Олигонуклеотидные праймеры и зонд для выявления фрагмента гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/686 C12Q1/689 C12N15/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой набор олигонуклеотидов для обнаружения фрагмента гена 23S рРНК семейства Enterococcaceae методом ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».

Экспрессия генов в клетках живых организмов - это перевод генетической информации, записанной четырех-буквенным кодом нуклеотидов в молекуле ДНК (хромосома), в структуру белка, состоящего из двадцати аминокислот, и который осуществляется макромолекулярной машиной рибосомой. Энзиматические реакции рибосомы исследовались несколько десятилетий и ранее уже было составлено схематическое представление о практически всех процессах работы рибосомы и участия основных лигандов белкового синтеза. Были описаны свойства матричных РНК (мРНК), транспортных РНК (тРНК) и белковых факторов трансляции, обеспечивающих синтез белка в клетке. На начальных этапах, исследования структуры рибосомы были сфокусированы на отдельных компонентах составляющих бактериальную рибосому из клеток Escherichia coli, представляющих наиболее удобную модель для лабораторных исследований. В результате было показано, что бактериальная рибосома состоит из двух неравных несимметричных субчастиц. Большая субчастица 50S содержит две цепи рибосомной РНК (рРНК) ( 23S рРНК, 2904 нуклеотида, и 5S рРНК, 120 нуклеотидов) и 32 индивидуальных рибосомных белка. Малая субчастица 30S содержит одну рибосомную РНК (16S рРНК, 1542 нуклеотида) и 21 индивидуальных рибосомных белка. Нуклеотидные последовательности рибосомных РНК были определены и вторичные структуры были предсказаны. Первичные структуры рибосомных белков были также определены [1].

Существует несколько вариантов использования фрагментов гена 23S рРНК для различных целей в молекулярной биологии. Авторы патента US 2003/0082598 от 2003 года, предлагают полинуклеотиды, содержащие сайты молекулярного взаимодействия 23S рРНК, которые имеют особую вторичную структуру. Также предложены способы использования таких полинуклеотидов для виртуального или фактического скрининга комбинаторных библиотек соединений, которые с ними связываются. Также предложен способ модуляции активности 23S рРНК путем приведения в контакт 23S рРНК или прокариотических клеток, содержащих ее, с соединением, идентифицированным посредством такого виртуального или фактического скрининга.

Патент US 5.703.217 от 1997 года, описывает способ обнаружения и/или идентификации бактерий рода Mycobacterium с использованием зондов, включающих фрагменты вариабельной области 23S-несомальной РНК.

Предлагаемое изобретение отличается тем, что подобранные олигонуклеотидные праймеры и зонд способны с высокой специфичностью выявить фрагмента гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae.

Ближайшие в предлагаемому изобретению CN105603102 (A) ― 2016-05-25, и KR102029595 (B1) ― 2019-10-07 в котором предлагаются специфические праймеры и зонды для флуоресцентной ПЦР-РВ с целью детекции только Enterococcus faecalis. С помощью предлагаемого изобретения возможно выявить пул семейства Enterococcaceae, что расширяет возможности его использования в том числе в качестве внутреннего контроля, например, при идентификации генов резистентности у бактерий [2].

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления фрагмента гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae, методом ПЦР в режиме реального времени, из образцов продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также для чистых бактериальных культур.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность выбранных олигонуклеотидов специфичных к фрагменту гена 23S рРНК, при идентификации которого осуществляется выявление бактерий семейства Enterococcaceae.

Преимуществом данного изобретения является экспресс - выявление фрагмента гена 23S рРНК.

Заявленный технический результат достигается благодаря набору оригинальных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентному зонду: F-23S_coccus TTCAGATAAACTCCGAATGCCAT

R-23S_coccus CAACCCCACATCCTTTTCCA,

Z-23S_coccus R6G-AAACAGCCCAGACCACCAGCTAA-BHQ1.

Сущность заявленного изобретения заключается в том, что при проведении полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени», используют специальный оригинальный набор олигонуклеотидных праймеров и зонд для выявления фрагмента гена 23S рРНК.

Олигонуклеотиды, входящие в набор, отличаются от известных из уровня техники тем, что имеют оригинальные олигонуклеотидные последовательности и позволяют специфическим образом детектировать и выявлять фрагмента гена 23S рРНК по которому осуществляется определение наличия или отсутствия бактерий семейства Enterococcaceae из образцов продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования; образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также для чистых бактериальных культур.

Для выбора и анализа ДНК последовательностей генов резистентности были использованы базы данных ResFinder, Arg-ANNOT, CARD и NCBI BARRGD, а также последовательности геномов различных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые были ранее получены в ФГБУ «ВГНКИ» методом полногеномного секвенирования.

Подбор праймеров производили на онлайн-ресурсе «PrimerQuest Tool» (IDT). Для анализа множественного выравнивания последовательностей использовали программу «Ugene» и алгоритм Clustal omega. Для выбора оптимальных параметров структурных характеристик наборов праймеров использовали программы PCR Primer Stats и Oligo Analysis Tool, оценивали оптимальную температуру отжига, возможность образования димеров и «шпилек». Специфичность праймеров оценивали при помощи онлайн-ресурса «Primer-Blast», расположенном на сайте NCBI.

Последовательности и характеристики выбранных праймеров и зонда для детекции для детекции гена 23S рРНК и множественное выравнивание фрагментов гена из различных баз данных представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристики праймеров и зонда для детекции гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae

Наименование Последовательность Длина праймера, п.н. Tm,
°C GC % Длина ампликона, п.н. 23S_coccus-F TTCAGATAAACTCCGAATGCCAT 23 39.1 62.5 141 23S_coccus-Z R6G-AAACAGCCCAGACCACCAGCTAA-BHQ1 23 52.2 68 23S_coccus-R CAACCCCACATCCTTTTCCA 29 50 62.5

Выделение ДНК из образца, осуществляют с помощью набора реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ) или «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen), или «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen) в соответствии с инструкцией производителя. В качестве отрицательного контроля выделения (Kв) используют 100 мм³ воды деионизованной. Срок хранения выделенной ДНК составляет при комнатной температуре не более 16 ч, при температуре (2-8) С – не более семи дней, при температуре не выше минус 16 °С – не более шести месяцев.

Для приготовления соответствующих мастермиксов «ПЦР-смесь-1» в отдельных пробирках смешивают из расчета на одну реакцию (с учетом контролей выделения и ПЦР) следующие реагенты: растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров и зондов в необходимой концентрации, 0,2 мм³ смеси дНТФ (25 ммоль/дм³) и воды деионизованной до 5 мм³. Смесь с полимеразой для выявления целевых генов готовили в отдельной пробирке (из расчета на каждую реакцию с учетом контролей выделения и ПЦР), вносят по 10 мм³ «ПЦР-смеси-1», 0,5 мм³ ДНК-полимеразы, 5 мм³ ПЦР-буфера с магнием. Затем вносят по 15 мм³ приготовленной смеси с полимеразой в тонкостенные пробирки и по 10 мм³ исследуемых или контрольных проб. Запускают на амплификаторе RotorGene соответствующие программы термоциклирования (табл. 2).

Таблица 2

Программа амплификации для выявления ДНК Enterococcaceae

(23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae)

Стадия Температура Время Число циклов Детекция флуоресценции Удерживание 95^оС 15 мин 1 - Циклирование 95^оС 15 сек 35 - 62^оС 45 сек По каналу Yellow

При идентификации ген-маркера бактерий семейства Enterococcaceae результаты интерпретируются в качественном формате на основании значения Ct. Учет результатов амплификации фрагментов генов начинают с оценки результатов амплификации положительных и отрицательных контролей в соответствии с таблицей 3. Результаты ПЦР исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей ПЦР и отрицательного контроля выделения ДНК.

Таблица 3

Необходимые показатели результатов анализа контролей

Контролируемый
этап анализа Значение порогового цикла Сt по каналу, соответствующему
фрагменту ДНК Enterococcaceae (канал Yellow) Выделение ДНК, Кв Нет значений ПЦР, К– Нет значений ПЦР, K+ ≤ 27

В образце обнаруженa ДНК бактерий семейства Enterococcaceae, если в таблице результатов по каналу Yellow определено среднее значение порогового цикла Ct ≤ 31, а результаты контрольных реакций соответствуют таблице 3.

Изобретение имеет преимущество от известных из уровня техники методов возможностью экспресс-идентификации и высокой специфичностью. Для подтверждения специфичности изобретения готовили панель, содержащую ДНК, выделенную из различных чистых бактериальных культур коллекции ФГБУ «ВГНКИ». В качестве контрольных использовали изоляты, которые охарактеризованы полногеномно (таблица 4).

Таблица 4

Результаты амплификации фрагмента гена 23S рРНК

№
пп Ожидаемый результат амплификации фрагментов генов Полученный результат
амплификации фрагмента гена Наименование образца Повтор1 Повтор2 1 – – – Salmonella enterica subsp. enterica, 2 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis 3 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis 4 Escherichia coli ATCC 25922 5 E.coli 6 E.coli 7 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecalis ATCC 29212, 8 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecium 9 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecalis 10 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecium 11 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecalis 12 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecalis 13 23S-coccus 23S-coccus 23S-coccus Enterococcus faecalis 14 Campylobacter jejuni ATCC 33560, 15 Campylobacter jejuni 16 Campylobacter coli

В рамках предложенной панели система идентификации и детекции фрагмента гена 23S рРНК показали 100% специфичность: наблюдается амплификация только фрагмента искомого гена.

Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

Изобретение может быть использовано в качестве внутреннего контроля для других разрабатываемых методик, в том числе при разработке методик идентификации генетических детерминант резистентности.

Литературные источники

1. Юсупов, М.М. Структура и функция эукариот. Результаты рентгено-структурного анализа: специальность 03.01.03 – молекулярная биология, 02.00.10 – биоорганическая химия: диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук / Юсупов Марат Миратович. – Москва, 2021. – 152 с.

2. Dmitry A. Makarov, Antimicrobial resistance of commensal Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from food-producing animals in Russia / Dmitry A. Makarov, Olga E. Ivanova, Anastasia V. Pomazkova, Maria A. Egoreva, Olga V. Prasolova, Sergey V. Lenev, Maria A. Gergel, Nataliya K. Bukova, Sergey Yu. Karabanov // Veterinary World, 15(3): 611-621, DOI: 10.14202/vetworld.2022.611-621

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарии и молекулярной биологии. Предложен набор, включающий олигонуклеотидные праймеры и зонд, для выявления фрагмента гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae методом ПЦР в режиме реального времени. Набор может быть использован для определения наличия или отсутствия бактерий семейства Enterococcaceae в образцах продовольственного сырья, пищевых продуктов, от животных (фекалии), из объектов окружающей среды (смывы с клеток, стен, оборудования, образцы фекалий, подстилка и др.), без этапа выделения бактериальных изолятов, а также для чистых бактериальных культур. Изобретение позволяет идентифицировать фрагмент гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae, что обеспечивается высокой специфичностью выбранных олигонуклеотидов. 4 табл.

Набор, включающий олигонуклеотидные праймеры и зонд, для выявления фрагмента гена 23S рРНК бактерий семейства Enterococcaceae методом ПЦР в режиме реального времени, характеризующийся тем, что имеет следующий нуклеотидный состав:

F-23S_coccus TTCAGATAAACTCCGAATGCCAT,

R-23S_coccus CAACCCCACATCCTTTTCCA,

Z-23S_coccus R6G-AAACAGCCCAGACCACCAGCTAA-BHQ1.