Способ определения устойчивости растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы G Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 A01H1/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника, в частности в выведении форм подсолнечника, устойчивых к заразихе кумской расы G.

Подсолнечник является одной из основных масличных культур в мире, в связи с этим современные селекционные программы нацелены на повышение продуктивности данной культуры, повышения качества масла. Одним из основных признаков, который также активно вводится селекционерами в коллекции это устойчивость к фитопатогенам. Значимые потери урожая подсолнечника вызывает заразиха - фитопатогенное растение, которое паразитирует на корнях, поглощая питательные вещества хозяина, снижая таким образом его продуктивность. Поскольку признак устойчивости к заразихе является моногенным его возможно ввести в коллекцию с помощью бэккроссирования и отбора потомства по признаку устойчивости.

Однако для оценки устойчивости необходимо производить дополнительные эксперименты в теплице и/или тестовых полях с использованием семян патогена, что с одной стороны является затратным по времени и финансам процессом.

С другой стороны, внесение патогена в почву увеличивает риск контаминации соседних полей и распространению этого патогена. В связи с этим перспективным способом оценки устойчивости растений к заразихе является предсказание данного признака по состоянию генетических маркеров, сцепленных с устойчивостью.

На сегодняшний день особую угрозу урожаю подсолнечника представляет заразиха подсолнечная (Orobanche cumana Wallr.) - фитопатогенное растение, которое паразитирует на корнях, поглощая питательные вещества хозяина, снижая таким образом его продуктивность приводя к значительным (> 90%) потерям урожая (Antonova T. S. The history of interconnected evolution of Orobanche cumana Wallr. and sunflower in the Russian Federation and Kazakhstan //Helia. - 2014. - Т. 37. - №. 61. - С. 215-225).

Из-за влияния факторов окружающей среды, недостаточного количества семян заразихи в почве, сложного процесса сбора семян заразихи, проблем с прорастанием семян и т.д. тесты на заразиху не всегда дают надежные результаты. Для достижения своих селекционных целей и выявления источников устойчивости к заразихе селекционеры подсолнечника, безусловно, выбирают подходящий метод инокуляции и метод молекулярных маркеров. Поскольку наиболее надежным и наиболее легко применимым методом скрининга селекционного материала на устойчивость к заразихе является использование молекулярных маркеров. До сих пор для этой цели использовались маркеры QTL, RFLP, RAPD, TRAOP и SSR (Imerovski I. et al. Identification of PCR markers linked to different Or genes in sunflower //Plant Breeding. - 2013. - Т. 132. - №. 1. - С. 115-120.; Pérez-Vich B. et al. Marker-assisted and physiology-based breeding for resistance to root parasitic Orobanchaceae //parasitic Orobanchaceae. - 2013. - С. 369-391). Молекулярные исследования с целью определения характеристик рас и составления карт быстро развиваются. Например, было обнаружено, что устойчивость к расе F может контролироваться либо двумя рецессивными генами, либо одним доминантным геном в инбредных линиях в зависимости от происхождения инбредных линий (Joia M. P. et al. Broomrape (Orobanche cumana Wallr.), the most important parasite in sunflower //Analele Institutului Naional de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Fundulea. - 2009. - Т. 77. - С. 49-56). Эти результаты были также показаны на молекулярном уровне и указывает на то, что маркер специфичен для материала, на котором он был разработан (Imerovski I. et al. Molecular profiles of sunflower lines resistant to broomrape (Orobanche cumana Wallr.) //Proc. Int. Symp. on Broomrape (Orobanche spp.) in Sunflower. Chisinau, Republic of Moldova. - 2011. - С. 25). Поскольку признак устойчивости к заразихе является моногенным его возможно ввести в коллекцию с помощью бэккроссирования и отбора потомства по признаку устойчивости.

Однако для оценки устойчивости необходимо производить дополнительные эксперименты в теплице и/или тестовых полях с использованием семян патогена, что с одной стороны является затратным по времени и финансам процессом. С другой стороны, внесение патогена в почву увеличивает риск контаминации соседних полей и распространению этого патогена.

Оригинальный метод петлевой изотермической амплификации (loop-mediated amplification - LAMP) был предложен японскими учеными Notomi et al. в 2000 году. Данный метод основан на автоциклическом синтезе ДНК с вытеснением нитей, который осуществляется с помощью ДНК-полимеразы с высокой активностью вытеснения нитей (исходно Bst ДНК-полимеразы) и набора из двух специально разработанных внутренних и двух внешних праймеров - всего четыре праймера.

Концевые участки амплифицируемого фрагмента формируются с созданием следующей структуры: последовательности (обычно 23-24 п.н.) внутри обоих концов целевого региона для амплификации обозначаются F2c и B2, соответственно. Две внутренние последовательности (обычно 23-24 нт), находящиеся на расстоянии 40 нт от концов F2c и B2 обозначаются F1c и B1, а две последовательности (17-21 нт) находящиеся на снаружи от участков F2c и B2, на самом конце амплифицируемого фрагмента, обозначаются F3c и B3.

В исходном варианте четыре праймера для LAMP должны быть подобраны так, чтобы быть специфичными к нуклеотидной последовательности данных 6 участков, обозначенных в целевом фрагменте ДНК:

FIP (forward inner primer) - прямой внутренний праймер состоит из двух частей: последовательность F1c (5’), TTTT спейсер и последовательность F2 (3’), комплементарных участкам F1 и F2c, соответственно, BIP - обратный внутренний праймер состоит из двух частей: B1c (5’), TTTT спейсер и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно; F3 - прямой наружный праймер, комплементарный участку F3c, B3 - обратный наружный праймер, комплементарный участку B3c.

На начальных этапах реакции LAMP используются все четыре праймера, но позже во время циклического повторения реакции для синтеза ДНК со вытеснением цепей используются только внутренние FIP и BIP праймеры.

Чуть позже авторы метода предложили его усовершенствованную модификацию, предполагающую использование уже шести праймеров, специфичных к 8 участкам целевого фрагмента. Два дополнительных петлевых праймера LoopF и LoopB должны быть комплементарны последовательностям между участками F1 и F2, а также B1 и B2 фрагмента-мишени. Они участвуют на третьем этапе реакции, отжигаясь на одноцепочечных участках, образовавшихся ранее петель ДНК в гантелевидной структуре, и становясь дополнительными центрами инициации синтеза.

Далее образец ДНК, содержащий целевую последовательность, и четыре праймера смешиваются и подвергаются тепловой денатурации. Затем реакция LAMP инициируется добавлением большого фрагмента ДНК-полимеразы Bst и проводится при 65°C в течение 1 ч.

Реакция состоит из трех основных этапов: 1) образование базовой гантелеобразной структуры, являющейся матрицей для последующих этапов; 2) этап циклической амплификации, 3) этап элонгации и повторения циклов.

В результате такой реакции образуется множество конкатемеров инвертированных повторов целевого фрагмента, формирующих в пространстве структуры, похожие на цветную капусту (cauliflower-like structures), а также стеблевых петель ДНК с различной длиной стебля. И если длина участка-мишени обычно составляет 80-250 н.п., то длина конкатемеров может достигать 20 т.п.н. и больше. В ходе LAMP целевая последовательность умножается в 3 раза каждые полцикла.

В связи с этим, перспективным способом оценки устойчивости растений к заразихе является создание аллель-специфичного набора праймеров для изотермической амплификации.

Одним из способов решения вышеозначенной проблемы является разработка набора олигонуклеотидных праймеров, в том числе аллель-специфичных, для изотермической реакции (LAMP) к маркеру, сцепленному с устойчивостью к заразихе кумской седьмой расы (раса G). Праймеры подбираются таким образом, чтобы в ходе проведения двух изотермических реакций стало возможным определить все аллельные состояния, включая гетерозиготное.

Задача определения устойчивости селекционного материала подсолнечника к заразихе решается путем создания набора специфичных праймеров, представляющих собой набор олигонуклеотидных последовательностей длиной от 18 до 50 дезоксирибонуклеотидов, к участкам, расположенным вокруг маркера, таким образом, чтобы на 3’-конце праймеров, под названием BIP находился однонуклеотидный полиморфизм (ОНП), сцепленный с устойчивостью к заразихе. Таким образом формируется 2 набора праймеров, для одного маркера, способных после постановки изотермической амплификации определить аллельное состояние локуса у растения.

Указанная задача решается путём создания набора праймеров с последующей изотермической амплификацией, включающей следующие стадии:

1. Выделяют тотальную ДНК из образца или образцов, предположительно обладающих устойчивостью к заразихе кумской расы G.

2. Проводится изотермическая амплификация с двумя наборами праймеров:

a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с восприимчивостью к заразихе;

b) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе.

3. Регистрируют накопление продукта амплификации для обеих реакций.

4. В зависимости от наличия или отсутствия продукта реакций определяется три варианта:

a) В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с восприимчивостью к заразихе продукт есть. В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе продукта нет. Из такого сочетания делается вывод о том, что растение подсолнечника гомозиготно по дикому аллелю и восприимчиво к заразихе. В случае самоопыления исследуемого растения потомство также будет восприимчиво к заразихе расы G;

b) В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с восприимчивостью к заразихе продукта нет. В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе продукта есть. Из такого сочетания делается вывод о том, что растение подсолнечника гомозиготно по мутантному аллелю и устойчиво к заразихе. В случае самоопыления исследуемого растения потомство также будет устойчиво к заразихе расы G;

c) В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с восприимчивостью к заразихе продукт есть. В реакции с набором праймеров SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 для выявления аллеля ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе продукта есть. Из такого сочетания делается вывод о том, что растение подсолнечника гетерозиготно по ОНП и устойчиво к заразихе. В случае самоопыления исследуемого растения потомство будет расщепляться по признаку устойчивости к заразихе расы G на устойчивых и неустойчивых в соотношении 3 к 1 соответственно.

Таким образом, в рамках настоящего изобретения разработан набор олигонуклеотидных последовательностей, праймеров, для проведения изотермической амплификации с последующим определением устойчивости или восприимчивости исследуемых растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы G.

Настоящее изобретение представляет собой набор олигонуклеотидных последовательностей (праймеров) для идентификации растений подсолнечника однолетнего (Helianthus annuus), обладающих устойчивостью к патогенной заразихе кумской (Orobanche cumana) расы G. Путем петлевой изотермической амплификации с аллель-специфичными праймерами достигается эффект определения генотипа растения по интересующему локусу (S7_99546708), с определением обоих гомозиготных состояний и гетерозиготного состояния локуса. Указанный набор содержит 7 олигонуклеотидов, обладающих праймерной активностью, комплементарных нуклеотидным последовательностям располагающихся в окружении локуса S7_99546708, при этом два праймера из набора обладают аллель-специфичностью. Настоящее изобретение позволяет расширить набор средств для определения устойчивых к заразихе растений подсолнечника однолетнего и тем самым ускорить отбор ценных линий в процессе селекции.

Настоящее изобретение позволяет повысить точность и скорость установления устойчивости подсолнечника к заразихе, в сравнении с полевым провокационным методом на инфекционном фоне и в сравнении с классическими лабораторными методами, такими, как ПЦР или секвенирование по Сэнгеру.

Подробное раскрытие изобретения.

Петлевой изотермической реакцией амплификации (LAMP) называется метод амплификации ДНК в пробирке при неизменной температуре реакции с применением специфического набора праймеров, позволяющего наработать продукт целевой последовательности, при участии ДНК-полимеразы с 5’-3’ вытесняющей активностью и без 5’-3’ и 3’-5’ экзонуклеазной активности.

Номера нуклеотидных последовательностей (SEQ_ID_NO:) в тексте описания соответствуют таковым в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, являющимися частью настоящего описания изобретения. В случае наличия разночтений в структуре последовательностей между текстом описания и соответствующей последовательностью в Перечне последовательностей согласно стандарту ST.26, приоритетными являются данные, представленные в тексте описания.

Данное изобретение описывает набор праймеров для петлевой изотермической реакции для установления устойчивости растений подсолнечника к заразихе кумской.

Описанный в данном изобретении набор праймеров создан на основании известного ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе.

В связи с тем, что сама реакция LAMP довольно проста и происходит условно “самопроизвольно” в одной пробирке при одной температуре, одним из критических моментов для достижения желаемого результата является дизайн праймеров для амплификации целевых участков ДНК. При этом можно руководствоваться следующими соображениями. Поскольку гибридизация четырех праймеров с целевой ДНК на начальном этапе критически важна для эффективности LAMP, последовательности и размеры праймеров желательно выбирать таким образом, чтобы их температуры плавления (Tm) находились в определённых диапазонах. В оригинальной статье Notomi et al. (2000) последовательности F2 и B2 в FIP и BIP были выбраны таким образом, чтобы их температура плавления (Tm) находилась в диапазоне от 60 до 65°C, что является оптимальной температурой для Bst-полимеразы. Значения Tm для F1c и B1c подбирались таким образом, чтобы быть немного выше, чем для F2 и B2, чтобы сразу после высвобождения одноцепочечной ДНК путем вытеснения цепи формировалась петлевая структура. Кроме того, значения Tm внешних праймеров (F3 и B3) были установлены ниже, чем у F2 и B2, чтобы синтез с внутренних праймеров происходил раньше, чем синтез праймированный внешними праймерами. Кроме того, внешние праймеры использовались в концентрации 1/4-1/10 от концентрации внутренних праймеров.

Кроме того, формирование стебле-петлевой структуры ДНК из гантелевидной структуры является критическим для LAMP. При изучении влияния различных размеров петли между F2c (B2c) и F1c (B1c) на эффективность амплификации было показано, что петля длиной 40 оснований или более дает наилучшие результаты.

Для того, чтобы сделать возможным дифференциальное определения нуклеотида в ОНП позиции, ассоциированной с признаком устойчивости к заразихе в данной работе был использован метод аллель-специфической LAMP (Aonuma et al., 2013) для маркера S7_99546708. В методе аллель-специфичной (AS)-LAMP два набора праймеров LAMP предназначены для дифференциации между двумя различными нуклеотидами в полиморфном SNP локусе в целевом гене. Специфические праймеры, а именно два праймера BIP или FIP, разрабатываются таким образом, чтобы искомая точечная однонуклеотидная мутация-замена располагалась на 3' конце, относительно праймера B2 (на 5' конце относительно праймера BIP). По соседству с полиморфным нуклеотидов внедряется дополнительный несовпадающий с последовательностью целевого гена нуклеотид для повышения специфичности к каждому целевому нуклеотидному сайту. В двух получаемых наборах праймеров остальные праймеры F3, B3 и FIP или BIP одинаковы. Для каждого образца, таким образом, проводится две реакции LAMP с каждым из двух наборов праймеров, указанных в таблице 1.

Подбор праймеров для AS-LAMP в данной работе проводился с помощью программы Primer Explorer 5.0 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html). Основные параметры при подборе были определены как автоматически оценённые (Automatic judgment). Аллель-специфичные правки в последовательностях праймеров были добавлены в ручном режиме.

Условия петлевой изотермической реакции:

25 μL LAMP реакционной смеси включали:

5,0 мкл 5x LAMP буфера (5 мМ MgSO₄ в конечной смеси);

2,5 мкл 10 мМ dNTP (конечная концентрация 1,0 мМ);

0,6 мкл препарата геномной ДНК (10 нг/мкл);

0,8 мкл 25x LAMP primer mix (BIP, FIP, B3 и F3);

0,8 мкл 25x Loop primer mix;

0,65 мкл флуоресцентного красителя;

1 мкл Bst L-полимеразы (8,000 ед/мл).

Деионизованная вода добавлялась до конечного объема.

Оптимальная температура отжига для набора праймеров была определена методом градиентного нагрева и составляет 59°C. Концентрация ионов Mg²⁺, также была подобрана экспериментально. Время проведения реакции составляет 40 минут. По прошествии 40 минут проводится детекция сигнала в каждой пробирке. Наличие продукта в наборе праймеров номер 1 говорит о наличии в образце аллеля ОНП, сцепленного с устойчивостью к заразихе. Наличие продукта в наборе праймеров номер 2 говорит о наличии в образце аллеля ОНП, сцепленного с восприимчивостью к заразихе.

Структура 7 олигонуклеотидных последовательностей:

SEQ_ID_NO:1

ACATTCACGTGGTTGACTT

SEQ_ID_NO:2

GATCATTCAATAGTCGAAAGCT

SEQ_ID_NO:3

GCAAATGTAAATGTGTGGAACATGGTTTTCAATGTTGACCAAGGGGA

SEQ_ID_NO:4

GAAGAGGAAAACCTTTGCTGACGTTTTTTGCTCAAGGTGGAAGGAGG

SEQ_ID_NO:5

GAAGAGGAAAACCTTTGCTGACGTTTTTTGCTCAAGGTGGAAGGAGA

SEQ_ID_NO:6

TCAGCACGTATTGACCATTT

SEQ_ID_NO:7

TTTTGTCGGATATACCCTTG

Таблица 1 - Описание набора праймеров Номер Название Специфичность к аллелю Набор праймеров SEQ_ID_NO:1 OcOT_F3 - 1, 2 SEQ_ID_NO:2 OcOT_B3 - 1, 2 SEQ_ID_NO:3 OcOT_FIP - 1, 2 SEQ_ID_NO:4 OcOT_BIP_s устойчивость 1 SEQ_ID_NO:5 OcOT_BIP_r восприимчивость 2 SEQ_ID_NO:6 OcOT_LF - 1, 2 SEQ_ID_NO:7 OcOT_LB - 1, 2

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Применение наборов праймеров в петлевой изотермической амплификации для кодоминантного определения устойчивых растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской

Для демонстрации возможности использования набора праймеров для определения устойчивых к заразихе растений подсолнечника были взяты 4 образца подсолнечника, полученных из расщепляющегося по устойчивости к заразихе потомства от скрещивания устойчивой и неустойчивой линий подсолнечника. С использованием наборов праймеров были проведены по две реакции для каждого растения. Этапы определения приведены ниже.

1. На первом этапе были выделены препараты ДНК из листовых высечек подсолнечников.

2. На втором этапе были проведены по две петлевые изотермические реакции для каждого образца ДНК с регистрацией уровня флюоресценции.

3. На третьем этапе определяли наличие или отсутствие продукта для каждой из пробирок. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты проведения петлевых изотермических реакций с использванием двух наборов праймеров Образец Набор праймеров 2 Набор праймеров 1 Вывод 3 Наличие восприимчивого аллеля Наличие устойчивого аллеля Гетерозигота 13 Наличие восприимчивого аллеля Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота 16 Наличие восприимчивого аллеля Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота 25 Отсутствие восприимчивого аллеля Наличие устойчивого аллеля Устойчивая
Гомозигота 23 Наличие восприимчивого аллеля Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота

4. На основании приведённых в таблице 2 результатов, можно сделать вывод о том, что образец под номером 25 является устойчивым и потомство, полученное от его самоопыления, также будет обладать устойчивостью к заразихе кумской расы G.

Пример 2. Применение набора праймеров 1 в петлевой изотермической амплификации для доминантного определения устойчивых растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской

Для демонстрации возможности использования набора праймеров 1 для определения устойчивых к заразихе растений подсолнечника были взяты 4 образца подсолнечника, полученных из расщепляющегося по устойчивости к заразихе потомства от скрещивания устойчивой и неустойчивой линий подсолнечника. С использованием наборов праймеров 1 была проведена реакция для каждого растения. Этапы определения приведены ниже.

1. На первом этапе были выделены препараты ДНК из листовых высечек подсолнечников.

2. На втором этапе были проведена изотермическая реакция для каждого образца ДНК с регистрацией уровня флюоресценции.

3. На третьем этапе определяли наличие или отсутствие продукта для каждой из пробирок. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты проведения петлевых изотермических реакций с использованием одного набора праймеров Образец Набор праймеров 1 Вывод 3 Наличие устойчивого аллеля Устойчивая
Гомозигота/Гетерозигота 13 Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота 16 Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота 25 Наличие устойчивого аллеля Устойчивая
Гомозигота/Гетерозигота 23 Отсутствие устойчивого аллеля Восприимчивая гомозигота

4. На основании приведённых в таблице 3 результатов, можно сделать вывод о том, что образцы под номерами 3, 23 и 25 являются носителями устойчивого аллеля, однако так как в данном примере система используется как доминантная, невозможно отличить устойчивую гомозиготу от устойчивой гетерозиготы, и потомство, полученное от их самоопыления, возможно будет расщепляться по признаку устойчивости к заразихе кумской расы G.

Настоящее изобретение позволяет повысить точность и скорость установления устойчивости подсолнечника к заразихе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ.

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="/home/rim/Desktop/OilGene/ТатНефть_Патент/Sequences_TatNeft.

xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-02-11">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023117635/10(037749)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-24</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2023117635/10(037749)</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023117635/10(037749)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-24</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru"> Публичное акционерное общество

"Татнефть" имени В.Д. Шашина, RU</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>TatNeft</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ определения устойчивости

растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы

G</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>7</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>telomere</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acattcacgtggttgactt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatcattcaatagtcgaaagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaaatgtaaatgtgtggaacatggttttcaatgttgaccaagggga</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaagaggaaaacctttgctgacgttttttgctcaaggtggaaggagg</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q17">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gaagaggaaaacctttgctgacgttttttgctcaaggtggaaggaga</INS

DSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcagcacgtattgaccattt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Helianthus annuus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttttgtcggatatacccttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу определения устойчивости растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы G. Изобретение позволяет эффективно определять устойчивое растение подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы G. 3 табл., 2 пр.

Способ определения устойчивости растений подсолнечника однолетнего к заразихе кумской расы G, заключающийся в том, что выделяют общую ДНК из образцов; проводят петлевую изотермическую амплификацию с набором праймеров SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7; устанавливают наличие устойчивости растения подсолнечника к заразихе кумской расы G при наличии продукта амплификации.