пробе порошкообразного материала, в отличие от проб белок не содержащих, вызывает характеристическое снижение коэффициента отражения от дюралюминиевой пластины с подвергшейся на ней пробой порошка различной массы. Это обусловлено оптическими свойствами образующейся сажи при сгорании органических веществ, содержащих углерод.

Для изучения зависимости коэффициента отражения от массы материала проведены эксперименты. Для этого пробы порошкообразных материалов без учета влажности массой от 0,005 до 0,030 г перед термодеструкцией равномерно распределяли при помощи скальпеля на поверхности дюралюминиевой пластины в отмеченном круге диаметром 30 мм (размер освещаемой области). Термодеструкцию проводили путем нагревания проб на дюралюминиевой пластине размером 30×50×1 мм, при помощи спиртовки до прекращения изменения коэффициента отражения, регистрируемого фотометром отражения. Дюралюминиевую пластину удерживали над пламенем спиртовки при помощи держателя (зажима Кохера). Пламя спиртовки, нагревая пластину, обеспечивало полную деструкцию указанных масс органических материалов (содержащих и не содержащих углерод), с образованием сажи. После нагревания дюралюминиевой пластины производили измерение коэффициента отражения при помощи фотометра отражения ФО-1 [12]. При этом пластине после нагрева давали остыть до комнатной температуры.

Для определения продолжительности нагрева пластины был проведен эксперимент с холинэстеразой. В качестве примера на фиг. 1 приведена зависимость коэффициента отражения, регистрируемого от металлической пластины с размещенной на ней пробой холинэстеразы массой 0,005; 0,010; 0,020; 0,030 г от времени деструкции. Из фиг. 1 видно, что процесс термической деструкции пробы холинэстеразы с максимальной массой (0,030 г) можно ограничить 110-120 с. Во всех последующих экспериментах продолжительность нагрева ограничивали 120 с.

Зависимости коэффициентов отражения термодеструктированных белок содержащих и белок не содержащей проб разной массы, равномерно размещенных на поверхности дюралюминиевой пластины в круге диаметром 30 мм представлены на фиг. 2. Из фиг. 2 видно, что коэффициенты отражения термодеструктированных белоксодержащих проб примерно равны и значительно отличаются от термодеструктированной белок не содержащей, причем коэффициент отражения уменьшается при увеличении массы вещества от 0,005 до 0,030 г.

Результаты измерений коэффициента отражения в зависимости от массы белоксодержащих и белок не содержащей проб, подвергшихся термодеструкции, представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что у белок содержащих порошкообразных материалов коэффициент отражения, в зависимости от массы пробы, снижается в несколько раз больше, чем у белок не содержащей, что является подтверждением выдвинутой ранее гипотезы.

Затем проводили сравнительный анализ полученных результатов и делали выводы относительно влияния содержания сажи в различных материалах на коэффициент отражения с возможностью определения наличия белка в пробе.

Для того чтобы отличить белоксодержащий материал от белок не содержащего, необходим критерий надежного распознавания. В качестве такового предложено использовать отношение площади криволинейной трапеции, построенной на графике зависимости коэффициента отражения металлической поверхности от массы исследуемого порошкообразного материала, подвергавшегося термодеструкции на пластине, от таковой, рассчитанной для холинэстеразы.

Последовательность определения критерия распознавания следующая:

1. Строили график (точечную диаграмму) зависимости коэффициента отражения металлической поверхности с исследуемым термодеструктированным материалом от массы (0,005; 0,010; 0,020; 0,030 г) исследуемой пробы в редакторе Excel;

2. Добавляли в точечную диаграмму линию тренда (опция программы Excel) и подбирали уравнение аппроксимирующей кривой таким образом, чтобы величина достоверности аппроксимации (R²) равнялась единице. В большинстве случаев уравнение аппроксимирующей кривой являлось полиномиальным уравнением третьей степени;

3. Интегрировали полученное полиномиальное уравнение третьей степени по максимальному и минимальному значению массы исследуемой пробы для определения площади криволинейной трапеции (опция программы Excel); Результаты расчетов площадей криволинейных трапеций, ограниченных аппроксимирующей кривой, построенной в координатах коэффициент отражения - масса материала представлены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что у белоксодержащих материалов уравнение аппроксимирующей кривой является полиномиальным уравнением третьей степени, а у белок не содержащих материалов - линейным уравнением. Также видно, что площади криволинейных трапеций у белоксодержащих материалов меньше площади трапеций белок не содержащих.

4. Рассчитывали критерий распознавания белоксодержащих и белок не содержащих материалов: как отношение площади криволинейной трапеции исследуемого материала к площади криволинейной трапеции, рассчитанной для холинэстеразы (см. таблицу 3).

Из данных таблицы 3 видно, что в случае, если критерий распознавания превышает значение 0,95, то в пробе есть белок.

В ходе проведенных в дальнейшем экспериментах с кодированными «слепыми» пробами с помощью данного критерия были распознаны белоксодержащие и белок не содержащие материалы.

Изобретение может найти применение на предприятиях биохимической, микробиологической, фармацевтической, пищевой промышленности. Причем в качестве эталона сравнения в конкретной области промышленности может быть выбрана площадь, рассчитанная для приемлемого в данном случае материала. При распознавании исследуемого порошкообразного материала значение рассчитанного критерия, в образце должно быть равно 1.

ЛИТЕРАТУРА

1. Технические средства радиационной, химической, биологической разведки и засечки ядерных взрывов. Часть IV. Технические средства химической и неспецифической биологической разведки: учебное пособие / С.В. Сабанов, С.Н. Сизиков [и др.]; под ред. И.Г. Васюкевича. - Кострома: Издательство «Военная академия РХБ защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко», 2020. - 432 с. - Текст: непосредственный.

2. Петров К.П. Методы биохимии растительных продуктов: / К.П. Петров. - Киев, 1978. - 224 с. - Текст: непосредственный.

3. Индикация, средства аналитического мониторинга окружающей среды. Часть I: учебник / Ю.И. Морозик, Г.В. Мацюк [и др.]; под ред. С.Н. Сизикова. - Кострома: Издательство «Военная академия РХБ защиты имени Маршала Советского Союза С.К. Тимошенко», 2020. - 261 с. - Текст: непосредственный.

4. Техническое описание и инструкция по эксплуатации автоматического сигнализатора для обнаружения аэрозолей специальных примесей АСП. 5И2.845.014 ТО. – М., 1976. - 96 с. - Текст: непосредственный.

5. Техническое описание и инструкция по эксплуатации спектрофлуориметра ОСПП-1. - М, 1999 г. - Текст: непосредственный.

6. Лебедев А.Т. Основы масс-спектрометрии белков и пептидов: / А.Т. Лебедев, К.А. Артеменко, Т.Ю. Самгина. - М.: Техносфера, 2012. -176 с. - Текст: непосредственный.

7. Хитрин Л.Н. Физика горения и взрыва: учебник / Л.Н. Хитрин. - М.: Издательство Московского университета, 1957. - 452 с. - Текст: непосредственный.

8. Патент №2739138 Российская Федерация, МПК G01N 33/24 (2006.01). Аналитический комплекс и способ его работы для анализа суммарного и индивидуального содержания углеводородов в образцах нефтеносных горных пород методом пиролитической хроматографии: №2020115480: заявл. 07.05.2020: опубл. 21.12.2020 / Герасимов Р.С.- 16 с: ил. - Текст: непосредственный.

9. Кузнецов С.А. Большой толковый словарь русского языка: / С.А. Кузнецов. - СПб.: Норинт., 1998. - 1534 с. - Текст: непосредственный.

10. Цитович И.К. Химия с сельскохозяйственным анализом: / И.К. Цитович. - М.: «Колос», 1974. - 527 с. - Текст: непосредственный.

11. Патент №2296324 Российская Федерация, МПК G01N 33/10 (2006.01), G01N 33/02 (2006.01). Способ определения способности пшеничной муки к потемнению: №2006102421/13: заявл. 27.01.2006: опубл. 27.03.2007 / Черных В.Я., Артемьева Е.В., Шуленин А.В. - 7 с: ил. - Текст: непосредственный.

12. Техническое описание и инструкция по эксплуатации фотометра отражения ФО-1. – М., 2009. - 32 с. - Текст: непосредственный.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к экспресс-способам обнаружения белка в порошкообразных материалах и может найти применение на предприятиях биохимической, микробиологической, фармацевтической, пищевой промышленности. Способ заключается в последовательной регистрации с помощью фотометра ФО-1 отражения потока света в видимой области спектра от поверхности металлической пластины с пробой порошкообразного вещества разной массы, подвергнувшейся термодеструкции в одинаковых условиях. Затем осуществляют построение графиков зависимости коэффициента отражения металлической поверхности с исследуемым термодеструктированным порошкообразным веществом от массы исследуемой пробы в редакторе Excel. Проводят подбор уравнения аппроксимирующей кривой, чтобы величина достоверности аппроксимации R2 равнялась единице. Осуществляют интегрирование уравнения аппроксимирующей кривой по максимальному и минимальному значению массы исследуемой пробы для определения площади криволинейной трапеции и рассчитывают критерий распознавания белоксодержащих и белок не содержащих материалов как отношение площади криволинейной трапеции исследуемого вещества к площади криволинейной трапеции, рассчитанной для выбранного эталона сравнения. Способ обеспечивает обнаружение белка в пробах порошкообразных веществ. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Экспрессный безреагентный термодеструкционно-фотометрический способ обнаружения белка в пробах порошкообразных веществ, заключающийся в последовательной регистрации с помощью фотометра ФО-1 отражения потока света в видимой области спектра от поверхности металлической пластины с пробой порошкообразного вещества разной массы, подвергнувшейся термодеструкции в одинаковых условиях; с построением графиков зависимости коэффициента отражения металлической поверхности с исследуемым термодеструктированным порошкообразным веществом от массы исследуемой пробы в редакторе Excel; подбором уравнения аппроксимирующей кривой таким образом, чтобы величина достоверности аппроксимации R2 равнялась единице; интегрированием уравнения аппроксимирующей кривой по максимальному и минимальному значению массы исследуемой пробы для определения площади криволинейной трапеции; рассчитывают критерий распознавания белоксодержащих и белок не содержащих материалов как отношение площади криволинейной трапеции исследуемого порошкообразного вещества к площади криволинейной трапеции, рассчитанной для выбранного эталона сравнения, причем если критерий распознавания превышает значение 0,95, то в пробе есть белок.

2. Способ по п. 1, где из образца порошкообразного вещества отбирают пробы массой 0,005; 0,010; 0,020; 0,030 г, помещают и равномерно их распределяют на поверхности дюралюминиевой пластины в отмеченном круге диаметром 30 мм; после чего последовательно проводят термодеструкцию путем нагревания пластины с каждой пробой на пламени спиртовки в течение 120 с и измеряют коэффициент отражения деструктированного исследуемого материала при помощи фотометра отражения ФО-1.

3. Способ по п. 1, где в качестве эталона сравнения выбирают холинэстеразу.