ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств и, в частности, относится к применению производных бензизоселеназола для получения лекарственных средств против коронавируса.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Коронавирусы относятся к отряду Nidovirales, семейству Coronaviridae и роду Coronavirus в соответствии с систематической классификацией. Вирусы рода Coronavirus имеют оболочку и содержат линейный геном, представленный одноцепочечной РНК положительной полярности. Они представляют собой большую группу вирусов, широко распространенных в природе.
Коронавирус изначально выделили из цыпленка в 1937 г. Вирусные частицы имеют диаметр 60 - 200 нм, средний диаметр 100 нм, сферическую или эллиптическую форму и проявляют полиморфизм. Вирус содержит оболочку с шипами на ней. Весь вирус похож на солнечную корону. Шипы различных коронавирусов существенно отличаются.
Новый коронавирус 2019 (2019-nCoV или SARS-CoV-2, вызывающий коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19)) представляет собой седьмой известный коронавирус, инфицирующий людей, после HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKUl, SARS-CoV (вызывающего тяжелый острый респираторный синдром) и MERS-CoV (вызывающего ближневосточный респираторный синдром). 2019-nCoV относится к роду бетакоронавирусов. Он содержит оболочку. Частицы имеют кольцевую или эллиптическую форму, обычно проявляют полиморфизм и имеют диаметр 60 - 140 нм. Его генетические характеристики значительно отличаются от таковых у SARS-CoV и MERS-CoV. Настоящее исследование показывает, что он более чем на 85% гомологичен Bat SARS-подобному коронавирусу (bat-SL-CoVZC45).
2019-nCoV представляет собой РНК-вирус. Его пролиферация зависит от воспроизведения материнской РНК посредством РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). Белок 3CLpro 2019-nCoV представляет собой ключевой белок для того, чтобы ключевой белок 2019-nCoV - RdRp - был в активированной форме. Белок 3CLpro 2019-nCoV гидролизует белки вируса pp1a и pp1ab с образованием зрелого продукта nsp1-16, который затем собирается в активный RdRp. На данный момент, 3CLpro 2019-nCoV считают одной из мишеней для лекарственных средств для борьбы с коронавирусами.
Существует острая необходимость в активных лекарственных средствах, которые эффективны против коронавирусов, в частности, против 2019-nCoV.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением предложено применение производных бензизоселеназола для получения лекарственных средств против коронавируса, причем указанные производные бензизоселеназола представляют собой соединения формулы (I), или их стереоизомеры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства или активные метаболиты,
где R выбран из водорода, циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, нитро, амино, СООН, SO3H, С1-12 алкила, С3-12 циклоалкила, С1-12 алкокси, С1-12 алкилтио, С2-12 алкенила, С1-12 алкиламидо, С1-12 алкилацилокси, 3-14-членного гетероциклила, С6-14 арила и 5-14-членного гетероарила, где указанные С1-12 алкил, С3-12 циклоалкил, С1-12 алкокси, С1-12 алкилтио, С1-12 алкиламидо, С1-12 алкилацилокси, 3-14-членный гетероциклил, С6-14 арил и 5-14-членный гетероарил необязательно содержат в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из перечисленных далее: циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, амино, нитро, оксо, тио, СООН, SO3H, С1-12 алкила, С3-12 циклоалкила, С1-12 алкокси, С2-12 алкенила, 3-14-членного гетероциклила, С6-14 арила и 5-14-членного гетероарила;
р представляет собой целое число от 0 до 4;
L выбран из *-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NRN-(CH2)n-#, *-(CH2)n-CH(OH)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NH-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-O-(CH2)n-#, *-(СН2)n-O-С(O)-(СН2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-C(O)-(CH2)n-#, *-(СН2)n-S(O)-(СН2)n-#, *-(CH2)n-S(O)2-(CH2)n-#, *-(СН2)n-С3-8 циклоалкилен-(CH2)m-#, *-(CH2)n-S-S-(CH2)m-#, *-(CHRL)(CH2)n-S-S-(CH2)m(CHRL)-#, *-(CH2)n-(CHRL)-S-S-(CHRL)-(CH2)m-#, фенилена, бифенилена, трифенилена, *-фенил-(СН2)n-#, *-(СН2)n-фенил-#, *-фенил-(СН2)n-фенил-#, *-фенил-(СН2)n-S(O)2-# и *-(СН2)n-S(O)2-фенил-#;
где * представляет собой место соединения с атомом N бензизоселеназольной группы, и # представляет собой место соединения с группой Q;
n представляет собой целое число от 0 до 12, m представляет собой целое число от 0 до 12, RN представляет собой С1-12 алкил, и RL представляет собой галоген, гидроксил, амино, карбоксил или сульфгидрил;
Q выбран из Н, С1-12 алкила, С3-12 циклоалкила, С1-12 алкокси, С1-12 алкилтио, С1-12 алкиламидо, С1-12 алкилацилокси, С2-12 алкенила, 3-14-членного гетероциклила, С6-14 арила и 5-14-членного гетероарила, где указанные С1-12 алкил, С3-12 циклоалкил, С1-12 алкокси, С1-12 алкиламидо, С1-12 алкилацилокси, 3-14-членный гетероциклил, С6-14 арил и 5-14-членный гетероарил необязательно содержат в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из перечисленных далее: циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, амино, нитро, оксо, тио, СООН, SO3H, С1-12 алкила, С3-12 циклоалкила, С1-12 алкокси, С2-12 алкенила, 3-14-членного гетероциклила, С6-14 арила и 5-14-членного гетероарила.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, в соединениях формулы (I), R выбран из водорода, циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, нитро, амино, СООН, SO3H, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио, C1-6 алкиламидо, C1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенила, 3-10-членного гетероциклила, С5-10 арила и 5-10-членного гетероарила, где указанные C1-6 алкил, С3-7 циклоалкил, С1-6 алкокси, С1-6 алкилтио, С1-6 алкиламидо, C1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенил, 3-10-членный гетероциклил, С6-10 арил и 5-10-членный гетероарил необязательно содержат в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из перечисленных далее: циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, амино, нитро, оксо, тио, СООН, SO3H, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, С1-6 алкокси, С2-6 алкенила, 3-10-членного гетероциклила, С6-10 арила и 5-10-членного гетероарила; р представляет собой целое число от 0 до 4;
L выбран из *-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NRN-(CH2)n-#, *-(СН2)n-СН(ОН)-(СН2)n-#, *-(CH2)n-NH-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-O-(CH2)n-#, *-(СН2)n-O-С(O)-(СН2)n-#, *-(СН2)n-С(O)-O-(CH2)n-#, *-(CH2)n-С(O)-(CH2)n-#, *-(СН2)n-С(O)-С(O)-(CH2)n-#, *-(СН2)n-S(O)-(СН2)n-#, *-(CH2)n-S(O)2-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C3-8 циклоалкилен-(CH2)m-#, *-(CH2)n-S-S-(CH2)m-#, *-(CHRL)(CH2)n-S-S-(CH2)m(CHRL)-#, *-(CH2)n-(CHRL)-S-S-(CHRL)-(CH2)m-#, фенилена, бифенилена, трифенилена, *-фенил-(СН2)n-#, *-(СН2)n-фенил-# и *-фенил-(СН2)n- фенил-#, *-фенил-(СН2)n-S(O)2-# и *-(СН2)n-S(O)2-фенил-#, где * представляет собой место соединения с атомом N бензизоселеназольной группы, и # представляет собой место соединения с группой Q; n представляет собой целое число от 0 до 12, m представляет собой целое число от 0 до 12, RN представляет собой C1-6 алкил и RL представляет собой галоген, гидроксил, амино, карбоксил или сульфгидрил;
Q выбран из Н, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, C1-6 алкокси, С1-6 алкилтио, C1-6 алкиламидо, C1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенила, 3-10-членного гетероциклила, С6-10 арила и 5-10-членного гетероарила, где указанные C1-6 алкил, С3-7 циклоалкил, C1-6 алкокси, C1-6 алкиламидо, C1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенил, 3-10-членный гетероциклил, С6-10 арил и 5-10-членный гетероарил необязательно содержат в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из перечисленных далее: циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, амино, нитро, оксо, тио, СООН, SO3H, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, C1-6 алкокси, С2-6 алкенила, 3-10-членного гетероциклила, С6-10 арила и 5-10-членного гетероарила.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, в соединениях формулы (I), L выбран из *-(СН2)2-#, *-(СН2)3-#, *-(СН2)4-#, *-(СН2)5-#, *-(СН2)6-#, *-(СН2)7-#, *-(CH2)8-#, *-(СН2)9-#, *-(СН2)10-#, *-(СН2)11-#, *-(CH2)12-#, циклопентилена, циклогексилена, фенилена, бифенилена, трифенилена, *-фенил-(СН2)n-#, *-(СН2)n-фенил-#, *-фенил-(СН2)n-фенил-#*, *-фенил-S(O)2-#, *-(СН2)n-S(O)2-фенил-#, *-(CH2)n-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NRN-(CH2)n-#, *-(CH2)n-CH(OH)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-NH-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)n-#, *-(CH2)n-O-(CH2)n-#, *-(CH2)n-O-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-O-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-C(O)-C(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-S(O)-(CH2)n-#, *-(CH2)n-S(O)2-(CH2)n-#, *-(СН2)n-циклопропилен-(СН2)m-#, *-(СН2)n-циклобутилиден-(СН2)m-#, *-(CH2)n-циклопентилен-(СН2)m-#, *-(СН2)n-циклогексилен-(СН2)m-#, *-(CH2)n-S-S-(CH2)m-#, *-(CHRL)(CH2)n-S-S-(CH2)m(CHRL)-# *-(CH2)n-(CHRL)-S-S-(CHRL)-(CH2)m-#, где * представляет собой место соединения с атомом N бензизоселеназольной группы, и # представляет собой место соединения с группой Q; n представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, m представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, RN представляет собой С1-6 алкил и RL представляет собой галоген, гидроксил, амино, карбоксил или сульфгидрил.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, в соединениях формулы (I), Q выбран из Н, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио, C1-6 алкиламидо, C1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенила, бензизоселеназолила, остатка сахарида, аминокислотного остатка, Re-NH-Rf, 
где 
представляет собой группу соединения с L;
каждый из R5 и R6 независимо выбран из водорода, галогена, циано, С1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио, N(C1-6 алкил)2, NH(C1-6 алкил), COORb и SO3Rb;
Rb выбран из водорода, C1-6 алкила и C1-6 алкокси;
каждый из Rc и Rd независимо выбран из водорода, C1-6 алкила и фенила, или Rc и Rd вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют азотсодержащий гетероцикл или азотсодержащее гетероарильное кольцо;
каждый из Re и Rf независимо выбран из C1-6 алкила и С3-7 циклоалкила;
указанные C1-6 алкил, С3-7 циклоалкил, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио, C1-6 алкиламидо, С1-6 алкилацилокси, С2-6 алкенил, С3-7 циклоалкил, бензизоселеназолил, остаток сахарида и аминокислотный остаток необязательно могут содержать один или более заместителей, выбранных из перечисленных далее: циано, гидроксила, сульфгидрила, галогена, амино, нитро, оксо, тио, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила и С1-6 алкокси.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, остаток сахарида, описанный выше, может представлять собой D-глюкопиранозильную группу, такую как 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-дезокси-D-глюкопиранозил.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, аминокислотный остаток, описанный выше, содержит в качестве заместителя сульфгидрил и дополнительно связан с группой L посредством указанного сульфгидрила.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, в соединениях формулы (I), R выбран из водорода, гидроксила, галогена, СООН, SO3H, C1-6 алкила и С1-6 алкокси.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, в соединениях формулы (I), R выбран из водорода, гидроксила, фтора, хлора, брома, йода, СООН, SO3H, метила, фторметила, дифторметила, трифторметила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, трет-бутила, н-пентила, изопентила, метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, трет-бутокси н-пентокси и изопентокси.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-1):
где каждый из R, L и р независимо соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I).
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-1) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 1:
В одном варианте реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-2а), формулы (I-2b) или формулы (I-2c):
В соединениях формулы (I-2а), формулы (I-2b) и формулы (I-2 с), описанных выше, каждый из R, L и р соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I).
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-2а), формулы (I-2b) или формулы (I-2 с) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 2:
В одном варианте реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-3):
где каждый из R и р соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I);
r представляет собой целое число от 0 до 12, предпочтительно целое число от 2 до 4.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-3) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 3:
В одном варианте реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-4):
где каждый из R1, R2; R3, R4, R5, R6, R7 и R8 независимо представляет собой Н, C1-6 алкил, C1-6 алкокси или галоген; t представляет собой целое число от 1 до 4, предпочтительно 2 или 3.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-4) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 4:
В одном варианте реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-5а) или формулы (I-5b):
В формуле (I-5a), R1 выбран из водорода, галогена, нитрила, C1-6 алкила, C1-6 алкокси, С1-6 алкилтио, N(C1-6 алкила)2, NH(C1-6 алкила), СООН, -CORb, CONHRb, CONRcRd, SO3R, арила, гетероарила, циклоалкила и гетероциклила, которые необязательно могут содержать в качестве заместителя C1-6 алкил, C1-6 алкокси, галоген, нитрил, арил или гетероарил, предпочтительно -Н, -СН3, галоген, -ОАс или -ОН, и более предпочтительно -Н, -СН3, -CI, -F, -ОАс или -ОН;
R2 выбран из С1-12 алкилена, фенилена, бифенилена, трифенилена, циклогексилена, циклопентана, -RaSSRa-, -(RaO)uRa-, -(CH2)(RaO)3Ra-, -RaN(CH3)2Ra- и -RaNHRa-;
Ra представляет собой C1-6 алкилен; Rb представляет собой Н, C1-6 алкил или C1-6 алкокси; Rc и Rd независимо выбраны из Н, C1-6 алкила и фенила, или Rc и Rd вместе с N, с которым они связаны, образуют азотсодержащий гетероцикл или азотсодержащее гетероарильное кольцо;
R3 выбран из -Н, фенилкарбонила и С1-6 алкилоксикарбонила;
u представляет собой целое число от 0 до 4;
или
В формуле (I-5b), R1' выбран из водорода, галогена, нитрила, С1-6 алкила, С1-6 алкокси, С1-6 алкилтио, N(C1-6 алкила)2, NH(С1-6 алкила), СООН, -CORb, CONHRb, CONRcRd, SO3R, арила, гетероарила, циклоалкила и гетероциклила, которые необязательно могут содержать в качестве заместителя С1-6 алкил, С1-6 алкокси, галоген, нитрил, арил или гетероарил, предпочтительно -Н, -СН3, галоген, -ОАс или -ОН, и более предпочтительно -Н, -СН3, -Cl, -F, -ОАс или -ОН;
R2' выбран из С1-12 алкилена, фенилена, бифенилена, трифенилена, циклогексилена, циклопентана, -RaSSRa-, -(RaO)uRa-, -(CH2)(RaO)3Ra-, -RaN(CH3)2Ra- и -RaNHRa-;
Ra представляет собой С1-6 алкилен; Rb представляет собой Н, С1-6 алкил или C1-6 алкокси; Rc и Rd независимо выбраны из Н, C1-6 алкила и фенила, или Rc и Rd вместе с N, с которым они связаны, образуют азотсодержащий гетероцикл или азотсодержащее гетероарильное кольцо;
R3' выбран из -Н, фенилкарбонила и С1-6 алкилоксикарбонила;
u представляет собой целое число от 0 до 4.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-5а) или формулы (I-5b) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 5:
В одном варианте реализации настоящего изобретения, производные бензизоселеназола формулы (I) представляют собой соединения следующей формулы (I-6):
где каждый из R и р соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I);
R' выбран из водорода, C1-6 алкила, С3-7 циклоалкила, C1-6 алкил-ОН, Re-NH-Rf, 
и остатка сахарида;
каждый из R5 и R6 независимо выбран из водорода, галогена, циано, С1-6 алкила, C1-6 алкокси, С1-6 алкилтио, N(С1-6 алкил)2, NH(С1-6 алкил), COORb и SO3Rb;
Rb выбран из водорода, С1-6 алкила и С1-6 алкокси;
каждый из Rc и Rd независимо выбран из водорода, C1-6 алкила и фенила, или Rc и Rd вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют азотсодержащий гетероцикл или азотсодержащее гетероарильное кольцо;
каждый из Re и Rf независимо выбран из C1-6 алкила и С3-7 циклоалкила.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, остаток сахарида может представлять собой D-глюкопиранозильную группу, такую как 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-дезокси-D-глюкопиранозил.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (I-6) выбраны из соединений, приведенных ниже в таблице 6:
В соответствии с настоящим изобретением также предложено применение производных бензизоселеназола следующей формулы (II) для получения лекарственных средств против коронавируса:
где каждый из R, р и L соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I);
каждый из R1 и R2 независимо выбран из С1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио и 
где атом S связан с атомом Se одинарной связью.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, оба R1 и R2 представляют собой 
, где атом S связан с атомом Se одинарной связью.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (II) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 7:
В соответствии с настоящим изобретением также предложено применение производных бензизоселеназола следующей формулы (III) для получения лекарственных средств против коронавируса:
где каждый из R, р и L соответствует определениям, приведенным выше для соединений формулы (I);
R2 выбран из C1-6 алкила, C1-6 алкокси, C1-6 алкилтио и 
, где атом S связан с атомом Se одинарной связью.
В соответствии с настоящим изобретением, производные бензизоселеназола формулы (III) представляют собой соединения, приведенные ниже в Таблице 8:
В соответствии с настоящим изобретением, коронавирусы включают HCoV-229E, HCoV-ОС43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV и 2019-nCoV, особенно 2019-nCoV.
В соответствии с настоящим изобретением также предложено применение производных бензизоселеназола формулы (I), описанных выше, для получения лекарственных средств для лечения заболеваний, вызванных коронавирусами.
В соответствии с настоящим изобретением, коронавирусы включают HCoV-229E, HCoV-ОС43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV и 2019-nCoV, особенно 2019-nCoV.
В соответствии с настоящим изобретением, заболевания, вызванные коронавирусами, включают заболевания дыхательных путей, такие как заболевания верхних дыхательных путей и/или заболевания нижних дыхательных путей, такие как острая или хроническая инфекция верхних или нижних дыхательных путей.
В соответствии с настоящим изобретением, заболевания, вызванные коронавирусами, включают тяжелый острый респираторный синдром, ближневосточный респираторный синдром и коронавирусное заболевание 2019 (COVID-19).
В соответствии с настоящим изобретением, заболевания, вызванные коронавирусами, включают интерстициальное заболевание легких (ИЗЛ).
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны восстанавливать функцию легких и лечить поражения легких.
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны ингибировать отек селезенки.
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны лечить или облегчать воспаление легких, например, способны уменьшать количество CD8+ Т-клеток, CD4+ Т-клеток и В-клеток.
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны ингибировать/частично снимать симптомы фиброза легких, осложненного интерстициальной пневмонией. В одном аспекте, указанные лекарственные средства способны улучшать у пациента кислотность и щелочность крови, парциальное давление кислорода, избыток (эксцесс) оснований в интерстициальной жидкости, фактическое содержание бикарбоната, общее содержание диоксида углерода, насыщение кислородом и/или уровень лактата. Для наглядности, 1,4-[бис(1,2-бензизоселеназол-3(2H)-он)]бутан вызывает существенные улучшения функции легочной вентиляции и состояния кислотно-основного равновесия у пациента при введении в дозах, составляющих 90 мг/кг и 180 мг/кг массы тела субъекта. В другом дополнительном аспекте, указанные лекарственные средства дополнительно способны снижать уровни NF-κВ, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-1β и/или TGF-β и улучшать уровень IFN-γ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа субъекта. В другом дополнительном аспекте, указанные лекарственные средства способны уменьшать структурные изменения в тканях легкого и инфильтрацию воспалительных клеток и улучшать состояние фиброза легких на ранней стадии фиброза легких и/или на стадии формирования фиброза легких.
В соответствии с одним вариантом реализации настоящего изобретения, указанные лекарственные средства особенно подходят для предотвращения/лечения интерстициальной пневмонии. В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства применяют для предотвращения/лечения фиброзной интерстициальной пневмонии; они способны контролировать развитие и прогрессировать фиброза легких. В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны контролировать развитие и прогрессирование связанной с фиброзом легких интерстициальной пневмонии.
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны ингибировать накопление внеклеточного матрикса (ВКМ). Для наглядности, 1,4-[бис(1,2-бензизоселеназол-3(2H)-он)] бутан способен ингибировать накопление ВКМ при введении в дозе, составляющей 180 мг/кг массы тела субъекта.
В некоторых вариантах реализации указанные лекарственные средства способны уменьшать накопление бронхиальных подслизистых и легочных интерстициальных коллагеновых волокон.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением также предложен способ лечения коронавирусных инфекций у млекопитающего, который включает введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества производного бензизоселеназола формулы (I), описанного выше.
Преимущества настоящего изобретения
Производные бензизоселеназола в соответствии с настоящим изобретением способны эффективно ингибировать активность протеолитического фермента 3CLpro 2019-nCoV и последующую активацию РНК-полимеразы 2019-nCoV и репликацию вируса, так что вирусы в конечном итоге ликвидируются. Следовательно, они эффективны против коронавируса и вызванных им заболеваний.
Определения и описание
Если не указано иное, определения групп и терминов, описанных в описании и формуле изобретения настоящей заявки, включая их определения как примеров, примеры определений, предпочтительные определения, определения, задокументированные в таблицах, определения конкретных соединений в примерах, и тому подобные определения, могут быть произвольно скомбинированы и включены друг в друга. Определения групп и структур указанных соединений в таких комбинациях и включениях должны входить в объем настоящего описания.
Термин «алкил» относится к линейной или разветвленной насыщенной моновалентной углеводородной группе, содержащей определенное количество атомов углерода. Например, «С1-12 алкил» относится к линейным и разветвленным алкильным группам, содержащим 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода. Алкил, например, представляет собой метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, изопропил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил, 2-метилбутил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, 1,2-диметилпропил, неопентил, 1,1-диметилпропил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 2-этилбутил, 1-этилбутил, 3,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,1-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 1,2-диметилбутил и т.д., или их изомеры.
Термин «алкокси» относится к -О-алкилу, причем алкил соответствует определению, описанному выше.
Термин «алкилтио» относится к -S-алкилу, причем алкил соответствует определению, описанному выше.
Термин «циклоалкил» относится к насыщенному моновалентному моноциклическому или бициклическому углеводородному кольцу, содержащему указанное количество атомов углерода. Термин «С3-12 циклоалкил» относится к насыщенному моновалентному моноциклическому или бициклическому углеводородному кольцу, содержащему 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 атомов углерода. Указанный С3-12 циклоалкил может представлять собой моноциклическую углеводородную группу, такую как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклононил или циклодецил, или бициклическую углеводородную группу, такую как декалиновое кольцо.
Термин «алкилен» относится к двухвалентной алкильной группе, содержащей определенное количество атомов углерода; например, С1-12 алкилен относится к двухвалентной С1-12 алкильной группе.
Термин «алкенил» относится к линейной или разветвленной моновалентной углеводородной группе, содержащей определенное количество атомов углерода и одну или более этиленовых связей, например, С2-12 алкенил, предпочтительно С2-6 алкенил; например, «С2-6 алкенил» означает содержащий 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода (т.е. С2-6 алкенил), или, содержащий 2 или 3 атома углерода (т.е. С2-3 алкенил). Должно быть очевидно, что в указанном случае, если алкенил содержит более чем одну двойную связь, двойные связи могут быть отделены друг от друга или сопряжены. Алкенил, например, представляет собой винил, аллил, (E)-2-метилвинил, (Z)-2-метилвинил, (E)-бут-2-енил, (Z)-бут-2-енил, (E)-бут-1-енил, (Z)-бут-1-енил, пент-4-енил, (Е)-пент-3-енил, (Z)-пент-3-енил, (E)-пент-2-енил, (Z)-пент-2-енил, (E)-пент-1-енил, (Z)-пент-1-енил, гекс-5-енил, (E)-гекс-4-енил, (Z)-гекс-4-енил, (E)-гекс-3-енил, (Z)-гекс-3-енил, (Е)-гекс-2-енил, (Z)-гекс-2-енил, (E)-гекс-1-енил, (Z)-гекс-1-енил, изопропенил, 2-метилпроп-2-енил, 1-метилпроп-2-енил, 2-метилпроп-1-енил, (E)-1-метилпроп-1-енил, (Z)-1-метилпроп-1-енил, 3-метилбут-3-енил, 2-метилбут-3-енил, 1-метилбут-3-енил, 3-метилбут-2-енил, (E)-2-метилбут-2-енил, (Z)-2-метилбут-2-енил, (Е)-1-метилбут-2-енил, (Z)-1-метилбут-2-енил, (E)-3-метилбут-1-енил, (Z)-3-метилбут-1-енил, (Е)-2-метилбут-1-енил, (Z)-2-метилбут-1-енил, (E)-1-метилбут-1-енил, (Z)-1-метилбут-1-енил, 1,1-диметилпроп-2-енил, 1-этилпроп-1-енил, 1-пропилвинил или 1-изопропилвинил.
Термин «гетероциклил» относится к насыщенному моновалентному моноциклическому или бициклическому углеводородному кольцу, содержащему определенное количество атомов кольца, например, от 3 до 14 атомов кольца, которое содержит от 1 до 5 гетероатомов, независимо выбранных из N, О и S, и предпочтительно представляет собой «3- - 10-членный гетероциклил». Термин «3- - 10-членный гетероциклил» относится к насыщенному моновалентному моноциклическому или бициклическому углеводородному кольцу, содержащему 1-5, предпочтительно 1-3 гетероатома, выбранных из N, О и S. Указанный гетероциклил может быть соединен с остальной частью молекулы через любой из атома углерода или атома азота (если он присутствует). В частности, указанный гетероциклил может включать, но не ограничен перечисленными: 4-членные кольца, такие как азетидинил и оксетанил; 5-членные кольца, такие как тетрагидрофуранил, диоксолил, пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил и пирролинил; 6-членные кольца, такие как тетрагидропиранил, пиперидил, морфолинил, дитианил, тиоморфолинил, пиперазинил или тритианил; или 7-членные кольца, такие как диазепанил. Необязательно, указанный гетероциклил может быть бензоконденсирован. Гетероциклил может быть бициклическим, например, но не ограничиваясь перечисленными, 5,5-членным кольцом, таким как гексагидроциклопента[с]пиррол-2(1H)-ильное кольцо, или 5,6-членным бициклическим кольцом, таким как гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1H)-ильное кольцо. Кольцо, содержащее атомы азота, может быть частично ненасыщенным, т.е., оно может содержать одну или более двойных связей, например, но не ограничиваясь перечисленными, 2,5-дигидро-1H-пирролил, 4H-[1,3,4]тиадиазинил, 4,5-дигидрооксазолил или 4H-[1,4]тиазинил, или оно может быть бензоконденсированным, например, но не ограничиваясь перечисленными, может представлять собой дигидроизохинолил. В соответствии с настоящим изобретением, указанный гетероциклил неароматический.
Термин «арил» относится к моновалентному ароматическому или частично ароматическому моноциклическому, бициклическому или трициклическому углеводородному кольцу, содержащему указанное количество атомов углерода, например, от 6 до 20 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 14 атомов углерода, и предпочтительно к «С6-14 арилу». Термин «С6-10 арил» предпочтительно относится к моновалентному ароматическому или частично ароматическому моноциклическому, бициклическому или трициклическому углеводородному кольцу, содержащему 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомов углерода («С6-14 арил»), в частности, к кольцу, содержащему 6 атомов углерода («С6 арил»), такому как фенил или бифенил, к кольцу, содержащему 9 атомов углерода («С9 арил»), такому как инданил или инденил, к кольцу, содержащему 10 атомов углерода («С10 арил»), такому как тетрагидронафтил, дигидронафтил или нафтил, к кольцу, содержащему 13 атомов углерода («С11 арил»), такому как флуоренил, или к кольцу, содержащему 14 атомов углерода («C14 арил»), такому как антрил. Когда указанный С6-14 арил содержит заместители, он может быть однозамещенным или полизамещенным. Кроме того, место замены не ограничено, и замена может представлять собой, например, орто-замену, пара-замену или мета-замену.
Термин «гетероарил» относится к моновалентной моноциклической, бициклической или трициклической группе ароматического кольца, содержащей указанное количество атомов кольца, например, от 3 до 20 атомов кольца, и содержащей от 1 до 5 гетероатомов, независимо выбранных из N, О, S, Se, Те, и так далее, например, «5-14-членный гетероарил». Термин «5-14-членный гетероарил» относится к моновалентной моноциклической, бициклической или трициклической группе ароматического кольца, содержащей 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомов кольца, в частности, 5, или 6, или 9, или 10 атомов углерода, и, содержащей от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 3, гетероатомов, независимо выбранных из N, О и S, и может быть бензоконденсирован в каждом случае. В частности, гетероарил выбран из тиенила, фуранила, пирролила, оксазолила, тиазолила, имидазолила, пиразолила, изоксазолила, изотиазолила, оксадиазолила, триазолила, тиадиазолила и тому подобных, и их бензо-производных, таких как бензофуранил, бензотиенил, бензоксазолил, бензоизоксазолил, бензимидазолил, бензотриазолил, индазолил, индолил, изоиндолил, бензизоселеназолил и тому подобные производные; или пиридинила, пиридазинила, пиримидинила, пиразинила, триазинила и тому подобных и их бензо-производных, таких как хинолил, хиназолинил, изохинолил и тому подобные производные; или азосинила, индолизинила, пуринила и тому подобных и их бензо-производных; или циннолинила, фталазинила, хиназолинила, хиноксалинила, нафтиридинила, птеридинила, карбазолила, акридинила, феназинила, фенотиазинила, феноксазинила и тому подобных.
Термин «оксо» означает, что атом углерода, атом азота или атом серы в заместителе содержит в качестве заместителя оксигруппу, образовавшуюся после окисления (=O).
Термин «тио» относится к группе C=S, образовавшейся путем замены атома кислорода в карбон иле на атом серы.
Фармацевтически приемлемые соли производных бензизоселеназола в соответствии с настоящим изобретением включают: соли присоединения кислоты, образованные из указанных соединений и неорганических или органических кислот; указанные неорганические кислоты выбраны из по меньшей мере одной из соляной кислоты, фтористоводородной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодисто водород ной кислоты, перхлорной кислоты, серной кислоты, пиросерной кислоты, фосфорной кислоты и азотной кислоты; органические кислоты выбраны из по меньшей мере одной из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, ацетоуксусной кислоты, пировиноградной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, капроновой кислоты, энантовой кислоты, ундекановой кислоты, лауриновой кислоты, бензойной кислоты, салициловой кислоты, 2-(4-гидроксибензоил)бензойной кислоты, камфорной кислоты, коричной кислоты, циклопентанпропионовой кислоты, диглюконовой кислоты, 3-гидрокси-2-нафтойной кислоты, никотиновой кислоты, памовой кислоты, пектиновой кислоты, персерной кислоты, 3-фенилпропионовой кислоты, пикриновой кислоты, пивалиновой кислоты, 2-гидроксиэтансульфоновой кислоты, итаконовой кислоты, сульфаминовой кислоты, трифторметансульфоновой кислоты, додецилсерной кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты, 2-нафталинсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, камфорсульфоновой кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, стеариновой кислоты, молочной кислоты, щавелевой кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты, адипиновой кислоты, альгиновой кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, D-глюконовой кислоты, миндальной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюкогептоновой кислоты, глицерофосфорной кислоты, аспарагиновой кислоты, сульфосалициловой кислоты, гемисерной кислоты и тиоциановой кислоты;
в качестве альтернативы, фармацевтически приемлемые соли производных бензизоселеназола в соответствии с настоящим изобретением представляют собой соли щелочных металлов, соли щелочноземельныйх металлов или соли аммония указанных соединений, или соли, образованные из указанных соединений и органических оснований, которые дают физиологически приемлемые катионы, например, соли, образованные из указанных соединений и по меньшей мере одного из следующих веществ: ион натрия, ион калия, ион кальция, ион магния, морфолин, пиперидин, триэтиламин, трипр опил амин, трибутиламин, диизопропиламин, диизопропилэтилендиамин, пиридин, диметиламин, диэтиламин, н-метилглюкамин, диметилглюкамин, этилглюкамин, лизин, дициклогексиламин, 1,6-гександиамин, этаноламин, глюкозамин, меглумин, саркозин, серинол, тригидроксиметиламинометан, аминопропандиол и 1-амино-2,3,4-бутантриол.
Соединения, описанные в данной заявке, могут находиться в форме сольвата (например, гидрата), и соединения, описанные в данной заявке, содержат полярный растворитель в качестве структурного элемента кристаллической решетки указанного соединения, в частности, например, воду, метанол или этанол. Количество полярного растворителя, в частности, воды, может присутствовать в стехиометрическом или нестехиометрическом отношении.
В соответствии с молекулярной структурой, соединения, описанные в данной заявке, могут быть хиральными и, следовательно, могут существовать в различных энантиомерных формах. Эти соединения, следовательно, могут существовать в рацемической или оптически активной форме. Соединения, описанные в данной заявке, или их интермедиаты могут быть разделены на энантиомеры с помощью химических или физических способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, или могут использоваться в этой форме для синтеза. Соответствующие стабильные изомеры можно разделить в соответствии с известными способами, такими как экстракция, фильтрация или колоночная хроматография.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На ФИГ. 1 представлена схематическая диаграмма создания модели на животных в течение 24 часов и введения.
На ФИГ. 2 представлена схематическая диаграмма создания модели на животных в течение 7 дней и введения.
На ФИГ. 3 показаны изменения массы тела мышей при создании модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 4 показаны изменения массы тела мышей при создании модели на животных в течение 7 дней.
На ФИГ. 5 представлены коэффициенты легкого и селезенки мышей в группах с созданием модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 6 представлены коэффициенты легкого и селезенки мышей в группах с созданием модели на животных в течение 7 дней.
На ФИГ. 7 показаны сравнения результатов определения газов крови у мышей после завершения введения в группах с созданием модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 8 показаны сравнения результатов определения газов крови у мышей после завершения введения в группах с созданием модели на животных в течение 7 дней.
На ФИГ. 9 показаны сравнения количеств воспалительных клеток в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа в группах с созданием модели на животных в течение 7 дней.
На ФИГ. 10 показаны сравнения цитокинов в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа.
На ФИГ. 11 показано содержание гидроксипролина в легких мышей на 35 день введения после создания модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 12 показаны баллы фиброза легких у мышей в группах с созданием модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 13 показаны результаты окрашивания гематоксилин-эозином (ГЭ) тканей легкого мышей в группах с созданием модели на животных в течение 24 часов.
На ФИГ. 14 показаны баллы фиброза легких у мышей в группах с созданием модели на животных в течение 7 дней.
На ФИГ. 15 показаны результаты окрашивания ГЭ тканей легкого мышей в группах с созданием модели на животных в течение 7 дней.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Применение настоящего изобретения будет проиллюстрировано более подробно в следующем описании конкретных вариантов реализации. Должно быть очевидно, что следующие варианты реализации представляют собой лишь типичные примеры и объяснение настоящего изобретения, и не должны истолковываться как ограничивающие объем защиты настоящего изобретения. Все методики, осуществленные на основании содержания настоящего описания, представленного выше, входят в объем защиты настоящего изобретения.
Если не указано иное, все исходные материалы и реагенты, используемые в следующих примерах, представляют собой доступные для приобретения продукты или могут быть получены с применением известных способов.
Производные бензизоселеназола в соответствии с настоящим изобретением можно получить, применяя способы, известные в данной области техники, или способы, описанные в литературе. Например, можно сослаться на способы получения, описанные в следующих документах: способы получения, описанные в CN 106977472 A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1 - 34; способы получения, описанные в CN106146371 А, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-5; способы получения, описанные в CN104119329A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-68; способы получения, описанные в CN102898402A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-96; способы получения, описанные в CN102234254A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-13; способы получения, описанные в CN 101921303 A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-6; способы получения, описанные в CN101786976A, в частности, способ получения, описанный в Примере 1; способы получения, описанные в CN100497324C, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-9; способы получения, описанные в CN1990475A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-17; способы получения, описанные в CN1704409A, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-9; способы получения, описанные в CN1280279C, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-12; способы получения, описанные в CN1242999C, в частности, способы получения, описанные в Примерах 1-4; способы получения, описанные в CN202010287745,6, в частности, способы получения в Примерах 1-8. Содержания указанных документов полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
Биологический Пример 1
2019-nCoV представляет собой РНК-виру с. Его пролиферация зависит от воспроизведения материнской РНК посредством РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). Белок 3CLpro 2019-nCoV является ключевым белком для того, чтобы ключевой белок RdRp 2019-nCoV был в активированной форме. Белок 3CLpro 2019-nCoV гидролизует белки вируса pp1a и pp1ab с образованием зрелого продукта nsp1-16, который далее собирается в активный RdRp.На данный момент, 3CLpro 2019-nCoV рассматривают как одну из мишеней для лекарственных средств для борьбы с коронавирусами. На основании основного свойства, состоящего в том, что белок 3CLpro 2019-nCoV представляет собой протеолитический фермент, создали систему скрининга для определения активности белка 3CLpro 2019-nCoV, применяя флуоресцентный метод. Белок 3CLpro 2019-nCoV может специфически расщеплять субстраты, в которых Gln (Q) находится в положении Р1. При определении его активности, флуоресцентный полипептид можно применять в качестве субстрата. Можно детектировать возникновение флуоресцентных сигналов, которые отражают активность протеолитического фермента
По полученным выше результатам можно увидеть, что производные бензизоселеназола в соответствии с настоящим изобретением могут эффективно ингибировать активность протеазы 3CLpro 2019-nCoV, последующую активность РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) и, тем самым, репликацию вируса. Следовательно, они эффективны против коронавируса и вызванных им заболеваний.
Биологический Пример 2
Цель
В анализе клеток in vitro определяли цитотоксичность тестируемых образцов в соответствии с ростом обработанных лекарственным средством клеток Vero Е6. Ингибиторное действие тестируемых образцов на репликацию вируса определяли по наблюдению цитопатических действий (СРЕ), осуществляемых обработанными лекарственным средством клетками Vero Е6 с вирусными инфекциями. Во время наблюдения обнаружили, что ингибиторные действия указанных лекарственных средств на вирус SARS-CoV-2 можно было наблюдать, когда указанные лекарственные средства находились в низких концентрациях, составляющих 1 - 2,5 мкМ, и что нельзя было осуществить приемлемые оценки в случаях более высоких концентраций вследствие токсичного фона указанных лекарственных средств для СРЕ, что позволяет предположить, что указанные лекарственные средства в этих концентрациях проявляют ингибиторные действия на вирус SARS-CoV-2. Материалы и методы:
1. Источник материала: штамм вируса 2019-nCoV был выделен и получен из Центра профилактики и контроля, Институт вирусологии Ухань. Указанный штамм вируса пассировали дважды в клетках Vero Е6, и штамм вируса собирали через 6 дней после его инокуляции. Вирус сохраняли при -80°С, и выделение вируса, анализ TCID50 и остальное осуществляли в лаборатории 3 уровня биологической безопасности (BSL-3).
2. Реагенты и устройства.
Клетки VeroE6 (АТСС® CRL1586™), культуральная среда - минимальная эссенциальная среда (MEM) (Gibco, номер в каталоге 41500-034) и фетальная бычья сыворотка (PANSera ES, номер в каталоге 2602-Р130707); устройства и приспособление включали термостат с диоксидом углерода, устройство для подсчета клеток и инвертированный микроскоп.
3. Способы
Анализ средней дозы, инфицирующей 50% культуры ткани (TCID50): осуществляли один цикл замораживания/размораживания культуры вируса на 6 день после инокуляции (все клетки были поражены вирусом) и центрифугировали ее, супернатант собирали и криоконсервировали в виде аликвот. Осуществляли полулогарифмическое разведение одной пробирки указанного раствора криоконсервированного вируса от 10-2 до 10-7. 96-луночный планшет с растущим в нем монослоем адгерентных клеток Vero-Е6 дважды промывали поддерживающей средой (MEM, содержащей 2% фетальную бычью сыворотку) и добавляли 100 мкл разбавленного раствора вируса, 4 повторные лунки на разведение. Поддерживающую среду использовали в качестве отрицательного контроля. Планшет инкубировали при 36°С в термостате с 5% СО2 в течение 90 мин, во время которых указанный планшет встряхивали раз в 30 мин. После инкубации раствор вируса отбирали пипеткой. После однократной промывки клеток поддерживающей средой, в каждую лунку добавляли 200 мкл поддерживающей среды. Планшет инкубировали при 36°С в термостате с 5% СО2, и наблюдали за патологическими изменениями в клетках. Эксперимент завершился через 6 дней после инокуляции. Значение TCID50 рассчитывали, применяя метод Рида-Менча, и подсчитывали клетки.
4. Пролиферация вируса и анализ титра
Исходный раствор вируса разбавляли до 5 TCID50/100 мкл, и 7,8 мл указанного раствора вируса (пересчитали в соответствии с площадью дна культурального сосуда и количеством 100 мкл/лунку в анализе TCID50) инокулировали культуральный флакон Т25 (площадь основания составляла 25 см2, плотность адгерентных клеток составляла 95% - 100%, количество клеток составляло приблизительно 2,42 × 106/флакон, множественность заражения (MOI) составляла приблизительно 1,74 × 10-4 TCID50/клетку). Флакон инкубировали в термостате при 36°С, 5% СО2, в течение 90 мин, во время которых флакон с клетками встряхивали раз в 30 мин. После инкубации раствор вируса отбирали пипеткой, и однократно промывали клетки поддерживающей средой. Во флакон с клетками добавляли 10 мл поддерживающей среды, и флакон инкубировали в термостате при 36°С, 5% СО2. С начала инкубации по 6 день, когда завершали эксперимент, наблюдали за патологическими изменениями в клетках раз в 24 ч, в это время собирали 0,55 мл продукта пролиферации, используя пипетку, и центрифугировали, и супернатант криоконсервировали при -80°С для дальнейшего использования. Осуществляли полулогарифмическое разведение супернатанта, который собирали каждый день, с исходной концентрации до 10-5 и инокулировали им 96-луночный культуральный планшет, 3 лунки на разведение. За патологическими изменениями в клетках наблюдали каждый день. Рассчитывали значение TCID50 и подсчитывали клетки.
5. Лекарственная форма (суспензии соединений в соответствии с настоящим изобретением в растворе 5% натрий-карбоксиметилцеллюлозы (CMC-Na))
Примеры соединений в соответствии с настоящим изобретением имеют следующую структуру (сокращенно BS):
Результаты представлены в таблице А:
Биологический Пример 3
1. Модель на животных интерстициального заболевания легких.
Блеомицин представляет собой химиотерапевтическое средство для применения для лечения различных опухолей, таких как лимфома, рак яичка, рак яичников и злокачественный плевральный выпот. Наиболее серьезным нежелательным действием блеомицина является токсичность для легких, которая сначала манифестируется как отек эндотелиальных клеток и интерстициальных капилляров, некроз альвеолярных эпителиальных клеток II типа и высвобождение воспалительных медиаторов. Затем фибробласты пролиферируют и превращаются в миофибробласты. На данный момент, блеомицин является наиболее важным и широко применяемым индуктором фиброза легких в моделях на животных. Процесс создания модели включает проявление основных элементов характерных для интерстициального заболевания легких процессов, таких как воспаление, воспаление, сопровождаемое развитием и прогрессированием фиброза, формирование необратимого фиброза и тому подобных элементов.
В данном эксперименте, смоделированный патологический процесс, достигнутый введением мышам, проявился воспалением (через 24 ч после введения), фиброзом и так далее, и преимущественно проявился фиброзом на более поздней стадии в указанной модели. В частности, воспаление и апоптоз эпителиальных клеток происходил приблизительно на 10 день и фиброз легких - на 14 день; патологическое изменение фиброза легких было наиболее выражено на 21-28 день. Степень и распространение вызванного блеомицином фиброза легких зависят от дозы. Разовая доза блеомицина приведет к относительно временным изменениям, тогда как повторные дозы приведут к длительным патологическим изменениям. Это больше сходно с полностью необратимой стадией фиброза легких (включая идиопатический фиброз легких (ИФЛ)) у людей.
Dex (дексаметазон) выбрали в качестве положительного контроля в данном исследовании, чтобы исследовать действие соединений в соответствии с настоящим изобретением (например, активных лекарственных средств, перечисленных в таблице 9) на контроль развития и прогрессирования фиброза на ранней стадии воспаления в модели вызванного блеомицином заболевания легких у мышей.
Примеры соединений в соответствии с настоящим изобретением имеют следующую структуру (сокращенно BS)):
Значения сокращений:
Модель означает модельную группу, Dex означает дексаметазон, BSL означает группу, которой вводили низкую дозу BS, BSM означает группу, которой вводили среднюю дозу BS, и BSH означает группу, которой вводили высокую дозу BS.
2. Информация о тестируемом образце и контроле
2.1. Тестируемый образец
Название: BS
2.2. Контроль
Название: дексаметазон (Dex), партия №D107196 (CAS: 2392-39-4).
Количество и чистота: 250 мг, 98%; вид и физико-химические свойства: белый порошок.
Производитель: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
2.3. Лекарственное средство для индукции
Название: блеомицин; партия №В1010423 (CAS: 9041-93-4).
Количество и чистота: 25 мг, 1,5-2,0 ед./мг.
Вид и физико-химические свойства: белый порошок.
Производитель: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
3. Дизайн эксперимента
3.1. Скрининг животных и их распределение по группам
Животных модели, созданной в течение 24 часов, произвольно делили на 5 групп в соответствии с таблицей ниже: 3 животных в контрольной группе и 5 животных в тестируемой группе.
Животных модели, созданной в течение 7 дней, произвольно делили на 7 групп в соответствии с таблицей ниже: 6 животных в контрольной группе и 12 животных в тестируемой группе.
3.2. Путь и частота введения
Введение лекарственного средства начали через 24 ч или 7 д после начала создания модели. BS вводили ежедневно путем разового введения через желудочный зонд, и Dex вводили раз в два дня путем разовой интраперитонеальной инъекции. День первого введения посчитали 1 днем (Д1), следующий день - Д2, и т.д. Нормальным группам и модельным группам вводили 200 мкл нормального солевого раствора ежедневно путем введения через желудочный зонд.
3.3. Выбор дозы
Схема введения BS представляла собой 1 дозу/день. BS не оказывал токсичных и побочных действий при введении через желудочный зонд при суммарной дозе в пределах из 36, 90 и 180 мг/кг. Соответственно, в данном эксперименте выбрали указанные выше дозировки в качестве дозировок для введения.
4. Детектируемые показатели
4.1. Масса тела
У всех животных раз в день в ходе эксперимента отслеживали смерть или предсмертное состояние, экскременты, прием пищи, психическое состояние и поведение и активность. Отклонения от нормы регистрировали своевременно. Всех животных взвешивали один раз перед распределением по группам и один раз перед каждой дозой.
4.2. Коэффициенты органов. Регистрируемые животные: все животные
Период регистрирования: после естественной смерти мышей.
Способ: после умерщвления, животных препарировали и взвешивали сердце, печень, селезенку, легкое и почку.
Детектируемые показатели: коэффициенты органов.
4.3. Определение газов крови
1. После анестезии мышь фиксировали на пластине в положении лежа на спине.
2. После дезинфицирования кожи спиртом, осуществляли срединный разрез приблизительно на 1,5 см сверху вниз в коже шеи. Соединительную ткань между грудиноподъязычной мышцей и грудинощитовидной мышцей разделяли вдоль передней границы грудинно-сосцевидной мышцы с помощью хирургического пинцета. Пульсирующую общую сонную артерию можно было видеть в глубине с правой стороны от трахеи. Отделяли общую сонную артерию длиной приблизительно 1,5 см. Дисталыгый конец лигировали шелковой нитью, а проксимальный конец зажимали с помощью зажима для артерии и перевязывали шелковой нитью для дальнейшего использования. Пластину с мышью помещали под препаровальный микроскоп и аккуратно делали надрез в форме буквы V по направлению к центру в месте рядом с дистальным концом артерии с помощью ножниц для микроскопии. Микрокатетер РЕ вставляли в артерию и фиксировали путем завязывания узла шелковой нитью. Зажим для артерии снимали, и собирали 0,1-0,2 мл крови с помощью шприца емкостью 1 мл. Проксимальный конец зажимали с помощью зажима для артерии и удаляли шприц. Кровь незамедлительно анализировали на микроанализаторе газов крови AbboTTi-STAT.
4.4. Анализ воспалительных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа
После фиксации мыши, обнажали ее трахею и грудную полость, и трахею и пищевод напрямую разделяли с помощью офтальмологического изогнутого пинцета. Накладывали два шва между трахеей и пищеводом. Вставляли в трахею внутривенный трокар и лигировали в месте его вставки в трахею и по его дистальному концу. Подсоединяли шприц емкостью 1 мл, чтобы набрать 1 мл предварительно охлажденного ФБР и ввести его путем инфузии в ткань легкого. Значительное заполнение легкого было видно невооруженным глазом. Шприц держали в течение 10 с и осуществляли отсасывание. Цикл инфузии/отсасывания повторяли трижды. Собранную путем отсасывания БАЛЖ переносили в чистую пробирку ЕР и центрифугировали при 4°С, и супернатант собирали и сохраняли при -80°С. Проводили обычные тесты с клетками.
4.5. Анализ воспалительных факторов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа
После фиксации мыши, обнажали ее трахею и грудную полость, и трахею и пищевод напрямую разделяли с помощью офтальмологического изогнутого пинцета. Накладывали два шва между трахеей и пищеводом. Вставляли в трахею внутривенный трокар и лигировали в месте его вставки в трахею и по его дистальному концу. Подсоединяли шприц емкостью 1 мл, чтобы набрать 1 мл предварительно охлажденного ФБР и ввести его путем инфузии в ткань легкого. Значительное заполнение легкого было видно невооруженным глазом. Инфузию останавливали на 10 с и осуществляли отсасывание. Цикл инфузии/отсасывания повторяли трижды. Собранную путем отсасывания БАЛЖ переносили в чистую пробирку ЕР и центрифугировали при 4°С, и супернатант собирали и сохраняли при -80°С. Проводили анализ воспалительных факторов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа с помощью ELISA.
4.6. Анализ содержания гидроксипролина в тканях легкого
(I) Выделение общего белка из тканей печени
1. Криоконсервированные ткани печени вынимали из жидкого азота. Образец массой 100 мг отсекали от каждого образца ткани печени и помещали в пробирку для центрифуги емкостью 5 мл без ДНКазы и РНКазы. Добавляли 2 мл предварительно охлажденного физиологического раствора. Ткани иссекали на так много кусочков, насколько возможно, и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 2 мин, и супернатант отбрасывали.
2. К преципитату добавляли 1 мл лизирующего буфера RIPA (смешанный коктейль ингибиторов протеаз добавляли в соотношении 1:100 перед применением, и полученную в результате этого смесь хранили на льду). Получали гомогенат ткани на льду с помощью электрического гомогенизатора (6000 об/мин, 30 с × 3), лизировали на льду в течение 30 мин и центрифугировали при 4°С на 16000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант - выделенный общий белок - переносили в новую пробирку ЕР и сохраняли при -20°С для дальнейшего использования.
(II) Анализ концентрации белка с помощью бицинхониновой кислоты (ВСА)
1. В 96-луночный планшет добавляли 20 мкл каждого из стандартных растворов белка БСА 0, 125, 250, 500, 1000 и 2000 мкг/мл. В лунки для образца добавляли 2 мкл образца, а затем добавляли 18 мкл ФБР до суммарного объема 20 мкл.
2. Готовили свежий подходящий рабочий раствор ВСА в соответствии с количеством стандартного вещества и образцов. После тщательного смешивания полученный раствор добавляли в количестве 200 мкл/лунку. Планшет инкубировали при 37°С в течение 30 мин, и измеряли поглощение на 570 нм на спектрофотометре для прочтения микропланшетов. Концентрацию образца белка рассчитывали по стандартной кривой.
(III) Анализ уровня гидроксипролина (HYP)
1. Нужный планшет вынимали из пакета из алюминиевой фольги, который уравновешивали при комнатной температуре в течение 20 мин. Определяли лунки со стандартным веществом и лунки с образцами. В лунки со стандартным веществом добавляли 50 мкл стандартных растворов с различными концентрациями. В лунки с образцом добавляли по 10 мкл тестируемого образца, с последующим разведением образца объемом 40 мкл. В холостую лунку ничего не добавляли.
2. В каждую лунку, за исключением холостой лунки, добавляли 100 мкл меченого пероксидазой хрена (HRP) тестируемого антитела. Лунки с реакционной смесью запечатывали с помощью герметизирующей пленки для планшета. Планшет инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 ч.
3. Жидкость отбрасывали и планшет сушили постукиванием. Каждую лунку наполняли буфером для промывки, и планшет оставляли стоять на 1 мин. Жидкость отбрасывали и планшет сушили постукиванием. Промывку повторяли 5 раз.
4. В каждую лунку добавляли 50 мкл каждого из субстратов А и В. Планшет инкубировали в термостате при 37°С в течение 15-30 мин, с защитой от света.
5. В каждую лунку добавляли 50 мкл останавливающего реакцию раствора и незамедлительно измеряли поглощение на длине волны 450 нм.
4.7. Патологический анализ легкого с помощью ГЭ
1. Заключение в парафин и изготовление срезов
1) Ткань легкого фотографировали, а затем фиксировали в 10% формальдегиде в течение 48 ч.
2) Ткань легкого полностью обезвоживали на 105%, 80%, 90%, 95% и 100%.
3) Осуществляли осветление ткани легкого в ксилоле I в течение 20 мин и в ксилоле II в течение 60 мин.
4) Ткань легкого погружали в легкоплавкий воск на 1 ч, в легкоплавкий воск на 2 ч и в твердый воск на 2 ч.
5) Пропитанный воском блок ткани заключали в парафин. В частности, сначала подготавливали кассету, а затем ткань укладывали горизонтально на дно кассеты; после расположения поверхностью среза вниз, кассету закрывали крышкой; в кассету заливали расплавленный воск до тех пор, пока он не переполнил кассету, а затем кассету осторожно поднимали и клали плашмя на замораживающую платформу; после быстрого охлаждения и замораживания в течение примерно 10 мин кассету вынимали.
6) Способ изготовления срезов.
Заключенный в парафин блок, с которого собирались делать срезы, фиксировали на предметном столике так, чтобы наружная поверхность среза заключенного в парафин блока была параллельна сечению держателя образца, и выставляли короткую сторону заключенного в парафин блока. После выталкивания ножа к внешнему краю винт держателя лезвия ослабляли и лезвие помещали в держатель таким образом, чтобы угол между плоскостью лезвия и поверхностью среза ткани составлял 15°, а верхняя и нижняя границы заключенного в парафин блока были параллельны лезвию ножа. Желательную толщину срезов регулировали с помощью устройства для микроперемещений. При регулировке толщины указатель не должен находиться между двумя отметками; в противном случае, устройство для изготовления срезов может легко сломаться. Нож располагали рядом с предметным столиком. Вращающийся маховик вращали правой рукой, а щетку держали левой рукой, чтобы держать срезы у нижнего края кромки ножа и чтобы держать срезанную парафиновую полоску. После образования парафиновой полоски определенной длины, вращение останавливали правой рукой, и брали другую щетку, чтобы аккуратно подхватить восковую полоску. После изготовления срезов соответствующие части устройства для изготовления срезов следует своевременно протирать.
2. Окрашивание ГЭ
1) Для окрашивания ГЭ выбирали плоский срез.
2) Указанный срез депарафинизировали в ксилоле I в течение 20 мин.
3) Указанный срез депарафинизировали в ксилоле II в течение 20 мин.
4) Указанный срез выдерживали в абсолютном этаноле в течение 10 мин.
5) Проводили поэтапную регидратацию: в абсолютном этаноле в течение 5 мин, в 90% этаноле в течение 5 мин, в 80% этаноле в течение 5 мин и в 100% этаноле в течение 5 мин; и промывку водой.
6) Окрашивание гематоксилином в течение 3-5 мин. Промывка водой.
7) Дифференцирование в 1% HCl - 105% этаноле в течение 5-10 с. Промывка водой и окрашивание в синий цвет.
8) Окрашивание с эозином в течение 30-60 с. Промывка водой.
9) Промывка 80% этанолом в течение 3-5 с, 95% этанолом в течение 3-5 с и абсолютным этанолом в течение 3-5 с.
10) Заключение в нейтральную смолу под покровное стекло, наблюдение под микроскопом и фотографирование.
Изготовление срезов для ГЭ: делали 3 последовательных среза; плоские срезы, полностью занятые тканью, выбирали для окрашивания ГЭ; каждый из срезов фотографировали в 3 произвольно выбранных полях зрения при 200х увеличении. Оценивали полученные изображения.
5. Сбор данных и статистический анализ
5.1. Сбор данных
Результаты и данные, полученные в ходе анализа и наблюдения, требуемые протоколом, регистрировали вручную в соответствующих таблицах, или данные напрямую собирал компьютер.
5.2. Статистический анализ
Результаты измерения выражали в виде среднего - стандартные отклонения. Все данные обрабатывали, применяя статистическое программное обеспечение Graphpad prism
5.0. Проводили анализ методом Массона путем анализа общей пощади по 3 полям зрения и положительной по коллагену пощади, применяя Image J. Влияние синих ядер можно исключить путем установления порога. Объемную долю коллагена (CVF%) определяли путем деления положительной по коллагену площади на общую площадь.
6. Результаты
Часть I. Анализ изменений массы тела и коэффициентов органов в каждой группе после введения BS
6.1. Масса тела
В данном эксперименте произвольно выбирали 105 мышей С57 и осуществляли капельное введение в орган разовой дозы блеомицина на уровне 2,5 мг/кг в течение 24 ч или 7 д для индукции. После 7 дней индукции, произвольно выбирали 3 модельных мышей и препарировали, чтобы определить, было ли успешным создание модели. После создания модели регистрировали выживаемость мышей. Наблюдали за показателями жизненно важных функций мышей и измеряли их массу тела в определенное время.
Схематическая диаграмма создания модели на животных в течение 24 ч и введения показана на ФИГ. 1. После индукции в течение 24 ч мышей произвольно делили на Модельную группу, группу Dex и группу BS, по 5 мышей на группу. В группу нормального контроля входили 3 мыши.
Схематическая диаграмма создания модели на животных в течение 7 д и введения показана на ФИГ. 2. После индукции в течение 7 д мышей произвольно делили на Модельную группу, группу Dex, группу BSL, группу BSM и группу BSH, по 12 мышей на группу. В группу нормального контроля входили 6 мышей.
Во время периода содержания у мышей контрольной группы была мягкая и гладкая шерсть и хорошее психическое состояние, и они проявляли нормальную активность и быстрые реакции на стимуляцию. У мышей в модельной группе были тусклые и сухие волосы, плохое психическое состояние, низкая активность и медленная реакция на стимуляцию. Группы с различными дозами BS были более активными, чем в модельной группе.
Изменения массы тела мышей в группах создания модели на животных в течение 24 часов показаны на ФИГ. 3. На ФИГ. 3 представлена диаграмма, показывающая изменения массы тела мышей в каждой группе во время введения. В А на ФИГ. 3 показаны уровни изменения массы тела мышей в каждой группе во время введения. В С на ФИГ. 3 представлена диаграмма, на которой показаны сравнения массы тела мышей в каждой группе на 1 день введения, а затем на 35 день введения.
Изменения массы тела мышей в каждой группе показаны в А на ФИГ. 3 и в Таблице 10. Масса тела мышей в каждой группе введения, за исключением контрольной группы, уменьшалась. У мышей в модельной группе было плохое психическое состояние и большая потеря массы тела. Их масса тела уменьшилась с 20,40 до 0,85 г - 18,22±1,01 г - на 12,25%. На 35 день введения мыши из контрольной группы весили 25,13±0,06 г, мыши из модельной группы весили 18,22±1,01 г, мыши из группы Dex весили 18,36±0,66 г и мыши из группы BS весили 18,02±1,75 г.
Скорости изменения массы тела мышей в указанных группах показаны в В на ФИГ. 3. Масса тела в контрольной группе увеличилась на 8,10%, масса тела в модельной группе уменьшилась на 12,25%, масса тела в группе Dex уменьшилась на 8,48% и масса тела в группе BS уменьшилась на 13,58%, с 1 дня до 35 дня введения.
Изменения массы тела мышей в группах создания модели на животных в течение 7 дней показаны на ФИГ. 4. В А на ФИГ. 4 представлена диаграмма, на которой показаны изменения массы тела мышей в каждой группе во время введения. В В на ФИГ. 4 показаны скорости изменения массы тела мышей в каждой группе во время введения. В С на ФИГ. 4 представлена диаграмма, на которой показаны сравнения массы тела мышей в указанных группах на 1 день введения и таковые на 28 день введения.
Изменения массы тела мышей в каждой группе показаны в А на ФИГ. 4 и в Таблице 11. Масса тела мышей в каждой группе введения, за исключением контрольной группы, уменьшалась. У мышей в модельной группе было плохое психическое состояние и потеря массы тела. Их масса тела уменьшилась с 18,02±0,52 г до 17,19±0,63 г - на -4,85%. На 28 день введения мыши контрольной группы весили 25,10±0,40 г, мыши модельной группы весили 17,19±0,63 г, мыши группы Dex весили 17,38±0,85 г, мыши группы BSL весили 17,23 ±0,82 г, мыши группы BSM весили 17,41±0,72 г и мыши группы BSH весили 19,19±0,71 г.
Скорости изменения массы тела мышей в указанных группах показаны в В на ФИГ. 4. Масса тела в контрольной группе увеличилась на 10,91%, масса тела в модельной группе уменьшилась на 4,85%, масса тела в группе Dex уменьшилась на 2,42%, масса тела в группе BSL уменьшилась на 3,39%, масса тела в группе BSM уменьшилась на 4,53% и масса тела в группе BSH уменьшилась на 3,62%, с 1 дня по 28 день введения. В С на ФИГ. 4 показано сравнение масс тела мышей в указанных группах на 1 день введения и таковых на 28 день введения.
6.2. Коэффициенты органов
Коэффициент легкого может динамически отражать прогрессирование болезней легких. По мере прогрессирования воспаления и фиброза легких, экссудация в легких возрастает, содержание воды возрастает, различные белки инфильтрируют ткани легкого и содержание коллагена в легком повышается, что приводит к увеличению массы легкого, а также коэффициента легкого. Коэффициенты легких мышей в модельной группе значительно повышались вследствие воспаления и накопления внеклеточного матрикса, позволяя предположить успешное создание моделей фиброза легких у мышей.
В ходе эксперимента модельные мыши проявляли симптомы фиброза легких и повышение коэффициентов селезенки, вызванные моделью как внешним стимулом.
После того, как введение мышам в группах создания модели на животных в течение 24 часов было завершено, коэффициенты легкого и селезенки у животных в указанных группах регистрировали и анализировали, как показано в Таблице 12. Наблюдали значимые изменения коэффициента легкого и коэффициента селезенки.
После того, как введение мышам в группах создания модели на животных в течение 7 дней было завершено, коэффициенты легкого и селезенки у животных в указанных группах регистрировали и анализировали, как показано в Таблице 13. Наблюдали значимые изменения коэффициента легкого и коэффициента селезенки.
BS может снижать выраженность воспаления легких и фиброза. Результаты эксперимента позволяют предположить, что BS, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 180 мг/кг, мог значимо уменьшать коэффициент селезенки мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex, и что BS оказывал некоторое ингибиторное действие на отек селезенки у мышей. В условиях этого эксперимента, BS (36, 90 и 180 мг/кг) не оказывал значимых токсических или побочных действий на мышей.
После того, как введение мышам в группах создания модели на животных в течение 24 часов было завершено, коэффициенты легкого и селезенки у животных в указанных группах регистрировали и анализировали. Результаты коэффициента легкого позволяют предположить, что BS1801, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 90 мг/кг, либо отдельно, либо в комбинации с другими лекарственными средствами, мог значительно снижать увеличения коэффициента легкого у мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex. BS может снижать выраженность воспаления и фиброза легких. Результаты коэффициентов селезенки позволяют предположить, что BS, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 90 мг/кг, мог значимо уменьшать коэффициент селезенки мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex, и что BS оказывал некоторое ингибиторное действие на отек селезенки у мышей.
После того, как введение мышам в группах создания модели на животных в течение 7 дней было завершено, коэффициенты легкого и селезенки у животных в указанных группах регистрировали и анализировали. Результаты коэффициентов легкого позволяют предположить, что в группах, которым вводили низкую, среднюю и высокую дозу BS, выявили дозозависимые эффекты на коэффициент легкого. При введении в экспериментальной дозе, составляющей либо 90 мг/кг, либо 180 мг/кг, отдельно или в экспериментальной дозе, составляющей 90 мг/кг, в комбинации с другими лекарственными средствами, BS мог значительно снижать увеличения коэффициента легкого мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex. BS может снижать выраженность воспаления и фиброза легких. Результаты коэффициентов селезенки позволяют предположить, что BS, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 180 мг/кг, мог значимо уменьшать коэффициент селезенки мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex, и что BS оказывал некоторое ингибиторное действие на отек селезенки у мышей.
Часть II. Определение газов крови после введения BS
6.3. Определение газов крови
При определении газов крови, можно определить концентрацию Н+ в крови и газы (преимущественно СО2 и О2), растворенные в крови, которые напрямую отражают функцию легочной вентиляции и состояние кислотно-основного равновесия. Их используют, чтобы определить, есть ли нарушение кислотно-основного равновесия в организме, возникло ли кислородное голодание (аноксия), каков уровень кислородного голодания и т.д. Результаты анализа описаны далее.
Результаты показали, что BS, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 90 мг/кг, приводил к значительным улучшениям функции легочной вентиляции и состояния кислотно-основного равновесия у мышей, у которых развился фиброз легких, в моделях интерстициального заболевания легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex (1-1,5 мг/кг) в целом.
Результаты показали, что BS, при введении в экспериментальных дозах, составляющих 90 мг/кг и 180 мг/кг, приводил к значительным улучшениям функции легочной вентиляции и состояния кислотно-основного равновесия у мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex (1-1,5 мг/кг) в целом.
Результаты определения газов крови непосредственно отражают дыхательную функцию и состояние кислотно-основного равновесия мышей с фиброзом легких. В условиях этого эксперимента, результаты определения газов крови мышей в группах создания модели на животных в течение 24 ч и 7 дней согласуются. BS может значительно улучшать при определении газов крови у мышей кислотность и щелочность крови, парциальное давление кислорода, избыток оснований в интерстициальной жидкости, фактическое содержание бикарбоната, общее содержание диоксида углерода, насыщение кислородом и уровень лактата, и напрямую улучшать функцию легких мышей с фиброзом легких.
После создания модели на животных в течение 24 ч и 7 дней, BS, при введении в экспериментальных дозах, составляющих 90 мг/кг и 180 мг/кг, приводил к значительным улучшениям функции легочной вентиляции и состояния кислотно-основного равновесия у мышей с моделью фиброза легких, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex (1 -1,5 мг/кг) в целом.
Часть III. Анализ воспалительных клеток и анализ факторов воспаления в жидкости бронхоальвеолярного лаважа
6.4. Анализ воспалительных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа
Лейкоциты преимущественно выполняют защитную функцию. Разные виды лейкоцитов различным образом участвуют в защитных реакциях организма. У взрослых количество лейкоцитов составляет (5-9)×10^9/л, из которых нейтрофилы составляют 0,50-0,100, эозинофилы составляют 0,005-0,05, базофилы составляют 0,00-0,01, моноциты составляют 0,03-0,08 и лимфоциты составляют 0,20-0,40.
Эксперименты показывают, что в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и патологических срезах ткани легкого на ранней стадии повреждений легкого значительно повышалась инфильтрация нейтрофилами и макрофагами, причем указанное повышение было тесно связано со степенью фиброза легких, что свидетельствует о важной роли нейтрофилов и макрофагов в процессе фиброза легких. Избыточное накопление нейтрофилов и макрофагов в легочных сосудах, интерстиции и альвеолярной стенке может вызывать сосудистые и бронхиальные повреждения, основными причинами которых являются активные формы кислорода (АФК) и продуцированные протеолитические ферменты. Нейтрофилы и макрофаги продуцируют АФК, которые могут стимулировать продукцию TNF-α, IFN-γ и TGF-β и т.п., которые опосредуют фибропролиферативные реакции и способствуют формированию фиброза легких.
После окончания введения, лейкоциты (лимфоциты, нейтрофилы и моноциты) в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа мышей в группах создания модели на животных в течение 7 дней классифицировали и подсчитывали. Результаты анализа показаны на ФИГ. 9 и в Таблице 17.
Все абсолютные количества лейкоцитов, абсолютные количества лимфоцитов и абсолютные количества моноцитов в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа мышей в группе Dex, группе BSL, группе BSM и группе BSH были ниже, чем таковые в модельной группе. Кроме того, в группах, которым вводили низкую, среднюю и высокую дозу BS, выявили дозозависимые эффекты. Абсолютные количества нейтрофилов в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа мышей в группе Dex и группе BSH значительно уменьшались по сравнению с модельной группой.
Результаты эксперимента позволяют предположить, что после создания модели в течение 7 д, BS, при введении в экспериментальной дозе, составляющей 180 мг/кг, мог значимо снижать выраженность воспаления легких и улучшать функцию легких у мышей с фиброзом легких в модели интерстициального заболевания легких у мышей, и указанное действие было лучше, чем таковое у Dex (1-1,5 мг/кг).
6.5. Анализ факторов воспаления в жидкости бронхоальвеолярного лаважа
Аномальная экспрессия цитокинов и дисбаланс секреции цитокинов, вызванные инфильтрацией и активацией воспалительных клеток, играют важную роль в развитии и прогрессировании интерстициальной пневмонии. Цитокины, которые играют важную роль в повреждениях легких, включают: TGF-β, TNF-α, IFN-γ и IL и т.п.
Предыдущие исследования показали, что Dex ингибирует пролиферацию и активацию фибробластов, главным образом, посредством противовоспалительного действия. При применении отдельно, BSH оказывает большее ингибиторное действие на воспалительные клетки (лейкоциты, лимфоциты, моноциты и нейтрофилы) и провоспалительные факторы (NF-κВ, TNF-α, IL-1β IL-2 и IL-6) по сравнению с лекарственным средством положительного контроля - Dex - от фиброза легких. Снижается выраженность опосредованных фиброзом воспалительных повреждений альвеол, и ингибируются активация и пролиферация фибробластов и синтез коллагена и, следовательно, накопление белков матрикса и образование фиброзной ткани, и, следовательно, снижается выраженность фиброза легких.
При вызванном блеомицином поражении фиброзом легких, в очагах воспаления обнаруживается значительная инфильтрация макрофагами, нейтрофилами и лимфоцитами. Эти воспалительные клетки также могут продуцировать большое количество цитокинов, таких как TGF-β, TNF-α, IFN-γ и IL и т.п., поэтому образуется сложная сеть цитокинов. Они регулируют пролиферацию и апоптоз альвеолярных эпителиальных клеток и интерстициальных фибробластов, так что накопление внеклеточного матрикса постепенно увеличивается, ингибируется активация фибринолитической системы и, в конечном счете, это способствует формированию фиброза легких.
Часть IV. Анализ содержания гидроксипролина в тканях легкого после введения BS
6.6. Анализ содержания гидроксипролина в тканях легкого
В гомогенатах печени из 3 животных из каждой группы создания модели на животных в течение 24 часов анализировали содержание гидроксипролина. Результаты представлены в Таблице 21 и на ФИГ. 11. После введения, в группе Dex и группах BS содержание гидроксипролина было меньше, чем в модельной группе.
Часть V. Анализ ГЭ легкого и патологический анализ по Массону после введения BS
6.7. Патологический анализ ГЭ
Общий стандартный метод оценки Ашкрофта тканей фиброза легких использовали для оценки ГЭ. Патологический анализ ГЭ представляет собой оценку исхода необратимого фиброза легких, который развивается в моделях интерстициального заболевания легких.
Для 5 животных из каждой группы создания модели на животных в течение 24 часов оценивали всего 15 полей зрения ГЭ. Результаты представлены в Таблице 22 и на ФИГ. 13. Контрольной группе был присвоен балл 0,00±0,00, модельной группе был присвоен балл 6,00±0,65, группе Dex был присвоен балл 2,53±0,52 и группе BS был присвоен балл 3,00±0,65. Группе Dex и группе BS был присвоен значительно меньший балл, чем модельной группе. Среднее значение баллов фиброза уменьшалось с уровня 6 единиц до приблизительно 3 единиц. В соответствии с критериями оценки, балл ниже 3 единиц свидетельствует об отсутствии значимых структурных изменений, сопутствующих тканям легкого. Следовательно, эти результаты позволяют предположить, что возникновение патологических структурных изменений в тканях легкого можно эффективно контролировать в группе BS.
Балл ГЭ до 5 единиц рассматривают как наличие явного повреждения тканей легкого и возникновение фиброзных тканей, таких как фиброзные тяжи. Балл фиброза легких и анализ уровня пользы представлены в Таблице 23 и на ФИГ. 12. После 35 дней введения не происходило явного повреждения тканей легкого в группе Dex или группе BS.
Полученные результаты позволяют предположить, что на ранней стадии фиброза легких (модель 24 ч), BS, при введении в дозе, составляющей 90 мг/кг, мог значительно уменьшать структурные изменения в тканях легкого и уменьшать инфильтрацию воспалительными клетками, и снижать выраженность фиброза легких.
Для 6 животных из каждой группы создания модели на животных в течение 7 дней, оценивали всего 18 полей зрения ГЭ. Результаты представлены в Таблице 24 и на ФИГ. 15. Контрольной группе был присвоен балл 0,00±0,00, модельной группе был присвоен балл 5,67±0,69, группе Dex был присвоен балл 3,28±0,83, группе BSL был присвоен балл 4,28±0,83, группе BSM был присвоен балл 3,00±0,84 и группе BSH был присвоен балл 1,48±0,78. В группе Dex, группе BSL, группе BSM и группе BSH были значимо меньшие баллы фиброза легких, чем в модельной группе. Эти результаты позволяют предположить, что возникновение патологических структурных изменений в тканях легкого можно эффективно контролировать в группе BSH.
Балл ГЭ до 5 единиц рассматривают как наличие явного повреждения тканей легкого и возникновение фиброзных тканей, таких как фиброзные тяжи. Балл фиброза легких и анализ уровня пользы представлены в Таблице 25 и на ФИГ. 14. В группе BSM, вероятность явного повреждения тканей легкого составляла 5,6% (1/18), и вероятность патологического изменения тканей составляла 27,8% (5/18). Указанные два вида вероятностей для группы клинического лекарственного средства Dex от фиброза легких составляли 5,6% (1/18) и 38,9% (7/18), соответственно. В группе BSM и группе Dex выявили по существу эквивалентные эффекты. В группе BSH не выявили явного повреждения ткани легкого или патологических изменений в тканях. Поскольку патологические изменения в тканях легких являются важной предпосылкой к утрате функции легких, полученные результаты свидетельствуют о том, что при формировании патологических изменений в тканях легких лекарственное средство BS оказывало наиболее значимое функциональное действие в отношении контроля возникновения патологических изменений.
В контрольной группе наблюдали четкие структуры тканей легкого и однородную цитоплазму и ядра, и не наблюдали значительной инфильтрации воспалительными клетками и накопления коллагеновых волокон. У мышей модельной группы структуры тканей легкого были значительно и серьезно изменены и повреждены, наблюдали инфильтрацию большими количествами воспалительных клеток, перегородки легочной ткани были утолщены или даже заполнены, наблюдали большую область с фиброзными изменениями в легких. В группе Dex наблюдали гораздо лучшие структуры легкого, чем в модельной группе в целом, но все же были изменения в структурах тканей легкого; наблюдали повреждение и инфильтрацию воспалительными клетками структур тканей легкого, и можно было наблюдать область с фиброзными изменениями в легких. В группе BSL наблюдали относительно лучшие структуры легкого, чем в модельной группе в целом, но все же наблюдали инфильтрацию большими количествами воспалительных клеток; структуры тканей легкого были сильно повреждены, и можно было наблюдать большую область с фиброзными изменениями в легких. В группе BSM наблюдали гораздо лучшие структуры легкого, чем в модельной группе в целом, но все же были изменения в структурах тканей легкого; наблюдали повреждение и инфильтрацию воспалительными клетками структур тканей легкого, и можно было наблюдать область с фиброзными изменениями в легких. В группе BSH наблюдали по существу все структуры тканей легкого, и можно было наблюдать незначительное количество областей с фиброзом легких и воспалительными клетками.
Полученные результаты позволяют предположить, что на стадии формирования фиброза легких (модель 7 д), BSL (36 мг/кг), BSM (90 мг/кг) и BSH (180 мг/кг) могли значительно уменьшать структурные изменения в тканях легкого, уменьшать инфильтрацию воспалительными клетками и снижать выраженность фиброза легких. При введении в дозе, составляющей 180 мг/кг, BSH оказывал значимое синергическое действие против накопления ВКМ.
На ранней стадии фиброза легких (модель 24 ч), BS, при введении в дозе, составляющей 90 мг/кг, мог значительно уменьшать структурные изменения в тканях легкого, уменьшать инфильтрацию воспалительными клетками и снижать выраженность фиброза легких.
В модели стадии формирования фиброза легких (модель 7 д), BSL (36 мг/кг), BSM (90 мг/кг) и BSH (180 мг/кг) могли значительно уменьшать структурные изменения в тканях легкого, уменьшать инфильтрацию воспалительными клетками и снижать выраженность фиброза легких. При введении в дозе, составляющей 180 мг/кг, BSH оказывал значимое синергическое действие против накопления ВКМ.
Варианты реализации настоящего изобретения были описаны выше. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено ими. Любые модификация, эквивалент, улучшение и тому подобные изменения, совершенные без отклонения от сущности и принципа настоящего изобретения, подпадают под объем защиты настоящего изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НОВОЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ТИЕНО[3,2-D]ПИРИМИДИН-4-ОНА | 2019 |
|
RU2768828C1 |
| АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ | 2013 |
|
RU2701156C2 |
| ИНГИБИТОР FAP | 2019 |
|
RU2797409C2 |
| АНАЛОГИ БУПРЕНОРФИНА | 2009 |
|
RU2520222C2 |
| КОМБИНАЦИЯ MCL-1 ИНГИБИТОРА И ТАКСАНОВОГО СОЕДИНЕНИЯ, ИХ ПРИМЕНЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ | 2018 |
|
RU2763544C2 |
| Способ лечения фокально-сегментарного гломерулосклероза | 2017 |
|
RU2765737C2 |
| ПРОДУКТ, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНО ВЕЩЕСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ NO-СИНТАЗЫ, В КОМБИНАЦИИ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ С ОДНИМ ВЕЩЕСТВОМ, ИНГИБИРУЮЩИМ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 | 2000 |
|
RU2256465C2 |
| НОВОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА И ФИБРОЗА | 2017 |
|
RU2762280C2 |
| Способ лечения фиброза печени | 2017 |
|
RU2740902C2 |
| ФЕНИЛАТНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ, ПОЛУЧЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ | 2017 |
|
RU2744975C2 |
Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к лечению интерстициального заболевания легких (ИЗЛ). Раскрывается применение производных бензизоселеназола формулы (I-1) для получения лекарственных средств для лечения интерстициального заболевания легких. Использование изобретения позволяет эффективно лечить интерстициальное заболевание легких, вызванное коронавирусом. В общей формуле (I-1) R выбран из водорода, циано, гидроксила, галогена; p представляет собой целое число от 0 до 4; L выбран из -(CH2)n-, -(CH2)n-O-(CH2)n-, -(CH2)n-S-S-(CH2)m-, -фенил-(CH2)n-S(O)2- и -(CH2)n-S(O)2-фенил-, где n представляет собой целое число от 0 до 12, m представляет собой целое число от 0 до 12. 2 з.п. ф-лы, 15 ил., 25 табл., 3 пр.
1. Применение производных бензизоселеназола для получения лекарственных средств для лечения интерстициального заболевания легких (ИЗЛ), причем указанные производные бензизоселеназола представляют собой соединения формулы (I-1),
где R выбран из водорода, циано, гидроксила, галогена;
p представляет собой целое число от 0 до 4;
L выбран из -(CH2)n-, -(CH2)n-O-(CH2)n-, -(CH2)n-S-S-(CH2)m-, -фенил-(CH2)n-S(O)2- и -(CH2)n-S(O)2-фенил-, где n представляет собой целое число от 0 до 12, m представляет собой целое число от 0 до 12.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что в соединениях формулы (I-1),
L выбран из -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -фенил-S(O)2-, -(CH2)n-S(O)2-фенил-, -(CH2)n-O-(CH2)n-, -(CH2)n-S-S-(CH2)m-, где n представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6, m представляет собой 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанные производные бензизоселеназола формулы (I-1) выбраны из соединений, приведенных ниже в Таблице 1:
Таблица 1
| JIN, ZHENMING et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Nature, 09 April 2020, vol | |||
| Автоматический указатель станций | 1914 |
|
SU582A1 |
| РЕЛЬСОВАЯ ПЕДАЛЬ | 1920 |
|
SU289A1 |
| CN 104119329 A, 29.10.2014 | |||
| CN 102898402 B, 20.01.2016 | |||
| ARSHAD, USMAN et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
