УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США №62/873,843, поданной 12 июля 2019 г., временной заявки на патент США №62/879,762, поданной 29 июля 2019 г., и временной заявки на патент США №63/049,476, поданной 8 июля 2020 г., которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
1. Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение в целом относится к области молекулярной биологии и медицины. Более конкретно, оно относится к иммуногенным или вакцинным композициям против Ehrlichia canis и относящимся к ним способам.
2. Описание уровня техники
[0002] Моноцитарный эрлихиоз человека (HME) является новым распространяющимся заболеванием группы 1 NIAID, и этиологический агент, Ehrlichia chaffeensis, классифицируется как приоритетный патоген категории C. HME представляет собой недифференцированное лихорадочное заболевание, угрожающее жизни, клинический диагноз которого затруднен, а окончательный диагноз чаще всего ставится ретроспективно (Walker and Dumler, 1997; Walker et al., 2004; Dumler et al., 2007). Хотя по состоянию на 2012 г. в центрах по контролю за заболеваниями было зарегистрировано более 8000 случаев, это число, вероятно, в 100 раз ниже фактического количества случаев (Olano et al., 2003). Заболевание часто не диагностируется из-за неспецифических симптомов, связанных с дебютом, но приводит к госпитализации больных в 43-62% случаев (Fishbein et al., 1994). Прогрессирование заболевания может привести к летальному исходу и часто сопровождается полиорганной недостаточностью, причем во многих случаях с летальным исходом часто встречаются острый респираторный дистресс-синдромом (ARDS) и менингоэнцефалит (Fishbein et al., 1994; Paparone et al., 1995). Угроза для здоровья населения возрастает при появлении новых эрлихиозных агентов, однако вакцины против эрлихиоза человека отсутствуют, и терапевтические возможности ограничены. Ehrlichia canis (E. canis) - родственный организм, который может заражать собак и вызывает аналогичные ветеринарные и клинические проблемы. Очевидно, что существует потребность в новых и улучшенных способах диагностики и вакцинации от Ehrlichia, таких как E. canis.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] В некоторых аспектах настоящее изобретение преодолевает ограничения предшествующего уровня техники путем предоставления новых композиций и способов, которые можно использовать для генерации иммунного ответа к Ehrlichia canis. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере два белка или иммуногенных пептида E. canis и адъювант, как раскрыто в настоящем описании. Изобретение также относится к родственным способам генерации иммунного ответа к E. canis. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ можно индуцировать у субъекта-млекопитающего (например, у собаки) путем введения субъекту: (i) бактерина E. canis, (ii) адъюванта (например, содержащего Quil A, холестерин и иммуностимулирующий олигонуклеотид) и (iii) одного или более белков или пептидов TRP, причем эти компоненты можно вводить в одной фармацевтической композиции (содержащей бактерин, адъювант и один или более белков или пептидов TRP) или в нескольких фармацевтических композициях. Например, субъекту можно вводить как первую фармацевтическую композицию (содержащую белок(-и) TRP и адъювант), так и вторую фармацевтическую композицию (содержащую бактерин и адъювант), причем первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию вводят по существу в одно и то же время или в разное время.
[0004] В некоторых аспектах изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей: (i) по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95, TRP19 и/или TRP120 (например, TRP140, TRP36 и/или TRP19); и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или более пептидов, содержащих или состоящих из пептида любой из SEQ ID NO: 1-16; (ii) по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95, TRP19 и/или TRP120 (например, TRP140, TRP36 и/или TRP19); (iii) бактерин E. canis и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95, TRP19 или TRP120 (например, TRP140, TRP36 и/или ТРП19); (iv) бактерин E. canis и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или более пептидов, содержащих или состоящих из пептида любой из SEQ ID NO:1-16; или (v) бактерин E. canis, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95, TRP19, TRP120 (например, TRP140, TRP36 и/или TRP19), и по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или более пептидов, содержащих или состоящих из пептида любой из SEQ ID NO: 1-16; и фармацевтически приемлемый эксципиент. Необязательно иммуногенная композиция может содержать 1, 2, 3, все из: Ank200, Ank153, OMP-1 и/или P30/28. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция не включает TRP120. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемый эксципиент содержит адъювант или состоит из него. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит тритерпеноидный сапонин (например, Quil A), стерол (например, холестерин) и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG-содержащий ODN). В некоторых вариантах осуществления тритерпеноидный сапонин представляет собой Quil A, стерол представляет собой холестерин, и иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой CpG-содержащий ODN. CpG-содержащий ODN может представлять собой 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 17), где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи и «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину. Композиция может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все из: TRP140, TRP36 и/или TRP19. Композиция может содержать химерный белок, содержащий 1, 2 или все из: TRP140, TRP36 и/или TRP19. Композиция может содержать полипептид, содержащий 1, 2 или все из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 14. Адъювант может представлять собой эмульсию или липосомы, или адъювант может содержать липид. В некоторых вариантах осуществления эмульсия представляет собой эмульсию масло-в-воде (O/W) или эмульсию вода-в-масле (W/O). Адъювант может содержать тритерпеноид, стерол, иммуномодулятор, полимер и/или иммуностимулирующий олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой диэтиламиноэтил (ДЭАЭ, DEAE)-декстран, полиэтиленгликоль или полиакриловую кислоту. Иммуностимулирующий олигонуклеотид может представлять собой CpG-содержащий ODN. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит ДЭАЭ-декстран, иммуностимулирующий олигонуклеотид и масло, такое как минеральное масло, где иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой CpG-содержащий ODN, и где состав адъюванта представляет собой эмульсию вода-в-масле (W/O). Адъювант может содержать сапонин, стерол, соединение четвертичного аммония, полимер и ORN/ODN. В некоторых вариантах осуществления сапонин представляет собой Quil A или его очищенную фракцию, стерол представляет собой холестерин, соединение четвертичного аммония представляет собой бромид диметилдиоктадециламмония (DDA), полимер представляет собой полиакриловую кислоту, и ORN/ODN представляет собой CpG-содержащий олигонуклеотид. Сапонин может присутствовать в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, стерол может присутствовать в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, соединение четвертичного аммония может присутствовать в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, и полимер может присутствовать в количестве от приблизительно 0,0001% по объему до приблизительно 75% по объему. Адъювант может дополнительно содержать гликолипид, такой как, например, N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит тритерпеноидный сапонин, стерол, соединение четвертичного аммония и полимер полиакриловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления сапонин представляет собой Quil A или его очищенную фракцию, стерол представляет собой холестерин, и соединение четвертичного аммония представляет собой диметилдиоктадециламмония бромид (DDA). В некоторых вариантах осуществления, где сапонин присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, стерол присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, соединение четвертичного аммония присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, и полимер полиакриловой кислоты присутствует в количестве от приблизительно 0,0001% по объему (об./об.) до приблизительно 75% по объему. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит или представляет собой эмульсию вода-в-масле. Эмульсия вода-в-масле может содержать масляную фазу и водную фазу, поликатионный носитель (например, ДЭАЭ-декстран) и CpG-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид. Композиция может дополнительно содержать гель гидроксида алюминия. В некоторых вариантах осуществления поликатионный носитель представляет собой ДЭАЭ-декстран. Композиция может содержать или представлять собой эмульсию или эмульсию масло-в-воде (O/W). В некоторых вариантах осуществления эмульсия содержит водную фазу, которая содержит алкил-полиакриловую кислоту (алкил-РАА) или одновременно акриловый полимер и диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид. В некоторых вариантах осуществления водная фаза эмульсии масло-в-воде содержит диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид и алкил-полиакриловую кислоту (алкил-РАА). В некоторых вариантах осуществления алкил-РАА представляет собой децил-РАА, октил-РАА, бутил-РАА или метил-РАА. В некоторых вариантах осуществления акриловый полимер представляет собой полимер акриловой кислоты, сшитый полиаллилсахарозой. Композиция может содержать или представлять собой эмульсию вода-в-масле (W/O), содержащую неминеральное масло и эмульгатор. В некоторых вариантах осуществления эмульгатор представляет собой моноолеат маннида. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой MF59, AS01, AS02, AS03, AS04, виросомы, CAF01, CAF04, CAF05, эмульсию акриловый полимер/DDA, эмульсию CpG/ДЭАЭ, адъювант сапонин/холестерин/DDA или эмульсию полимера полиакриловой кислоты.
[0005] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95 и TRP19. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит (TRP153 и TRP36), (TRP153 и TRP140), (TRP153 и TRP28), (TRP153 и TRP95), (TRP36 и TRP140), (TRP36 и TRP28), (TRP36 и TRP95), (TRP140 и TRP28), (TRP140 и TRP95), (TRP28 и TRP95), (TRP19 и TRP153), (TRP19 и TRP36), (TRP19 и TRP140), (TRP19 и TRP28), (TRP19 и TRP95), (TRP120 и TRP153), (TRP120 и TRP36), (TRP120 и TRP140), (TRP120 и TRP28), (TRP120 и TRP95) или (TRP120 и TRP19). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит TRP120, TRP140 и TRP36. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит TRP140, TRP36 и TRP19. Композиция может дополнительно содержать бактерин E. canis. Бактерин E. canis может быть термоинактивированным или химически инактивированным бактерином. В некоторых вариантах осуществления химически инактивированный бактерин инактивирован формальдегидом, формалином, биэтиленамином, облучением, ультрафиолетовым светом, обработкой бета-пропиолактоном или формальдегидом. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит: (SEQ ID NO: 2 и по меньшей мере одну из (SEQ ID NO: 3-11 или 16)), (SEQ ID NO: 2 и по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 12-13), (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 14), (по меньшей мере одну из (SEQ ID NO: 3-11 или 16) и по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 12-13), (по меньшей мере одну из (SEQ ID NO: 3-11 или 16) и SEQ ID NO: 14), (по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 12-13 и SEQ ID NO: 14), (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 1 и по меньшей мере одну из (SEQ ID NO: 3-11 или 16)), (SEQ ID NO: 1 и по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 12-13), (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 14), (SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 2), (SEQ ID NO: 15 и по меньшей мере одну из (SEQ ID NO: 3-11 или 16)), (SEQ ID NO: 15 и по меньшей мере одну из SEQ ID NO: 12-13), (SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 14) или (SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14 и (любую из SEQ ID NO: 3-11 или 16). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 1. Композиция может дополнительно содержать бактерин E. canis. Бактерин E. canis может быть термоинактивированным или химически инактивированным бактерином. В некоторых вариантах осуществления химически инактивированный бактерин инактивирован формальдегидом, формалином, биэтиленамином, облучением, ультрафиолетовым светом, обработкой бета-пропиолактоном или формальдегидом. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит бактерин E. canis. Бактерин E. canis может быть термоинактивированным или химически инактивированным бактерином. В некоторых вариантах осуществления химически инактивированный бактерин инактивирован формальдегидом, формалином, биэтиленамином, облучением, ультрафиолетовым светом, обработкой бета-пропиолактоном или формальдегидом.
[0006] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу диагностики воздействия или инфицирования Ehrlicia или E. canis, включающему: а) получение биологического образца от субъекта-млекопитающего и b) тестирование биологического образца на иммунореактивность к TRP120, TRP140 и/или TRP36, или их пептиду, такому как любому из SEQ ID NO: 3-11, 14, 15 или 16; при этом иммунореактивность к TRP120, TRP140 и/или TRP36 указывает на то, что субъект подвергался воздействию Ehrlichia или E. canis или был им инфицирован. В некоторых вариантах осуществления субъект-млекопитающее представляет собой собаку. В некоторых вариантах осуществления способ включает тестирование биологического образца на иммунореактивность к TRP120 и TRP36 или его иммунореактивному пептиду, такому как любому из SEQ ID NO: 3-11, 14 или 16. В некоторых вариантах осуществления способ включает тестирование биологического образца на иммунореактивность к TRP120, TRP140 и TRP36 или его иммунореактивному пептиду, такому как любому из SEQ ID NO: 3-11, 14, 15 или 16. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает способ лечения субъекта-млекопитающего, при этом субъекту-млекопитающему вводят фармакологически релевантное или терапевтически релевантное количество антибиотика, такого как, например, доксициклин.
[0007] Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу индукции иммунного ответа у субъекта-млекопитающего, включающему введение субъекту фармацевтически релевантного количества иммуногенной композиции, определенной выше или в настоящем описании. Иммуногенная композиция может содержать адъювант. В некоторых вариантах осуществления адъювант содержит тритерпеноидный сапонин (например, Quil A), стерол (например, холестерин) и иммуностимулирующий олигонуклеотид (например, CpG-содержащий ODN). В некоторых вариантах осуществления тритерпеноидный сапонин представляет собой Quil A, стерол представляет собой холестерин, и иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой CpG-содержащий ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG-содержащий ODN, представляет собой 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 17), где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи, и «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один, по меньшей мере два или все из: TRP140, TRP36 и/или TRP19. Иммуногенная композиция может содержать химерный белок, содержащий 1, 2 или все из: TRP140, TRP36 и/или TRP19. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит полипептид, содержащий 1, 2 или все из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и/или SEQ ID NO: 14. Иммуногенная композиция может содержать адъювант и 1, 2 или все из: TRP140, TRP36 и/или TRP19. Способ может дополнительно включать введение субъекту второй иммуногенной композиции, где вторая иммуногенная композиция содержит бактерин Ehrlichia (например, бактерин E. canis). Вторая иммуногенная композиция может содержать адъювант, предпочтительно при этом адъювант содержит тритерпеноидный сапонин (например, Quil A), стерол (например, холестерин) и иммуностимулирующий олигонуклеотид (CpG-содержащий ODN). В некоторых вариантах осуществления адъювант во второй иммуногенной композиции содержит Quil A, холестерин и CpG-содержащий ODN. В некоторых вариантах осуществления CpG-содержащий ODN, представляет собой 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO: 17), где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи, и «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину. В некоторых вариантах осуществления субъект-млекопитающее представляет собой собаку.
[0008] В некоторых вариантах осуществления адъювант может содержать или состоять из иммунологически активной сапониновой фракции коры Quillaja saponaria. Сапонин может представлять собой, например, Quil A или другой очищенный или частично очищенный препарат сапонина, который является коммерчески доступным. Quil A коммерчески доступен, например, от E.M. Sergeant Pulp & Chemical Company (Clifton, NJ, USA). Адъювант может содержать или состоять из QS-7, QS-17, QS-18 и QS-21. QS-7, QS-17, QS-18 и QS-21 также коммерчески доступны, например, от Antigenics (Framingham, Massachusetts, USA). Экстракты сапонинов можно использовать в виде смесей в адъюванте, или в адъювант могут быть включены отдельные очищенные компоненты, такие как QS-7, QS-17, QS-18 и QS-21. В некоторых вариантах осуществления Quil A имеет чистоту по меньшей мере приблизительно 85%. В других вариантах осуществления Quil A имеет чистоту по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или приблизительно 99%.
[0009] Адъювант предпочтительно может включать иммуностимулирующий олигонуклеотид Р-класса, более предпочтительно модифицированный иммуностимулирующий олигонуклеотид Р-класса. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды P-класса представляют собой олигонуклеотиды CpG, которые включают по меньшей мере один палиндром, обычно длиной 6-20 нуклеотидов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления олигонуклеотид P-класса способен к спонтанной самосборке в конкатемер либо in vitro, либо in vivo. Олигонуклеотиды P-класса являются индивидуально одноцепочечными, но наличие палиндромов позволяет образовывать конкатемеры или структуры типа «стебель-петля» между несколькими олигонуклеотидами P-класса (например, несколькими олигонуклеотидами P-класса, имеющими одинаковую нуклеотидную последовательность). В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующие олигонуклеотиды P-класса имеют длину от 19 до 100 нуклеотидов, например, 19-30 нуклеотидов, 30-40 нуклеотидов, 40-50 нуклеотидов, 50-60 нуклеотидов, 60-70 нуклеотидов, 70-80 нуклеотидов, 80-90 нуклеотидов, 90-100 нуклеотидов или в любом диапазоне, полученном из них.
[0010] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид содержит 5'-домен активации TLR и по меньшей мере две палиндромные области, например: первую палиндромную область, которая представляет собой 5'-палиндромную область длиной по меньшей мере 6 нуклеотидов и соединена со второй палиндромной областью, которая представляет собой 3'-палиндромную область длиной по меньшей мере 8 нуклеотидов, причем первая палиндромная область и вторая палиндромная область соединены непосредственно или опосредованно (например, через спейсер). Мотивы, активирующие TLR-9, известны и включают, без ограничения, TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT и TTTT. 5'-область TLR может быть полностью или частично включена в 5'-палиндромную область или может располагаться выше 5'-палиндромной области. 3'-палиндром или 3'-комплементарная область в некоторых вариантах осуществления имеет в длину по меньшей мере 8 оснований и обычно богата C и G.
[0011] Иммуностимулирующий(-е) олигонуклеотид(-ы) класса Р может(-гут) быть модифицирован(-ы) в соответствии с методами, известными в данной области. Например, для получения йод-модифицированных нуклеотидов можно использовать J-модификацию. Е-модификацию можно использовать для получения этил-модифицированных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой E-модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды P-класса. Е-модифицированные иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса представляют собой иммуностимулирующие олигонуклеотиды Р-класса, которые включают по меньшей мере один нуклеотид (предпочтительно 5'-нуклеотид), который является этилированным. Дополнительные модификации, которые можно использовать, включают присоединение 6-нитро-бензимидазола, O-метилирование, модификацию проинил-dU, модификацию инозином и/или присоединение 2-бромвинила (предпочтительно к уридину).
[0012] Иммуностимулирующие олигонуклеотиды P-класса также могут содержать модифицированную межнуклеотидную связь, включая, без ограничения, фосфодиэфирные связи и фосфоротиоатные связи. Олигонуклеотиды, представленные в настоящем описании, могут быть синтезированы, получены рекомбинантным путем или получены из коммерческого источника.
[0013] Стеролы, подходящие для включения в адъювант, включают β-ситостерол, стигмастерол, эргостерол, эргокальциферол и/или холестерин. Эти стеролы хорошо известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Например, холестерин описан в Merck Index, 12th Ed., p. 369. Количество стерола(-ов), включенного(-ых) в адъювантные композиции, может зависеть от природы используемого стерола. В некоторых вариантах осуществления стерол включен в состав адъюванта в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на мл. Они также используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 4000 мкг на мл; от приблизительно 1 мкг до приблизительно 3000 мкг на мл; от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2000 мкг на мл; и от приблизительно 1 пг до приблизительно 1000 мкг на мл. Они также используются в количестве от приблизительно 5 мкг до приблизительно 750 мкг на мл; от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг на мл; от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг на мл; от приблизительно 5 мкг до приблизительно 100 мкг на мл; от приблизительно 15 мкг до приблизительно 100 мкг на мл; и от приблизительно 30 мкг до приблизительно 75 мкг на мл.
[0014] В некоторых вариантах осуществления адъювант может содержать или состоять из стерола (например, холестерина), сапонина (например, Quil-A) и иммуностимулирующего олигонуклеотида (например, олигонуклеотида CpG и/или иммуностимулирующего олигонуклеотида P-класса). В различных вариантах осуществления предполагается, что адъювант может содержать: (стерол и сапонин), (сапонин и иммуностимулирующий олигонуклеотид) или (стерол и иммуностимулирующий олигонуклеотид). Получение адъюванта, содержащего сапонин и стерол, по настоящему изобретению находится в пределах компетенции специалистов в данной области. Например, можно приготовить водную смесь, содержащую антигенный белок или пептид, раскрытый в настоящем описании (например, один или более антигенных пептидов из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28, TRP95, TRP19 и/или TRP120; необязательно дополнительно содержащую бактерин E. canis или бактерин E. chaffeensis), иммуностимулирующий олигонуклеотид P-класса и сапонин. Затем к смеси можно постепенно или по каплям добавлять стерол.
[0015] В контексте настоящего описания термин «бактерин» относится к одной или более убитым бактериям, которые можно использовать в качестве компонента вакцины или иммуногенной композиции. Бактерин может содержаться в суспензии. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления бактерин представляет собой термоинактивированную Ehrlichia (например, термоинактивированную E. canis) или химически инактивированную Ehrlichia (например, химически инактивированную E. canis).
[0016] В контексте настоящего описания «адъювант» относится к любому веществу, которое усиливает гуморальный или клеточный иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления адъюванты можно использовать как для обеспечения контролируемого высвобождения антигенов из места инъекции вакцины, так и для стимуляции иммунной системы субъекта, получающего вакцинную композицию.
[0017] В контексте настоящего описания термин «практически свободный» в отношении определенного компонента используется в настоящем описании для обозначения того, что ни один из указанных компонентов не был специально включен в состав композиции и/или присутствует только в качестве загрязняющего вещества или в следовых количествах. Общее количество указанного компонента в результате любого непреднамеренного загрязнения композиции предпочтительно составляет менее 0,01%. Наиболее предпочтительной является композиция, в которой стандартными аналитическими методами нельзя обнаружить какое-либо количество указанного компонента.
[0018] В контексте настоящего описания термины в единственном числе могут означать один или более. Используемое в пункте(-ах) формулы изобретения единственное число в сочетании со словом «содержащий» может означать один или более чем один.
[0019] Термин «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если в явном виде не указано, что он относится только к альтернативным вариантам, или если альтернативные варианты являются взаимоисключающими, хотя раскрытием подтверждено определение, которое относится только к альтернативным вариантам и «и/или». В контексте настоящего описания термин «другой» может означать по меньшей мере второй или более.
[0020] В настоящей заявке термин «приблизительно» используется для обозначения того, что значение включает предел погрешности, присущий устройству, методу, используемому для определения значения, или изменчивости, существующей среди субъектов исследования.
[0021] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из представленного ниже подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, демонстрирующие предпочтительные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку из приведенного подробного описания специалистам в данной области станут очевидными различные изменения и модификации, находящиеся в пределах сущности и объема изобретения.
ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0022] В некоторых аспектах настоящее изобретение преодолевает ограничения предшествующего уровня техники путем предоставления новых композиций и способов, которые можно использовать для генерации иммунного ответа к Ehrlichia, такого как Ehrlichia canis (E. canis). В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере два белка или иммуногенных пептида E. canis и адъювант, как раскрыто в настоящем описании. Изобретение также относится к родственным способам генерации иммунного ответа на E. canis. В некоторых аспектах предполагается, что включение белка или иммуногенного пептида E. canis в комбинации с бактерином E. canis и/или адъювантом позволяет обеспечить синергическое улучшение иммунного или защитного иммунного ответа у субъекта-млекопитающего, такого как, например, собака.
I. Иммуногенные белки и пептиды Ehrlichia canis
[0023] В некоторых аспектах иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем описании, может содержать по меньшей мере два иммуногенных белка или пептида E. canis и адъювант. Например, иммуногенная композиция может содержать по меньшей мере два иммуногенных белка E. canis и адъювант. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один белок E. canis, один иммуногенный пептид E. canis (например, иммуногенный пептид может быть включен в состав пептида или полипептида) и адъювант. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит по меньшей мере два иммуногенных пептида E. canis (например, иммуногенный пептид может быть включен в состав пептида или полипептида) и адъювант.
[0024] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный белок Ehrlichia (например, E. canis) представляет собой TRP153 (например, также называемый gp153, как описано в US 7204992), TRP36 (например, также называемый gp36, как описано в US 9645148), TRP140 (например, также называемый p140, как описано в US 9250240), TRP28 (например, также называемый p28, как описано McBride et al. Gene. 2000 Aug 22; 254(1-2):245-52), TRP95 (см., например, McBride et al., Infect Immun. 2011 Aug;79(8):3178-87), TRP19 (см., например, Aguiar et al. Ticks Tick Borne Dis. 2016 Feb; 7(1):142-145) или TRP120 (например, Zhu et al., Infect Immun., 2011 Nov; 79(11):4370-81), или один или более пептидов, содержащих или состоящих из его иммуногенной области; в некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция, раскрытая в настоящем описании, может содержать 1, 2, 3, 4 или более из этих иммуногенных белков и адъювант, как раскрыто в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит (TRP140, TRP36 и TRP19) и/или их иммунореактивные пептиды.
[0025] В некоторых вариантах осуществления иммуногенный белок Ehrlichia содержит или состоит из иммуногенной области белка E. canis. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный белок E. canis содержит или состоит из пептида из Таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция включает адъювант и 1, 2, 3, 4, 5 или более иммуногенных пептидов из таблицы 1, которые необязательно могут быть включены в состав пептида или полипептида.
[0026] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит TRP140 (или пептид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 14), TRP36 (или пептид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 3-11 или 16) и адъювант. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит TRP140 (или пептид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 14), TRP36 (или пептид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 3-11 или 16), TRP19 (или пептид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 1), TRP120 (или пептид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 15) и адъювант. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция не содержит TRP19. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит: TRP140 (или пептид, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 14); TRP36 (или пептид, содержащий или состоящий из любой из SEQ ID NO: 3-11 или 16); TRP95 (или пептид, содержащий или состоящий из одной или обеих SEQ ID NO: 12-13) и адъювант. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит 1, 2, 3, 4 или все из: TRP153, TRP36, TRP140, TRP28 и/или TRP95, при этом иммуногенная композиция может дополнительно содержать адъювант, как раскрыто в настоящем описании. Например, иммуногенная композиция может содержать: (TRP153 и TRP36), (TRP153 и TRP140), (TRP153 и TRP28), (TRP153 и TRP95), (TRP36 и TRP140), (TRP36 и TRP28), (TRP36 и TRP95), (TRP140 и TRP28), (TRP140 и TRP95), (TRP28 и TRP95), (TRP19 и TRP153), (TRP19 и TRP36), (TRP19 и TRP140), (TRP19 и TRP28), (TRP19 и TRP95), (TRP120 и TRP153), (TRP120 и TRP36), (TRP120 и TRP140), (TRP120 и TRP28), (TRP120 и TRP95) или (TRP120 и TRP19); при этом иммуногенная композиция предпочтительно содержит адъювант.
II. Бактерин E. canis
[0027] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная или вакцинная композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит бактерин Ehrlichia, предпочтительно бактерин E. canis. Бактерин E. canis может быть получен путем термоинактивации или химической инактивации бактерий E. canis.
[0028] Для получения бактерина E. canis можно использовать различные способы. Например, бактерин может быть инактивирован нагреванием или псораленом в присутствии ультрафиолетового света. Эффективное иммунизирующее количество инактивированного бактерина E. canis может варьировать в зависимости от выбранного штамма или штаммов. Предполагается, что в различных вариантах осуществления можно использовать любое количество бактерина E. canis, достаточное, чтобы вызвать защитный иммунный ответ, отдельно или в комбинации с (i) другими иммуногенными белками или пептидами E. canis (например, как описано в таблице 1) и/или (ii) адъювантом(-ами). В некоторых вариантах осуществления можно использовать единицу дозирования, содержащую по меньшей мере приблизительно 1×104 TCID50 инактивированного бактерина E. canis. Дополнительные способы, которые можно использовать для получения бактерина E. canis, включают, без ограничения, обработку E. canis нагреванием, формальдегидом, формалином, биэтиленамином, облучением и бета-пропиолактоном. Предполагается, что бактерин E. canis может быть инактивирован любым подходящим доступным способом. Дополнительные способы, которые можно использовать для получения бактерина Ehrlichia или E. canis, включают способы, описанные, например, в WO 2005087803, EP 2433646, Vega et al. (Vaccine (2007) 25:519-525) или Stuen et al. (Acta Vet Scand (2015): 57:40).
[0029] В некоторых вариантах осуществления бактерин E. canis содержит инактивированный неочищенный антиген, полученный из инактивированных бактерий E. canis. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть получена замороженная лейкоцитарная пленка (например, 10 мл замороженной лейкоцитарной пленки), содержащая E. canis, и материал может быть инактивирован обработкой 0,3% формальдегидом в течение 48 часов при комнатной температуре. После этого материал можно проверить на отсутствие инфекционности методами in vitro или с использованием животной модели in vivo. Способы инактивации бактерий с помощью формальдегида дополнительно описаны в Tollersrud et al. (Vaccine (2001) 19:3896-3903). Полученный бактерин E. canis может быть включен с (i) 1, 2, 3 или более иммуногенными белками или пептидами E. canis (например, как описано в таблице 1) и/или (ii) адъювантом для образования иммуногенной или вакцинной композиции. Например, инактивированный бактерин E. canis можно приготовить в виде суспензии, а затем включить в эмульсионный адъювант, например, как описано ниже.
III. Адъюванты
[0030] В некоторых аспектах иммуногенная или вакцинная композиция, раскрытая в настоящем описании (например, содержащая по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или более иммуногенных пептидов или белков из: TRP153, TRP36, TRP140, HSP, TRP28, TRP19, TRP140 и/или TRP120, или пептид или полипептид, содержащий или состоящий из пептида таблицы 1), содержит адъювант. Известно множество адъювантов, которые могут быть включены. Например, адъюванты, такие как MF59, AS01, AS02, AS03, AS04, виросомы, CAF01, CAF04, CAF05, Montanide ISATM 720 или Montanide ISATM 51 (см., например, Bonam et al., Trends in Pharmacological Sciences (2017) 38(9):771-778).
[0031] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная или вакцинная композиция включает адъювант, содержащий тритерпеноид, стерол, иммуномодулятор, полимер и/или стимулятор Th2. Например, в некоторых вариантах осуществления адъювант содержит ДЭАЭ-декстран, иммуностимулирующий олигонуклеотид и масло (например, легкое минеральное масло), где иммуностимулирующий олигонуклеотид представляет собой CpG-содержащий ODN, и где адъювантный состав представляет собой эмульсию вода-в-масле (W/O). Вакцинный адъювант может содержать бактерин E. canis (такой как термоинактивированный E. canis) и/или 1, 2, 3 или более иммуногенных белков или пептидов E. canis, указанных в таблице 1 или раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная или вакцинная композиция включает антигенный компонент и адъювантный состав, содержащий сапонин (например, присутствующий в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу), стерол (например, присутствующий в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу), четвертичное аммониевое соединение (например, присутствующее в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу), полимер (например, присутствующий в количестве от приблизительно 0,0001% по объему до приблизительно 75% по объему) и ORN/ODN; причем сапонин может представлять собой Quil A или его очищенную фракцию, стерол может представлять собой холестерин, соединение четвертичного аммония может представлять собой диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид, полимер может представлять собой полиакриловую кислоту, и ORN/ODN может представлять собой CpG. Адъювант может содержать гликолипид, такой как N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат. Адъювант может содержать иммуностимулирующий олигонуклеотид, полимер полиакриловой кислоты и по меньшей мере два из следующих веществ: (а) диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид; (b) стерол; и/или (c) N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат. Например, вакцинная композиция может содержать адъювант, как описано, например, в патенте США 10,238,736, патенте США 8,580,280 или публикации США 2019/0008953.
[0032] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная или вакцинная композиция включает антигенный компонент и адъювантный состав, содержащий тритерпеноидный сапонин, стерол, соединение четвертичного аммония и полимер полиакриловой кислоты, где антигенный компонент содержит или состоит из бактерина E. canis (такого как термоинактивированный E. canis) и/или иммуногенного белка или пептида E. canis (например, 1, 2, 3 или более белков E. canis, раскрытых в настоящем описании, и/или 1, 2, 3 или более пептидов таблицы 1). В некоторых вариантах осуществления сапонин присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, стерол присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, соединение четвертичного аммония присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, и полимер полиакриловой кислоты присутствует в количестве от приблизительно 0,0001% по объему до приблизительно 75% по объему. Например, вакцинная композиция может содержать адъювант, как описано, например, в патенте США 9,662,385.
[0033] В некоторых аспектах иммуногенная или вакцинная композиция, раскрытая в настоящем описании, содержит адъювант на масляной основе, содержащий бактерин E. canis (такой как термоинактивированный E. canis) и/или 1, 2, 3 или более иммуногенных белков или пептидов E. canis, как раскрыто в настоящем описании. Например, адъювантный состав может содержать масляную фазу и водную фазу, поликатионный носитель (например, ДЭАЭ-декстран) и иммуностимулирующий CpG-содержащий олигонуклеотид, при этом вакцина представляет собой эмульсию вода-в-масле. Адъювант необязательно может дополнительно содержать гель гидроксида алюминия. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий CpG-содержащий олигонуклеотид присутствует в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 400 мкг на дозу, и ДЭАЭ-декстран присутствует в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 300 мг на дозу. Адъювантная композиция может содержать иммуностимулирующий олигонуклеотид, поликатионный носитель, стерол, сапонин, четвертичный амин, агонист TLR-3, гликолипид и/или MPL-A (или его аналог) в масляной эмульсии. Например, вакцинная композиция может содержать адъювант, как описано, например, в патенте США 10,117,921 или US 2019/0038737.
[0034] В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция представляет собой эмульсию, содержащую (i) бактерин E. canis (такой как термоинактивированный E. canis) и/или (ii) 1, 2, 3, 4 или более иммуногенных белков или пептидов E. canis, как раскрыто в настоящем описании (например, в таблице 1). Например, эмульсионная композиция может содержать адъювант, такой как акриловый полимер и/или диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид, в водной фазе. В некоторых вариантах осуществления эмульсия может быть получена путем смешивания водной фазы, содержащей антиген (например, бактерин E. canis, такой как термоинактивированный E. canis, и/или 1, 2, 3 или более иммуногенных белков или пептидов E. canis, как раскрыто в настоящем описании) и адъювант, с масляной фазой в присутствии эмульгатора. В некоторых вариантах осуществления вспомогательный компонент содержит эмульсию масло-в-воде, где водная фаза эмульсии масло-в-воде содержит диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид и/или алкил-полиакриловую кислоту (алкил-РАА). В некоторых вариантах осуществления масло в эмульсии масло-в-воде представляет собой минеральное масло, терпеновое масло, соевое масло, оливковое масло или производное пропиленгликоля. Адъювант может дополнительно содержать адъювантный компонент, дополнительно содержащий CpG ДНК, липополисахарид и/или монофосфорил-липид А. Вакцина может дополнительно содержать один или более эмульгаторов. Например, вакцинная композиция может содержать адъювант, как описано, например, в патенте США 9,545,439 или патенте США 8,980,288.
[0035] Адъювант может представлять собой липосому или эмульсионный состав. Липосомы могут быть однослойными, многослойными или мультивезикулярными. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная или вакцинная композиция содержит липид или липид-содержащий адъювант. В некоторых вариантах осуществления липосомы представляют собой катионные липосомы. В различных вариантах осуществления могут быть использованы адъюванты, такие как MF59 (см., например, Calabro et al. (2013) Vaccine 31:3363-3369), AS01 (Didierlaurent et al. (2014) J. Immunol. 193, 1920-1930), AS02 (Garçon и Van Mechelen (2011) Expert Rev. Vaccines 10, 471-486), AS03 (Morel, S. et al. (2011) Vaccine 29, 2461-2473), AS04 (Didierlaurent, et al. (2009) J. Immunol 183:6186-6197), виросомы (Künzi, et al. (2009) Vaccine 27, 3561-3567), CAF01 (Tandrup Schmidt, et al. (2016) Pharmaceutics 8, 7), CAF04 (Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217), CAF05 (Billeskov, et al. (2016) PLoS One 11, e0161217), Montanide ISA™ 720 (Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev. Vaccines 1, 111-118) или Montanide ISA™ 51 (Aucouturier, et al. (2002) Expert Rev. Vaccines 1, 111-118). В таблице 2 приведен список иллюстративных составов, содержащих адъювант, которые можно использовать в различных вариантах осуществления.
IV. Иммуногенные и вакцинные композиции
[0036] В некоторых вариантах осуществления в фармацевтическую композицию могут быть включены 1, 2, 3, 4 или более иммуногенных белков или пептидов, раскрытых в настоящем описании, необязательно с бактерином E. canis и/или адъювантом, например, как раскрыто в настоящем описании. Фармацевтическую композицию можно вводить субъекту-млекопитающему, такому как собака, например, для индуцирования защитного иммунного ответа к Ehrlichia, например E. canis. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию используют в качестве вакцины.
[0037] В некоторых вариантах осуществления иммунореактивную композицию или вакцинную композицию вводят субъекту (например, собаке) для индукции защитного иммунного ответа у субъекта, который может в значительной степени предотвратить или облегчить инфицирование субъекта Ehrlichia canis. Вакцинная композиция для фармацевтического применения у субъекта может содержать иммунореактивный полипептид из 2, 3, 4 или более иммуногенных белков или пептидов, раскрытых в настоящем описании, адъювант, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
[0038] Фразы «фармацевтический», «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным соединениям и композициям, которые не вызывают неблагоприятных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении при необходимости животному, такому как, например, человек. В контексте настоящего описания термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, соли, консерванты, лекарственные вещества, стабилизаторы лекарственных веществ, гели, связующие вещества, вспомогательные вещества, разрыхлители, лубриканты, подсластители, ароматизаторы, красители, аналогичные им материалы и их комбинации, которые известны специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1289-1329, 1990, включено в настоящее описание посредством ссылки). За исключением случаев, когда какой-либо обычный носитель несовместим с активным ингредиентом, предполагается использование носителя в вакцинных композициях по настоящему изобретению.
[0039] В контексте настоящего описания термин «защитный иммунный ответ» относится к ответу иммунной системы хозяина-млекопитающего на антиген Ehrlichia, что приводит к улучшению распознавания антигена и усилению продуцирования антител иммунной системой хозяина-млекопитающего при последующем контакте с возбудителем Ehrlichia. Защитный иммунный ответ позволяет существенно уменьшить или предотвратить симптомы в в случае последующего контакта с Ehrlichia chaffeensis или Ehrlichia canis.
[0040] Специалисту в области медицины понятно, что фактическое количество дозы вакцинной композиции, вводимой пациенту-животному или человеку, может определяться физическими и физиологическими факторами, такими как масса тела, тяжесть состояния, тип заболевания, подверженного лечению, предшествующие или сопутствующие терапевтические вмешательства, идиопатия у пациента и способ введения. Практикующий врач, ответственный за введение, в любом случае сможет определить концентрацию активного(-ых) ингредиента(-ов) в композиции и соответствующую(-ие) дозу(-ы) для отдельного субъекта.
[0041] В некоторых вариантах осуществления вакцинные композиции могут содержать, например, по меньшей мере приблизительно 0,1% иммунореактивного полипептида Ehrlichia, содержащего полипептид формулы I или полипептид, приведенный в таблице 2. В других вариантах осуществления активное соединение может содержать от приблизительно 2% до приблизительно 75% по весу единицы дозирования или, например, от приблизительно 25% до приблизительно 60% и любой диапазон, в указанных пределах. Как и в случае многих вакцинных композиций, частота введения, а также дозировка могут отличаться среди представителей популяции животных или людей способом, предсказуемым специалистом в области иммунологии. В качестве неограничивающего примера фармацевтические композиции и вакцины можно вводить путем инъекции (например, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно или подкожно), интраназально (например, путем аспирации) или перорально. Можно вводить от 1 до 3 доз в течение 1-36 недельного периода. Предпочтительно вводят 3 дозы с интервалами 3-4 месяца, после чего возможны периодические бустерные вакцинации.
[0042] В некоторых вариантах осуществления «подходящая доза» представляет собой количество иммунореактивного полипептида, которое при введении, как описано выше, способно вызвать у иммунизированного пациента иммунный ответ, достаточный для защиты субъекта от инфекции Ehrlichia при последующих воздействиях Ehrlichia на организм. Как правило, количество пептида, присутствующего в подходящей дозе (или продуцируемого in situ нуклеиновой кислотой в дозе), может составлять от приблизительно 1 пг до приблизительно 500 мг на кг массы тела, обычно от приблизительно 10 пг до приблизительно 10 мг, предпочтительно от приблизительно 100 пг до приблизительно 1 мг и более предпочтительно от приблизительно 100 пг до приблизительно 100 микрограмм.
[0043] Вакцинная композиция по настоящему изобретению может содержать разные типы носителей в зависимости от того, должна ли она вводиться в твердой, жидкой или аэрозольной форме, и от того, должна ли она быть стерильной для таких способов введения, как инъекция. Вакцинную композицию, раскрытую в настоящем описании, можно вводить внутримышечно, внутрикожно, подкожно, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутрь очага поражения, внутричерепно, внутрисуставно, внутрипростатически, внутриплеврально, внутритрахеально, интраназально, интравитреально, интравагинально, интраректально, топически, внутриопухолево, внутримышечно, внутрибрюшинно, субконъюнктивально, внутрипузырно, через слизистую, внутриперикардиально, местно, перорально, интраназально или путем ингаляции, инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, лаважа или локальной перфузии. Вакцинную композицию также можно вводить субъекту через катетер, в кремах, в липидных композициях, путем доставки баллистических частиц или другим способом или в виде любой комбинации вышеизложенного, как это известно специалистам в данной области (см., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott Williams and Wilkins, 2005, включенное в настоящее описание посредством ссылки).
[0044] Хотя в вакцинных композициях по настоящему изобретению может быть использован любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области, тип носителя будет меняться в зависимости от способа введения. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из указанных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В качестве носителей для фармацевтических композиций по настоящему изобретению также можно использовать биоразлагаемые микросферы (например, полимолочный галактид). Подходящие биоразлагаемые микросферы раскрыты, например, в патентах США 4,897,268 и 5,075,109.
[0045] Особый интерес в аспекте настоящего изобретения представляет вакцинная композиция, которую можно вводить посредством микроструктурированной трансдермальной доставки или доставки баллистическими частицами. Микроструктуры в качестве носителей для вакцинного состава являются желательной конфигурацией для применения вакцин и широко известны в данной области (например, патенты США 5,797,898, 5,770,219 и 5,783,208 и заявка на патент США 2005/0065463). Такая вакцинная композиция, составленная для доставки баллистическими частицами, может содержать выделенный иммунореактивный полипептид из таблиц 1, 2 или 3, иммобилизованный на поверхности подложки-носителя. В этих вариантах осуществления подложка-носитель может включать, без ограничения, микрокапсулу, микрочастицу, микросферу, нанокапсулу, наночастицу, наносферу или их комбинацию.
[0046] Микроструктуры или баллистические частицы, которые служат в качестве подложки-носителя для иммунореактивного полипептида Ehrlichia, раскрытого в настоящем описании, могут состоять из биоразлагаемого материала и небиоразлагаемого материала, и такие подложки-носители могут состоять из синтетических полимеров, диоксида кремния, липидов, углеводов, белков, лектинов, ионных агентов, сшивающих агентов и других компонентов микроструктуры, доступных в данной области техники. Протоколы и реагенты для иммобилизации пептида по изобретению на подложке-носителе, состоящем из таких материалов, широко доступны в продаже и в данной области техники.
[0047] В других вариантах осуществления вакцинная композиция содержит иммобилизованный или инкапсулированный иммунореактивный полипептид или пептид, раскрытый в настоящем описании, адъювант, как раскрыто в настоящем описании, и подложку-носитель. В этих вариантах осуществления подложка-носитель может включать, помимо прочего, липидную микросферу, липидную наночастицу, этосому, липосому, ниосому, фосфолипид, сфингосому, поверхностно-активное вещество, трансферосому, эмульсию или их комбинацию. Формирование и применение липосом и других композиций липидных нано- и микроносителей в целом известно специалистам в данной области, и использование липосом, микрочастиц, нанокапсул и т.п. получило широкое распространение для доставки терапевтических средств (например, патент США 5,741,516, специально включенный в настоящее описание посредством ссылки). Были рассмотрены многочисленные способы использования липосомных и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств, включая инкапсуляцию пептидов (патенты США 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 и 5,795,587, каждый из которых специально включен в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки).
[0048] В дополнение к способам доставки, описанным в настоящем описании, также рассматривается ряд альтернативных способов введения раскрытых вакцинных композиций. В качестве неограничивающего примера вакцинную композицию можно вводить с помощью сонофореза (т.е. ультразвука), который использовался и описан в патенте США 5,656,016 для повышения скорости и эффективности проникновения лекарственного средства в кровеносную систему и через нее; внутрикостной инъекции (патент США 5,779,708) или доставки с обратной связью (патент США 5,697,899), каждый из патентов в этом абзаце специально включен в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.
[0049] В вакцинах по настоящему изобретению можно использовать любой из множества адъювантов для неспецифического усиления иммунного ответа. Большинство адъювантов содержат вещество, предназначенное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и неспецифический стимулятор иммунных реакций, такой как липид А, Bortadella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Подходящие адъюванты являются коммерчески доступными, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, MI) и адъювант Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Другие подходящие адъюванты включают квасцы, биоразлагаемые микросферы, монофосфориловый липид А и квил А.
[0050] Полипептид может быть включен в композицию в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли с кислотой (образованные со свободными аминогруппами белка) и которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальный и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п.
[0051] В любом случае композиция может содержать различные антиоксиданты для замедления окисления одного или более компонентов. Кроме того, действие микроорганизмов может быть предотвращено с помощью консервантов, таких как различные антибактериальные и противогрибковые агенты, включая, помимо прочего, парабены (например, метилпарабены, пропилпарабены), хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту, тимеросал или их комбинации.
[0052] Стерильные растворы для инъекций готовят путем включения активных пептидов в требуемом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии готовят путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, суспензий или эмульсий предпочтительными методами приготовления являются методы вакуумной сушки или сублимационной сушки, которые позволяют получить порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из предварительно стерильно отфильтрованной жидкой среды. Жидкая среда должна быть соответствующим образом забуферена, если это необходимо, и перед инъекцией жидкий разбавитель необходимо сначала сделать изотоническим, используя достаточное количество физиологического раствора или глюкозы. Предусмотрено также приготовление высококонцентрированных композиций для прямого введения, при этом предполагается, что использование ДМСО в качестве растворителя приводит к чрезвычайно быстрому проникновению, позволяет доставлять высокие концентрации активных агентов на небольшую площадь.
[0053] Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Следует понимать, что загрязнение эндотоксином должно поддерживаться на минимально безопасном уровне, например менее 0,5 нг/мг белка.
[0054] В конкретных вариантах осуществления пролонгированное всасывание инъекционной композиции может быть достигнуто путем использования в композициях замедляющих всасывание агентов, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.
V. Наборы для вакцинации от Ehrlichia
[0055] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены наборы для вакцинации субъекта (например, собаки) от инфекции E. canis, которые включают иммуногенный полипептид или иммуногенный пептид, раскрытый в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления композицию можно вводить субъекту для индуцирования защитного иммунного ответа против инфекции E. canis.
[0056] В зависимости от осуществляемого способа набор может дополнительно включать одно или более устройств для доставки композиции субъекту или для иного обращения с композицией по изобретению. В качестве неограничивающего примера набор может включать устройство, которое представляет собой шприц, пипетку, аппликатор баллистических частиц (например, аппликаторы, раскрытые в патентах США 5,797,898, 5,770,219 и 5,783,208, и заявке на патент США 2005/0065463) и т.п.
[0057] Когда реагенты и/или компоненты, входящие в набор, представлены в лиофилизированной форме (лиофилизате) или в виде сухого порошка, лиофилизат или порошок можно восстановить путем добавления подходящего растворителя. В конкретных вариантах осуществления растворитель может представлять собой стерильный фармацевтически приемлемый буфер и/или другой разбавитель. Предполагается, что такой растворитель также может быть представлен как часть набора.
[0058] Когда компоненты набора представлены в виде одного и/или более жидких растворов, жидкий раствор может быть, в качестве неограничивающего примера, стерильным водным раствором. Композиции также могут быть составлены в виде композиции, предназначенной для введения. В этом случае средство-контейнер само по себе может быть шприцем, пипеткой, аппликатором для местного применения и т.п., из которого состав можно наносить на пораженный участок тела, вводить субъекту и/или наносить на кожу или смешивать с другими компонентами набора.
VI. Способы получения иммунореактивного полипептида
[0059] Иммунореактивный полипептид по настоящему изобретению может быть получен с помощью различных способов, включая рекомбинантное получение белка из клеток, методы транскрипции и трансляции in vitro (IVTT) и/или пептидный синтез (например, с помощью твердофазного синтеза).
[0060] IVTT можно использовать для рекомбинантного получения белка с использованием различных типов клеток (например, бактериальных клеток, клеток млекопитающих, клеток E. coli, дрожжей и насекомых и т.д.). В данной области известны различные подходы к IVTT, которые можно использовать в различных вариантах осуществления. IVTT обычно включает бесклеточные методы получения или синтеза белка из ДНК. В бесклеточной системе для получения белка может использоваться, например, экстракт E. coli, экстракты простейших, дрожжевые экстракты, экстракты клеток человека, экстракт зародышей пшеницы, экстракты млекопитающих, экстракты из культивируемых линий клеток человека, лизат ретикулоцитов кролика, экстракт клеток насекомых или восстановленные и очищенные компоненты E. coli. Коммерчески доступными являются многочисленные наборы, включая, например, RTS (FivePrime, San Francisco, CA), Expressway™ (Life Technologies); высокопродуктивный S30 T7 (Promega), одноэтапный IVT человека (Thermo Scientific), WEPRO® (CellFree Sciences), TNT® связанный (Promega), RTS CECF (5 PRIME), TNT® связанный (Promega), Retic lysate IVT™ (Life Technologies); TNT® T7 (Promega), набор EasyXpress Insect (Qiagen/RiN A), PURExpress® (New England Biolabs) и PURESYSTEM® (BioComber). Такие методы можно использовать для включения неприродных аминокислот в белки, если это желательно. Бесклеточные системы экспрессии, которые можно использовать в различных вариантах осуществления, также описаны, например, в Zemella et al., 2015.
[0061] Выделенный иммунореактивный белок, раскрытый в настоящем описании, может быть получен в некоторых вариантах осуществления с помощью соответствующего метода, известного в области органической химии. Например, пептиды могут быть получены с помощью одного из общепринятых методов твердофазного пептидного синтеза, которые хорошо известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления пептиды могут быть синтезированы с помощью оборудования для автоматизированного синтеза пептидов, которое можно приобрести у коммерческих поставщиков, таких как Perkin Elmer (Foster City, CA), или пептид может быть химически синтезирован с помощью методов гомогенного синтеза, таких как описанные в Carpino. et al., 2003 или заявке на патент США 2009/0005535. В некоторых вариантах осуществления пептиды или более короткие белки могут быть синтезированы, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза (SPPS), твердофазного пептидного синтеза по схеме t-Boc или твердофазного пептидного синтеза по схеме Fmoc.
[0062] В некоторых вариантах осуществления иммунореактивный белок, раскрытый в настоящем описании, может быть получен рекомбинантным путем из нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или пептид. Такая нуклеиновая кислота может быть функционально связана с вектором экспрессии. В качестве неограничивающего примера иммунореактивный белок может быть экспрессирован из вектора и выделен из питательной среды клетки-хозяина, содержащей вектор. В некоторых вариантах осуществления иммунореактивный белок может быть получен в бесклеточной системе из нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид.
[0063] В целом, независимо от способа получения, иммунореактивные белки, раскрытые в настоящем описании, предпочтительно получают в основном в чистом виде. Предпочтительно иммунореактивные белки имеют чистоту по меньшей мере приблизительно 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99%.
VII. Примеры
[0064] Представленные ниже примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области должно быть понятно, что способы, раскрытые в представленных ниже примерах, представляют собой способы, обнаруженные изобретателем, которые хорошо работают при практическом применении изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как представляющие собой предпочтительные способы его практического применения. Тем не менее, специалисты в данной области техники должны, в свете настоящего раскрытия, понимать, что в конкретных раскрытых вариантах осуществления могут быть сделаны многочисленные изменения, приводящие в конечном счете к подобному или аналогичному результату, без отступления от сущности и объема изобретения.
Пример 1. Оценка эффективности вакцины от бактерий Ehrlichia Canis и рекомбинантных антигенов TRP у собак породы бигль
[0065] Цель исследования заключалась в оценке эффективности бактериальной вакцины Ehrlichia canis, полученной с помощью различных процессов в виде новой адъювантной композиции, состоящей из Quil A, холестерина и CpG-ODN SEQ ID NO: 17 (5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3', где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи, а «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину) (QCT; каждый компонент присутствует в количестве 50 мкг/дозу), против заражения гетерологичным штаммом Ehrlichia canis (E. canis) Ebony собак в возрасте приблизительно 12 недель на момент первой вакцинации. Кроме того, эффективность вакцин, содержащих рекомбинантные белки тандемных повторов (TRP) размером 19, 36 и 120 кДа E. canis, оценивали либо в виде трехкомпонентной комбинированной вакцины, либо в виде совместно вводимой комбинированной вакцины (бактерин с QCT) + (TRP антигены с QCT).
[0066] Семьдесят два (72) самца породы бигль в возрасте приблизительно 12 недель случайным образом распределяли в одну из шести групп лечения (12 животных/группа лечения) в рамках рандомизированного полного блочного дизайна. Группы лечения были определены как T01 - контрольные группы с физиологическим раствором; T02 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson, инактивация BEI (бинарный этиленимин) + QCT; T03 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson, инактивация BEI+QCT; T04 - [цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson, инактивация BEI+QCT] и [TRP 140, 36, 19+QCT] (вводимые совместно); T05 - бактерин, инактивированный формалином+QCT; и T06 - TRP 140, 36, 19+QCT (табл. 1).
[0067] Все собаки были здоровыми и имели отрицательный результат теста IDEXX SNAP 4Dx Plus на E. canis до вакцинации в день 0. Всех животных вакцинировали подкожно либо плацебо (физиологическим раствором), либо экспериментальным ветеринарным продуктом (IVP) в дни 0 и 28. Животных заражали внутривенно штаммом E. canis Ebony через шесть недель после второй вакцинации. Ежедневно измеряли температуру барабанной перепонки, и всех животных ежедневно осматривали на наличие клинических признаков инфекции E. canis до конца исследования (день 134). Образцы крови собирали для полного биохимического анализа крови (CBC) каждые три дня после заражения, а также для анализа количественной ПЦР, начиная с седьмого дня после заражения. Дополнительные образцы крови собирали для тестирования IDEXX SNAP® 4Dx Plus в дни 0, 28, 49 и 134; тестирования ELISA в дни 0, 28, 49, 68-70 и 134; и для анализа CMI в дни 0, 35, 83 и 104.
*Вакцинацию в день 0 выполняли в область правого плеча. Вакцинацию в день 28 выполняли в область левого плеча.
[0068] Эффективность в этом исследовании определяли по уменьшению тромбоцитопении (количества тромбоцитов <143×103/мкл и уменьшению >50% по сравнению с исходным уровнем) и клиническому проявлению заболевания (главным образом, лихорадки) после заражения. Эффект вакцины подтверждали, если после заражения группы лечения Т02, Т03, Т04, Т05 и/или Т06 имели значительно более низкую тромбоцитопению или значительно более легкое клиническое проявление заболевания по сравнению с контрольными группами Т01.
Результаты
[0069] Для этого исследования кПЦР выполняли, используя нерасфасованные антигены для стандартизации составов вакцин на основе геномов инактивированных бактеринов. Целевые вакцины для этого исследования смешивали с 400 мкг инактивированного бактерина.
[0070] Наличие тромбоцитопении (количества тромбоцитов <143×103/мкл) после заражения значительно снизилось в группах лечения T02 (67%, P=0,0497), T03 (67%, P=0,0497) и T04 (58%, P=0,0141) по сравнению с группой лечения T01 (100%). В группах лечения T05 (75%) и T06 (83%) значимое уменьшение тромбоцитопении по сравнению с группой лечения T01 (контроль) отсутствовало (таблицы 2 и 3).
T01 - Контроль, физиологический раствор
T02 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация BEI) + QCT
T03 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (без среды; инактивация BEI) + QCT
T04 - [цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация BEI) + QCT] + [TRP 140, 36, 19+QCT]
T05 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация формалином) + QCT
T06 - TRP 140, 36, 19+QCT
относительно исходного уровня)
P-значения
сравнения
P-значения
T01 - Контроль, солевой раствор
T02 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация BEI) + QCT
T03 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (без среды; инактивация BEI) + QCT
T04 - [цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация BEI) + QCT] + [TRP 140, 36, 19+QCT]
T05 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba Silverson (инактивация формалином) + QCT
T06 - TRP 140, 36, 19+QCT
[0071] Продолжительность тромбоцитопении значительно снизилась в группе лечения T04 совместного введения по сравнению с контрольной группой T01 по обоим показателям тромбоцитопении. При измерении тромбоцитопении по количеству тромбоцитов <143×103/мкл, продолжительность тромбоцитопении в группе T04 составила 23,08 дня (LSM) по сравнению с 47,42 дня в группе T01 (P=0,0014). При измерении тромбоцитопении по уменьшению количества тромбоцитов >50% по сравнению с исходным уровнем, продолжительность в группе T04 составила 23,83 дня по сравнению с 47,92 днями в группе T01 (P=0,0020).
[0072] Все вакцинированные группы лечения, содержащего бактерин (T02-T05), показали значительное сокращение продолжительности тромбоцитопении по сравнению с группой лечения T01 (контроль). В группе T06 лечения, содержащего только антигены TRP+адъювант, значимое сокращение продолжительности тромбоцитопении по сравнению с контрольной группой отсутствовало при определении тромбоцитопении по уменьшению количества тромбоцитов >50% по сравнению с исходным уровнем, было значимым при определении тромбоцитопении по количеству тромбоцитов <143×103/мкл (данные не показаны). Вполне возможно, что инактивированный бактерин необходим для сокращения продолжительности тромбоцитопении, и его действие усиливается при добавлении белков тандемных повторов. Однако такая доза белков тандемных повторов, введенная в виде самостоятельной вакцины, не сокращала продолжительность тромбоцитопении.
[0073] Титры антител каждой вакцинированной группы (T02-T06) значимо отличались по сравнению с контрольной группой (T01) в дни 28 (исключая T06), 49, 68, 69 и 70. Все вакцинные препараты вызывали гуморальный ответ на E. canis (данные не показаны). В день 134 в конце исследования титры антител каждой вакцинированной группы (T02-T06) не имели значимых отличий относительно группы T01.
[0074] Сравнения лечебных групп относительно наличия у животного клинического проявления заболевания после заражения не были завершены, поскольку все животные имели клиническое заболевание, определяемое по наличию по меньшей мере одного клинического признака после заражения, за исключением одного животного в группе лечения Т03.
[0075] Наиболее значимыми клиническими признаками заболевания, вызванного E. canis, у собак являются тромбоцитопения и лихорадка. По этому определению 11 (91,7%) контрольных животных имело заболевание после заражения; в группах Т02 и Т03, получавших только бактерин, после заражения заболели 8 (66,7%) животных; в группе T04 совместного введения бактерина и TRP после заражения заболевание имели 6 (50%) животных; в группе формалин-бактерин заразилось 9 (75%) животных; и в группе T05, получавшей вакцины, содержащие только TRP, после контрольного заражения заболевание имели 10 (83,3%) животных.
[0076] Единственное значимое улучшение в течении заболевания после заражения, определяемое по лихорадке + тромбоцитопении, по сравнению с контрольной группой (T01), наблюдали в группе T04, в которой одновременно вводили цельноклеточную бактериальную вакцину без среды + TRP-вакцину (Р=0,0399).
Выводы
[0077] Эффективность в этом исследовании определяли по уменьшению после заражения тромбоцитопении и клинических признаков, а именно лихорадки. Все животные в день 0 имели отрицательные результаты тестов IDEXX SNAP 4Dx Plus и количественной ПЦР на E. canis.
[0078] После заражения у всех контрольных животных (T01) развилась тромбоцитопения (первичная переменная). Напротив, только 7/12 животных в группе лечения Т04 имели тромбоцитопению, что является значимым снижением (P=0,0141) по сравнению с контрольной группой Т01. Продолжительность тромбоцитопении (≤143000) в днях также была короче в группе T04 совместного введения вакцин по сравнению с контрольной группой T01.
[0079] После заражения у 11/12 контрольных животных (T01) развилась лихорадка (>39,7°C). Среди животных в группе лечения T04 после заражения лихорадка наблюдалась у 7/12 собак. В группах T02 и T03 после заражения лихорадкой страдали 8/12 собак, а в группах T05 и T06 лихорадка после заражения была у 10/12 собак.
[0080] В группе совместного введения вакцин (T04) наблюдалось значимое снижение заболеваемости после заражения, которое определяли по тромбоцитопении и лихорадке, (P=0,0399). Вакцины, совместно вводимые группе T04 (вакцина бактерина E. canis+вакцина рекомбинантных белков TRP), соответствовали критериям эффективности.
Пример 2. Подтверждение эффективности вакцины бактерина Ehrlichia canis и рекомбинантных антигенов TRP у собак породы бигль
[0081] Целью данного исследования является подтверждение предварительной эффективности вакцины, содержащей бактерин Ehrlichia canis (E. canis) и рекомбинантные белки тандемного повтора (TRP), смешанные вместе в составе адъюванта, состоящего из Quil A, холестерина и CpG (QCT), против гетерологичного E. canis (штамм Ebony) у собак в возрасте приблизительно 12 недель на момент первой вакцинации. Предварительная эффективность была установлена ранее, когда подкожно вводили отдельные вакцины, содержащие инактивированный бактерин с QCT, и вакцину, содержащую три белка TRP и QCT, с интервалом в 28 дней. Кроме того, исследование также предназначено для оценки эффективности вакцины, содержащей как бактерин, так и химерный белок E. canis.
[0082] Сорок восемь (48) самок породы бигль в возрасте приблизительно 12 недель случайным образом распределяют в одну из четырех групп лечения (12 животных/группа лечения) в рамках рандомизированного полного блочного дизайна. Группы лечения определяют как T01 - физиологический раствор, T02 - [цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba, инактивация BEI (бинарный этиленимин) + QCT] и [TRP 140, 36, 19+QCT] (вводимые совместное), T03 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba, инактивация BEI+TRP 140, 36, 19+QCT (смешанные), T04 - цельноклеточный препарат бактерина E. canis Sheba, инактивация BEI+QCT+химерный белок (таблица 4).
[0083] Все животные являются здоровыми и имеют отрицательные результаты тестов IDEXX SNAP 4DX и количественной ПЦР на E. canis в день 0. Всех животных вакцинируют подкожно либо плацебо (физиологическим раствором), либо экспериментальным ветеринарным продуктом (IVP) в дни 0 и 28. Животных внутривенно заражают штаммом E. canis Ebony через три недели после второй вакцинации. Ежедневно измеряют температуру барабанной перепонки, и всех животных ежедневно наблюдают на наличие клинических признаков инфекции E. canis до конца исследования. Образцы крови собирают для полного биохимического анализа крови (CBC) каждые три дня после заражения и тестируют с помощью количественной ПЦР, начиная с седьмого дня после заражения. Дополнительные образцы крови берут для тестов IDEXX SNAP® 4Dx Plus и ELISA.
1 Вакцинацию в день 0 выполняют в область правого плеча. Вакцинацию в день 28 выполняют в область левого плеча.
2 Целевая доза для контрольного заражения составляет 500 инфицированных клеток в 1,0 мл, вводимых внутривенно.
[0084] Первичными переменными являются тромбоцитопения (количество тромбоцитов ниже 143×103/мкл или уменьшение >50% по сравнению с уровнями до заражения) и клиническое проявление заболевания. Эффект вакцины подтверждали, если после заражения групп лечения группы T02, T03 и/или T04 имеют значительно более низкую тромбоцитопению или значительно более легкое клиническое проявление заболевания по сравнению с контрольными группами Т01 (p<0,10). Эффект вакцины также считается продемонстрированным, если нижняя граница 90%-го доверительного интервала предотвращенной доли заболеваемости в анализе парных данных при сравнении групп T02, T03 и T04 с T01 выше 0. Эффект вакцины считается подтвержденным, если продолжительность тромбоцитопении хотя бы в одной из вакцинированных групп значительно сократилась по сравнению с контролем (T01), и/или если нижняя граница 90% доверительного интервала выше 0 для доли со смягченной формой заболевания в анализе парных данных, а также имеет сдвиг в пятичисловой сводке (минимум; 25-й процентиль; медиана; 75-й процентиль и максимум).
[0085] Тромбоцитопению (группы лечения T01-T04) анализируют по возможности с помощью обобщенной линейной смешанной модели с биномиальным распределением и функцией логит-связи. Фиксированный эффект относится к лечению, а случайный эффект относится к блоку. В противном случае данные анализируют с применением точного критерия Фишера. Средние значения, определенные методом наименьших квадратов, стандартные ошибки и 90% доверительные интервалы подвергают обратному преобразованию, если обобщенная линейная смешанная модель сходится. Предотвращенные доли заболеваемости по постоянно наблюдаемой тромбоцитопении в анализе парных данных вычисляют для групп лечения T02, T03 и T04 относительно T01 с 90% доверительными интервалами. Парный анализ основан на блоке.
[0086] Продолжительность тромбоцитопении, определяемой по количеству тромбоцитов <143×103/мкл и уменьшению >50% по сравнению с уровнями до заражения, вычисляют для каждого животного после заражения. Продолжительность равна количеству дней от первого случая тромбоцитопении до последнего дня или 0, если у животного нет тромбоцитопении. Продолжительность анализируют с помощью обобщенной линейной смешанной модели с фиксированным эффектом лечения и случайными эффектами блока, и остатком. Рассчитывают средние значения для групп лечения методом наименьших квадратов, стандартные ошибки, 90% доверительные интервалы, минимумы и максимумы. Группу лечения T01 сравнивают с группами лечения T02, T03 и T04 методом контрастов. Рассчитывают доли со смягченной формой заболевания в анализе парных данных между T01 и другими группами лечения с 90% доверительными пределами. Парный анализ основан на блоке.
[0087] Заболевание определяют по наличию лихорадки у животного (повышенная температура тела ≥39,5°C) и тромбоцитопении (количество тромбоцитов <143×103/мкл) в любой момент времени после заражения. Распределение частоты клинического заболевания вычисляют для каждой группы лечения. Клиническое проявление заболевание (группы лечения T01-T04) анализируют по возможности с помощью обобщенной линейной смешанной модели с биномиальным распределением и функцией логит-связи. Фиксированный эффект считают лечением, а случайный эффект относится к блоку. В противном случае данные анализируют с применением точного критерия Фишера. Группы лечения T02-T04 сравнивают с T01 методом контрастов. Средние значения, рассчитанные методом наименьших квадратов, стандартные ошибки и 90% доверительные интервалы подвергают обратному преобразованию, если обобщенная линейная смешанная модель сходится. Предотвращенные доли заболеваемости по постоянно наблюдаемому клиническому проявлению заболевания в анализе парных данных вычисляют для групп лечения T02, T03 и T04 относительно T01 с 90% доверительными интервалами. Парный анализ основан на блоке
[0088] Все способы, раскрытые и заявленные в настоящем описании, могут быть реализованы без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Хотя композиции и способы по настоящему изобретению описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что способы и этапы или последовательности этапов раскрытого в настоящем описании способа могут быть изменены без отклонения от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, очевидно, что раскрытые в настоящем описании агенты могут быть заменены некоторыми агентами, которые являются химически и физиологически родственными, с достижением таких же или аналогичных результатов. Все такие подобные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции изобретения, определенного прилагаемой формулой изобретения.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Приведенные ниже ссылки, в той мере, в какой они предоставляют иллюстративные процедурные или другие подробности, дополняющие изложенные в настоящем описании, специально включены в настоящее описание посредством ссылки.
Европейский патент 2433646
Патент США 4,373,932
Патент США 4,220,450
Патент США 4,897,268
Патент США 4,472,509
Патент США 4,938,948
Патент США 5,075,109
Патент США 5,440,013
Патент США 5,446,128
Патент США 5,470,723
Патент США 5,470,932
Патент США 5,543,504
Патент США 5,552,157
Патент США 5,565,213
Патент США 5,567,434
Патент США 5,618,914
Патент США 5,656,016
Патент США 5,670,155
Патент США 5,697,899
Патент США 5,738,868
Патент США 5,741,516
Патент США 5,770,219
Патент США 5,779,708
Патент США 5,783,208
Патент США 5,795,587
Патент США 5,797,898
Патент США 5,840,833
Патент США 5,853,744
Патент США 5,859,184
Патент США 5,891,506
Патент США 5,929,237
Патент США 6,136,610
Патент США 6,210,708
Патент США 6,372,445
Патент США 6,617,142
Патент США 6,875,750
Патент США 6,951,765
Патент США 7,163,677
Патент США 7,204,992
Патент США 7,282,194
Патент США 7,344,893
Патент США 7,371,582
Патент США 8,580,280
Патент США 8,980,288
Патент США 9,250,240
Патент США 9,545,439
Патент США 9,645,148
Патент США 9,662,385
Патент США 10,117,921
Патент США 10,238,736
Заявка на патент США 2005/0047972
Заявка на патент США 2005/0065463
Заявка на патент США 2005/0250141
Заявка на патент США 2007/0264664
Заявка на патент США 2009/0005535
Заявка на патент США 2019/0008953
Заявка на патент США 2019/0038737
WO2005087803
Aguiar et al. Ticks Tick Borne Dis. 2016 Feb; 7(1):142-145.
Aucouturier, et al. (2002) Montanide ISA 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines. Expert Rev. Vaccines 1, 111-118.
Billeskov, et al. (2016) Testing the H56 vaccine delivered in 4 different adjuvants as a BCG-booster in a non-human primate model of tuberculosis. PLoS One 11, e0161217.
Bonam et al., Trends in Pharmacological Sciences (2017) 38(9): 771-778.
Calabro et al. (2013) Vaccine 31: 3363-3369
Carpino et al., Org. Proc. Res. Dev., 7(1)28-37, 2003.
Didierlaurent, et al. (2009) AS04, an aluminum salt-and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity. J. Immunol. 183, 6186-6197.
Didierlaurent, et al. (2014) Enhancement of adaptive immunity by the human vaccine adjuvant AS01 depends on activated dendritic cells. J. Immunol. 193, 1920-1930.
Dumler et al., Clin. Infect. Dis., 45:S45-S51, 2007.
Feng and Walker, Infect. Immun., 72:966-971, 2004.
Fishbein et al., Human ehrlichiosis in the United States, 1985 to 1990. AnnInternMed 120:736-743, 1994.
Garçon and Van Mechelen (2011) Recent clinical experience with vaccines using MPL-and QS-21-containing adjuvant systems. Expert Rev. Vaccines 10, 471-486.
Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81(13):3998-4002, 1984.
He et al., Vaxign: the first web-based vaccine design program for reverse vaccinology and applications for vaccine development. J Biomed Biotechnol 2010:297505, 2010.
Hotopp et al., Comparative genomics of emerging human ehrlichiosis agents. PLoS Genet 2:e21, 2006.
Künzi, et al. (2009) Immunogenicity and safety of low dose virosomal adjuvanted influenza vaccine administered intradermally compared to intramuscular full dose administration. Vaccine 27, 3561-3567.
Kuriakose et al., Ehrlichia chaffeensis transcriptome in mammalian and arthropod hosts reveals differential gene expression and post transcriptional regulation. PLoS One 6:e24136, 2011.
Kuriakose et al., Molecular basis of antibody mediated immunity against Ehrlichia chaffeensis involves species-specific linear epitopes in tandem repeat proteins. Microbes Infect 14:1054-1063, 2012.
Li and Winslow, Survival, replication, and antibody susceptibility of Ehrlichia chaffeensis outside of host cells. InfectImmun 71:4229-4237, 2003.
Li et al., Antibodies highly effective in SCID mice during infection by the intracellular bacterium Ehrlichia chaffeensis are of picomolar affinity and exhibit preferential epitope and isotype utilization. JImmunol 169:1419-1425, 2002.
Li et al., Outer membrane protein-specific monoclonal antibodies protect SCID mice from fatal infection by the obligate intracellular bacterial pathogen Ehrlichia chaffeensis. JImmunol 166:1855-1862, 2001.
Lin et al., Global proteomic analysis of two tick-borne emerging zoonotic agents: Anaplasma phagocytophilum and Ehrlichia chaffeensis. Front Microbiol 2:24, 2011.
Magnan et al., High-throughput prediction of protein antigenicity using protein microarray data. Bioinformatics 26:2936-2943, 2010.
McBride and Walker, Progress and obstacles in vaccine development for the ehrlichioses. Expert Rev Vaccines 9:1071-1082, 2010.
McBride et al., Infect Immun. 2011 Aug; 79(8):3178-87.
McBride et al. Gene. 2000 Aug 22; 254(1-2):245-52.
Mizuno et al., Chemistry.23(58):14394-14409, Oct 17 2017.
Morel, et al. (2011) Adjuvant System AS03 containing a-tocopherol modulates innate immune response and leads to improved adaptive immunity. Vaccine 29, 2461-2473.
Nandi et al., CD4 T-cell epitopes associated with protective immunity induced following vaccination of mice with an ehrlichial variable outer membrane protein. InfectImmun 75:5453-5459., 2007.
Olano et al., Human monocytotropic ehrlichiosis, Missouri. EmergInfectDis 9:1579-1586, 2003.
Paparone et al., Ehrlichiosis with pancytopenia and ARDS. New Jersey Med 92:381-385, 1995.
Paterson et al., Anal Chem. 86(19):9481-8, Oct 7; 2014.
Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, at A12-A13, 1991
Racine et al., IgM production by bone marrow plasmablasts contributes to long-term protection against intracellular bacterial infection. J Immunol 186:1011-1021, 2011.
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1289-1329, 1990.
Sotomay et al., Animal model of fatal human monocytotropic ehrlichiosis. AmJPath 158:757-769, 2001.
Stuen et al. (Acta Vet Scand (2015):57:40).
Tandrup Schmidt, et al. (2016) Liposome-based adjuvants for subunit vaccines: formulation strategies for subunit antigens and immunostimulators. Pharmaceutics 8, 7.
The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005
Tollersrud et al., «Staphylococcus aureus capsular polysaccharide type 5 conjugate and whole cell vaccines stimulate antibody responses in cattle» (2001) Vaccine 19:3896-3903
Vega et al. (Vaccine (2007) 25:519-525.
Walker and Dumler, Human monocytic and granulocytic ehrlichioses. Discovery and diagnosis of emerging tick-borne infections and the critical role of the pathologist. [Review] [50 refs]. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 121:785-791, 1997.
Walker et al., Ehrlichia chaffeensis: a prevalent, life-threatening, emerging pathogen. Trans Am Clin Climatol Assoc 115:375-382; discussion 382-374, 2004.
Winslow et al., Ann. NY Acad. Sci., 990:435-443, 2003.
Winslow et al., Infect. Immun., 68:2187-2195, 2000.
Winslow et al., Infection of the laboratory mouse with the intracellular pathogen Ehrlichia chaffeensis. InfectImmun 66:3892-3899, 1998.
Yager et al., Infect. Immun., 73:8009-8016, 2005.
Zemella et al., Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. Chembiochem.;16(17):2420-2431, 2015.
Zhu et al., Infect Immun. 2011 Nov; 79(11):4370-81
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION
ZOETIS SERVICES LLC
<120> ВАКЦИНЫ ПРОТИВ EHRLICHIA И ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ
<130> CLFR.P0490WO
<140> Not yet assigned
<141> 2020-07-13
<150> US 62/873,843
<151> 2019-07-12
<150> US 62/879,762
<151> 2019-07-29
<150> US 63/049,476
<151> 2020-07-08
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 1
His Phe Thr Gly Pro Thr Ser Phe Glu Val Asn Leu Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
Lys Met Glu Leu Gln Glu Val Ser
20
<210> 2
<211> 21
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 2
Ala Lys Glu Glu Lys Asn Ala Thr Ala Lys Thr Phe Gln Leu Lys Gly
1 5 10 15
Asp Trp Asp Gly Ala
20
<210> 3
<211> 9
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 3
Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 4
Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 5
Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala
1 5
<210> 6
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 6
Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala
1 5 10 15
Glu Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala
20 25
<210> 7
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 7
Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu
20 25
<210> 8
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 8
Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro
1 5 10 15
Ala Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala
20 25
<210> 9
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 9
Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala
20 25
<210> 10
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 10
Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala Glu
20 25
<210> 11
<211> 26
<212> Белок
<213> Ehrlichia spp.
<400> 11
Thr Glu Asp Pro Val Ser Ala Thr Ala Ala Ser Val Val Pro Glu Ala
1 5 10 15
Glu Thr Glu Asp Ser Val Ser Ala Pro Ala
20 25
<210> 12
<211> 24
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 12
Asp Asp Ser Lys Leu Pro Val Ile Lys Val Glu Asp Lys Ser Lys Leu
1 5 10 15
Gln Asp Thr Lys Asp Lys Lys Arg
20
<210> 13
<211> 19
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 13
Lys Lys Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Asp Tyr Thr Ile Thr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Asp Asp Asp
<210> 14
<211> 25
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 14
Glu His Ser Ser Ser Glu Val Gly Glu Lys Val Ser Glu Thr Ser Lys
1 5 10 15
Glu Glu Asn Thr Pro Glu Val Lys Ala
20 25
<210> 15
<211> 22
<212> Белок
<213> Ehrlichia chaffeensis
<400> 15
Ser Lys Val Glu Gln Glu Glu Thr Asn Pro Glu Val Leu Ile Lys Asp
1 5 10 15
Leu Gln Asp Val Ala Ser
20
<210> 16
<211> 28
<212> Белок
<213> Ehrlichia canis
<400> 16
Glu Ala Ser Val Val Pro Ala Ala Glu Ala Pro Gln Pro Ala Gln Gln
1 5 10 15
Thr Glu Asp Glu Phe Phe Ser Asp Gly Ile Glu Ala
20 25
<210> 17
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олиго
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n = 5'-йод-2'-дезоксиуридин
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(24)
<223> фосфодиэфирная связь
<400> 17
ncgtcgacga tcggcggccg ccgt 24
<---
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ХИМЕРНЫЕ ГЕНЫ OSPA, БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2773402C2 |
ПЕПТИДНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-31 | 2019 |
|
RU2786441C2 |
ИММУНОДОМИНАНТНЫЙ АНТИГЕННЫЙ БЕЛОК МАССОЙ 120 КДА И ГЕН EHRLICHIA CANIS | 1999 |
|
RU2232814C2 |
ПЕПТИДНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ИММУНОТЕРАПИИ ДЕМЕНЦИИ АЛЬЦГЕЙМЕРОВСКОГО ТИПА | 2013 |
|
RU2811687C2 |
НОВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ HAEMOPHILUS PARASUIS | 2020 |
|
RU2822516C1 |
ХИМЕРНЫЕ ГЕНЫ OSPA, БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2011 |
|
RU2583289C2 |
ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ | 2013 |
|
RU2721274C2 |
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ИММУННЫХ ОТВЕТОВ | 2017 |
|
RU2770060C2 |
АДЪЮВАНТЫ НА МАСЛЯНОЙ ОСНОВЕ | 2014 |
|
RU2816851C2 |
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ | 2016 |
|
RU2732118C2 |
Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыта иммуногенная композиция, содержащая: TRP140, TRP36 и TRP19 и фармацевтически приемлемый эксципиент, причем указанный фармацевтически приемлемый эксципиент содержит адъювант, причем указанный адъювант содержит тритерпеноидный сапонин, стерол и иммуностимулирующий CpG-содержащий олигонуклеотид. Описан способ диагностики воздействия или заражения Ehrlicia или E. canis, включающий: получение биологического образца от субъекта-млекопитающего и тестирование биологического образца на иммунореактивность к TRP19, или TRP140 и TRP140, или TRP120, или TRP28; причем иммунореактивность к TRP120, TRP140 и/или TRP19 указывает на то, что субъект подвергся воздействию или был инфицирован Ehrlicia или E. canis. Описан способ индукции иммунного ответа у субъекта-млекопитающего, включающий введение субъекту фармацевтически релевантного количества иммуногенной композиции. Изобретение расширяет арсенал средств для иммунизации против Ehrlichia canis. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 6 табл., 2 пр.
1. Иммуногенная композиция, содержащая:
TRP140, TRP36 и TRP19
и фармацевтически приемлемый эксципиент, причем указанный фармацевтически приемлемый эксципиент содержит адъювант, причем указанный адъювант содержит тритерпеноидный сапонин, стерол и иммуностимулирующий CpG-содержащий олигонуклеотид.
2. Иммуногенная композиция по п.1, где тритерпеноидный сапонин представляет собой Quil A.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, где стерол представляет собой холестерин.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-3, где CpG-содержащий ODN представляет собой 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:17), где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи и «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину.
5. Иммуногенная композиция по п.1, где композиция содержит полипептид, содержащий SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:14.
6. Иммуногенная композиция по п.1, где адъювант дополнительно содержит полимер полиакриловой кислоты.
7. Иммуногенная композиция по п.6, где адъювант дополнительно содержит соединение четвертичного аммония.
8. Иммуногенная композиция по п.7, где сапонин представляет собой Quil A или его очищенную фракцию, стерол представляет собой холестерин, соединение четвертичного аммония представляет собой диметилдиоктадециламмония (DDA) бромид.
9. Иммуногенная композиция по п.8, где сапонин присутствует в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, стерол присутствует в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, соединение четвертичного аммония присутствует в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу, и полимер присутствует в количестве от приблизительно 0,0001% по объему до приблизительно 75% по объему.
10. Иммуногенная композиция по п.9, где адъювант дополнительно содержит гликолипид.
11. Иммуногенная композиция по п.10, где гликолипид представляет собой N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат.
12. Иммуногенная композиция по любому из пп.10, 11, где сапонин присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, стерол присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, соединение четвертичного аммония присутствует в количестве от приблизительно 1 мг до приблизительно 5000 мг на дозу, и полимер полиакриловой кислоты присутствует в количестве от приблизительно 0,0001% по объему до приблизительно 75% по объему.
13. Иммуногенная композиция по п.1, где композиция дополнительно содержит бактерин E. canis.
14. Иммуногенная композиция по п.13, где бактерин E. canis представляет собой термоинактивированный или химически инактивированный бактерин.
15. Иммуногенная композиция по п.14, где химически инактивированный бактерин инактивирован формальдегидом, формалином, биэтиленамином, облучением, ультрафиолетовым светом, обработкой бета-пропиолактоном или формальдегидом.
16. Способ диагностики воздействия или заражения Ehrlicia или E. canis, включающий:
а) получение биологического образца от субъекта-млекопитающего, и
b) тестирование биологического образца на иммунореактивность к TRP19, или TRP140 и TRP140, или TRP120, или TRP28;
причем иммунореактивность к TRP120, TRP140 и/или TRP19 указывает на то, что субъект подвергся воздействию или был инфицирован Ehrlicia или E. canis.
17. Способ по п.16, где млекопитающим является собака.
18. Способ по любому из пп.16, 17, где способ дополнительно включает способ лечения субъекта-млекопитающего, и где субъекту-млекопитающему вводят фармакологически релевантное или терапевтически релевантное количество антибиотика.
19. Способ по п.18, где антибиотик представляет собой доксициклин.
20. Способ индукции иммунного ответа у субъекта-млекопитающего, включающий введение субъекту фармацевтически релевантного количества иммуногенной композиции по любому из пп.1-15.
21. Способ по п.20, дополнительно включающий введение субъекту второй иммуногенной композиции, где вторая иммуногенная композиция содержит бактерин Ehrlichia.
22. Способ по п.21, где бактерин Ehrlichia представляет собой бактерин E. canis.
23. Способ по любому из пп.21, 22, где вторая иммуногенная композиция содержит адъювант, причем предпочтительно адъювант содержит тритерпеноидный сапонин, стерол и CpG-содержащий иммуностимулирующий олигонуклеотид.
24. Способ по п.23, где адъювант во второй иммуногенной композиции содержит Quil A и холестерин.
25. Способ по п.24, где CpG-содержащий ODN представляет собой 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:17), где «*» относится к фосфоротиоатной связи, «-» относится к фосфодиэфирной связи, и «JU» относится к 5'-йодо-2'-дезоксиуридину.
26. Способ по любому из пп.20-25, где млекопитающим является собака.
WO 2004042037 A1, 21.05.2004 | |||
WO 2006138509 A2, 28.12.2006 | |||
WO 2008043000 A2, 10.04.2008 | |||
WO 2008112007 A1, 18.09.2008 | |||
WO 2010126993 A1, 04.11.2010 | |||
JEEBA A | |||
KURIAKOSE et al | |||
"Molecular basis of antibody mediated immunity against Ehrlichia chaffeensis involves species-specific linear epitopes in tandem repeat proteins", MICROBES AND INFECTION, |
Авторы
Даты
2024-08-15—Публикация
2020-07-13—Подача