УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКИ КОЛИЧЕСТВА ЛЕГКООКИСЛЯЕМЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПО ИНДЕКСУ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/02 C12M1/34 

Устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода относится к области экологического мониторинга окружающей среды и может быть использовано для оценки состояния поверхностных вод и контроля процессов очистки сточной воды. Для выявления загрязнения водных сред органическими веществами используют параметр БПК (биохимическое потребление кислорода) - количество кислорода (в мг), требуемое для окисления находящихся в 1 дм³ воды органических веществ в аэробных условиях. Продолжительность стандартного метода определения БПК₅ составляет 5 суток [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.], поэтому растет потребность в разработке экспресс-анализаторов.

Известно устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода, которое представляет собой биосенсорную систему с иммобилизованными микроорганизмами. [Zhao С. et al. Bacterial Cellulose Immobilized S. cerevisiae as Microbial Sensor for Rapid BOD Detection // Fibers and Polymers. - 2021. - T. 22. - №. 5. - C. 1208-1217]. Устройство состоит из магнитной мешалки, измерительной кюветы с тремя электродами: каломельного электрода сравнения, платинового вспомогательного электрода и рабочего стеклоуглеродного электрода, модифицированного электропроводящей углеродной сажей с иммобилизованными в бактериальную целлюлозу дрожжевыми клетками Saccharomyces cerevisiae, на поверхности которых адсорбирован медиатор менадион; дополнительно в измерительную кювету вводят раствор второго медиатора гексацианоферрата (III) калия. Существенными недостатками данной модели является использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae, что приводит к искажению результатов анализа в виду того, что биоматериал обладает низкой стабильностью при воздействии негативных факторов окружающей среды (присутствию различных токсикантов в анализируемых пробах) [Gao G., Fang D., Yu Y, Wu L., Wang Y, Zhi J. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute bioloxicity assessment of wastewater // Talanta. - 2017. - V. 167. - P. 208-216]. К другим недостаткам следует отнести необходимость дополнительного введения в измерительную ячейку раствора медиатора гексацианоферрата (III) калия для обеспечения приемлемого для определения БПК₅ спектра окисляемых веществ.

Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-мониторинга индекса биохимического потребления кислорода [Зайцева А.С. и др. Медиаторный БПК-биосенсор па основе ферроцена и дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii // Прикладная биохимия и микробиология. - 2017. - Т. 53. - №. 3. - С. 341-348]. Устройство содержит магнитную мешалку, измерительную кювету, хлорсеребряный электрод сравнения и рабочий угольно-пастовый электрод, модифицированный медиатором ферроценом и иммобилизованными на поверхности электрода клетками штамма Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482. Устройство позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода БПК₅ пробах, значение БПК₅ которых не менее 25,2 мг О₂/дм³, время анализа одной пробы составляет 10 минут. Существенным недостатком прототипа является высокая нижняя граница определяемых значений биохимического потребления кислорода более 25 мг/дм³, не позволяющая проводить анализ проб, значения БПК₅ которых ниже предельно-допустимых значений [СанПиН 2.1.5.980-00. Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 22 июня 2000 г. - М., 2000].

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является улучшение технических характеристик устройства для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода, в частности снижение нижней границы определяемых значений биохимического потребления кислорода.

Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода содержит магнитную мешалку, измерительную кювету, хлорсеребряный электрод сравнения, рабочий угольно-пастовый электрод, модифицированный медиатором ферроценом и иммобилизованными на поверхности электрода клетками, причем в качестве иммобилизованных клеток взята ассоциация дрожжей Blastobotrys adeninivorans ВКМ Y-2677 (В. adeninivorans) и Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (О. polymorpha) в соотношении 1:1.

На фиг. показано устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода. В табл. представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода.

Технический результат заявляемого устройства заключается в улучшении технических характеристик, за счет снижения нижней границы 25,2 мг/дм³ (прототип) до 2 мг/дм³ (заявляемое техническое решение), уменьшения длительности единичного измерения с 10 минут (прототип) до 6 минут (заявляемое техническое решение), увеличении спектра окисляемых субстратов с 15 веществ (прототип) до 20 (заявляемое техническое решение).

Снижение нижней границы и увеличение числа окисляемых субстратов заявляемым техническим решением связано с заменой дрожжей D. hansenii на ассоциацию, составленную из дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha. Каждый индивидуальный микроорганизм, взятый для формирования ассоциации, обладает высокой окислительной активностью по отношению к широкому спектру субстратов в условиях медиаторного биоэлектрокатализа [Kharkova A.S. et al. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay // 3 Biotech. - 2021. -T. 11. - №. 5. - C. 1-13], использование дрожжевых клеток совместно в составе ассоциации увеличивает окислительную активность рецеиторной системы и повышает чувствительность при оценке количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода.

Незначительное уменьшение длительности единичного измерения обусловлено тем, что ферроцен обладает более высокой константой скорости взаимодействия с индивидуальными микроорганизмами ассоциации, чем с клетками дрожжей D. hansenii, взятых в прототипе [Kharkova A. S. et al. A kinetic approach to the formation of two-mediator systems for developing microbial biosensors as exemplified by a rapid biochemical oxygen demand assay //3 Biotech. - 2021. - T. 11. - №. 5. - С.1-13].

Заявляемое устройство состоит из следующих элементов: рабочий угольно-пастовый электрод 1, модифицированный ферроценом с иммобилизованными на поверхности клеток 2 ассоциации дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha, взятых в соотношении 1:1, хлорсеребряный электрод 3 сравнения, измерительная кювета 4 объемом 5 мл, магнитная мешалка 5.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение характеристик устройства, в частности снижение нижней границы, что связано с использованием в качестве иммобилизованных клеток ассоциации дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha (1:1).

При регистрации сигнала устройства используют электрохимический преобразователь-потенциостат, регистрирующий зависимость силы тока от времени - IPC Micro, к которому подключают электроды. Измерения проводят при постоянном потенциале +250 мВ.

Рабочий электрод 1 готовят на основе графитовой пасты следующего состава: ферроцен - 10 мг, графитовая пудра - 90 мг, минеральное масло -40 мкл. Ферроцен растворяют в ацетоне объемом 500 мкл. После испарения ацетона данной смесью наполняют пластиковый корпус электрода. Затем на зачищенную поверхность электрода наносят клетки 2 на основе дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha в соотношении 1:1 с общим титром 330 мг/см³, при этом суммарный объем суспензии составляет 10 мкл, для удерживания клеток применяют диализную мембрану, которую фиксируют с помощью пластикового кольца. Принцип работы устройства для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода заключается в следующем: измерения проводят в измерительной кювете 4 объемом 5 мл, содержащей калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=6,8). В измерительной кювете 4 погружены рабочий угольно-пастовый электрод 1, модифицированный ферроценом с иммобилизованными клетками 2 ассоциации дрожжей В. adeninivorans и О. polymorpha, взятых в соотношении 1:1, и хлорсеребряный электрод 3 сравнения. Измерения проводят при непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки 5 (300 об/мин) при комнатной температуре.

После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества. После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы калий-натрий-фосфатным буферным раствором. Скорость биоразложения органических субстратов рассчитывают по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение биохимического потребления кислорода по предварительно построенной с помощью модельного глюкозо-глутаматного раствора калибровочной кривой. В соответствии с ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97 значение биохимического потребления кислорода модельного раствора, содержащего суммарно 300 мг/дм³ глюкозы и глутаминовой кислоты (1:1), составляет 205 мгО₂/дм³ [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М.: 1997. - 25 с.].

Таким образом, заявляемое устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода не требует привлечения высококвалифицированного персонала и позволяет определять индекс биохимического потребления кислорода за время не более 6 минут, при этом нижняя граница определяемых значений составляет 2 мг О₂/дм³.

Изобретение относится к области аналитической биотехнологии. Устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода, характеризующееся тем, что содержит магнитную мешалку, измерительную кювету, хлорсеребряный электрод сравнения, рабочий угольно-пастовый электрод, модифицированный медиатором ферроценом и иммобилизованными на поверхности электрода клетками - ассоциацией дрожжей Blastobotrys adeninivorans ВКМ Y-2677 (В. adeninivorans) и Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (О. polymorpha) в соотношении 1:1. Изобретение позволяет улучшить технические характеристики устройства, в частности снизить нижнюю границу до 2 мг/дм³, снизить длительность единичного измерения, увеличить спектр окисляемых субстратов. 1 ил., 1 табл.

Устройство для экспресс-оценки количества легкоокисляемых органических веществ по индексу биохимического потребления кислорода, содержащее магнитную мешалку, измерительную кювету, хлорсеребряный электрод сравнения, рабочий угольно-пастовый электрод, модифицированный медиатором ферроценом и иммобилизованными на поверхности электрода клетками, отличающееся тем, что в качестве иммобилизованных клеток взята ассоциация дрожжей Blastobotrys adeninivorans ВКМ Y-2677 (В. adeninivorans) и Ogataea polymorpha ВКМ Y-2559 (O. polymorpha) в соотношении 1:1.