Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной лабораторной практике, а именно к химико- токсикологическим и госконтрольным ветеринарным исследованиям, и может быть использовано также в микробиологической промышленности при производстве кормовых дрожжей.

Кормовой микробный белок производится на основе комплексной химической и микробиологической переработки цел- люлозосодержащего растительного сырья. В соответствии с действующей нормативно-технической документацией содержание белка (протеина) определяется по рбщему азоту, что создает возможность фальсификации по протеину выпускаемой продукции путем введения мочевины на заключительной стадии производства.

Кормовые дрожжи содержат много трудноустранимых пигментов, липидов, белков и других мешающих определению веществ, а используемые при определении мочевины способы депротеинизации биологических жидкостей для исследования дрожжей не пригодны.

Для определения содержания мочевины в биологических жидкостях (кровь, плазма и сыворотка крови, моча) применяют уреазный и диацетилионооксимовый (ДА- МО) несложные и быстрые методы . Особенно широко используют унифицированный метод определения мочевины по цветной реакции с ДАМО.

Однако для надлежащей очистки экстрактов из кормовых дрожжей и получения высокоочищенных фильтратов не пригодны условия и реагенты (трихлоруксусная или

VI

ся

о VJ

СП

сульфаниловая кислота), широко применяемые для очистки (депротеинизации) биологических жидкостей Экстракты из кормовых дрожжей подлежат не только депротеинизации, но и депигментации, что требует при- менения более жестких условий их осуществТпенЦ использованием других реагентов, которые, в свою очередь, делают невозможной постановку ДАМО реакции из-за высокой интерференции и низкой чувствительности.

Известен также способ определения мочевины в биологических объектах с использованием диметилглиоксима (ДМГ), в котором, используя малоизвестную тиосе- микарбазидную (ТСК) модификацию реакции Фирона, В.А.Храмов и др. вместо ДАМО (2,3-бутандионмонооксим), в качестве реактива на никель применяют ДМГ (2,3-бутан- метилглиоксим, диацетилдиоксим), а в качестве реактивной смеси - 25%-ный раствор серной кислоты,

Однако указанный способ имеет малый диапазон линейной зависимости между оптической плотностью цветной реакции и концентрацией мочевины в реакции, большую лабильность реакции от условий ее выполнения, высокую интерференцию и низкую чувствительность, а условия фотометрии не оптимальны.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является диметилглиоксимовый метод определения содержания мочевины в биологических жидкостях, включающий де- протеинизацию, центрифугирование (фильтрование), прибавление к центрифугату катализатор-кислотной смеси и раствор ДМГ, перемешивание, нагревание в кипящей водяной бане, охлаждение, постановку эталонной пробы со стандартным раствором мочевины, измерения оптических плотностей при 510-550 нм в 10 мм кювете против контроля на реактивы и вычисление результатов по порции.

Недостатком известного способа является то, что мягкие условия депротеинизации, а тем более с использованием 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), не обеспечивает необходимой степени депигментации и депротеинизации экстракта из навески кормовых дрожжей с получение высокоочищенных от мешающих определению веществ фильтратов (центрифугатов). Диапазон линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины ограничен. Способу присущи высокая интерференция, низкая специфичность и, особенно, чувствительность реакции. Также отсутствуют методы обнаружения и

полуколи1 pjCTBCHHoro определения мочеви ны, которые исключали бы необходимость определения в случае ее отсутствия, а при наличии ее давали бы возможность правильно выбрать концентрацию стандартного (рабочего) раствора мочевины для подстановки эталонной пробы (реакции).

Целью изобретения является увеличение чувствительности способа определения

0 мочевины,

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу проводят очистку (депигментацию и депротеинизацию) экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, поста5 новку реакции в смеси серной и орто-фос- форной кислот по объему 25 и 10% соответственно, содержащей 100 мг % диметилглиоксима, а фотометрию - при 490 нм (при обнаружении). Для расширения преде0 ла прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в смеси указанных кислот с диметилглиоксимом

5 дополнительно содержащей 8-10 мг% тиосемикарбазида, а фотометрию - при 540 нм

Сущность способа состоит в том что

мочевина в сильнокислой среде с диметилглиоксимом образует желтый комплекс, а

0 при дополнительном присутствии тиосе- микарбазида - красный комплекс, которые фотометрируют при 490 и 540 нм соответственно.

Для полуколичественного определения

5 и повышения достоверности результатов обнаружения за счет исключения влияния на результаты измерения возможной остаточной интерференции на нижней границе чувствительности, наряду с полноценной

0 ставят неполноценную реакцию (без ДМГ), с последующей фотометрией при 490 нм (Д2490). В положительных случаях вычисляют полуколичественное содержание мочевины в дрожжах по полученным значениям

5 оптических плотностей, используя выведенные экспериментальным путем коэффициенты (например, 2,9 для навески пробы 0,5 г и 3,6 для навески 1 г). В сомнительных случаях обнаружения вычисляют соотно0 шение значений полученных величин оптических плотностей полноценной и неполноценной реакций (Д14ОД Да490), которые при отсутствии мочевины в пробе менее 3,7 для навески 0,5 г и менее 4,1 для навески

5 дрожжей 1,0 г.

При определении массовой доли ставят эталонную пробу с концентрацией мочевины в стандартном растворе, близкой к массовой доле исследуемого вещества в исследуемой пробе (по результатам полуколичественного вычисления), а вычисление проводят по принципу пропорций.

Предлагаемый способ отличается от известного методом депротеинизации с одновременной депигментацией с использованием гидрата окиси меди, составом реакционной смеси как по концентрациям кислот, ТСК и ДМГ, так и по составу (отсутствие железа хлорного), увеличением предела линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины, уменьшением времени экспозиции в кипящей водяной бане, максимальной приближенностью концентрации эталонного раствора к исследуемой пробе. Кроме того, предлагаемому способу присущи качественное определение (обнаружение) мочевины, в котором возможное влияние интерференции на результаты исследования учитывается путем постановки реакции на пробу.без ДМГ, измерения оптической плотности и вычисления соотношения оптических плотностей полноценной и неполноценно реакцией, а также полуколичественное вычисление мочевины по измеренной оптической плотности и выводимым экспериментальным путем коэффициентам.

Пример Получение экстракта (вытяжки), Навеску пробы массой 0,5 или 1,0 г взвешивают с погрешностью не более 0,002 г, помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают пестиком в течение 2-3-х мин. Приливают 1-2 см воды и продолжают растирать 2-3 мин. Затем приливают 8-10 см дистиллированной воды и с помощью пестика смывают растертую массу с поверхности ступки и пестика. Без потерь суспензию переносят в химический стакан вместимостью 150-200 см Остатки суспензии из ступки трижды смывают по 10 см3 воды в стакан. Суспензию в стакане оставляют стоять при периодическом перемешивании и комнатной температуры в течении 5-10 ч или в холодильнике до следующего дня

Депротеинизация, депигментации экстракта и получение фильтрата.

Суспензию (экстракт) пробы хорошо перемешивают, приливают 25 см3 6%-ного раствора меди сульфата, перемешивают, оставляют стоять 5-10 мин Затем приливают 25 см 1,25%-ного раствора гидроокиси натрия, перемешивают, оставляют стоять 2-3 мин, повторно перемешивают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят содержимое колбы водой до метки, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Затем проводят доочистку полученного фильтрата. Для этого к фильтрату при постоянном перемешивании стеклянной палочкой приливают по каплям 33-40%-ный раствор гидроокиси натрия до рН 9,0-10,0 Выпавший осадок меди гидроокиси отфильтровывают через плотный бумажный фильтр, а доочищенный фильтрат подкисляют серной или смесью серной и орто-фос форной кислот до исчезновения голубого оттенка.

Обнаружение и полуколичественное оп0 ределение мочевины.

Для проведения испытания применяют колориметр фотоэлектрический КФК-2, ФЭК-56 или другого типа с наличием светофильтров с максимумом пропускания 490 и

5 540 нм; смесь кислот (серной концентрированной - 25 см3, орто-фосфорной - 10 см3, воды дистиллированной - 53 см3, смесь реактивов: к 88 см смеси кислот приливают 10 см 1%-ного раствора диметилглиоксима

0 (ДМГ) на 96°-ном этаноле, перемешивают и при необходимости, спустя 5-10 мин фильтруют через стеклянный пористый фильтр (используют в день приготовления) Проведение обнаружения.

5В четыре пенициллиновых флакона вносят по 1 см3 доочищенного фильтрата пробы, в два из которых приливают по 4,5 см3 смеси реактивов с ДМГ, а в два других - по 4,5 см смеси кислот (без ДМГ). Флаконы

0 закрывают резиновыми пенициллиновыми пробками, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят в кипящую водяную баню (стерилизатор электрический) на 40 мин. Для уменьшения испарения

5 содержимого флаконов пробка сверху покрывают слоем полиэтиленовой пленки, затем поролоном (1,0-1,5 см толщиной) и металлической пластинкой (крышкой стерилизатора) с грузом.

0 После нагревания пробы немедленно охлаждают в холодной воде, содержимое флаконов повторно хорошо перемешивают Измерение оптических плотностей каждой реакции проводят при 490 нм в 10 мм

5 кювете против воды. Получают Di490 - оптическую плотность исследуемой (п0А- ноценной) реакции и Da - оптическую плотность неполноценной (без ДМГ) реакции.

0

«Учет качественной реакции. За положительную реакцию на мочевину принимают наличие желтой окраски, интенсивность которой четко превышает

5 интенсивность окраски неполноценной

В сомнительных случаях вычисляют соотношение значений измеренных величин оптических плотностей. При отсутствии мочевины, когда Д1490 Д249° составляет менее 3,7 для навески 0,5 г и 4,1 для навески 1,0,

дальнейшая количественная оценка и определение мочевины не требуются.

Вычисление полуколичественное.

По величинам значения оптических плотностей (Д/90 и Д2490), используя пред- лагаемые соответствующие коэффициенты (2,9 для навески около 0,5 г и 3,6 для навески около 1 г), вычисляют значение величины предполагаемой (возможной) оптической плотности, которая характеризует интерфе- ренцию при 490 нм. Затем вычисляют разницу между фактически полученной Дг90 и установленной путем вычисления величиной возможной (предполагаемой) оптической плотности. Полученный результат указывает на полуколичественное содержание (X, %) мочевины в пробе.

Например, при массе навески пробы дрожжей кормовых 0,5 г, общем объеме доочищенно- го фильтрата 100 см°, fli4W 0,110, Д2490 0,024. Тогда 0,024 2,,0692 - предполагаемая оптическая плотность за счет интерференции; 0,110-0,,04 г - содержание мочевины в 100 г дрожжей, т.е. 0,04% мочевины в кормовых дрожжах(фак- тическое содержание 0,05%).

Определение массовой доли мочевины.

Для проведения испытания применяют смесь реактивов: к 88 см смеси кислот приливают 2 см3 0,4%-ного раствора тиосеми- карбазидной (ТСК) и 10 см3 1%-ного раствора Д МГ на 96°-ном этаноле; основной стандартный раствор мочевины с содержанием 100 мг/100 см3. Рабочий исходный стандартный раствор мочевины готовят пу- тем разведения основного в 20 раз (5 см3 основного и 95 см3 воды), в 1 см которого содержится 50 мкг мочевины. Другие рабочие стандартные растворы мочевины готовят путем разведения исходного.-

В табл. 1 приведены стандартные растворы.

При необходимости доочищенный фильтрат дополнительно разбавляют водой в 2 раза (при навеске 0,5 г будет соответст- вовать общему объему 200 см или соотношению 1:400).

Проведение испытания.

В два пенициллиновых флакона вносят по 1 см дистиллированной воды, в два фла- кона - по 1 см3 фильтрата пробы и в два флакона - по 1 см3 рабочего стандартного раствора. Содержание мочевины в рабочем растворе должно быть близким к определяемой в пробе массовой долей мочевины, предварительно обнаруженной полуколичественным способом (например, 0,04%).

Во все флаконы приливают по 4,5 см3 смеси реактивов (смесь кислот, ТСК и ДМ Г), флаконы закрывают резиновыми пробками

с отверстиями для выравнивания давления, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят в кипящую водяную баню (стерилизатор электрический) на 20 мин (точно). В водяной бане пробки сверху покрывают полиэтиленовой пленкой, затем поролоном (1-1,5 см толщиной) и металлической пластинкой (крышкой) с грузом. После нагревания пробы сразу же охлаждают в холодной воде, содержимое флаконов перемешивают. Измерения оптических плот- ностей каждой реакции проводят при 540 нм в 10 мм кювете против воды.

Обработка результатов.

Массовую долю мочевины (X, %) вычисляют по формуле

X, %

(Д1 -До)-С . Д2-До

где Д1 - оптическая плотность искомой массовой доли мочевины;.

Д2 оптическая плотность известной массовой доли мочевины;

С - массовая доля мочевины в пробе, соответствующая известной оптической плотности (Да), %;

До - оптическая плотность реакции на реактивы (реакции с водой).

Пример вычисления:

Оптическая плотность реакции на реактивы (реакции с 1 см3 воды); ,129; ,131,

Оптическая плотность реакции на пробу (реакции с 1 см3 фильтрата пробы): Д ,203 и ,207.

Оптическая плотность реакции с рабочим стандартным раствором (реакции с 1 см3 рабочего стандартного раствора, соответствующего 0,04% мочевины): ,214 и ,216.

Тогда

v « - (0,203-0,129) 0.04 0.074 0.04

k0,214 0.129 0085° 035

v у - (0.207-0.131) -0.04 ,04

7°0.216 -0 1310.085°°3fi

Среднеарифметическое - 0,0353%.

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений.

Результаты исследования во времени (6 дней) проб кормовых дрожжей без и с точными добавками мочевины на пределе чувствительности (0,01 и 0,02%) способа приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что способу-прототипу присущи высокая интерференция и низкая

чувствительность. Предлагаемый способ характеризуется малой степенью разброса (S), высокой сходимостью (Sx), существенностью разницы (t) и достоверностью (р 0,0001). Коэффициент вариации (V, %) ха- рактеризует высокую воспроизводимость предлагаемого способа по сразнению с прототипом, что указывает на относительно низкий разброс результатов (чем меньше, V %, тем выше воспроизводимость и сходи- мость результатов исследования).

Чувствительность способа, характеризующая способностью выявлять наименьшее различие между двумя концентрациями (массовыми долями) исследуемого вещест- ва, согласно данным табл. 2, характеризуется высокой величиной отношения разности между результатами определения к разности измеряемых концентраций (ЛД : ДС), где АД - показатель прибора (оптическая плотность); А С - массовая доля (концентрация) определяемого вещества. На высокую чувствительность также указывает показатель минимальной концентрации (Смин, определяемой по Браунсберг-Джамесу.

В высокобелковых и интенсивно окрашенных кормовых дрожжах чувствительность предлагаемого способа определения мочевины высокая (нижняя граница чувствительности 0,01 г/100 г, минимальная чув- ствительность по Браунсберг-Джамесу t S; ,0065-0,0085, по АД: ,87) при навеске дрожжей 1 г, общем обьеме экстракта 100 см3, депротеинизации и депигментации гидроокисью меди, доочистке фильтрата, 0,5-1 см3 фильтрата в §„5 см3 реакционной смеси, типе аппарата ФЭК- 56М или КФК-2 (светофильтр 540 нм), толщине рабочего слоя кюветы 1 см, диапазоне линейной зависимости 0,5-50 мкг.

Преимущества предлагаемого способа состоят также в том, что использован доступный дешевый реактив (ДМГ) отечественного производства. Стабильность развившейся цветной реакции позволяет выполнять анализы большими сериями, а простота постановки реакции дает возможность использовать ее в автоматических анализаторах.

Предлагаемый способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах может быть использован в ветеринарной лабораторной практике при химико-тоКСикологическйх и госконтроль- ных исследованиях, а также в микробиологической промышленности для интенсификации производства кормовых дрожжей.

Формула изобретения

1.Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах путем получения экстракта, его очистки, постановки реакции при нагревании в смеси серной и орто-фосфорной кислот, содержащем диме- тилглиоксим, и фотометрии, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что, с целью увеличения чувствительности, очистку экстракта проводят гидроокисью меди, а содержание серной и орто-фосфорной кислот по объему составляет 25 и 10% соответственно при содержании 100 мг % диметилглиоксима, а фотометрию проводят при 490 и 540 нм.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что, с целью определения массовой доли и расширения предела прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины, смесь дополнительно содержит 8-10 мг % тиосе- микарбазида.

Использование; ветеринария, химико- токсикологические и госконтрольные ветеринарные исследования. Сущность изобретения: проводят очистку экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и орто-фос- форной кислот по объему 25 и 10% соответственно, содержащей 100 мг% ди- метилглиоксима. Для расширения предела прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в указанной смеси, дополнительно содержащей 8-10 мг% тиосемикарбазида. 1 з.п.ф- лы, 2 табл. ч-Ё

Таблица 1

Статистические данные по оптической плотности (ДО и массовой доле мочевины, г/100 г (5,5 см реакционной смеси 1 см

вытяжки 1 100 фотометрия в 1 см кювете при 540 им)

Таблица 2