МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ WT1-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РАКОВ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/39 A61K35/00 A61K45/06 A61P37/04 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с серийным номером 62/832,244, поданной 10 апреля 2019 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки, включая любые чертежи, таблицы, последовательности нуклеиновых кислот, аминокислотные последовательности или чертежи.

Список последовательностей для этой заявки помечен как «Seq-List.txt», он был создан 9 апреля 2020 г. и имеет размер 47 КБ. Полное содержание списка последовательностей полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В настоящем изобретении предложены способы лечения, снижения заболеваемости и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, и композиции, применимые для тех же целей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы лечения, снижения заболеваемости и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, и композиции, включающие иммуногенные композиции, применимые для тех же целей. В одном варианте осуществления, в настоящем изобретении представлены способы такого применения, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации, по меньшей мере, следующих семи пептидов WT1: YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205). В некоторых вариантах осуществления, все семь пептидов присутствуют в композиции, которую вводят субъекту, в виде поливалентной (семивалентной) иммунотерапевтической композиции.

Комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов можно вводить субъекту путем введения субъекту одного или нескольких агентов доставки WT1, что приводит к доставке комбинации WT1 пептидов и индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего WT1. Примеры этих агентов доставки WT1, которые можно использовать, включают: (i) один или несколько из самих выделенных WT1 пептидов, (ii) одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих WT1 пептиды, и (iii) одну или несколько иммунных клеток, содержащих или презентирующих комбинацию WT1 пептидов или нуклеиновой кислоты, кодирующей комбинацию WT1 пептидов, или любую комбинацию двух или трех из (i), (ii) или (iii).

Может быть желательно ввести один или несколько из, по меньшей мере, семи WT1 пептидов в виде пептидов и ввести другой из, по меньшей мере, семи WT1 пептидов через другие формы агента доставки WT1, такие как нуклеиновые кислоты, кодирующие WT1 пептиды, или через иммунные клетки, содержащие или презентирующие WT1 пептиды. Следовательно, по меньшей мере, семь WT1 пептидов можно вводить в форме пептидов или в форме нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды, или в форме иммунных клеток, содержащих или презентирующих WT1 пептиды или кодирующие нуклеиновые кислоты, или в виде двух или всех трех таких форм (т.е. пептиды и нуклеиновые кислоты; пептиды и иммунные клетки; нуклеиновые кислоты и иммунные клетки; или пептиды, нуклеиновые кислоты и иммунные клетки). Таким образом, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов можно вводить: (i) в виде семи или более пептидов, индивидуально или в любой одной или нескольких комбинациях; или (ii) в виде нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, индивидуально или в любой одной или нескольких комбинациях; или (iii) в виде иммунных клеток, содержащих или презентирующих комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи или более пептидов, индивидуально или в любой одной или нескольких комбинациях. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, семь WT1 пептидов вводят в виде комбинации двух или всех трех из этих форм (т.е. (i) и (ii); или (i) и (iii); или (ii) и (iii); или (i), (ii) и (iii)).

Необязательно, альтернативно или в дополнение к средствам доставки WT1 (пептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды и иммунные клетки), субъекту могут быть введены цитотоксические Т-клетки (CTL) против рака, экспрессирующего WT1, при этом CTL были индуцированы комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов: YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205).

Необязательно, в дополнение к комбинации семи WT1 пептидов, нуклеиновых кислот, кодирующих семь WT1 пептидов, иммунных клеток, содержащих или презентирующих семь WT1 пептидов и/или содержащих нуклеиновые кислоты, кодирующие WT1 пептиды, или CTL, индуцированных семью WT1 пептидами, один или несколько дополнительных WT1 пептидов или CTL, индуцированные одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами, могут быть включены в композицию или иным образом введены субъекту. Один или несколько дополнительных WT1 пептидов могут быть нативными пептидами, которые являются фрагментами белка WT1, или они могут быть такими пептидами с одной или несколькими модификациями, которые могут повышать их иммуногенность, или их смесью. Такими модификациями могут быть аминокислотные замены (например, гетероклитические пептиды) или любая другая модификация. Один или несколько дополнительных WT1 пептидов можно вводить субъекту через агент доставки WT1, или можно вводить CTL против рака, экспрессирующего WT1, и которые были индуцированы одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами.

Необязательно, один или несколько ингибиторов контрольной точки можно вводить субъекту до, во время или после введения агентов доставки WT1 и/или CTL. Один или несколько ингибиторов контрольных точек (также известных как ингибиторы иммунных контрольных точек) представляют собой соединение или агент, который блокирует или ингибирует белки иммунных контрольных точек. Неограничивающие примеры соединений или агентов, которые являются ингибиторами контрольных точек, включают малые молекулы, пептиды и антитела. Неограничивающие примеры антител включают ниволумаб (OPDIVO), пембролизумаб (KEYTRUDA), пидилизумаб (CT-011), MEDI0680 (AMP-514), AMP-224, AUNP-12, BMS 936559, атезолизумаб (MPDL3280A), дурвалумаб (MEDI4736), авелумаб (MSB0010718C), BMS935559 (MDX-1105), rHIgM12B7, BMS-986016, GSK2831781, IMP321, лирилумаб (BMS-986015), IPH2101 (1-7F9), индоксимод (NLG 9189), NLG 919, INCB024360, PF-05082566, урелумаб (BMS-663513) и MEDI6469.

В одном варианте осуществления, представлены способы, в которых один или несколько агентов доставки WT1 или CTL и один или несколько ингибиторов контрольной точки вводят субъекту по схеме, которая дает максимальную пользу субъекту. Таким образом, один или несколько агентов доставки WT1 или CTL и один или несколько ингибиторов контрольных точек необязательно вводят в одно и то же время, или даже в одной и той же композиции, или каждый с одинаковой длительностью, или каждый одинаковым путем. Каждый WT1 пептид можно вводить в соответствии с определенной схемой, как и ингибитор каждой контрольной точки. В одном варианте осуществления, схемы дозирования, по меньшей мере, одного WT1 пептида и, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, совпадают. В одном варианте осуществления, схемы дозирования, по меньшей мере, одного WT1 пептида и, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, перекрываются. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один агент доставки WT1 или CTL и, по меньшей мере, один ингибитор контрольной точки, присутствуют в одной и той же композиции. В одном варианте осуществления, способы, представленные в настоящем документе, обеспечивают улучшенную или повышенную способность лечения, снижения частоты и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, по сравнению с агентами доставки WT1 или CTL и ингибиторами контрольных точек по отдельности. В одном варианте осуществления, способность лечить, снижать частоту и индуцировать иммунные ответы против рака, экспрессирующего WT1, обеспечиваемая способами, описанными в настоящем документе, выше, чем комбинация эффекта агентов доставки WT1 или CTL по отдельности и только ингибиторов контрольной точки.

Уровень дозы и схема дозирования агента доставки WT1 или CTL и ингибитора контрольной точки, способ введения и другие аспекты введения оптимизированы для получения максимальной пользы для субъекта. Варианты осуществления в настоящем документе обеспечивают улучшенные способы лечения, снижения заболеваемости и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, а также улучшенные композиции, полезные для тех же целей.

Раками, поддающимися лечению с помощью способов, представленных в настоящем документе, являются любые виды рака, которые экспрессируют белок WT1 или его фрагмент. В одном варианте осуществления, раком является рак яичников. В другом варианте осуществления, раком является рак груди. В другом варианте осуществления, раком является рак толстой кишки или колоректальный рак. В другом варианте осуществления, раком является мезотелиома. В другом варианте осуществления, раком является лейкоз. В других вариантах осуществления, раком является опухоль Вильмса, острый миелоидный лейкоз (AML), множественная миелома, хронический миелоидный лейкоз (CML), миелодиспластический синдром (MDS), меланома, мезотелиома (например, злокачественная мезотелиома плевры), рак желудка, рак простаты, рак желчных путей, рак мочевой системы, глиобластома, саркома мягких тканей, остеосаркома или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предлагаются способы лечения, снижения заболеваемости и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, и композиции, включающие иммуногенные композиции, полезные для тех же целей. В одном варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способы такого применения, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или цитотоксических Т-клеток (CTL) к ним, где комбинация включает каждый из YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124 ; также обозначенный как WT1-A1), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1; также обозначенный как длинный WT1-427), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2; также обозначенный как длинный WT1-331), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125; также обозначенный как длинный WT1-122A1), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21; также обозначенный как короткий NLM), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26; также обозначенный как WNLM или длинный NLM) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205; также обозначенный как WNYM или длинный NYM). Комбинацию из семи WT1 пептидов можно вводить с одним или несколькими ингибиторами контрольной точки или без них. В некоторых вариантах осуществления, иммунотерапевтическая композиция, используемая для лечения опухоли, экспрессирующей WT1, или индуцирования in vitro, ex vivo или in vivo образования и пролиферации Т-клеток, специфичных для рака, экспрессирующего WT1, и где комбинация оказывает синергетический эффект на одно или другое из вышеперечисленного.

Комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов можно вводить субъекту путем введения субъекту одного или нескольких агентов, что приводит к доставке комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего WT1 (т. е. один или несколько агентов доставки WT1). Каждый из, по меньшей мере, семи WT1 пептидов может быть доставлен в одном или нескольких одинаковых или разных агентах доставки WT1 и в одной или нескольких их комбинациях. Примеры этих агентов доставки WT1, которые можно использовать, включают: (i) выделенный WT1 пептид, (ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую, по меньшей мере, один WT1 пептид, и (iii) иммунную клетку, содержащую или презентирующую, по меньшей мере, один WT1 пептид, или нуклеиновую кислоту, кодирующую, по меньшей мере, один WT1 пептид. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов вводят в форме семи выделенных WT1 пептидов. В некоторых вариантах осуществления, субъекту вводят композицию, которая включает все семь выделенных WT1 пептидов.

Необязательно, альтернативно или в дополнение к средствам доставки WT1 (пептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды и иммунные клетки), субъекту можно вводить цитотоксические Т-клетки (CTL) против рака, экспрессирующего WT1, при этом CTL индуцируются посредством комбинации, по меньшей мере, семи выделенных пептидов: YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205). CTL включают WT1-специфические CTL, полученные in vitro или ex vivo, или они могут быть получены in vivo у донора и получены от донора.

Агенты доставки WT1 или CTL могут быть представлены в композиции с носителем, эксципиентом или разбавителем, среди которых может быть адъювант. Неограничивающий выбор пептидного компонента, используемого в способах и композициях, представленных в настоящем документе, описан ниже.

Рак яичников является одним из самых распространенных гинекологических злокачественных новообразований и пятой по частоте причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах. Ежегодно диагностируется более 22000 случаев заболевания, и, по оценкам, ежегодно происходит 15500 случаев смерти [1]. У большинства пациентов при поступлении имеется широко распространенное заболевание [2]. 5-летняя выживаемость при запущенной стадии заболевания составляет менее 30% [1]. Хотя для многих пациентов можно ожидать полной клинической ремиссии после начальной химиотерапии, обзор контрольной релапаротомии, которую часто выполняют в качестве обычного лечения, показывает, что менее 50% пациентов фактически свободны от болезни [3]. Кроме того, почти у половины пациентов с негативным результатом контрольного осмотра возникают рецидивы и требуется дополнительное лечение [4]. Многие пациенты достигают второго полного клинического ответа после дополнительной химиотерапии. Однако почти у всех пациентов рецидив наступает после короткого периода ремиссии в 9-11 месяцев. [5]. Требуются эффективные стратегии для продления ремиссии или предотвращения рецидива, поскольку последующие ремиссии становятся все короче, пока не разовьется широкая устойчивость к химиотерапии [2].

Было показано, что как антитела, так и эффекторы Т-клеток полезны в моделях рака яичников. Было отмечено, что антитела сокращают раннюю тканевую инвазию [6]. Доклинические модели также продемонстрировали удаление циркулирующих опухолевых клеток и устранение системных микрометастазов за счет использования как пассивно вводимых, так и индуцированных вакциной антител. Что касается эффекторов Т-клеток, было показано, что глобально активированный иммунный ответ связан с улучшением клинического исхода у пациентов с запущенным раком яичников. Zhang et al. показали, что присутствие Т-клеток, инфильтрирующих опухоль, в островках опухолевых клеток, было связано с улучшением как выживаемости без прогрессирования, так и общей выживаемости [7]. И наоборот, инфильтрация Т-регуляторных клеток дает худший прогноз [8].

Данные по пациентам с раком яичников во второй или следующей ремиссии предсказуемо подтверждают их рецидив [9]. В последние годы рак яичников стал мишенью для множества новых иммунных подходов. Терапия антителами включала ореговомаб [10], который является терапией моноклональными антителами, таргетирующими антиген CA125; абаговомаб [11], который является антиидиотипическим антителом, таргетирующим CA-125; и трастузумаб [12], который является моноклональным гуманизированным анти-HER2 антителом. Другие стратегии включают терапию цитокинами, такими как интерферон-γ [13, 14] и IL-2 [15]. Также была оценена активная иммунизация другими антигенами, такими как Lewis y [16], MUC1 [17], HLA-рестриктированный пептид NY-ESO-1b [18] и конъюгат KH-1-KLH. Предыдущие стратегии были неэффективными, и необходимы новые терапевтические методы для повышения эффективности лечения рака яичников, а также многих других видов рака, которые неэффективно лечат с помощью доступных в настоящее время методов лечения.

WT1 относится к опухоли Вильмса 1 или генному продукту гена WT1. Ген-супрессор опухоли Вильмса, WT1, был впервые идентифицирован в детских опухолях почек, но WT1 также высоко экспрессируется при многих других гематологических злокачественных новообразованиях и солидных опухолях, включая мезотелиому [19, 20]. WT1 был первоначально идентифицирован путем картирования кДНК в области хромосомы 11p13. кДНК WT1 кодирует белок, содержащий четыре цинковых пальца Круппеля, и содержит сложный паттерн альтернативного сплайсинга, приводящий к четырем различным факторам транскрипции. Каждая изоформа WT1 имеет различную ДНК-связывающую и транскрипционную активность [21] и может положительно или отрицательно регулировать различные гены, вовлеченные в пролиферацию, дифференциацию, апоптоз клеток, развитие органов и определение пола. WT1 обычно экспрессируется в тканях мезодермального происхождения во время эмбриогенеза, включая почки, яичники, сердце, мезотелий и селезенку [22]. В нормальных тканях взрослого человека экспрессия WT1 ограничена низкими уровнями в ядрах нормальных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток, миоэпителиальных клеток-предшественников, почечных подоцитов и некоторых клеток семенников и яичников [23]. WT1 является высоко гомологичным у мышей и людей (96% на уровне аминокислот) и имеет сходное тканевое распределение и функции [24, 25]. Белки WT1, первоначально описанные как ген-супрессор опухолей, по-видимому, участвуют в онкогенезе.

Сильная экспрессия белка WT1 при раке яичников в сочетании с предполагаемым механизмом действия делает его рациональной мишенью для иммунотерапии многих других видов рака, которые также экспрессируют белок WT1, таких как, но не ограниченных ими, мезотелиома, лейкоз, опухоль Вильмса, острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелоидный лейкоз (CML), миелодиспластический синдром (MDS), меланома, рак желудка, рак простаты, рак желчевыводящих путей, рак мочевыделительной системы, глиобластома, саркома мягких тканей, остеосаркома и немелкоклеточный рак легких (NSCLC). При раке яичников экспрессия является настолько частой, что патологи обычно используют иммуногистохимические окрашивания для WT1 (со стандартизированным соглашением для описания экспрессии и определения в качестве «положительного» или «отрицательного», чтобы помочь отличить эпителиальный рак яичников от других опухолей. WT1 является особенно чувствительным и специфическим маркером серозного рака яичников [26]. Микроматрицы ткани яичников предполагают, что 70-80% серозных опухолей яичников экспрессируют WT1, так что большинство пациентов будут иметь мишень и иметь право на участие в исследовании.

Один или несколько дополнительных WT1 пептидов, которые можно использовать в комбинации с семью WT1 пептидами, могут быть нативными пептидами, которые являются фрагментами белка WT1. В одном варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами являются LVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 3) или NKRYFKLSHLQMHSR (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными пептидами являются SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 5) или QARMFPNAPYLPSCL (SEQ ID NO: 6). В другом варианте осуществления, один или несколько дополнительных пептидов выбирают из RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 7), SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 8), ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 9), NLGATLKGV (SEQ ID NO: 10), DLNALLPAV (SEQ ID NO: 11), GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 12), KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 13), ALLLRTPYS (SEQ ID NO: 14), CMTWMQMNL (SEQ ID NO: 15), NMHQRNMTK (SEQ ID NO: 16), QMNLGATLK (SEQ ID NO: 17), FMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 18) или KLSHLQMHSR (SEQ ID NO: 19).

В другом варианте осуществления, один или несколько дополнительных WT1 пептидов выбраны из NQMNLGATL (SEQ ID NO: 20), NYMNLGATL (SEQ ID NO: 22), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 23), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 24), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 25), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 27), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 28), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 29), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO:30), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 31), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 32), MTWNYMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 33), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 34), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 35), WNQMNLGAT (SEQ ID NO: 36), TWNQMNLGA (SEQ ID NO: 37), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 38), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 39), WNLMNLGAT (SEQ ID NO: 40), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 41), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 42), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 43), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 44), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 45), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 46), GYLRNPTAC (SEQ ID NO: 47), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 48), YALRNPTAC (SEQ ID NO: 49), GLLRNPTAC (SEQ ID NO:50), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 51), RYRPHPGAL (SEQ ID NO: 52), YQRPHPGAL (SEQ ID NO: 53), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 54), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 55), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 56), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 57), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 58), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 59), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 60), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 61), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 62), HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 63), HSFKHEDPY (SEQ ID NO: 64), HSFKHEDPK (SEQ ID NO: 65), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO: 66), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 67), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 68), FMCAYPGCN (SEQ ID NO: 69), FMCAYPGCY (SEQ ID NO: 70) или FMCAYPGCK (SEQ ID NO: 71).

В другом варианте осуществления, один или несколько дополнительных WT1 пептидов выбраны из RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 72), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 73), PLPHFPPSL (SEQ ID NO: 74), HFPPSLPPT (SEQ ID NO: 75), THSPTHPPR (SEQ ID NO: 76), AILDFLLLQ (SEQ ID NO: 77), PGCLQQPEQ (SEQ ID NO: 78), PGCLQQPEQQG (SEQ ID NO: 79), KLGAAEASA (SEQ ID NO: 80), ASGSEPQQM (SEQ ID NO: 81), RDLNALLPAV (SEQ ID NO: 82), GGCALPVSGA (SEQ ID NO: 83), GAAQWAPVL (SEQ ID NO: 84), LDFAPPGAS (SEQ ID NO: 85), LDFAPPGASAY (SEQ ID NO: 86), SAYGSLGGP (SEQ ID NO: 87), PAPPPPPPP (SEQ ID NO: 88), ACRYGPFGP (SEQ ID NO: 89), SGQARMFPN (SEQ ID NO: 90), RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 91), PSCLESQPA (SEQ ID NO: 92), NQGYSTVTF (SEQ ID NO: 93), HHAAQFPNH (SEQ ID NO: 94), HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 95), CHTPTDSCT (SEQ ID NO: 96), CTGSQALLL (SEQ ID NO: 97), TDSCTGSQA (SEQ ID NO: 98), RTPYSSDNL (SEQ ID NO: 99), NLYQMTSQLE (SEQ ID NO: 100), WNQMNLGAT (SEQ ID NO: 101), NQMNLGATL (SEQ ID NO: 102), WNQMNLGATLK (SEQ ID NO: 103), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 104), NLGATLKGV (SEQ ID NO: 105), LGATLKGVAA (SEQ ID NO: 106), TLGVAAGS (SEQ ID NO: 107), GYESDNHTT (SEQ ID NO: 108), FMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 109), KRPFMCAYPGC (SEQ ID NO: 110), RKFSRSDHL (SEQ ID NO: 111), LKTHTTRTHT (SEQ ID NO: 112), NMHQRNHTKL (SEQ ID NO: 113), LLAAILDFL (SEQ ID NO: 114), CLQQPEQQGV (SEQ ID NO: 115), DLNALLPAV (SEQ ID NO: 116), ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 117), VLDFAPPGA (SEQ ID NO: 118), CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 119), QARMFPNAPY (SEQ ID NO: 120), ALRNPTACPL (SEQ ID NO: 121), YPGCNKRYF (SEQ ID NO: 122) или APVLDFAPPGASAYG (SEQ ID NO: 123).

В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами является любой пептид, описанный в WO2017087857, WO2014113490 или WO2019006401. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами является любой нативный WT1 пептид, описанный в WO2005053618, WO2007047763, WO2007047764, WO2007120673, US20060084609, WO2014113490 и WO2013106834. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами является любой природный WT1 пептид, описанный в US20110070251A1, US7063854B1, US7063854, US7901693, US7662386, US7,063,854, US7115272, US7368119, US7329410, US7144581, US7323181, US7655249, US7,553,494, US7608685, US7380871, US7030212, US7807792, US7517950, US2010/0166738, US2011/0070251, US2009/0143291 и WO2003037060. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами является любой природный WT1 пептид, описанный в US7666985B2, US20080070835A1, US20070128207A1, US7915393B2, US20110136141A1, US7598221B2, US20100111986A1, US20100092522A1, US20030082194A1 и WO2001025273A2. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами может быть модифицированный фрагмент WT1 пептида, например, содержащий одну или несколько гетероклитических модификаций для повышения иммуногенности против нативной пептидной последовательности. В другом варианте осуществления, дополнительным WT1 пептидом является QAYMFPNAPYLPSCL (SEQ ID NO: 126). В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными пептидами являются любые из следующих: YLGEQQYSV (SEQ ID NO: 127), YLLPAVPSL (SEQ ID NO: 128), YLGATLKGV (SEQ ID NO: 129), YLNALLPAV (SEQ ID NO: 130), GLRRGIQDV (SEQ ID NO: 131), KLYFKLSHL (SEQ ID NO: 132), ALLLRTPYV (SEQ ID NO: 133), YMTWNQMNL (SEQ ID NO: 134), NMYQRNMTK (SEQ ID NO: 135), NMHQRVMTK (SEQ ID NO: 136), NMYQRVMTK (SEQID NO: 137), QMYLGATLK (SEQ ID NO: 138), QMNLGVTLK (SEQ ID NO: 139), QMYLGVTLK (SEQ ID NO: 140), FMYAYPGCNK (SEQ ID NO: 141), FMCAYPFCNK (SEQ ID NO: 142), FMYAYPFCNK (SEQ ID NO: 143), KLYHLQMHSR (SEQ ID NO: 144), KLSHLQMHSK (SEQ ID NO: 145) и KLYHLQMHSK (SEQ ID NO: 146).

В другом варианте осуществления, одним или несколькими дополнительными WT1 пептидами является любой модифицированный WT1 пептид из NQMNLGATL (SEQ ID NO: 147), NYMNLGATL (SEQ ID NO: 149), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 150), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 151), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 152), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 154), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 155), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 156), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 157), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 158), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 159), MTWNYMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 160), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 161), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 162), WNQMNLGAT (SEQ ID NO: 163), TWNQMNLGA (SEQ ID NO: 164), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 165), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 166), WNLMNLGAT (SEQ ID NO: 167), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 168), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 169), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 170), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 171), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 172), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 173), GYLRNPTAC (SEQ ID NO: 174), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 175), YALRNPTAC (SEQ ID NO: 176), GLLRNPTAC (SEQ ID NO: 177), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 178), RYRPHPGAL (SEQ ID NO: 179), YQRPHPGAL (SEQ ID NO: 180), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 181), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 182), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 183), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 184), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 185), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 186), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 187), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 188), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 189), HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 190), HSFKHEDPY (SEQ ID NO: 191), HSFKHEDPK (SEQ ID NO: 192), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO: 193), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 194), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 195), FMCAYPGCN (SEQ ID NO: 196), FMCAYPGCY (SEQ ID NO: 197) или FMCAYPGCK (SEQ ID NO: 198).

В другом варианте осуществления, WT1 пептидом является любой модифицированный WT1 пептид, описанный в WO2005053618, WO2007047763, WO2007047764, WO2007120673, US20060084609, WO2014113490 и WO2013106834. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, WT1 пептидом является любой модифицированный WT1 пептид, описанный в US20110070251A1, US7063854B1, US7063854, US7901693, US7662386, 7,063,854, US7115272, US7368119, US7329410, US7144581, US7323181, US7655249, US7,553,494, US7608685, US7380871, US7030212, US7807792, US7517950, US2010/0166738, US2011/0070251, US2009/0143291 и WO2003037060. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

В другом варианте осуществления, WT1 пептидом является любой модифицированный WT1 пептид, описанный в US7666985B2, US20080070835A1, US20070128207A1, US7915393B2, US20110136141A1, US7598221B2, US20100111986A1, US20100092522A1, US20030082194A1 и WO2001025273A2. Вышеизложенные полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

Один или несколько дополнительных WT1 пептидов, полезных для целей, описанных в настоящем документе, могут быть одним пептидом или комбинацией пептидов. Каждый из одного или нескольких дополнительных WT1 пептидов может быть нативным WT1 пептидом или модифицированным WT1 пептидом. Если используют два или несколько пептидов, каждый может вводиться индивидуально (в отдельных составах) или в комбинации с другим одним или несколькими пептидами (в одном составе). Один или несколько пептидов можно вводить в комбинации с носителем, разбавителем или эксципиентом. В одном варианте осуществления, пептид вводят в сочетании с адъювантом. Каждый пептид можно вводить с разными адъювантами или комбинацией адъювантов, или пептиды можно вводить в комбинации двух или более пептидов с адъювантом или комбинацией адъювантов. Иммуноген или композиция, содержащая один или несколько пептидов, может называться в настоящем документе вакциной, пептидной вакциной, WT1 вакциной и подобными.

Адъювант может относиться к любому классу, например, солям квасцов и другим минеральным адъювантам, бактериальным продуктам или адъювантам, полученным из бактерий, поверхностно-активным агентам (например, сапонинам), эмульсиям масло в воде (м/в) и вода в масле (в/м), липосомным адъювантам, цитокинам (например, IL-2, GM-CSF, IL-12 и IFN-гамма) и аналогам альфа-галактозилцерамида. Неограничивающие примеры адъювантов включают эмульсии монтанида, QS21, полный или неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, бациллу Кальмета-Герена (BCG) и квасцы. В одном из вариантов осуществления, адъювантом является агент, который усиливает CTL ответ иммунной системы против WT1 пептида, такой как поверхностно-активное вещество моноолеат маннида, содержащий олеиновую кислоту растительного происхождения (VG), полученную из оливкового масла (Монтанид ISA 51 VG эмульсия в/м). Адъювант можно вводить в той же композиции, что и один или несколько WT1 пептидов, или в той же композиции, что и один или несколько ингибиторов контрольной точки, или в той же композиции, что и один или несколько WT1 пептидов и один или несколько ингибиторов контрольной точки, или в композиции, отдельной от одного или нескольких WT1 пептидов и одного или нескольких ингибиторов контрольной точки.

В другом варианте осуществления, любой из вышеупомянутых пептидов (комбинация семи WT1 пептидов и, необязательно, один или нескольких дополнительных WT1 пептидов) имеет одну или несколько точечных мутаций в первичном или вторичном якорном остатке связывающего мотива HLA класса I. В одном из вариантов осуществления, этот пептид имеет точечную мутацию в положении 2 или 9 связывающего мотива класса I, или в положении вторичного якорного остатка 1, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 связывающего мотива класса I. В одном варианте осуществления, пептид, положение 1 связывающего мотива HLA класса I, заменяется на глицин, треонин или фенилаланин; в одном варианте осуществления, положение 2 связывающего мотива HLA класса I заменяется на лейцин или изолейцин; в одном варианте осуществления, положение 6 связывающего мотива HLA класса I заменяется на валин, глутамин или гистидин; или, в одном варианте осуществления, положение 9 связывающего мотива HLA класса I заменяется на валин, аланин, треонин, изолейцин или цистеин.

Необязательно, комбинация семи WT1 пептидов дополнительно включает один или несколько нативных или модифицированных WT1 пептидов из тех, которые описаны в WO2014113490, таких как NQMNLGATL (SEQ ID NO: 147), NLMNLGATL (SEQ ID NYMNLGATL (SEQ ID NO: 149), CMTWNQMNLGATLKG (SEQ ID NO: 150), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 151), WNQMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 152), MTWNQMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 154), TWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 155), CMTWNLMNLGATLKG (SEQ ID NO: 156), MTWNLMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 157), TWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 158), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 159), MTWNYMNLGATLKGV (SEQ ID NO: 1260), TWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 161), CMTWNQMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 162), WNQMNLGAT (SEQ ID NO: 163), TWNQMNLGA (SEQ ID NO: 164), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 165), CMTWNLMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 166), WNLMNLGAT (SEQ ID NO: 167), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 168), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 169), CMTWNYMNLGATLKGVA (SEQ ID NO: 170), MNLGATLKG (SEQ ID NO: 171), MTWNQMNLG (SEQ ID NO: 172), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 173), GYLRNPTAC (SEQ ID NO: 174), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 175), YALRNPTAC (SEQ ID NO: 176), GLLRNPTAC (SEQ ID NO: 177), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 178), RYRPHPGAL (SEQ ID NO: 179), YQRPHPGAL (SEQ ID NO: 180), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 181), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 182), GALRNPTAC (SEQ ID NO: 183), GALRNPTAL (SEQ ID NO: 184), RQRPHPGAL (SEQ ID NO: 185), RLRPHPGAL (SEQ ID NO: 186), RIRPHPGAL (SEQ ID NO: 187), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 188), QFPNHSFKHEDPMGQ (SEQ ID NO: 189), HSFKHEDPM (SEQ ID NO: 190), HSFKHEDPY (SEQ ID NO: 191), HSFKHEDPK (SEQ ID NO: 192), KRPFMCAYPGCYKRY (SEQ ID NO: 194), SEKRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 194), KRPFMCAYPGCNK (SEQ ID NO: 195), FMCAYPGCN (SEQ ID NO: 196), FMCAYPGCY (SEQ ID NO: 197) или FMCAYPGCK (SEQ ID NO: 198)

Каждый пептид комбинации можно вводить отдельно в его собственном составе, или два, три, четыре, пять, шесть или семь или более пептидов комбинации можно вводить вместе в одном составе. В одном варианте осуществления, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов вводят в одном составе.

Уровень дозы каждого пептида, частота введения каждого индивидуума или любой одной или нескольких комбинаций до семи или нескольких пептидов, продолжительность введения и другие аспекты иммунизации семью или несколькими WT1 пептидами могут быть оптимизированы в соответствии с клинической картиной пациента, продолжительностью или течением заболевания, сопутствующими заболеваниями и другими аспектами клинической помощи. Изобретение не является настолько ограниченным этими конкретными аспектами компонента иммунизации способов, представленных в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления, композиция для поливалентной иммунотерапии содержит 280 мкг каждого из семи вышеупомянутых пептидов: YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205). В одном варианте осуществления, композиция дополнительно содержит один или несколько дополнительных WT1 пептидов. В одном варианте осуществления, композиция не включает дополнительные WT1 пептиды. В одном варианте осуществления, композиция не включает дополнительные пептиды.

В одном варианте осуществления, 200 мкг каждого пептида вводят с каждой дозой (0,5 мл). В одном варианте осуществления, от 100 до 2000 мкг каждого пептида вводят с каждой дозой. В одном варианте осуществления, вышеуказанную дозу вводят каждые две недели в течение 10 недель (т.е. 6 введений). В одном варианте осуществления, введение осуществляют подкожно. В одном варианте осуществления, адъювант смешивают (эмульгируют) с вакциной перед дозированием. В одном варианте осуществления, 0,5 мл иммунотерапевтической композиции (т.е. 200 мкг каждого пептида) эмульгируют с 1,0 мл адъюванта перед введением. В другом варианте осуществления, адъювант вводят инъекцией в то же место, что и вакцина, до или после инъекции иммунотерапевтической композиции. В одном варианте осуществления, адъювантом является эмульсия. В одном варианте осуществления, эмульсией является эмульсия монтанида. В одном варианте осуществления, эмульсией монтанида является иммунологический адъювант монтанид ISA 51 VG. Необязательно, при практическом применении изобретения, один или несколько ингибиторов контрольных точек также вводят субъекту с иммунотерапевтической композицией, как дополнительно описано ниже.

Как отмечалось выше, иммунотерапевтическая композиция, содержащая или состоящая из комбинации семи WT1 пептидов, может вводиться в виде иммуногенной композиции для того, чтобы вызвать иммунный ответ против рака, экспрессирующего WT1, или, в другом варианте осуществления, комбинация WT1 пептидов может использоваться для получения WT1-специфических CTL с использованием способов in vitro или ex vivo, указанные CTL при введении пациенту будут направлены против рака, экспрессирующего WT1. В одном варианте осуществления, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов используют для индуцирования продуцирования CTL in vitro, например, с использованием клеток из клеточной линии. В другом варианте осуществления, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов используют для индуцирования продуцирования CTL в образце клеток, взятых у пациента, при этом CTL, индуцированные ex vivo, вливают обратно тому же пациенту, нуждающемуся в этом. В другом варианте осуществления, комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов используют для индуцирования продуцирования CTL в образце клеток, взятых у донора, при этом CTL, индуцированные ex vivo, вливают пациенту, нуждающемуся в этом, который не является донором. В другом варианте осуществления, субъекту, который не является пациентом, нуждающимся в терапии, вводят комбинацию из семи или более WT1 пептидов, описанных в настоящем документе, для того, чтобы вызвать образование CTL, которые затем переносят от донора пациенту. Каждый из этих вариантов осуществления является отдельным аспектом изобретения, и источником WT1-специфических клеток, полезных для лечения рака или снижения заболеваемости раком, или его рецидива, как описано в настоящем документе. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, CTL к каждому из, по меньшей мере, семи WT1 пептидов могут быть получены индивидуально или в комбинации. CTL, полученные индивидуально, можно вводить субъекту отдельно, или можно комбинировать перед введением субъекту.

В любом из вышеупомянутых способов, будь то проведение иммунотерапии пациента для индуцирования CTL ответа против рака, экспрессирующего WT1, или получение WT1-специфических CTL от донора, in vitro или ex vivo способом с использованием иммунных клеток из клеточной линии, пациент или донор, который не является пациентом, комбинированное использование ингибитора контрольной точки может быть необязательно воплощено в настоящем документе, независимо от того, являются ли способы лечения, снижения заболеваемости раком или его рецидива путем иммунизации субъекта, нуждающегося в этом, комбинацией семи или более WT1 пептидов, или продуцирующих CTL in vitro ex vivo или у субъекта-донора. В любом из этих способов, в настоящем документе необязательно может быть реализовано комбинированное использование одного или нескольких ингибиторов контрольной точки. Один или несколько ингибиторов контрольной точки могут вводиться пациенту, который иммунизирован одним или несколькими WT1 пептидами. Ингибитор контрольной точки можно использовать in vitro или ex vivo для усиления образования WT1-специфических CTL, которые впоследствии вводят пациенту. Один или несколько ингибиторов контрольной точки можно использовать у субъекта-донора для усиления образования WT1-специфических CTL, которые затем будут перенесены пациенту. Ингибитор контрольной точки можно использовать у пациента, получающего CTL, приготовленные in vitro, ex vivo, или у донора, независимо от того, вводили ли in vitro, ex vivo или донору ингибитор контрольной точки или нет. В последних вариантах осуществления, один или разные ингибиторы контрольной точки могут использоваться in vitro, ex vivo или у субъекта-донора, и у пациента.

Иммунные контрольные точки регулируют функцию Т-клеток в иммунной системе. Т-клетки играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Белки контрольных точек взаимодействуют со специфическими лигандами, которые посылают сигнал в Т-клетки и по существу выключают или ингибируют функцию Т-клеток. Раковые клетки используют преимущества этой системы, управляя высокими уровнями экспрессии белков контрольных точек на своей поверхности, что приводит к контролю Т-клеток, экспрессирующих белки контрольных точек на поверхности Т-клеток, которые входят в микроокружение опухоли, тем самым ингибируя противораковый иммунный ответ. Таким образом, ингибирование белков контрольной точки может привести к восстановлению функции Т-клеток и иммунному ответу на раковые клетки. Ингибитором иммунных контрольных точек (или ингибитором контрольных точек) является соединение или агент, который блокирует или ингибирует белки иммунных контрольных точек (т.е., который блокирует или ингибирует рецепторы контрольных точек или лиганды рецепторов контрольных точек). Примеры белков контрольных точек включают, но не ограничиваются ими, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, IDO, KIR, 2B4 (принадлежит семейству молекул CD2 и экспрессируется на всех NK клетках и CD8⁺ T-клетках памяти), CD160 (также называемый BY55), CGEN-15049, киназы CHK 1 и CHK2, A2aR и различные лиганды семейства B-7. Белок 1 запрограммированной смерти клеток (PD-1) является членом суперсемейства иммуноглобулинов (IGSF) молекул, участвующих в регуляции активации Т-клеток. PD-1 получил название «запрограммированная смерть», когда он был идентифицирован в 1992 году как ген, активированный в Т-клеточной гибридоме, претерпевающей гибель клетки. Структура PD-1 состоит из одного домена IGSF, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, содержащего иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) и иммунорецепторный тирозиновый переключающий мотив (ITSM) [38]. PD-1 имеет двух партнеров по связыванию: PD-L1 (B7-H1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273). PD-L1 широко экспрессируется как в гемопоэтических, так и в не гемопоэтических клеточных линиях [39, 40]. Он обнаруживается на Т-клетках, В-клетках, макрофагах, NK-клетках, DC и тучных клетках, а также в периферических тканях [41, 42]. Привлечение PD-1 является одним из средств, с помощью которых опухоли избегают иммунного надзора и клиренса [43]. Была продемонстрирована блокада пути PD-1 ниволумабом, который проявляет активность на иммунокомпетентных моделях рака у мышей [44].

Неограничивающие примеры ингибиторов контрольной точки включают малые молекулы, пептиды и антитела. Неограничивающие примеры антител включают ниволумаб (OPDIVO), пембролизумаб (KEYTRUDA), пидилизумаб (CT-011), MEDI0680 (AMP-514), AMP-224, AUNP-12, BMS 936559, атезолизумаб (MPDL3280A), дурвалумаб (MEDI4736), авелумаб (MSB0010718C), BMS935559 (MDX-1105), rHIgM12B7, BMS-986016, GSK2831781, IMP321, лирилумаб (BMS-986015), IPH2101 (1-7F9), индоксимод (NLG 9189), NLG 919, INCB024360, PF-05082566, урелумаб (BMS-663513) и MEDI6469.

Ниволумаб (OPDIVO) является полностью человеческим моноклональным антителом IgG4, направленным против рецептора PD-1 на активированных Т- и В-лимфоцитах [47]. Пембролизумаб (KEYTRUDA) является другим не ограничивающим примером антитела, таргетирующего PD-1. Другие соединения и агенты, которые блокируют, ингибируют или таргетируют белки контрольных точек, включают соединения, которые проходят испытания и еще не доступны на рынке. Изобретение не ограничивается конкретным ингибитором контрольной точки. Не ограничивающие примеры ингибиторов контрольных точек, которые можно использовать, перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Примеры ингибиторов контрольных точек

Наименование Класс агента Мишень Ипилумумаб (он же MDX-010; MDX-101; BMS-734016; продается как Yervoy) mAb IgG1 человека Цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4)

Тремелимумаб (он же тицилимумаб; CP-675-206) mAb IgG2 человека CTLA-4 Ниволумаб (он же ONO-4538; BMS-936558; MDX1106; продается как Opdivo) mAb IgG4 человека Запрограммированная смерть-1 (PD-1) Пембролизумаб (он же МК-3475; ламбролизумаб; продается как Keytruda) гуманизированные mAb IgG4 PD-1 Пидлизумаб (он же CT-011) гуманизированные mAb IgG1 PD-1 MEDI0680 (он же AMP-514) гуманизированные mAb IgG4 PD-1 AMP-224 Слитый белок Fc-PD-L2 PD-1 AUNP-12 Разветвленный пептид из 29 аминокислот PD-1 BMS-936559 mAb IgG4 человека Лиганд запрограммированной смерти-1 (PD-L1) Атезолизумаб (он же MPDL3280A; RG7446) гуманизированные mAb IgG1 PD-L1 Дурвалумаб (он же MEDI4736) mAb IgG1 человека PD-L1 Авелумаб (он же MSB0010718C) mAb IgG1 человека PD-L1 BMS935559 (он же MDX-1105) mAb IgG4 человека PD-L1 rHIgM12B7 mAb IgM человека Лиганд запрограммированной смерти-2 (PD-L2) BMS-986016 mAB Ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3; он же CD223) GSK2831781 Гуманизированные афусцированные mAb LAG-3 IMP321 Растворимый LAG-3 LAG-3 Лирилумаб (он же BMS-986015) mAb IgG4 человека Иммуноглобулиноподобный рецептор киллеров (KIR) IPH2101 (он же 1-7F9) Моноклональные антитела против ингибитора KIR Индоксимод (от же NLG 9189; CAS # 110117-83-4) Малая молекула (D-изомер 1-метилтриптофана) Индолеамин-2,3-диоксигеназа 1 (IDO1) NLG 919 (CAS # 1402836-58-1) Малая молекула IDO1 INCB024360 (CAS # 914471-09-3) Малая молекула IDO1 PF-05082566 mAB IgG2 человека 4-1BB (он же CD137) Урелумаб (он же BMS-663513) гуманизированное mAb IgG4 4-1BB MEDI6469 анти-человеческое Ab IgG1 мыши OX40 (он же CD134)

В одном варианте осуществления, субъекту вводят комбинацию из двух или нескольких ингибиторов контрольной точки. В одном варианте осуществления, комбинацию ингибиторов контрольной точки выбирают из числа тех, которые указаны в таблице 1. Два или несколько ингибиторов контрольной точки можно вводить одновременно или последовательно по отношению друг к другу и по отношению к одному или нескольким WT1 пептидам. В дополнительном варианте осуществления, комбинацию двух или нескольких ингибиторов контрольных точек, таргетирующую два разных белка контрольных точек, таких как PD-1 (например, ниволумаб или другой ингибитор PD-1) и CTLA-4 (например, ипилумумаб или другой ингибитор CTLA-4)., вводят субъекту одновременно или последовательно по отношению друг к другу и по отношению к одному или нескольким WT1 пептидам. В одном варианте осуществления, комбинация двух или нескольких ингибиторов контрольных точек таргетирует два или несколько разных белков контрольных точек из следующих: CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, киназа CHK 1, киназа CHK2, лиганды семейства A2aR и B-7. В одном варианте осуществления, комбинацию двух или нескольких ингибиторов контрольной точки, таргетирующих два или несколько различных белков контрольной точки, выбирают из числа тех, которые указаны в таблице 1.

Уровень дозы, частота дозирования, продолжительность дозирования и другие аспекты введения ингибитора контрольной точки могут быть оптимизированы в соответствии с клинической картиной пациента, продолжительностью или течением заболевания, сопутствующими заболеваниями и другими аспектами клинической помощи. Изобретение не является таким ограничивающим в отношении конкретных аспектов компонента ингибитора контрольной точки в способах, воплощенных в настоящем документе.

В одном варианте осуществления, доза ниволумаба и схема приема включает 3 мг/кг каждые 2 недели в течение курса продолжительностью 12 недель. В одном из вариантов осуществления, введение является внутривенным. В одном варианте осуществления, курс введения ингибитора контрольной точки совпадает с курсом введения WT1 вакцины. В одном варианте осуществления, курс введения ингибитора контрольной точки частично совпадает с курсом введения WT1 вакцины. В одном варианте осуществления, курс введения ингибитора контрольной точки начинается примерно в то же время, что и курс введения WT1 вакцины.

В одном варианте осуществления, иммунотерапевтическая композиция содержит 200 мкг каждого из пептидов YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205) объединены в общем объеме 0,5 мл, эмульгированы с 1,0 мл Монтанида ISA 51 VG и вводятся подкожно каждые 2 недели в количестве 6 введений; и ниволумаб, 3 мг/кг, вводится внутривенно путем 60-минутной инфузии каждые две недели в течение 7 введений, начиная с того же времени, что и иммунотерапия WT1.

В одном варианте осуществления, в настоящем документе представлены способы, в которых комбинация из семи или нескольких WT1 пептидов и, необязательно, один или несколько ингибиторов контрольной точки вводят субъекту в соответствии со схемой, которая приносит максимальную пользу пациенту. Следовательно, один или несколько WT1 пептидов и один или несколько ингибиторов контрольной точки необязательно вводят одновременно или даже в одной и той же композиции, или каждый с одной и той же продолжительностью. Каждый WT1 пептид или комбинацию WT1 пептидов можно вводить в соответствии с определенной схемой, как и ингибитор каждой контрольной точки. В одном неограничивающем варианте осуществления, комбинация семи или нескольких WT1 пептидов и одного или нескольких ингибиторов контрольной точки присутствует в одной и той же композиции.

Как отмечено в настоящем документе, уровень дозы и схема дозирования, включая частоту и продолжительность приема WT1 пептида или пептидов (отдельно или вместе) и одного или нескольких ингибиторов контрольной точки (вводимых отдельно или вместе), способ введения и другие аспекты введения оптимизированы для получения максимальной пользы для пациента. Эти же аспекты также учитываются, когда субъект-донор является реципиентом WT1 пептида или пептидов и ингибитора или ингибиторов контрольной точки с целью создания WT1-специфичных CTL для введения пациенту.

В одном варианте осуществления представлены композиции, содержащие комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки. В одном варианте осуществления, WT1 пептид или пептиды в композиции относятся к тем, которые описаны в настоящем документе. В одном варианте осуществления, ингибитор контрольной точки входит в число описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления, композиция содержит ингибитор контрольной точки ниволумаб, пембролизумаб или их комбинацию. Композиция может дополнительно содержать эксципиент, разбавитель или носитель. Композиция также может содержать один или несколько адъювантов.

Вышеупомянутые варианты осуществления представляют улучшенные способы лечения, снижения заболеваемости и индуцирования иммунных ответов против рака, экспрессирующего WT1, и композиции, используемые для тех же целей. Другие аспекты изобретения описаны ниже.

В одном варианте осуществления, модифицированный WT1 пептид имеет одну или несколько измененных аминокислот, называемых в настоящем документе мутантным WT1 пептидом. В одном варианте осуществления, мутировавший WT1 пептид содержит: (а) связывающий мотив молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса II; и (b) связывающий мотив молекулы HLA класса I, содержащий точечную мутацию в одном или нескольких якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептид имеет длину 11 или более аминокислот. В некоторых других вариантах осуществления, пептид имеет длину 11-22, 11-30, 16-22 или 16-30 аминокислот. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-3 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1 якорном остатке связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 2 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-2 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 2-3 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-4 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. Каждая возможность представляет отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта с раком, экспрессирующим WT1, где способ включает введение субъекту комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, таким образом осуществляя лечение субъекта с раком, экспрессирующим WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения заболеваемости раком, экспрессирующим WT1, или его рецидива у субъекта, где способ включает введение субъекту комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым снижая частоту рака, экспрессирующего WT1, или его рецидивов у субъекта.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт популяции лимфоцитов с комбинацией, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым индуцируя образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования образования и пролиферации (а) CD8⁺ лимфоцита, специфичного к белку WT1; и (b) CD4⁺ лимфоцита, специфичного к белку WT1, где способ включает контакт популяции лимфоцитов с комбинацией, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым вызывая образование и пролиферацию (а) CD8⁺ лимфоцита, специфичного к белку WT1; и (b) CD4⁺ лимфоцита, специфичного к белку WT1.

В одном варианте осуществления, вышеупомянутые способы лечения рака, экспрессирующего WT1, снижения частоты рака, экспрессирующего WT1, или индуцирования образования и пролиферации Т-клеточного ответа, специфичного к белку WT1, достигаются с большим эффектом, чем если бы в таких способах использовалась только комбинация, по меньшей мере, семи WT1 пептидов отдельно или только ингибиторов контрольной точки. В одном варианте осуществления, курс введения иммунотерапии WT1 и курс введения одного или нескольких ингибиторов контрольных точек являются параллельными, пересекаются или являются одновременными, так что биологический ответ на вакцину усиливается введением одного или нескольких ингибиторов контрольной точки. Одновременное введение включает курс иммунотерапии WT1 для индуцирования WT1-специфичных CTL и введение одного или нескольких ингибиторов контрольной точки для усиления активности CTL против рака. В одном варианте осуществления, курс введения вакцины WT1 может закончиться до начала курса терапии ингибитором контрольной точки, поскольку эффективность CTL, вызванная введением иммунотерапии WT1, повышается терапией ингибитором контрольной точки. В одном варианте осуществления, первое введение терапии ингибитором контрольной точки проводится в тот же день, что и последнее введение иммунотерапии WT1. В одном варианте осуществления, окончание иммунотерапии WT1 и начало терапии ингибитором контрольной точки разделяют от 1 до 7 дней или от 1 до 4 недель.

Как отмечено в настоящем документе, один или несколько дополнительных WT1 пептидов могут быть нативными фрагментами или непрерывными аминокислотными последовательностями белка WT1, или они могут иметь одну или несколько модификаций аминокислотной последовательности для повышения иммуногенности или любых других полезных свойство пептида и развития иммунитета к раку, экспрессирующему WT1. В некоторых вариантах осуществления, одна или две аминокислоты изменены для повышения иммуногенности. В одном варианте осуществления, в способах применения использую выделенный мутированный WT1 пептид, содержащий: (а) связывающий мотив молекулы человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса II; и (b) связывающий мотив молекулы HLA класса I, имеющий точечную мутацию в 1 или нескольких якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, длина пептида составляет 11 или более аминокислот. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

«Точечная мутация» в другом варианте осуществления означает, что фрагмент мутирован относительно нативной последовательности белка, создавая, таким образом, мотив связывания молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, «точечная мутация» усиливает связывающую способность связывающего мотива молекулы HLA класса I, присутствующего в нативной последовательности. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления способов использования настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-3 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1 якорном остатке связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 2 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-2 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 2-3 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1-4 якорных остатках связывающего мотива молекулы HLA класса I. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению имеет длину 11-453 аминокислоты (AA). В другом варианте осуществления, длина составляет 12-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 13-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 17-453 AA. В другом варианте длина осуществления, составляет 18-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 19-453 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-453 AA.

В другом варианте осуществления, длина составляет 11-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 12-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 13-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 17-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 19-449 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-449 AA.

В другом варианте осуществления, длина составляет 11-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-22 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 19 AA. В другом варианте осуществления, длина пептида составляет 15-23 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-24 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-25 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-27 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 15-28 АА. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-29 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-24 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-22 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 14-20 АА. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-24 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 16-22 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-24 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-22 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 18-20 АА. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 20-24 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 22-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 22-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 22-26 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 24-30 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 24-28 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 24-26 AA.

В другом варианте осуществления, пептид, подходящий для способов и композиций по настоящему изобретению, длиннее минимальной длины для связывания с молекулой HLA класса II, которая в другом варианте осуществления, составляет около 12 AA. В другом варианте осуществления, увеличение длины пептида, связывающегося с HLA класса II, позволяет связываться с более чем одной молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, увеличение длины делает возможным связывание с молекулой HLA класса II, мотив связывания которой неизвестен. В другом варианте осуществления, увеличение длины делает возможным связывание с молекулой HLA класса I. В другом варианте осуществления, известен связывающий мотив молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, связывающий мотив молекулы HLA класса I неизвестен. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Каждая из вышеуказанных длин пептидов является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Молекулы HLA, известные в другом варианте осуществления как молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC), связывают пептиды и презентируют их иммунным клеткам. Таким образом, в другом варианте осуществления, иммуногенность пептида частично определяется его сродством к молекулам HLA. Молекулы HLA класса I взаимодействуют с молекулами CD8, которые обычно присутствуют на цитотоксических Т-лимфоцитах (CTL). Молекулы HLA класса II взаимодействуют с молекулами CD4, которые обычно присутствуют на хелперных Т-лимфоцитах.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению является иммуногенным. В другом варианте осуществления, термин «иммуногенный» относится к способности стимулировать, вызывать иммунный ответ или участвовать в нем. В другом варианте осуществления, вызванным иммунным ответом является клеточно-опосредованный иммунный ответ. В другом варианте осуществления, иммунным ответом является комбинация клеточно-опосредованного и гуморального ответов.

В другом варианте осуществления, Т-клетки, которые связываются с комплексом молекула HLA-пептид, активируются и индуцируются для пролиферации и лизиса клеток, экспрессирующих белок, содержащий пептид. Т-клетки обычно первоначально активируются «профессиональными» антигенпрезентирующими клетками («APC»; например, дендритными клетками, моноцитами и макрофагами), которые представляют костимулирующие молекулы, которые способствуют активации Т-клеток, а не анергии или апоптозу. В другом варианте осуществления, ответ является гетероклитическим, как описано в настоящем документе, так что CTL лизирует клетку новообразования, экспрессирующую белок, который имеет последовательность АА, гомологичную пептиду по настоящему изобретению, или пептиду, отличному от того, который использовался для первой стимуляции Т-клетки.

В другом варианте осуществления, встреча Т-клетки с пептидом по настоящему изобретению индуцирует ее дифференциацию в эффекторную Т-клетку и/или Т-клетку памяти. Последующие встречи между эффекторной Т-клеткой или Т-клеткой памяти и тем же пептидом или, в другом варианте осуществления, с гетероклитическим пептидом по настоящему изобретению, приводят к более быстрому и более интенсивному иммунному ответу. В другом варианте осуществления, такие ответы оценивают путем измерения степени пролиферации популяции Т-клеток, подвергнутой воздействию пептида. В другом варианте осуществления, такие ответы оценивают любым из перечисленных ниже способов.

В другом варианте осуществления, как описано в настоящем документе, субъект подвергается воздействию пептида или композиции/популяции клеток, содержащих пептид по настоящему изобретению, который отличается от экспрессированного нативного белка, где впоследствии развивается иммунный ответ хозяина перекрестно реагирующего с нативным белком/антигеном.

В другом варианте осуществления, пептиды, композиции и вакцины по настоящему изобретению стимулируют иммунный ответ, который приводит к лизису опухолевых клеток. Во всех вышеупомянутых вариантах осуществления, одновременное использование ингибитора контрольной точки усиливает иммунный ответ против опухоли.

В другом варианте осуществления, мотив связывания молекулы HLA класса I пептида по настоящему изобретению содержится в мотиве связывания молекулы HLA класса II пептида. В другом варианте осуществления, мотив связывания молекулы HLA класса I перекрывается с мотивом связывания молекулы HLA класса II. В другом варианте осуществления, мотив связывания молекулы HLA класса I не перекрывается с мотивом связывания молекулы HLA класса II. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Молекула HLA класса II, связывающий мотив которой содержится в пептиде по настоящему изобретению, в другом варианте является молекулой HLA-DR. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DP. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DQ.

В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DRB. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB101. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB301. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB401. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB701. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB1101. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является DRB1501. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является любая другая молекула HLA-DRB, известная в данной области техники. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DRA. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DQA1. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DQB1. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DPA1. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DPB1. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DMA. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DMB. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DOA. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является молекула HLA-DOB. В другом варианте осуществления, молекулой HLA класса II является любая другая молекула HLA класса II, известная в данной области техники.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связывается с 2 отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с тремя различными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с четырьмя отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с пятью отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с шестью отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается более чем с шестью отдельными молекулами HLA класса II.

В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II, которые связываются пептидом по настоящему изобретению, кодируются двумя или более отдельными аллелями в данном локусе HLA класса II. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются тремя разными аллелями в локусе. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются четырьмя различными аллелями в локусе. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются пятью различными аллелями в локусе. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются шестью различными аллелями в локусе. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются более чем шестью различными аллелями в локусе.

В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II, связанные пептидом, кодируются генами HLA класса II в двух различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 2 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 3 различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 3 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 4 различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 4 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 5 различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 5 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 6 различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в 6 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II кодируются генами HLA класса II в более чем 6 различных локусах. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связывается с 2 отдельными молекулами HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид связывается с тремя отдельными молекулами HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид связывается с четырьмя отдельными молекулами HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид связывается с пятью отдельными молекулами HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид связывается с шестью отдельными молекулами HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид связывается более чем с шестью отдельными молекулами HLA-DRB.

В другом варианте осуществления, молекулы HLA класса II, связанные WT1 пептидом, кодируются генами HLA класса II в 2 различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в 2 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в 3 различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в 3 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в 4 различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в 4 или нескольких различных локусах. В другом варианте осуществления, связанные молекулы HLA кодируются генами HLA класса II в более чем 4 различных локусах. В других вариантах осуществления, локусы выбираются из локусов HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептидом, связывающимся с HLA класса II, является пептид, связывающий HLA-DRA. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DQA1. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DQB1. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DPA1. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DPB1. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DMA. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DMB. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DOA. В другом варианте осуществления, пептидом является пептид, связывающий HLA-DOB. В другом варианте осуществления, пептид связывается с любой другой молекулой HLA класса II, известной в данной области техники. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связывается с молекулами HLA-DRB, которые кодируются двумя разными аллелями HLA-DRB, выбранными из DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 и DRB 1501. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулами HLA-DRB, кодируемыми 3 различными аллелями HLA-DRB, выбранными из DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 и DRB 1501. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулами HLA-DRB кодируется 4 различными аллелями HLA-DRB, выбранными из DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 и DRB 1501. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулами HLA-DRB, кодируемыми 5 отдельными выбранными аллелями HLA-DRB из DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 и DRB 1501. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулами HLA-DRB, кодируемыми каждым из следующих аллелей HLA-DRB: DRB 101, DRB 301, DRB 401, DRB 701, DRB 1101 и DRB 1501. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Каждая из вышеуказанных молекул HLA класса II, типов, классов и их комбинаций является отдельным вариантом осуществления, настоящего изобретения.

Молекула HLA класса I, связывающий мотив которой содержится в пептиде по настоящему изобретению, в другом варианте является молекулой HLA-A. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-B. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-C. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-A0201. В другом варианте осуществления, молекула является HLA A1. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A2. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A2.1. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A3. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A3.2. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A11. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA A24. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA B7. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA B27. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является HLA B8. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, связывающийся с молекулой HLA класса I WT1 пептид в способах и композициях по настоящему изобретению связывается с суперсемейством молекул HLA класса I. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство A2. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство A3. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство A24. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство B7. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство B27. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство B44. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство C1. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство C4. В другом варианте осуществления, суперсемейством является любое другое суперсемейство, известное в данной области техники. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, связывающий мотив молекулы HLA класса I пептида по настоящему изобретению проявляет повышенную аффинность к молекуле HLA класса I по сравнению с не мутантным аналогом пептида. В другом варианте осуществления, точечная мутация увеличивает аффинность выделенного мутированного WT1 пептида к молекуле HLA класса I. В другом варианте осуществления, увеличение аффинности происходит относительно аффинности (к той же самой молекуле HLA класса I) выделенного не мутантного WT1 пептида, из которого был получен выделенный мутированный WT1 пептид. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, связывающийся с молекулой HLA класса I пептид WT из способов и композиций по настоящему изобретению имеет длину 9-13 AA. В другом варианте осуществления, длина составляет 8-13 AA. В другом варианте осуществления, пептид имеет любую длину пептида по настоящему изобретению, перечисленную в настоящем документе.

В другом варианте осуществления, пептид WT, связывающийся с молекулой HLA класса I, имеет длину 8 AA. В другом варианте осуществления, пептид имеет длину 9 AA. В другом варианте осуществления, пептид имеет длину 10 AA. Как предусмотрено в настоящем документе, нативные и гетероклитические пептиды из 9-10 AA демонстрируют существенное связывание с молекулами HLA класса I и способность вызывать секрецию цитокинов и цитолиз с помощью CTL.

В другом варианте осуществления, WT1 пептид, связывающийся с молекулой HLA класса I, встроенный в WT1 пептид по настоящему изобретению, имеет 1 из указанных выше длин. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. В одном варианте осуществления, WT1 пептидом является пептид большей длины, чем WT1 пептид, связывающийся с молекулой HLA класса I. Пептид большей длины расщепляется клетками до соответствующей длины, которая будет презентирована молекулой HLA класса 1.

В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I, которая связана с WT1 пептидом, связывающимся с молекулой HLA класса I, является молекулой HLA-A. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-A2. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-A3. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-A11. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-B8. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I является молекулой HLA-0201. В другом варианте осуществления, молекула HLA класса I связывает любую другую молекулу HLA класса I, известную в данной области техники. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению сохраняет способность связываться с множеством молекул HLA класса II, как демонстрирует выделенный WT1 пептид, из которого был получен пептид настоящего изобретения.

Во всех аспектах, описанных в настоящем документе, один или несколько WT1 пептидов, применимых в вакцине, описанной в настоящем документе, или для генерации CTL in vitro, ex vivo или у донора, выбор пептида или последовательностей пептидов, нативных или модифицированных, для соответствия типам HLA пациента или донора, воплощен в настоящем документе.

Молекула WT1, из которой может быть получен пептид по настоящему изобретению, в другом варианте осуществления, имеет последовательность:

MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 199; номер доступа GenBank AY245105).

В другом варианте осуществления, молекула WT1 имеет последовательность:

AAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 200; номер доступа GenBank NM_000378).

В другом варианте осуществления, молекула WT1 имеет последовательность:

MQDPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 201; номер доступа GenBank NP_077742).

В другом варианте осуществления, молекула WT1 содержит последовательность:

MGHHHHHHHHHHSSGHIEGRHMRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFFRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL (SEQ ID NO: 202).

В других вариантах осуществления, белок WT1 содержит одну из последовательностей, указанных в одной из следующих записей последовательностей GenBank: NM_024426, NM_024425, NM_024424, NM_000378, S95530, D13624, D12496, D12497, AH003034 или X77549. В других вариантах осуществления, белок WT1 имеет одну из последовательностей, указанных в одной из приведенных выше записей последовательностей GenBank. В другом варианте осуществления, белком WT1 является любой белок WT1, известный в данной области техники. В другом варианте осуществления, белок WT1 имеет любую другую последовательность WT1, известную в данной области техники.

В другом варианте осуществления, пептид, полезный для целей настоящего изобретения, получают из фрагмента белка WT1. В другом варианте осуществления, процесс получения включает введение точечной мутации в якорные остатки связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, процесс получения состоит из введения точечной мутации в якорные остатки связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению отличается от соответствующего фрагмента белка WT1 только точечной мутацией в якорном остатке связывающего мотива молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, связывающий мотив молекулы HLA класса I пептида по настоящему изобретению отличается от соответствующей последовательности WT1 только точечной мутацией в якорном остатке. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, способ получения пептида по настоящему изобретению дополнительно включает одну или несколько модификаций аминокислоты (AA) до аналога AA. В другом варианте осуществления, процесс получения дополнительно включает модификацию одной или нескольких пептидных связей, соединяющих два или несколько AA. В другом варианте осуществления, аналогом AA или модификацией пептидной связи является один из аналогов AA или модификаций пептидной связи, перечисленных ниже. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Немутированный фрагмент белка WT1, из которого происходит пептид по настоящему изобретению («аналог» в последовательности дикого типа), в другом варианте осуществления, имеет последовательность SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 5). В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 имеет последовательность QARMFPNAPYLPSCL (SEQ ID NO: 6). В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 имеет последовательность LVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 3). В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 имеет последовательность RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1). В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 имеет последовательность NKRYFKLSHLQMHSR (SEQ ID NO: 4). В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 имеет последовательность PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2). В другом варианте осуществления, немутированным фрагментом WT1 является любой другой фрагмент WT1, который содержит мотив связывания молекулы HLA класса II. В другом варианте осуществления, немутированным фрагментом WT1 является любой другой фрагмент WT1, который содержит мотив связывания молекулы HLA-DR. В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 содержит несколько мотивов связывания молекулы HLA-DR. В другом варианте осуществления, немутированным фрагментом WT1 является любой другой фрагмент WT1, который содержит мотив связывания молекулы HLA-DRB. В другом варианте осуществления, немутированный фрагмент WT1 содержит несколько мотивов связывания молекулы HLA-DRB. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению отличается от своего аналога только точечной мутацией, которую он содержит. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению отличается от своего аналога только мутацией в якорных остатках HLA класса I. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению сохраняет способность связывать молекулу HLA класса II, что демонстрирует немутированный фрагмент WT1, из которого был получен пептид. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению сохраняет способность связывать несколько молекул HLA класса II, что проявляется немутированным фрагментом WT1. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, содержащему AA последовательность GATLKGVAAGSSSSVKWT (SEQ ID NO: 203) и LKGVAAGSSSSVKWT (SEQ ID NO: 204).

«Пептид» в другом варианте осуществления способов и композиций по настоящему изобретению относится к соединению субъединицы AA, соединенному пептидными связями. В другом варианте осуществления, пептид содержит аналог AA. В другом варианте осуществления, пептидом является пептидомиметик. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению содержит один из аналогов АА, перечисленных ниже. В другом варианте осуществления, субъединицы связаны пептидными связями. В другом варианте осуществления, субъединица связана другим типом связи, например сложным эфиром, простым эфиром и т.д. В другом варианте осуществления, пептидом по настоящему изобретению является один из типов пептидомиметиков, перечисленных ниже. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид из способов и композиций по настоящему изобретению связывается с высокой аффинностью с молекулой HLA класса I, в которой содержится связывающий мотив. В других вариантах осуществления, молекулой HLA класса I является любая молекула HLA класса I, перечисленная в настоящем документе. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса I со средней аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса I со значительной аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса I с измеримой аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид демонстрирует стабильное связывание с молекулой HLA класса I. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид из способов и композиций по настоящему изобретению связывается с высокой аффинностью с молекулой HLA класса II, в которой содержится связывающий мотив. В других вариантах осуществления, молекулой HLA класса II является любая молекула HLA класса II, перечисленная в настоящем документе. В другом варианте осуществления, пептид связывается с высокой аффинностью более чем с 1 молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса II со средней аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается со средней аффинностью более чем с 1 молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса II со значительной аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид со значительной аффинностью связывается с более чем 1 молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид связывается с молекулой HLA класса II с измеримой аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается с измеримой аффинностью более чем с 1 молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид демонстрирует стабильное связывание с молекулой HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептид демонстрирует стабильное связывание более чем с 1 молекулой HLA класса II. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид из способов и композиций по настоящему изобретению связывается как с молекулой HLA класса I, так и с молекулой HLA класса II со значительной аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается как с молекулой HLA класса I, так и с молекулой HLA класса II с высокой аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается как с молекулой HLA класса I, так и с молекулой HLA класса II со средней аффинностью. В другом варианте осуществления, пептид связывается как с молекулой HLA класса I, так и с молекулой HLA класса II с измеряемой аффинностью. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

«Фрагмент», в другом варианте относится к пептиду длиной 11 или более AA. В другом варианте осуществления, пептидный фрагмент настоящего изобретения имеет длину 16 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент имеет длину 12 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 13 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 14 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 15 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 17 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 18 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 19 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 22 или более AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет 8-12 AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет примерно 8-12 AA. В другом варианте осуществления, фрагментом является 16-19 AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет примерно 16-19 AA. В другом варианте осуществления, фрагментом является 10-25 AA. В другом варианте осуществления, фрагмент составляет примерно 10-25 AA. В другом варианте осуществления, фрагмент имеет любую другую длину. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления, настоящее изобретение представляет композицию, содержащую:

(а) комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов, состоящую из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) нуклеиновую кислоту, кодирующую комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а); или

(c) иммунную клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащую или презентирующую, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) цитотоксические Т-клетки (CTL), индуцированные комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а); или

(е) комбинацию двух, трех или всех четырех из пунктов (a), (b), (c) и (d).

В одном варианте осуществления, композиция содержит комбинацию WT1 пептидов, включая каждый из YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124; также называемый WT1-A1), RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1; также называемый длинным WT1-427), PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2; также называемый длинным WT1-331), SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125; также называемый длинным WT1-122A1), NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21; также называемый коротким NLM), WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26; также называемый WNLM или длинным NLM) и WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205; также называемый WNYM или длинным NYM). Необязательно, композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, 1 дополнительный WT1 пептид. В некоторых вариантах осуществления, представлена композиция, содержащая, по меньшей мере, 2 различных выделенных пептида по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, представлена композиция, содержащая, по меньшей мере, 3 или, по меньшей мере, 4 различных выделенных пептида по настоящему изобретению. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления, композицией по настоящему изобретению является вакцина.

В другом варианте осуществления, каждый пептид в способах и композициях по настоящему изобретению независимо связывает молекулу HLA класса II со значительной аффинностью, в то время как каждый пептид, полученный из исходного пептида, независимо связывает молекулу HLA класса I со значительной аффинностью и независимо относится к каждому пептиду, содержащему комбинацию.

В другом варианте осуществления, «аффинность» относится к концентрации пептида, необходимой для ингибирования связывания стандартного пептида с указанной молекулой MHC на 50%. В другом варианте осуществления, «высокая аффинность» относится к такой аффинности, при которой для 50% ингибирования связывания стандартного пептида требуется концентрация примерно 500 наномоль (нМ) или менее пептида. В другом варианте осуществления, требуется концентрация пептида примерно 400 нМ или менее. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 300 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 200 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 150 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 100 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 80 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 60 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 40 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 30 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 20 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 15 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 10 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 8 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 6 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 4 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 3 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 2 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 1,5 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 1 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 0,8 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 0,6 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 0,5 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 0,4 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет 0,3 нМ. В другом варианте осуществления, аффинность связывания составляет менее 0,3 нМ.

В другом варианте осуществления, «аффинность» относится к мере силы связывания с молекулой MHC. В другом варианте осуществления, аффинность измеряется с использованием способа, известного в данной области, для измерения аффинности конкурентного связывания. В другом варианте осуществления, аффинность измеряется с использованием способа, известного в данной области, для измерения относительной аффинности связывания. В другом варианте осуществления, способом является анализ конкурентного связывания. В другом варианте осуществления, этим способом является радиоиммуноанализ или RIA. В другом варианте осуществления, способом является анализ BiaCore. В другом варианте осуществления, способом является любой другой способ, известный в данной области техники. В другом варианте осуществления, способ дает IC50 по отношению к IC50 эталонного пептида с известной аффинностью.

Каждый тип аффинности и способ измерения аффинности представляют собой отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, «высокое сродство» относится к IC50 0,5-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 1-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 1,5-200 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 2-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 3-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 4-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 6-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 10-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 30-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 3-80 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 4-60 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 5-50 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 6-50 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 8-50 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 10-50 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 20-50 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 6-40 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 8-30 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 10-25 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 15-25 нМ. Каждая аффинность и диапазон аффинностей представляют отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, «средняя аффинность» относится к IC50, равной 100-500 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 100-300 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 100-200 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 50-100 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 50-80 нМ. В другом варианте осуществления, IC50 составляет 50-60 нМ. Каждая аффинность и диапазон аффинностей представляют отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

«Значительная аффинность» относится, в другом варианте осуществления, к достаточной аффинности для опосредования распознавания клетки-мишени Т-клеткой, несущей Т-клеточный рецептор (TCR), который распознает комплекс молекула MHC-пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному для опосредования распознавания раковой клетки Т-клеткой, несущей TCR, который распознает комплекс молекула MHC-пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному чтобы опосредовать активацию наивной Т-клетки дендритной клеткой, презентирующей пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному чтобы опосредовать активацию наивной Т-клетки APC, презентирующей пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному чтобы опосредовать повторную активацию Т-клетки памяти дендритной клеткой, презентирующей пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному чтобы опосредовать повторную активацию Т-клетки памяти APC, презентирующей пептид. В другом варианте осуществления, термин относится к сродству, достаточному чтобы опосредовать повторную активацию Т-клетки памяти соматической клеткой, презентирующей пептид. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

«Измеримая аффинность», в другом варианте осуществления, относится к достаточной аффинности, чтобы ее можно было измерить с помощью иммунологического анализа. В другом варианте осуществления, иммунологическим анализом является любой анализ, перечисленный в настоящем документе. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид из способов и композиций по настоящему изобретению связывается с суперсемейством молекул HLA. Суперсемейства молекул HLA имеют очень похожие или идентичные связывающие мотивы. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство HLA класса I. В другом варианте осуществления, суперсемейством является суперсемейство HLA класса II. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Термины «HLA-связывающий пептид», «пептид, связывающий молекулу HLA класса I» и «пептид, связывающий молекулу HLA класса II», в другом варианте осуществления, относится к пептиду, который связывает молекулу HLA с измеряемой аффинностью. В другом варианте осуществления, термины относятся к пептиду, который связывает молекулу HLA с высокой аффинностью. В другом варианте осуществления, термины относятся к пептиду, который связывает молекулу HLA с достаточной аффинностью для активации предшественника Т-клеток. В другом варианте осуществления, термины относятся к пептиду, который связывает молекулу HLA с достаточной аффинностью, чтобы опосредовать распознавание Т-клеткой. В других вариантах осуществления, молекулой HLA является любая из молекул HLA, перечисленных в настоящем документе. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептид в способах и композициях по настоящему изобретению является гетероклитическим. «Гетероклитический» относится, в другом варианте осуществления, к пептиду, который генерирует иммунный ответ, который распознает исходный пептид, из которого был получен гетероклитический пептид (например, пептид, не содержащий мутации якорного остатка). В другом варианте осуществления, «исходный пептид» относится к фрагменту белка WT1. Например, пептид, названный «WT1 122A1», имеющий последовательность SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 124), был получен из WT1 пептида SGQARMFPNAPYLPSCLES дикого типа (SEQ ID NO: 5) путем мутации остатка 5 до аргинина. Гетероклитическая мутация вводила CD8⁺ WT1 пептид RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 7) пептид, созданный YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), WT1A1 пептид. В другом варианте осуществления, «гетероклитический» относится к пептиду, который создает иммунный ответ, который распознает исходный пептид, из которого был получен гетероклитический пептид, при этом иммунный ответ, генерируемый вакцинацией гетероклитическим пептидом, выше, чем иммунный ответ, генерируемый вакцинацией исходным пептидом. В другом варианте осуществления, «гетероклитический» иммунный ответ относится к иммунному ответу, который распознает исходный пептид, из которого был получен улучшенный пептид (например, пептид, не содержащий мутации якорного остатка). В другом варианте осуществления, «гетероклитический» иммунный ответ относится к иммунному ответу, который распознает исходный пептид, из которого был получен гетероклитический пептид, при этом иммунный ответ, вызванный вакцинацией гетероклитическим пептидом, выше, чем иммунный ответ, вызванный вакцинацией исходным пептидом. В другом варианте осуществления, величина иммунного ответа, вызванного вакцинацией гетероклитическим пептидом, больше, чем иммунный ответ, по существу равный ответу на вакцинацию исходным пептидом. В другом варианте осуществления, величина иммунного ответа, вызванного вакцинацией гетероклитическим пептидом, больше, чем иммунный ответ, менее чем ответ на вакцинацию исходным пептидом. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, гетероклитический пептид по настоящему изобретению индуцирует иммунный ответ, который увеличивается, по меньшей мере, в 2 раза по сравнению с WT1 пептидом, из которого был получен гетероклитический пептид («нативный пептид»). В другом варианте осуществления, увеличение является 3-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 5-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 7-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 10-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 15-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 20-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 30-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 50-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 100-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 150-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 200-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 300-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 500-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является 1000-кратным по сравнению с нативным пептидом. В другом варианте осуществления, увеличение является более чем 1000-кратным по сравнению с нативным пептидом. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения и относится независимо к каждому гетероклитическому и производному от него нативному пептиду, в комбинации.

В другом варианте осуществления, гетероклитическим пептидом по настоящему изобретению является гетероклитический пептид HLA класса I. В другом варианте осуществления, гетероклитическим пептидом по настоящему изобретению является гетероклитический пептид HLA класса II. В другом варианте осуществления, гетероклитический пептид класса II по настоящему изобретению мутирован по связывающему остатку в классе II. В другом варианте осуществления, гетероклитический пептид класса II по настоящему изобретению идентифицируют и тестируют способом, аналогичным идентификации и тестированию гетероклитических пептидов HLA класса I, как проиллюстрировано в настоящем документе. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

«Якорные мотивы» или «якорные остатки» в другом варианте относятся к одному или набору предпочтительных остатков в конкретных положениях в HLA-связывающей последовательности. Например, остатки в положениях 1, 2, 3, 6 и 9 используют в качестве якорных остатков. В другом варианте осуществления, HLA-связывающей последовательностью является HLA-связывающая последовательность класса II. В другом варианте осуществления, HLA-связывающей последовательностью является HLA-связывающая последовательность класса I. В другом варианте осуществления, положения, соответствующие якорным мотивам, являются положениями, которые играют значительную роль в связывании молекулы HLA. В другом варианте осуществления, якорный остаток является первичным якорным мотивом. В другом варианте осуществления, якорный остаток является вторичным якорным мотивом. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, «якорными остатками» являются остатки в положениях 1, 3, 6 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 1, 2, 6 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 1, 6 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 1, 2 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 1, 3 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 2 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, термин относится к положениям 6 и 9 связывающего мотива HLA класса I. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Способы идентификации эпитопов MHC класса II хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II прогнозируют с использованием TEPITOPE (Meister GE, Roberts CG et al, Vaccine 1995 13: 581-91). В другом варианте осуществления, эпитоп МНС класса II идентифицируют с использованием EpiMatrix (De Groot AS, Jesdale BM et al, AIDS Res Hum Retroviruses 1997 13: 529-31). В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II идентифицируют с использованием способа прогнозирования (Yu K, Petrovsky N et al, Mol Med. 2002 8: 137-48). В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II идентифицируют с использованием алгоритма предсказания эпитопа SYFPEITHI. SYFPEITHI является базой данных, содержащей более 4500 пептидных последовательностей, которые, как известно, связывают молекулы MHC класса I и класса II. SYFPEITHI обеспечивает оценку, основанную на наличии определенных аминокислот в определенных положениях вдоль канавки связывания MHC. Идеальные аминокислотные якоря оценивают в 10 баллов, необычные якоря оценивают в 6-8 баллов, вспомогательные якоря оценивают в 4-6 баллов, предпочтительные остатки оценивают в 1-4 балла; отрицательное влияние аминокислоты на оценку связывания от -1 до -3. Максимальный балл для HLA-A*0201 составляет 36.

В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II идентифицируют с использованием Rankpep. Rankpep использует матрицы точковых мутаций (PSSM) или профили из наборов выровненных пептидов, которые, как известно, связываются с данной молекулой MHC, в качестве прогностического фактора связывания MHC-пептид. Rankpep включает информацию об оценке пептида и % оптимальной или процентильной оценки спрогнозированного пептида по сравнению с оценкой консенсусной последовательности, дающей максимальную оценку, с выбранным профилем. Rankpep включает выбор из 102 и 80 PSSM для прогнозирования связывания пептида с молекулами MHC I и MHC II, соответственно. Для каждой молекулы MHC I обычно доступно несколько PSSM для прогнозирования пептидных связывающих агентов разного размера.

В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II идентифицируют с использованием SVMHC (Donnes P, Elofsson A. Prediction of MHC class I binding peptides, using SVMHC. BMC Bioinformatics. 2002 Sep 11;3:25). В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса II идентифицируют с использованием любого другого способа, известного в данной области техники. Вышеупомянутые способы используют в другом варианте для идентификации связывания MHC класса II, которое будет нарушено введением мутации якорного остатка MHC класса I в последовательность WT1. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Способы идентификации эпитопов MHC класса I хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса I прогнозируют с использованием программного обеспечения BIMAS. Оценка BIMAS основана на расчете теоретического периода полужизни комплекса MHC-I/β₂-микроглобулин/пептид, который является мерой аффинности связывания пептида. Программа использует информацию о пептидах HLA-I длиной 8-10 аминокислот. Чем выше аффинность связывания пептида с MHC, тем выше вероятность того, что этот пептид представляет эпитоп. Алгоритм BIMAS предполагает, что каждая аминокислота в пептиде независимо участвует в связывании с молекулой класса I. Доминантные якорные остатки, которые имеют решающее значение для связывания, имеют коэффициенты в таблицах, которые значительно выше 1. Неблагоприятные аминокислоты имеют положительные коэффициенты, которые меньше 1. Если не известно, что аминокислота вносит благоприятный или неблагоприятный вклад в связывание, то присваивается значение 1. Все значения, присвоенные аминокислотам, умножаются, и полученная текущая оценка умножается на константу, чтобы получить оценку полупериода диссоциации.

В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса I идентифицируют с использованием SYFPEITHI. В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса I идентифицируют с использованием SVMHC (Donnes P, Elofsson A. Prediction of MHC class I binding peptides, using SVMHC. BMC Bioinformatics. 2002 Sep 11;3:25). В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса I идентифицируют с использованием NetMHC-2.0 (Sensitive quantitative predictions of peptide-MHC binding by a 'Query by Committee' artificial neural network approach. Buus S, Lauemoller SL, Worning P, Kesmir C, Frimurer T, Corbet S, Fomsgaard A, Hilden J, Holm A, Brunak S. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003). В другом варианте осуществления, эпитоп MHC класса I идентифицируют с использованием любого другого способа, известного в данной области техники. Вышеупомянутые способы используют в другом варианте для идентификации эпитопов MHC класса I, которые могут быть созданы путем введения мутации якорного остатка в последовательность WT1. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, мутация, которая усиливает связывание MHC, находится в остатке в положении 1 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, остаток заменен на тирозин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на глицин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на треонин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на фенилаланин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на любой другой остаток, известный в данной области техники. В другом варианте осуществления, замена в положении 1 (например, на тирозин) стабилизирует связывание якорного остатка в положении 2.

В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 2 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, остаток заменен на лейцин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на валин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на изолейцин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на метионин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на любой другой остаток, известный в данной области техники.

В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 6 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, остаток заменен на валин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на цистеин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на глутамин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на гистидин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на любой другой остаток, известный в данной области техники.

В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, мутация изменяет остаток в его С-концевом положении. В другом варианте осуществления, остаток заменен на валин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на треонин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на изолейцин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на лейцин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на аланин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на цистеин. В другом варианте осуществления, остаток заменен на любой другой остаток, известный в данной области техники.

В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в первичном якорном остатке. В другом варианте осуществления, первичные якорные остатки HLA класса I находятся в положениях 2 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится во вторичном якорном остатке. В другом варианте осуществления, вторичные якорные остатки HLA класса I находятся в положениях 1 и 8. В другом варианте осуществления, вторичные якорные остатки HLA класса I находятся в положениях 1, 3, 6, 7 и 8. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в положении, выбранном из положений 4, 5 и 8. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, точечная мутация присутствует в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 2, 8 и 9 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, точечная мутация происходит в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 3, 6 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация происходит в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 2, 6 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация присутствует в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 6 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация происходит в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 2 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация присутствует в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 1, 3 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация происходит в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 2 и 9. В другом варианте осуществления, точечная мутация находится в 1 или более остатках в положениях, выбранных из положений 6 и 9. Каждая возможность представляет отдельный вариант осуществления, настоящего изобретения. В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 4 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 5 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 7 связывающего мотива HLA класса I. В другом варианте осуществления, мутация находится в положении 8 связывающего мотива HLA класса I. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Каждый из вышеуказанных якорных остатков и замен является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, сайт связывания HLA класса II в пептиде по настоящему изобретению создается или улучшается путем мутации якорного остатка мотива HLA класса II. В другом варианте осуществления, модифицируемый якорный остаток находится в положении P1. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P2. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P6. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P9. В другом варианте осуществления, якорный остаток выбран из положений P1, P2, P6 и P9. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P3. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P4. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P5. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P6. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P8. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P10. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P11. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P12. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в положении P13. В другом варианте осуществления, якорный остаток находится в любом другом якорном остатке молекулы HLA класса II, который известен в данной области техники. В другом варианте осуществления, остатки, отличные от P1, P2, P6 и P9, служат в качестве вторичных якорных остатков; следовательно, их мутация может улучшить связывание HLA класса II. В другом варианте осуществления, мутирована любая комбинация вышеуказанных остатков. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает стадию введения субъекту иммунотерапевтической композиции, описанной в настоящем документе, необязательно с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, тем самым индуцируя у субъекта иммунный ответ против рака, экспрессирующего WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта с раком, экспрессирующим WT1, где способ включает стадию введения субъекту иммунотерапевтической композиции, описанной в настоящем документе, необязательно, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, таким образом, обеспечивая лечение субъекта с раком, экспрессирующим WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения заболеваемости раком, экспрессирующим WT1, или его рецидива у субъекта, где способ включает стадию введения субъекту иммунотерапевтической композиции, описанной в настоящем документе, необязательно с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, тем самым снижая частоту рака, экспрессирующего WT1, или его рецидива у субъекта.

Термины «гомология», «гомологичный» и т.д., когда они относятся к любому белку или пептиду, относятся, в другом варианте осуществления, к доле остатков AA в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующего нативного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной доли гомологии и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области техники.

В другом варианте осуществления, термин «гомология», когда он относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, аналогичным образом обозначает долю нуклеотидов в кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидам соответствующей нативной последовательности нуклеиновой кислоты.

В другом варианте осуществления, гомология определена компьютерным алгоритмом выравнивания последовательностей, способами, хорошо описанными в данной области техники. В других вариантах осуществления, компьютерный алгоритм анализа гомологии последовательностей нуклеиновых кислот включает использование любого количества доступных пакетов программного обеспечения, таких как, например, пакеты BLAST, DOMAIN, BEAUTY (BLAST Enhanced Alignment Utility), GENPEPT и TREMBL.

Доля идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % идентичности =# идентичных положений/общий # положений х 100), принимая во внимание количество гэпов, и длина каждого гэпа, который необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение доли идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием математического алгоритма в программном обеспечении для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков сопоставляет аналогичные последовательности, используя меры сходства, относящиеся к различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены.

Доля идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена, например, с помощью алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступны на www.gcg.com), используя любую из матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, а также штрафы за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафы за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA, применяя параметры по умолчанию или рекомендуемые параметры. Программа в GCG версии 6.1., FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и долю идентичности последовательностей областей наилучшего перекрытия между запрашиваемой последовательностью и последовательностью поиска (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000; 132:185-219). Доля идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть также определена с использованием алгоритма E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 1988; 11-17), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы веса остатков PAM120, штрафа за удлинение гэпа 12 и штрафа за гэп 4.

Другим алгоритмом сравнения последовательности с другими последовательностями, содержащимися в базе данных, является компьютерная программа BLAST, особенно blastp, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25:3389-402 (1997); каждый включен в настоящий документ в качестве ссылки. Последовательности белков по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве «запрашиваемой последовательности» для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск может быть проведен с помощью программы XBLAST (версия 2.0) Altschul, et al. 1990 (см. выше). Поиск белков BLAST может быть выполнен с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных WT1 пептидам по настоящему изобретению. Чтобы получить выравнивания с гэпами в целях сравнения, можно использовать Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., 1997 (см. выше). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

В другом варианте осуществления, «гомология» по отношению к гомологичной последовательности относится к доле идентичности с последовательностью, описанной в настоящем документе, более 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет композицию, содержащую один или несколько агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами, и, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно содержит адъювант. В другом варианте осуществления, композиция содержит 2 или несколько пептидов по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, композиция дополнительно содержит любую из добавок, соединений или эксципиентов, описанных в настоящем документе ниже. В другом варианте осуществления, адъювантом является соль квасцов или другой минеральный адъювант, бактериальный продукт или адъювант бактериального происхождения, поверхностно-активный агент (например, сапонин), эмульсия м/в или в/м, липосомный адъювант, цитокин (например, IL-2, GM-CSF, IL-12 и IFN-гамма) или аналог альфа-галактозилцерамида. В другом варианте осуществления, адъювантом является QS21, полный или неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, BCG или квасцы. В других вариантах осуществления, носителем является любой носитель, перечисленный в настоящем документе. В других вариантах осуществления, адъювантом является любой адъювант, перечисленный в настоящем документе. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, в изобретении представлена вакцина, содержащая один или несколько агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL и, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки. В другом варианте осуществления, вакцина дополнительно содержит носитель. В другом варианте осуществления, вакцина дополнительно содержит адъювант. В другом варианте осуществления, вакцина дополнительно содержит комбинацию носителя и адъюванта. В другом варианте осуществления, вакцина дополнительно содержит APC. В другом варианте осуществления, вакцина дополнительно содержит комбинацию APC и носителя или адъюванта. В другом варианте осуществления, вакциной является композиция на основе клеток. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, в изобретении представлена иммуногенная композиция, содержащая пептид по настоящему изобретению и, по меньшей мере, один ингибитор контрольной точки. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция дополнительно содержит носитель. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция дополнительно включает комбинацию носителя и адъюванта. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, термин «вакцина» относится к продукту или композиции, которая при введении субъекту обеспечивает профилактический или терапевтический ответ на конкретное заболевание, состояние или его симптом. В другом варианте осуществления, это изобретение включает вакцины на основе пептидов, где пептид включает любой вариант осуществления, перечисленный в настоящем документе, необязательно, дополнительно включающий иммуномодулирующие соединения, такие как цитокины, адъюванты и т. д.

В других вариантах осуществления, композиция или вакцина из способов и композиций по настоящему изобретению дополнительно содержит адъювант. В другом варианте осуществления, адъювантом является Монтанид ISA 51. Монтанид ISA 51 содержит натуральное метаболизируемое масло и очищенный эмульгатор. В другом варианте осуществления, адъювантом является GM-CSF. В другом варианте осуществления, адъювантом является гемоцианин лимфы улитки (KLH), который может быть конъюгирован с пептидным антигеном или может вводиться вместе с пептидом. Рекомбинантным GM-CSF является белок человека, выращенный, в другом варианте осуществления, в дрожжевом (S. cerevisiae) векторе. GM-CSF способствует клональной экспансии и дифференцировке гемопоэтических клеток-предшественников, APC, а также дендритных клеток и Т-клеток.

В другом варианте осуществления, адъювантом является цитокин. В другом варианте осуществления, адъювантом является фактор роста. В другом варианте осуществления, адъювантом является популяция клеток. В другом варианте осуществления, адъювантом является QS21. В другом варианте осуществления, адъювантом является неполный адъювант Фрейнда. В другом варианте осуществления, адъювантом является фосфат алюминия. В другом варианте осуществления, адъювантом является гидроксид алюминия. В другом варианте осуществления, адъювантом является BCG. В другом варианте осуществления, адъювантом являются квасцы. В другом варианте осуществления, адъювантом является интерлейкин. В другом варианте осуществления, адъювантом является хемокин. В другом варианте осуществления, адъювантом является адъювант любого другого типа, известного в данной области техники. В другом варианте осуществления, вакцина WT1 содержит два из указанных выше адъювантов. В другом варианте осуществления, вакцина WT1 содержит более двух из указанных выше адъювантов. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, вакцина WT1, используемая в способах по настоящему изобретению, может представлять собой одну или несколько молекул нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), кодирующих один или несколько WT1 пептидов по настоящему изобретению. В практике этого варианта осуществления, вводят вакцину, содержащую молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие один или несколько WT1 пептидов (вакцину на основе нуклеиновой кислоты), и пациенту вводят один или несколько ингибиторов контрольных точек. Во всех других вариантах осуществления, вакцина на основе нуклеиновой кислоты может использоваться вместо пептидной вакцины. Нуклеиновая кислота может быть введена отдельно, как часть вирусного носителя, или внутри клетки, возможно, как плазмида, или интегрирована в нуклеиновую кислоту клетки. Клеточный носитель может быть клетками пациента, взятыми у пациента, или клеткой от донора, или клеточной линией. Клеткой может быть антигенпрезентирующая клетка, такая как дендритная клетка или моноцитарная/макрофагальная клеточная линия. Клеточный вектор выбран из группы, состоящей из клетки, такой как аутологичная клетка, аллогенная клетка, клеточная линия, дендритная клетка или антигенпрезентирующая клетка, или слияния любых из вышеуказанных клеток в гибридную клетку.

WT1 пептид или кодирующая его нуклеиновая кислота, или его носитель в любой из описанных в настоящем документе форм могут подвергаться воздействию CTL ex vivo или in vivo. Если in vitro или ex vivo, клетки можно выращивать или размножать, и затем вводить пациенту.

Как взаимозаменяемо используется в настоящем документе, термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» включают РНК, ДНК или РНК/ДНК гибридные последовательности из более чем одного нуклеотида в одноцепочечной или дуплексной форме. Термины включают «модифицированные нуклеотиды», которые содержат, по меньшей мере, одну модификацию, включая в качестве примера, но не ограничения: (а) альтернативную связывающую группу, (b) аналогичную форму пурина, (c) аналогичную форму пиримидина или (d) аналогичный сахар. Примеры аналогичных связывающих групп, пуринов, пиримидинов и сахаров см., например, в публикации РСТ № WO 95/04064. Последовательности нуклеиновых кислот по изобретению могут быть получены любым известным способом, включая синтетический, рекомбинантный, получение ex vivo или их комбинацию, а также с использованием любых способов очистки, известных в данной области техники. Используемый в настоящем документе термин «вакцина на основе нуклеиновой кислоты» включает ДНК вакцины и РНК вакцины, а также вакцины, содержащие вирусный или не вирусный вектор.

В другом варианте осуществления, применение настоящего изобретения предлагает вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК). В других вариантах осуществления, композиция или вакцина, используемые на практике настоящего изобретения, могут содержать любой из вариантов осуществления WT1 пептидов по настоящему изобретению и их комбинации. Каждая возможность представляет отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, вакцина для использования в практике настоящего изобретения или композиция по настоящему изобретению содержит два пептида, которые получены из одного и того же фрагмента WT1, каждый из которых содержит другой гетероклитический пептид HLA класса I. В другом варианте осуществления, два гетероклитических пептида HLA класса I содержат мутации в различных якорных остатках молекулы HLA класса I. В другом варианте осуществления, два гетероклитических пептида HLA класса I содержат разные мутации в одном и том же якорном остатке. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептиды в композиции, используемой в настоящем изобретении, связываются с двумя отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с тремя различными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с четырьмя отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с пятью отдельными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды связываются более чем с пятью различными молекулами HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды в композиции связываются с одними и теми же молекулами HLA класса II.

В другом варианте осуществления, каждый из пептидов в композиции или способе применения по настоящему изобретению связывается с набором молекул HLA класса II. В другом варианте осуществления, каждый из пептидов связывается с отдельным набором молекул HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды в композиции связываются с одним и тем же набором молекул HLA класса II. В другом варианте осуществления, два пептида связываются с отдельным, но перекрывающимся набором молекул HLA класса II. В другом варианте осуществления, два или несколько пептидов связываются с одним и тем же набором молекул HLA класса II, в то время как другой из пептидов связывается с отдельным набором. В другом варианте осуществления, два или несколько пептидов связываются с перекрывающимся набором молекул HLA класса II, в то время как другой из пептидов связывается с отдельным набором.

В другом варианте осуществления, пептиды для использования в практике изобретения или в композиции по настоящему изобретению связываются с двумя отдельными молекулами HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с тремя различными молекулами HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с четырьмя отдельными молекулами HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды связываются с пятью различными молекулами HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды связываются более чем с пятью различными молекулами HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды в композиции связываются с одними и теми же молекулами HLA класса I.

В другом варианте осуществления, каждый из пептидов для использования в практике изобретения или в композиции настоящего изобретения связывается с набором молекул HLA класса I. В другом варианте осуществления, каждый из пептидов связывается с отдельным набором молекул HLA класса I. В другом варианте осуществления, пептиды в композиции связываются с одним и тем же набором молекул HLA класса I. В другом варианте осуществления, два пептида связываются с отдельным, но перекрывающимся набором молекул HLA класса I. В другом варианте осуществления, два или несколько пептидов связываются с одним и тем же набором молекул HLA класса I, в то время как другой из пептидов связывается с отдельным набором. В другом варианте осуществления, два или несколько пептидов связываются с перекрывающимся набором молекул HLA класса I, в то время как другой из пептидов связывается с отдельным набором.

В другом варианте осуществления, «набор молекул HLA класса II» или «набор молекул HLA класса I» относится к молекулам HLA, кодируемым разными аллелями в конкретном локусе. В другом варианте осуществления, термин относится к молекулам HLA с определенной специфичностью связывания. В другом варианте осуществления, термин относится к молекулам HLA с определенной консенсусной последовательностью пептидов. В другом варианте осуществления, термин относится к суперсемейству молекул HLA класса II. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

Каждая из вышеуказанных композиций и типов композиций является отдельным вариантом осуществления, настоящего изобретения.

Любые варианты осуществления, описанные в настоящем документе относительно пептидов, нуклеиновых кислот, композиций и вакцин по настоящему изобретению, можно использовать в любом из способов по настоящему изобретению. Каждая комбинация пептида, нуклеиновой кислоты, композиции или вакцины со способом является отдельным вариантом осуществления.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта с раком, экспрессирующим WT1, где способ включает введение субъекту композиции WT1 иммунотерапии, как описано в настоящем документе, и, необязательно, ингибитора контрольной точки, тем самым осуществляя лечение субъекта с раком, экспрессирующим WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта с раком, экспрессирующим WT1, где способ включает введение субъекту композиции по настоящему изобретению, содержащей, по меньшей мере, агент доставки WT1, для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью пептидами и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым обеспечивая лечение субъекта с раком, экспрессирующим WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта с раком, экспрессирующим WT1, где способ включает введение субъекту иммуногенной композиции, такой как вакцина, и, необязательно, ингибитора контрольной точки, таким образом, обеспечивая лечение субъекта с раком, экспрессирующим WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ ингибирования или остановки прогрессирования рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту одного или нескольких агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым ингибируя или останавливая прогрессирование рака, экспрессирующего WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ ингибирования или остановки прогрессирования рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции, содержащей комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым ингибируя или останавливая прогрессирование рака, экспрессирующего WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ ингибирования или остановки прогрессирования рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту иммуногенной композиции, такой как иммунотерапевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым ингибируя или останавливая прогрессирование рака, экспрессирующего WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения заболеваемости раком, экспрессирующим WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту одного или нескольких агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью пептидами и, необязательно, и, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, тем самым снижая частоту рака, экспрессирующего WT1, у субъекта. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения заболеваемости раком, экспрессирующим WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции по настоящему изобретению, содержащей один или несколько агентов доставки WT1, для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым снижая частоту рака, экспрессирующего WT1, у субъекта. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения заболеваемости раком, экспрессирующим WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции по настоящему изобретению, содержащей комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым снижая частоту рака, экспрессирующего WT1, у субъекта.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения частоты рецидивов рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции, содержащей один или несколько агентов доставки WT1, для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым снижая частоту рецидивов рака, экспрессирующего WT1, у субъекта. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ снижения частоты рецидивов рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, где способ включает введение субъекту композиции по настоящему изобретению, содержащей комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым снижая частоту рецидивов рака, экспрессирующего WT1, у субъекта.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ преодоления Т-клеточной толерантности субъекта к раку, экспрессирующему WT1, где способ включает введение субъекту одного или нескольких агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым преодолевая Т-клеточную толерантность к раку, экспрессирующему WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ преодоления Т-клеточной толерантности у субъекта к раку, экспрессирующему WT1, где способ включает введение субъекту композиции по настоящему изобретению, содержащей комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым преодолевая Т-клеточную толерантность к раку, экспрессирующему WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ преодоления Т-клеточной толерантности у субъекта к раку, экспрессирующему WT1, где способ включает введение субъекту иммуногенной композиции, такой как иммунотерапевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, тем самым преодолевая Т-клеточную толерантность к раку, экспрессирующему WT1.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта, имеющего рак, экспрессирующий WT1, включающий (а) индуцирование у донора образования и пролиферации цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) человека, которые распознают злокачественную клетку рака, посредством способа по настоящему изобретению; и (b) инфузию CTL человека субъекту, тем самым обеспечивая лечением субъекта, страдающего раком. В одном варианте осуществления, донору вводят комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, и CTL от указанного донора вводят субъекту, и, необязательно, субъекту вводят ингибитор контрольной точки, тем самым обеспечивая лечение субъекта, страдающего раком. В одном варианте осуществления, донору вводят комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, и CTL от указанного донора вливают субъекту и субъекту, тем самым обеспечивая лечение субъекта, страдающего раком. В одном варианте осуществления, донору вводят комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов и, необязательно, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, и CTL от указанного донора вводят субъекту, и, необязательно, субъекту вводят ингибитор контрольной точки, тем самым обеспечивая лечение субъекта, страдающего раком.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ лечения субъекта, страдающего раком, экспрессирующим WT1, включающий (а) индуцирование ex vivo образования и пролиферации CTL человека, которые распознают злокачественную клетку рака, способом по настоящему изобретению, где иммунные клетки человека получены от донора; и (b) вливание CTL человека субъекту, таким образом, обеспечивая лечение субъекта, страдающего раком. В одном варианте осуществления, ингибитор контрольной точки включают на стадии ex vivo. В другом варианте осуществления, субъекту вводят ингибитор контрольной точки. В другом варианте осуществления, обе стадии ex vivo включают ингибитор контрольной точки, и субъекту также вводят ингибитор контрольной точки.

Способы ex vivo иммунотерапии хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Davis ID et al (Blood dendritic cells generated with Flt3 ligand and CD40 ligand prime CD8+ T cells efficiently in cancer patients. J Immunother. 2006 Sep-Oct; 29(5):499-511) и Mitchell MS et al (The cytotoxic T cell response to peptide analogs of the HLA-A*0201-restricted MUC1 signal sequence epitope, M1.2. Cancer Immunol Immunother. 2006 Jul 28). Каждый способ представляет отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт популяции лимфоцитов с иммуногенной композицией, такой как иммунотерапевтическая композиция по настоящему изобретению, необязательно вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, тем самым вызывая образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция содержит антигенпрезентирующую клетку (APC), связанную с пептидом по настоящему изобретению, и ингибитор контрольной точки. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контактирование популяции лимфоцитов с пептидом или композицией по настоящему изобретению вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, тем самым индуцируя образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт популяции лимфоцитов с вакциной по настоящему изобретению вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, тем самым вызывая образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, CTL специфичны к клетке, экспрессирующей WT1. В другом варианте осуществления, клеткой-мишенью является клетка рака, экспрессирующего WT1. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования у субъекта образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт субъекта с иммуногенной композицией, такой как иммунотерапевтическая композиция по настоящему изобретению, необязательно вместе с по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, тем самым индуцируя у субъекта образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция содержит APC, связанные со смесью, по меньшей мере, семи WT1 пептидов по настоящему изобретению, которую вводят вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования у субъекта образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт субъекта с комбинацией, по меньшей мере, семи WT1 пептидов вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, или композиции по настоящему изобретению, тем самым индуцируя у субъекта образование и пролиферацию CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ индуцирования у субъекта образования и пролиферации CTL, специфичных к белку WT1, где способ включает контакт субъекта с вакциной по настоящему изобретению вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, тем самым индуцируя формирование и пролиферацию у субъекта CTL, специфичных к белку WT1. В другом варианте осуществления, клеткой-мишенью является клетка рака, экспрессирующего WT1. В другом варианте осуществления, у субъекта имеется рак, экспрессирующий WT1. В другом варианте осуществления, CTL специфичны к клетке, экспрессирующей WT1.

В другом варианте осуществления, это изобретение представляет способ создания гетероклитического иммунного ответа у субъекта, где гетероклитический иммунный ответ направлен против рака, экспрессирующего WT1, где способ включает введение субъекту комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, необязательно, вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки или композицией по настоящему изобретению, тем самым вызывая гетероклитический иммунный ответ. В другом варианте осуществления, это изобретение представляет способ создания гетероклитического иммунного ответа у субъекта, где гетероклитический иммунный ответ направлен против рака, экспрессирующего WT1, где способ включает введение субъекту иммуногенной композиции, такой как вакцина по настоящему изобретению, вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, вызывая тем самым гетероклитический иммунный ответ. В другом варианте осуществления, это изобретение представляет способ создания гетероклитического иммунного ответа у субъекта, где гетероклитический иммунный ответ направлен против рака, экспрессирующего WT1, где способ включает введение субъекту вакцины по настоящему изобретению вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, вызывая тем самым гетероклитический иммунный ответ.

Каждый способ является отдельным вариантом осуществления по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является острый миелогенный лейкоз (AML). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является хронический миелогенный лейкоз (CML). В другом варианте осуществления, рак, экспрессирующий WT1, связан с миелодиспластическим синдромом (MDS). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является MDS. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является плоскоклеточная карцинома пищевода. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является острый лимфобластный лейкоз (ALL). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является саркома кости или мягких тканей. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является опухоль Вильмса. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является лейкоз. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является гематологический рак. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является лимфома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является десмопластическая мелкокруглоклеточная опухоль. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является мезотелиома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является злокачественная мезотелиома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак желудка. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак толстой кишки. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак легкого. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак груди. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является опухоль зародышевых клеток. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является злокачественная мезотелиома плевры. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является множественная миелома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является миелоидный лейкоз. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является астроцитарный рак. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является глиобластома (например, мультиформная глиобластома). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является колоректальная аденокарцинома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак яичников (например, серозный, эпителиальный или эндометриальный). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак груди. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является меланома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является плоскоклеточный рак головы и шеи. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является карцинома из протоков поджелудочной железы. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является нейробластома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак матки. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак щитовидной железы. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является гепатоцеллюлярная карцинома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак щитовидной железы. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак печени. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является рак почек (например, почечно-клеточная карцинома). В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является саркома Капоши. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является саркома. В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является любая другая карцинома или саркома.

В другом варианте осуществления, раком, экспрессирующим WT1, является солидная опухоль. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком, экспрессирующим WT1. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с миелодиспластическим синдромом (MDS). В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC). В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком легких. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком груди. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с колоректальным раком. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком простаты. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком яичников. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком почек. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком поджелудочной железы. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком мозга. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком желудочно-кишечного тракта. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с раком кожи. В другом варианте осуществления, солидная опухоль ассоциирована с меланомой.

В другом варианте осуществления, предполагается, что рак или опухоль, подлежащие лечению способом по настоящему изобретению, экспрессируют WT1. В другом варианте осуществления, экспрессия WT1 не была подтверждена тестированием фактического образца опухоли. В другом варианте осуществления, рак или опухоль относится к типу, который, как известно, во многих случаях экспрессирует WT1. В другом варианте осуществления, тип в большинстве случаев экспрессирует WT1.

Каждый тип рака или опухоли, экспрессирующих WT1, а также рака или опухоли, предположительно экспрессирующих WT1, является отдельным вариантом осуществления, настоящего изобретения.

Неисчерпывающий список типов рака, которые можно лечить с помощью композиций и способов по настоящему изобретению, представлен в таблице 2.

Таблица 2. Примеры типов рака

Острый лимфобластный лейкоз у взрослых
Острый миелоидный лейкоз у взрослых
Острый миелоидный лейкоз у детей
Адренокортикальная карцинома,
Адренокортикальная карцинома у детей
Связанные со СПИДом раки,
Связанная со СПИДом лимфома,
Рак анального канала
Астроцитома,
Астроцитома мозжечка у детей
Астроцитома мозга у детей
Базально-клеточная карцинома
Рак желчных протоков, внепечоночный
Рак мочевого пузыря,
Рак мочевого пузыря у детей
Рак костей у детей, Остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома
Глиома ствола головного мозга у детей
Опухоль головного мозга у взрослых
Опухоль головного мозга, глиома ствола головного мозга, у детей,
Опухоль головного мозга, церебральная астроцитома/злокачественная глиома у детей
Опухоль мозга, эпендимома у детей
Опухоль головного мозга, медуллобластома у детей,
Опухоль головного мозга, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей,
Опухоль головного мозга, глиома зрительного пути и гипоталамуса у детей,
Опухоль мозга у детей
Рак молочной железы
Рак молочной железы у детей
Рак молочной железы у мужчин
Бронхиальные аденомы/карциноиды у детей
Лимфома Беркитта
Карциноидная опухоль у детей
Карциноидная опухоль, желудочно-кишечная
Карцинома неизвестная, первичная
Лимфома центральной нервной системы, первичная
Мозжечковая астроцитома у детей
Астроцитома мозга/злокачественная глиома у детей
Рак шейки матки
Раки у детей
Хронический лимфолейкоз
Хронический миелогенный лейкоз
Хронические миелопролиферативные нарушения
Рак толстой кишки
Колоректальный рак у детей
Кожная T-клеточная лимфома, см. грибовидный микоз и синдром Сезари.
Рак эндометрия
Эпендимома у детей
Рак пищевода
Рак пищевода у детей
Семейство опухолей Юинга
Опухоль экстракраниальных зародышевых клеток у детей
Рак экстрагонадных зародышевых клеток
Внепеченочный рак желчных протоков
Рак глаза, внутриглазная меланома
Рак глаза, ретинобластома
Рак желчного пузыря
Рак желудка (желудка)
Рак желудка (желудка) у детей
Желудочно-кишечная карциноидная опухоль
Опухоль зародышевых клеток, экстракраниальная, у детей
Опухоль зародышевых клеток, внегонадная
Опухоль зародышевых клеток, яичников
Гестационная трофобластная опухоль
Глиома у взрослых
Глиома ствола головного мозга у детей
Глиома астроцитома мозга у детей,
Глиома, зрительный путь и гипоталамус у детей
Рак кожи (меланома)
Карцинома кожи, из клеток Меркеля
Мелкоклеточный рак легкого
Рак тонкого кишечника
Саркома мягких тканей у взрослых
Саркома мягких тканей у детей,
Плоскоклеточная карцинома, см. рак кожи (не меланома)
Плоскоклеточный рак шеи неизвестного происхождения, первичный, метастатический
Рак желудка (желудка),
Рак желудка (желудка) у детей
Супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей
Т-клеточная лимфома, кожная, см грибовидный микоза и синдром Сезари
Рак яичек
Тимома у детей
Тимома и вилочковая карцинома
Рак щитовидной железы
Рак щитовидной железы у детей
Переходно-клеточный рак почечной лоханки и мочеточника
Трофобластная опухоль, гестационная
Неизвестная первичная локализация, карцинома у взрослых
Неизвестная первичная локализация, рак у детей
Необычные раки у детей
Переходноклеточный рак мочеточника и почечной лоханки
Рак мочеточника
Рак матки, эндометриальный
Саркома матки
Рак влагалища
Глиома зрительного пути и гипоталамуса у детей
Рак вульвы
Макроглобулинемия Вальденстрема
Опухоль Вильмса Волосатоклеточный лейкоз
Рак головы и шеи
Гепатоцеллюлярной рак (печени) у взрослых (первичный)
Гепатоцеллюлярный рак (печени) у детей (первичный)
Лимфома Ходжкина у взрослых,
Лимфома Ходжкина у детей
Лимфома Ходжкина во время беременности
Гипофарингеальный рак
Глиома гипоталамуса и зрительного пути у детей
Внутриглазная меланома
Островково-клеточная карцинома (эндокринная поджелудочная железа)
Саркома Капоши
Рак почек (почечно-клеточный)
Рак почек у детей
Рак гортани
Рак гортани у детей
Рак гортани, детства Острый лимфобластный лейкоз у взрослых
Острый лимфобластный лейкоз у детей
Острый миелоидный лейкоз у взрослых
Острый миелоидный лейкоз у детей
Хронический лимфоцитарный лейкоз
Хронический миелогенный лейкоз
Лейкоз из ворсистых клеток
Рак губ и полости рта
Рак печени у взрослых (первичный)
Рак печени у детей (первичный)
Рак легкого, немелкоклеточный
Рак легкого, мелкоклеточный
Лимфома, связанная со СПИДом
Лимфома Беркитта
Лимфома, кожная Т-клеточная, см. грибковидный микоз и синдром Сезари
Лимфома Ходжкина у взрослых
Лимфома Ходжкина у детей
Лимфома Ходжкина во время беременности
Неходжкинская лимфома у взрослых
Неходжкинская лимфома у детей
Неходжкинская лимфома во время беременности
Лимфома, первичная, центральной нервной системы
Макроглобулинемия Вальденстрема
Злокачественная фиброзная гистиоцитома костей/остеосаркома
Медуллобластома у детей
Меланома
Меланома, внутриглазная (глаз)
Карцинома из клеток Меркеля
Мезотелиома у взрослых, злокачественная
Мезотелиома у детей
Метастатический плоскоклеточный рак шеи, неизвестного происхождения, первичный
Синдром множественной эндокринной неоплазии у детей
Множественная миелома/новообразование клеток плазмы
Грибовидный микоз
Миелодиспластические синдромы
Миелодиспластические/ миелопролиферативные заболевания
Миелогенный лейкоз, хронический
Миелоидный лейкоз у взрослых, острый
Миелоидный лейкоз у детей, острый
Множественная миелома
Миелопролиферативные нарушения, хронические
Рак носовой полости и околоносовых пазух
Рак носоглотки
Рак носоглотки у детей
Нейробластома
Лимфома Ходжкина у взрослых
Лимфома Ходжкина у детей
Лимфома Ходжкина во время беременности
Немелкоклеточный рак легких
Рак полости рта у детей
Рак полости рта, губы и ротоглотки
Остеосаркома/злокачественная фиброзная гистиоцитома костей
Рак яичников у детей
Эпителиальный рак яичников
Опухоль зародышевых клеток яичника
Опухоль яичника с низкой злокачественностью
Рак поджелудочной железы
Рак поджелудочной железы у детей
Рак поджелудочной железы, островковые клетки
Рак околоносовых пазух и носовой полости
Рак паращитовидной железы
Рак полового члена
Феохромоцитома
Пинеобластома и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей
Опухоль гипофиза
Новообразование клеток плазмы/множественная миелома
Плевролегочная бластома
Беременность и рак молочной железы
Беременность и лимфома Ходжкина
Беременность и неходжкинская лимфома
Первичная лимфома центральной нервной системы
Рак предстательной железы
Рак прямой кишки
Рак почечной клетки (почки)
Рак почечной клетки (почки) у детей
Рак почечной лоханки и мочеточника, переходноклеточный
Ретинобластома
Рабдомиосаркома у детей
Рак слюнной железы
Рак слюнной железы у детей
Саркома, семейство опухолей Юинга
Саркома Капоши,
Саркома мягких тканей у взрослых
Саркома мягких тканей у детей
Саркома матки
Синдром Сезари
Рак кожи (не меланома )
Рак кожи у детей
Рак желудка

В другом варианте осуществления, несколько пептидов по настоящему изобретению вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки используют для стимуляции иммунного ответа в способах по настоящему изобретению.

Как представлено в настоящем документе, гетероклитические пептиды, которые вызывают антиген-специфические ответы CD8⁺ Т-клеток, могут быть созданы с использованием способов по настоящему изобретению. WT1 пептиды, которые вызывают ответы CD4⁺ Т-клеток на множественные молекулы HLA класса II, могут быть идентифицированы. CD4⁺ Т-клетки распознают пептиды, связанные с молекулой HLA класса II на APC. В другом варианте осуществления, антигенспецифические ответы CD4⁺ Т-клеток способствуют индуцированию и поддержанию ответов CD8⁺ цитотоксических Т-клеток (CTL).

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению, вводимые вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, демонстрируют повышенную способность вызывать ответы CTL из-за их способности связывать молекулы как HLA класса I, так и HLA класса II. В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению, вводимые вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, демонстрируют повышенную способность вызывать ответы CTL благодаря способности ингибитора контрольной точки увеличивать выживаемость и пролиферацию WT1-специфических CTL. В другом варианте осуществления, вакцины по настоящему изобретению, вводимые вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, обладают преимуществом активации или индуцирования как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клеток, которые распознают антигены WT1. В другом варианте осуществления, активация или вызов как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клеток, обеспечивает синергетический иммунный ответ против WT1 по сравнению с активацией одной популяции. В другом варианте осуществления, повышенная иммуногенность пептидов по настоящему изобретению проявляется у индивидуумов с несколькими подтипами HLA класса II благодаря способности пептидов по настоящему изобретению связывать несколько подтипов HLA класса II. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, активированные клетки CD4⁺ усиливают иммунитет через лицензирование дендритных клеток, тем самым поддерживая активацию и выживание цитотоксических Т-клеток. В другом варианте осуществления, активированные CD4⁺ Т-клетки вызывают гибель опухолевых клеток через прямой контакт с опухолевыми клетками или путем активации пути апоптоза. Например, опухолевые клетки мезотелиомы способны обрабатывать и презентировать антигены в контексте молекул HLA класса I и класса II.

Способы, описанные в настоящем документе, будут понятны специалистам в данной области, чтобы сделать возможным создание других пептидов, производных от WT1, которые способны связывать молекулы как HLA класса I, так и HLA класса II. Способы дополнительно позволяют создавать иммуногенные композиции и вакцины, объединяющие пептиды, производные от WT1, по настоящему изобретению. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, способы, пептиды, вакцины и/или иммуногенные композиции, вводимые вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки по настоящему изобретению, обладают преимуществом активации или вызова WT1-специфических CD4⁺ Т-клеток, содержащих несколько различных аллелей HLA класса II. В другом варианте осуществления, вакцины обладают тем преимуществом, что активируют или вызывают WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в значительной части популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 10% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 15% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 20% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 25% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 30% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 35% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 40% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 45% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 50% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 55% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 60% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 70% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 75% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 80% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 85% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 90% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в 95% популяции. В другом варианте осуществления, пептиды активируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в более чем 95% популяции. В другом варианте вакцины активируют или индуцируют WT1-специфические CD4⁺ Т-клетки в значительной части конкретной популяции (например, американских европеоидов). Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, способы по настоящему изобретению представляют улучшение иммунного ответа, который уже был установлен у субъекта. В другом варианте осуществления, способы настоящего изобретения включают введение пептида, композиции или вакцины вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки еще один или два раза. В другом варианте осуществления, пептиды различаются по своему составу, концентрации или их комбинации. В другом варианте осуществления, пептиды, вводимые вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки, обеспечивают инициирование иммунного ответа против представляющего интерес антигена у субъекта, у которого иммунный ответ против представляющего интерес антигена еще не был инициирован. В другом варианте осуществления, индуцированные CTL пролиферируют в ответ на презентацию пептида на APC или раковой клетке. В других вариантах осуществления, ссылка на модулирование иммунного ответа включает любую или обе, гуморальную и клеточно-опосредованную ветви иммунной системы, что сопровождается присутствием Th2 и Th1 T-хелперных клеток, соответственно, или, в другом варианте осуществления, каждой ветви индивидуально.

В других вариантах осуществления, способы, влияющие на рост опухоли, приводят к (1) прямому ингибированию деления опухолевых клеток или (2) лизису опухолевых клеток, опосредованному иммунными клетками, или к тому и другому, что приводит к подавлению чистого разрастания опухолевых клеток. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. Использование пептида или вакцины, вводимых вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки, увеличивает прямое ингибирование деления опухолевых клеток, лизис клеток, опосредованный иммунными клетками, или то и другое, в большей степени, чем без использования ингибитора контрольной точки.

Ингибирование роста опухоли любым из этих двух механизмов может быть легко определено специалистом в данной области техники на основе ряда хорошо известных способов. В другом варианте осуществления, ингибирование опухоли определяют путем измерения фактического размера опухоли в течение определенного периода времени. В другом варианте осуществления, ингибирование опухоли может быть определено путем оценки размера опухоли (за период времени) с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Более конкретно, различные способы радиологической визуализации (например, однофотонная и позитронно-эмиссионная компьютерная томография; см., в основном, «Nuclear Medicine in Clinical Oncology», Winkler, C. (ed.) Springer-Verilog, New York, 1986) могут использоваться для оценки размера опухоли. В таких способах также могут использоваться различные агенты визуализации, включая, например, обычные агенты визуализации (например, цитрат галлия-67), а также специализированные реагенты для визуализации метаболитов, визуализации рецепторов или иммунологической визуализации (например, опухолевых маркеров, специфичных к моноклональным антителам с радиоактивной меткой). Кроме того, не радиоактивные способы, такие как ультразвук (см. "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff and Fukuda, (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984), также могут быть использованы для оценки размера опухоли.

В дополнение к способам определения ингибирования опухоли in vivo, описанным выше, можно использовать различные способы in vitro для определения ингибирования опухоли in vivo. Типовые примеры включают опосредованную лимфоцитами противоопухолевую цитолитическую активность, определенную, например, с помощью анализа высвобождения ⁵¹Cr, опухолезависимой пролиферации лимфоцитов (Ioannides, et al., J. Immunol. 146(5):1700-1707, 1991), in vitro образования опухолеспецифических антител (Herlyn, et al., J. Immunol. Meth. 73:157-167, 1984), клеточно- (например, CTL, хелперные Т-клетки) или гуморально- (например, антитело) опосредованное ингибирование роста клеток in vitro (Gazit, et al., Cancer Immunol Immunother 35:135-144, 1992), и для любого из этих анализов определение частоты клеточных предшественников (Vose, Int. J. Cancer 30:135-142 (1982), и другие.

В другом варианте осуществления, способы подавления роста опухоли указывают на состояние роста, которое ограничено по сравнению с ростом без контакта или воздействия пептида, вводимого вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки по настоящему изобретению. Рост опухолевых клеток можно оценить любыми способами, известными в данной области техники, включая, помимо прочего, измерение размера опухоли, определение того, пролиферируют ли опухолевые клетки, с использованием анализа включения ³H-тимидина или подсчета опухолевых клеток. «Подавление» роста опухолевых клеток в других вариантах осуществления, относится к замедлению, задержке или остановке роста опухоли или к уменьшению опухоли. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления способов и композиций по настоящему изобретению, экспрессию WT1 измеряют до введения терапии, после введения терапии или как до, так и после введения терапии. В другом варианте осуществления, измеряют экспрессию транскрипта WT1. В другом варианте осуществления, измеряют уровни белка WT1 в опухолевых или раковых клетках. В другом варианте осуществления, измеряют белок или WT1 пептиды, выделяемые из раковых клеток или опухолевых клеток в кровоток или другие жидкости организма, такие как, но не ограничиваясь ими, мочу. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления способов и композиций по изобретению, экспрессию белка(ов) контрольной точки, таргетируемых одним или несколькими ингибиторами контрольной точки, вводимыми субъекту, измеряют (на уровне транскрипта или уровне белка) в опухолевых или раковых клетках, или в цельной крови, сыворотке или плазме до введения терапии (исходный уровень), после введения терапии или как до, так и после введения терапии. В одном варианте осуществления способов и композиций по изобретению, один или несколько белков контрольной точки выбирают из: CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, киназы CHK 1, киназы CHK2, лигандов семейства A2aR и B-7. В одном варианте осуществления способов и композиций по изобретению, экспрессию PD1, PD2, CTLA4 или комбинации двух или более из вышеперечисленных измеряют до введения терапии, после введения терапии или как до, так и после введения терапии. В одном варианте осуществления, экспрессию белка контрольной точки измеряют на участке первичной опухоли. В другом варианте осуществления, рак является метастатическим, и экспрессию белка контрольной точки измеряют в месте метастазирования или в месте первичной опухоли, или в обоих.

В другом варианте осуществления способов и композиций по изобретению, один или несколько из следующих маркеров измеряют до введения терапии (исходный уровень), после введения терапии или как до, так и после введения терапии: супрессорные клетки, полученные из моноцитарного миелоида (m-MDSC), С-реактивный белок (CRP), абсолютные лимфоциты, абсолютные лимфоциты и лактатдегидрогеназа (LDH). В другом варианте осуществления, в настоящем документе охватывается использование одного или нескольких маркеров для прогнозирования или идентификации реакции на модулирование контрольной точки.

Способы определения наличия и величины иммунного ответа хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, анализ пролиферации лимфоцитов, в котором поглощение Т-клетками радиоактивного вещества, например ³H-тимидина, измеряют как функцию пролиферации клеток. В других вариантах осуществления, обнаружение пролиферации Т-клеток осуществляют путем измерения увеличения продуцирования интерлейкина-2 (IL-2), потока Са²⁺ или поглощения красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, стимуляцию CTL определяют способами, известными специалистам в данной области техники, включая обнаружение пролиферации клеток, продуцирования цитокинов и другие. Анализ типов и количества цитокинов, секретируемых Т-клетками при контакте с возбужденными импульсами лиганда мишенями, может быть мерой функциональной активности. Цитокины могут быть измерены с помощью анализов ELISA, ELISPOT или сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) для определения скорости и общего количества продуцирования цитокинов. (Fujihashi K. et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:181; Tanguay S. and Killion J. J. (1994) Lymphokine Cytokine Res. 13:259).

В другом варианте осуществления, активность CTL определяют с помощью анализа лизиса с высвобождением ⁵¹Cr. Лизис возбужденных импульсами пептида ⁵¹Cr-меченых мишеней антигенспецифическими Т-клетками можно сравнить с клетками-мишенями, возбужденных импульсами контрольного пептида. В другом варианте осуществления, Т-клетки стимулируют пептидом по настоящему изобретению, и может быть определен лизис клеток-мишеней, экспрессирующих нативный пептид в контексте MHC. Кинетика лизиса, а также общий лизис мишени в фиксированный момент времени (например, 4 часа) используют, в другом варианте, для оценки эффективности лиганда. (Ware C. F. et al. (1983) J Immunol 131: 1312).

Способы определения аффинности пептида к молекуле HLA хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, аффинность определяют с помощью тестов стабилизации TAP.

В другом варианте осуществления, аффинность определяют конкурентным радиоиммуноанализом. В другом варианте осуществления, используют следующий протокол: клетки-мишени промывают два раза в PBS с 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA; Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ). Клетки ресуспендируют при 10⁷/мл на льду, и пептиды, связанные с нативной клеточной поверхностью, удаляют в течение 2 минут при 0°C с использованием цитрат-фосфатного буфера в присутствии 3 мг/мл бета₂ микроглобулина. Осадок ресуспендируют в концентрации 5×10⁶ клеток/мл в PBS/1% BSA в присутствии 3 мг/мл бета₂ микроглобулина и 30 мг/мл дезоксирибонуклеазы, и аликвоты по 200 мл инкубируют в присутствии или в отсутствие HLA-специфических пептидов в течение 10 мин при 20°C, затем с пептидом, меченным ¹²⁵I, в течение 30 мин при 20°C. Общее количество связанного ¹²⁵I определяют после двух промывок PBS/2% BSA и одной промывки PBS. Относительное сродство определяют путем сравнения возрастающих концентраций тестируемого пептида с известным связывающим пептидом.

В другом варианте осуществления, проводят анализ специфичности связывания пептида с HLA на поверхности живых клеток (например, клеток SKLY-16) для подтверждения того, что связывание происходит с соответствующей молекулой HLA, и для характеризации ее ограничения. В другом варианте осуществления, это включает конкуренцию с избытком немеченых пептидов, о которых известно, что они связываются с теми же или другими молекулами HLA, и использование клеток-мишеней, которые экспрессируют такие же или другие типы HLA. В другом варианте осуществления, этот анализ проводят на живых свежих или 0,25% фиксированных параформальдегидом PBMC человека, клеточных линиях лейкоза и EBV-трансформированных Т-клеточных линиях определенных типов HLA. Относительную авидность пептидов, которые, как было установлено, связывают молекулы MHC на конкретных клетках, анализируют с помощью конкурентных анализов, как описано выше, в отношении пептидов, меченных ¹²⁵I, с известным высоким сродством к соответствующей молекуле HLA, например, тирозиназе или пептидной последовательности HBV.

В другом варианте осуществления, любой WT1 пептид, используемый в способах и композициях по настоящему изобретению, содержит одну или несколько не классических аминокислот, таких как: 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоксилат (Kazmierski et al. (1991) J. Am Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-метилфенилаланин, (2S,3R)-метилфенилаланин, (2R,3S)-метилфенилаланини(2R,3R)-метилфенилаланин (Kazmierski and Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41): 5769-5772); 2-аминотетрагидронафталин-2-карбоновая кислота (Landis (1989) Ph.D. Thesis, University of Arizona); гидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоксилат (Miyake et al. (1984) J. Takeda Res. Labs. 43:53-76) гистидинизохинолинкарбоновая кислота (Zechel et al. (1991) Int. J. Pep. Protein Res. 38(2):131-138); и HIC (гистидинциклическая мочевина), (Dharanipragada et al. (1993) Int. J. Pep. Protein Res. 42(1):68-77) и ((1992) Acta. Cryst., Crystal Struc. Comm. 48(IV):1239-124). Такие не классические аминокислоты воплощены в модифицированных пептидах по изобретению.

В другом варианте осуществления, любой пептид, используемый в способах и композициях по настоящему изобретению, содержит один или несколько аналогов АА или является пептидомиметиком, который, в других вариантах осуществления, индуцирует или благоприятствует специфическим вторичным структурам. Такие пептиды в других вариантах осуществления, включают следующие: LL-Acp (LL-3-амино-2-пропенидон-6-карбоновую кислоту), дипептидный аналог, индуцирующий β-изгиб (Kemp et al. (1985) J. Org. Chem. 50:5834-5838); аналоги, индуцирующие β-складку (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); аналоги, индуцирующие β-изгиб (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Left. 29:5057-5060); аналоги, индуцирующие альфа-спираль (Kemp et al. (1988) Tetrahedron Left. 29:4935-4938); аналоги, индуцирующие гамма-изгиб (Kemp et al. (1989) J. Org. Chem. 54:109:115); аналоги, представленные в следующих ссылках: Nagai and Sato (1985) Tetrahedron Left. 26:647-650; и DiMaio et al. (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans. p. 1687; аналог изгиба Gly-Ala (Kahn et al. (1989) Tetrahedron Lett. 30:2317); изостеру амидной связи (Jones et al. (1988) Tetrahedron Left. 29(31):3853-3856); третразол (Zabrocki et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen et al. (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35:501:509); и аналоги, описанные в Olson et al. (1990) J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 и Garvey et al. (1990) J. Org. Chem. 55(3):936-940. Конформационно ограниченные миметики бета-поворотов и бета-выступов и пептиды, содержащие их, описаны в патенте США №№5,440,013, выданном Kahn 8 августа 1995 г.

В других вариантах осуществления, любой пептид, используемый в способе по настоящему изобретению, конъюгирован с одной из различных других молекул, как описано ниже, которые могут иметь ковалентную или не ковалентную связь (в комплексе), природа которой варьируется, в другом варианте осуществления, в зависимости от конкретной цели. В другом варианте осуществления, пептид ковалентно или не ковалентно образует комплекс с макромолекулярным носителем (например, иммуногенным носителем), включая, но не ограничиваясь ими, природные и синтетические полимеры, белки, полисахариды, полипептиды (аминокислоты), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и липиды. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связан с субстратом. В другом варианте осуществления, пептид конъюгирован с жирной кислотой для введения в липосому (патент США №5,837,249). В другом варианте осуществления, пептид по изобретению ковалентно или не ковалентно образует комплекс с твердой подложкой, множество из которых известно в данной области. В другом варианте осуществления, связывание пептида с носителем, субстратом, жирной кислотой или твердой подложкой служит для усиления вызванного иммунного ответа.

В других вариантах осуществления, носителем является тиреоглобулин, альбумин (например, сывороточный альбумин человека), столбнячный анатоксин, полиаминокислоты, такие как поли (лизин: глутаминовая кислота), белок гриппа, коровый белок вируса гепатита B, гемоцианин лимфы улитки, альбумин, или другой белок-носитель или пептид-носитель; рекомбинантная вакцина против вируса гепатита B или APC. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, термин «аминокислота» относится к природной или, в другом варианте осуществления, не природной или синтетической АА, и в других вариантах осуществления, может включать глицин, D- или L-оптические изомеры, аналоги АА, пептидомиметики или их комбинации.

В другом варианте осуществления, термины «рак», «новообразование», «неопластический» или «опухоль» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, которые претерпели злокачественную трансформацию, которая делает их патологическими для организма-хозяина. Рак может иметь любую стадию в пронумерованной системе стадий (например, стадию 0, стадию 1, стадию 2, стадию 3 или стадию 4) и любую стадию в системе стадий TNM. Первичные раковые клетки (т.е. клетки, полученные из места злокачественной трансформации) можно легко отличить от не злокачественных клеток с помощью хорошо зарекомендовавших себя способов, в частности гистологического исследования. Используемое в настоящем документе определение раковой клетки включает не только первичную раковую клетку, но также любую клетку, происходящую от предка раковой клетки. Оно включает метастазированные раковые клетки, а также культуры in vitro и клеточные линии, полученные из раковых клеток. В другом варианте осуществления, опухоль выявляют на основе массы опухоли; например, с помощью таких процедур, как компьютерная томография, магнитно-резонансная томография (МРТ), рентген, ультразвук или пальпация, и в другом варианте осуществления, идентифицируют с помощью биохимических или иммунологических результатов, которые также используют для идентификации раковых клеток, в других вариантах осуществления. Опухоль может быть солидной или несолидной опухолью.

Способы синтеза пептидов хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению синтезируют с использованием соответствующей процедуры синтеза в твердом состоянии (см., например, Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968); Merrifield (1967) Recent Progress in Hormone Res 23: 451). Активность этих пептидов тестируют в других вариантах осуществления, с использованием описанных в настоящем документе анализов.

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению очищают стандартными способами, включая хроматографию (например, ионообменную, аффинную и колоночную хроматографию с распределением по размеру), центрифугирование, дифференциальную растворимость или любой другой стандартный метод очистки белка. В другом варианте осуществления, используется иммуноаффинная хроматография, при которой эпитоп выделяют путем связывания его с аффинной колонкой, содержащей антитела, которые были индуцированы против этого пептида или родственного пептида по изобретению, и были прикреплены к стационарной подложке.

В другом варианте осуществления, аффинные метки, такие как hexa-His (Invitrogen), мальтозосвязывающий домен (New England Biolabs), последовательность оболочки вируса гриппа (Kolodziej et al. (1991) Meth. Enzymol. 194:508-509), глутатион-S-трансфераза или другие, присоединяют к пептидам по настоящему изобретению для облегчения очистки путем пропускания через соответствующую аффинную колонку. В других вариантах осуществления, выделенные пептиды также можно физически охарактеризовать с использованием таких способов, как протеолиз, ядерный магнитный резонанс и рентгеновская кристаллография.

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению получают трансляцией in vitro известными методами, как будет очевидно специалисту в данной области техники. В другом варианте осуществления, пептиды по-разному модифицируются во время или после трансляции, например, путем фосфорилирования, гликозилирования, перекрестного связывания, ацилирования, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела, молекулой мембраны или другим лигандом (Ferguson et al. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320).

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению дополнительно содержат определяемую метку, которая, в другом варианте осуществления, является флуоресцентной или, в другом варианте осуществления, люминесцентной, или, в другом варианте осуществления, радиоактивной или, в другом варианте осуществления, электронно-плотной. В других вариантах осуществления, определяемая метка включает, например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), DS-Red (красный флуоресцентный белок), секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP), бета-галактозидазу, люциферазу, ³²P, ¹²⁵I, ³H и ¹⁴С, флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил и умбеллиферон, люциферин или любое количество других таких меток, известных специалисту в данной области техники. Конкретная используемая метка будет зависеть от типа используемого иммуноанализа.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связан с субстратом, который, в другом варианте осуществления, служит носителем. В другом варианте осуществления, связывание пептида с субстратом служит для усиления вызванного иммунного ответа.

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению связаны с другими молекулами, как описано в настоящем документе, с использованием обычных поперечно-сшивающих агентов, таких как карбодимиды. Примерами карбодимидов являются 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид (CMC), 1-этил-3-(3-диметиаминопропил)карбодиимид (EDC) и 1-этил-3-(4-азония-44-диметилпентил)карбодиимид.

В других вариантах осуществления, поперечно-сшивающие агенты включают цианогенбромид, глутаральдегид и янтарный ангидрид. В общем, любой из ряда гомобифункциональных агентов, включая гомобифункциональный альдегид, гомобифункциональный эпоксид, гомобифункциональный имидоэфир, гомобифункциональный N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, гомобифункциональный малеимид, гомо-бифункциональный алкилгалогенид, гомобифункциональный пиридилдисульфид, гомобифункциональный арилгалогенид, гомобифункциональный гидразид, гомобифункциональное производное диазония и гомобифункциональное фотореактивное соединение. В других вариантах осуществления, также предусмотрены гетеробифункциональные соединения, например, соединения, имеющие амин-реакционноспособную и сульфгидрил-реакционноспособную группу, соединения с амин-реакционноспособной и фото-реакциооноспособной группой, и соединения с карбонил-реакционноспособной и сульфгидрил-реакционноспособной группой.

В других вариантах осуществления, гомобифункциональные поперечно-сшивающие агенты включают бифункциональные N-гидроксисукцинимидные сложные эфиры дитиобис(сукцинимидилпропионата), дисукцинимидилсуберата и дисукцинимидилтартарата; бифункциональные имидоэфиры диметиладипимидата, диметилпимелимидата и диметилсуберимидата; бифункциональные сульфгидрил-реакционноспособные поперечно-сшивающие агенты 1,4-ди-[3'-(2'-пиридилдитио)пропионамидо]бутан, бисмалеимидогексан и бис-N-малеимидо-1,8-октан; бифункциональные арилгалогениды 1,5-дифтор-2,4-динитробензол и 4,4'-дифтор-3,3'-динитрофенилсульфон; бифункциональные фото-реакционноспособные агенты, такие как бис-[b-(4-азидосалициламидо)этил]дисульфид; бифункциональные альдегиды формальдегид, малоновый диальдегид, янтарный альдегид, глутаральдегид и адипальдегид; бифункциональный эпоксид, такой как диглицидиловый эфир 1,4-бутанодиола; бифункциональные гидразиды дигидразид адипиновой кислоты, карбогидразид и дигидразид янтарной кислоты; бифункциональный диазоний о-толидин, диазотированный и бис-диазотированный бензидин; бифункциональные алкилгалогениды N1N'-этилен-бис(иодацетамида), N1N'-гексаметилен-бис(иодацетамида), N1N'-ундекаметилен-бис(иодацетамида), а также бензилгалогениды и галогениды, такие как a1a'-дийод-п-сульфоновая кислота и три(2-хлорэтил)амин, соответственно.

В других вариантах осуществления, гетеробифункциональные поперечно-сшивающие агенты, используемые для связывания пептидов с другими молекулами, как описано в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, SMCC (сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат), MBS (сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида), SIAB (N-сукцинимидил(4-иодоактеил)аминобензоат), SMPB (сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират), GMBS (N-(.гамма.-малеин)сукцинимидный эфир), MPBH (4-(4-N-малеимидопогенил)гидразид масляной кислоты), M2C2H (4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилгидразид), SMPT (сукцинимидилоксикарбонил-a-метил-a-(2-пиридилдитио)толуол) и SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат).

В другом варианте осуществления, пептиды по изобретению составлены как не ковалентное связывание мономеров посредством ионного, адсорбционного или биоспецифического взаимодействий. В другом варианте осуществления, комплексы пептидов с высоко положительно или отрицательно заряженными молекулами могут быть получены посредством образования солевого мостика в средах с низкой ионной силой, таких как деионизированная вода. В другом варианте осуществления, большие комплексы могут быть созданы с использованием заряженных полимеров, таких как поли-(L-глутаминовая кислота) или поли(L-лизин), которые содержат многочисленные отрицательные и положительные заряды, соответственно. В другом варианте осуществления, пептиды адсорбируют на поверхностях, таких как латексные шарики микрочастиц, или на других гидрофобных полимерах, образуя нековалентно связанные комплексы пептид-суперантиген, эффективно имитирующие поперечно-сшитый или химически полимеризованный белок, в других вариантах осуществления. В другом варианте осуществления, пептиды нековалентно связаны за счет использования биоспецифических взаимодействий между другими молекулами. Например, использование сильной аффинности биотина к таким белкам, как авидин или стрептавидин или их производные, можно использовать для образования пептидных комплексов. Пептиды, в соответствии с этим аспектом, и в другом варианте осуществления, могут быть модифицированы для обладания группами биотина с использованием обычных реагентов для биотинилирования, таких как N-гидроксисукцинимидиловый эфир D-биотина (NHS-биотин), который взаимодействует с доступными аминогруппами.

В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению связан с носителем. В другом варианте осуществления, носителем является KLH. В других вариантах осуществления, носителем является любой другой носитель, известный в данной области техники, включая, например, тиреоглобулин, альбумины, такие как сывороточный альбумин человека, столбнячный анатоксин, полиаминокислоты, такие как поли (лизин:глутаминовая кислота), грипп, коровый белок вируса гепатита B, рекомбинантную вакцину против вируса гепатита В и подобные. Каждая возможность представляет отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению конъюгированы с жиром, таким как P3 CSS. В другом варианте осуществления, пептиды по настоящему изобретению конъюгированы с гранулой.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления, пептид, поперечно-сшитый пептид, связанный пептид или любую другую форму пептида используют в способе по настоящему изобретению вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки.

В другом варианте осуществления, помимо использования, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки, способы и композиции по настоящему изобретению дополнительно включают иммуномодулирующие соединения. В других вариантах осуществления, иммуномодулирующим соединением является цитокин, хемокин или компонент комплемента, который усиливает экспрессию вспомогательных или адгезионных молекул иммунной системы, их рецепторов или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления, иммуномодулирующее соединение включает интерлейкины, например интерлейкины 1-15, интерфероны альфа, бета или гамма, фактор некроза опухоли, гранулоцитарно-макрофагальной колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), хемокины, такие как белок, активирующий нейтрофилы (NAP), макрофагальный хемоаттрактант и активирующий фактор (MCAF), RANTES, макрофагальные воспалительные пептиды MIP-1a и MIP-1b, компоненты комплемента или их комбинации. В других вариантах осуществления, иммуномодулирующее соединение стимулирует экспрессию или усиленную экспрессию OX40, OX40L (gp34), лимфотактина, CD40, CD40L, B7.1, B7.2, TRAP, ICAM-1, 2 или 3, цитокиновых рецепторов или их комбинаций.

В другом варианте осуществления, иммуномодулирующее соединение индуцирует или усиливает экспрессию костимулирующих молекул, которые участвуют в иммунном ответе, который включает, в некоторых вариантах осуществления.

В одном варианте осуществления, пациентам, которым вводят WT1 вакцину и ингибитор контрольной точки в соответствии с изобретением, также вводят GM-CSF до или в день первой вакцинации, или их комбинацию. В одном варианте осуществления, пациенту вводят 70 мкг GM-CSF подкожно за два дня до и в день первого введения вакцины.

В другом варианте осуществления, композиция содержит растворитель, включая воду, дисперсионную среду, среду для культивирования клеток, изотонические агенты и подобные. В другом варианте осуществления, растворителем является водный изотонический буферный раствор с pH около 7,0. В другом варианте осуществления, композиция содержит разбавитель, такой как вода, забуференный фосфатом солевой раствор или солевой раствор. В другом варианте осуществления, композиция содержит растворитель, который является не водным, такой как пропилэтиленгликоль, полиэтиленгликоль и растительные масла.

В другом варианте осуществления, композиция составлена для введения любым из многих методов, известных специалистам в данной области техники. Например, настоящее изобретение представляет введение фармацевтической композиции парентерально, внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутрислизисто, местно, перорально или путем ингаляции.

В другом варианте осуществления, при применении вакцины, содержащей один или несколько агентов доставки WT1 для доставки комбинации, по меньшей мере, семи WT1 пептидов или CTL, индуцированных, по меньшей мере, семью WT1 пептидами по настоящему изобретению, вакцина может дополнительно содержать клеточную популяцию, которая, в другом варианте осуществления, включает лимфоциты, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, эндотелиальные клетки, стволовые клетки или их комбинации, которые, в другом варианте осуществления, являются аутологичными, сингенными или аллогенными по отношению друг к другу. В другом варианте осуществления, популяция клеток содержит пептид по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, популяция клеток поглощает пептид. В одном варианте осуществления, клеткой является антигенпрезентирующая клетка (APC). В другом варианте осуществления, APC является профессиональной APC. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, популяции клеток по настоящему изобретению получают из источников in vivo, таких как, например, периферическая кровь, продукт крови лейкофереза, продукт крови афереза, периферические лимфатические узлы, лимфоидная ткань, ассоциированная с кишечником, селезенка, тимус, пуповинная кровь, брыжеечные лимфатические узлы, печень, участки иммунологических поражений, например синовиальная жидкость, поджелудочная железа, спинномозговая жидкость, образцы опухолей, гранулематозная ткань или любой другой источник, из которого можно получить такие клетки. В другом варианте осуществления, клеточные популяции получают из человеческих источников, которые, в других вариантах осуществления, получают из источников плода человека, новорожденного, ребенка или взрослого человека. В другом варианте осуществления, клеточные популяции по настоящему изобретению получают из животных источников, таких как, например, свиньи или обезьяны, или любое другое представляющее интерес животное. В другом варианте осуществления, клеточные популяции по настоящему изобретению получают от субъектов, которые являются нормальными или, в другом варианте осуществления, больными, или, в другом варианте осуществления, восприимчивыми к представляющему интерес заболеванию.

В другом варианте осуществления, клеточные популяции по настоящему изобретению разделяют способами разделения на основе аффинности. Способы аффинного разделения включают, в других вариантах осуществления, магнитное разделение с использованием магнитных шариков, покрытых антителом, аффинную хроматографию, цитотоксические агенты, присоединенные к моноклональному антителу или использование в сочетании с моноклональным антителом, например, комплементом и цитотоксинами, и «пэннинг» с антителом, прикрепленным к твердой матрице, такой как планшет, или любой другой удобный метод. В другом варианте осуществления, методы разделения включают использование клеточных сортеров с активацией флуоресценцией, которые могут иметь разную степень сложности, например, несколько цветовых каналов, каналы обнаружения малоуглового и тупого светорассеяния, каналы импеданса и т. д. В других вариантах осуществления, может применяться любой метод, который позволяет разделение клеточных популяций по настоящему изобретению, и его следует рассматривать как часть этого изобретения.

В другом варианте осуществления, дендритные клетки происходят из разнообразной популяции морфологически сходных типов клеток, обнаруженных во множестве лимфоидных и не лимфоидных тканей, квалифицируемых как таковые (Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296). В другом варианте осуществления, дендритные клетки, используемые в настоящем изобретении, выделены из костного мозга, или, в другом варианте осуществления, получены из клеток-предшественников костного мозга, или, в другом варианте осуществления, выделены из/получены из периферической крови, или в другом варианте осуществления, получены из, или являются клеточной линией.

В другом варианте осуществления, описанные в настоящем документе популяции клеток выделены из фракции лейкоцитов млекопитающего, такого как мышь, обезьяна или человек (см., например, WO 96/23060). В другом варианте осуществления, фракция лейкоцитов может быть выделена из периферической крови млекопитающего.

Способы выделения дендритных клеток хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, DC выделяют с помощью способа, который включает следующие стадии: (a) получение фракции лейкоцитов, полученной из млекопитающего источника, способами, известными в данной области техники, такими как лейкофорез; (b) разделение фракции лейкоцитов, полученной на стадии (а), на четыре или несколько субфракций путем противоточного элютриационного центрифугирования; (c) стимуляцию превращения моноцитов в одной или нескольких фракциях со стадии (b) в дендритные клетки путем контакта клеток с ионофором кальция, GM-CSF и IL-13 или GM-CSF и IL-4, (d) идентификацию обогащенной дендритными клетками фракции со стадии (с); и (e) сбор обогащенной фракции со стадии (d), предпочтительно примерно при 4°C.

В другом варианте осуществления, обогащенную дендритными клетками фракцию идентифицируют сортировкой флуоресцентно-активированных клеток, которая идентифицирует, в другом варианте осуществления, по меньшей мере, один из следующих маркеров: HLA-DR, HLA-DQ или B7.2, и одновременное отсутствие следующих маркеров: CD3, CD14, CD16, 56, 57 и CD 19, 20.

В другом варианте осуществления, клеточная популяция включает лимфоциты, которыми, в другом варианте осуществления, являются Т-клетки или, в другом варианте осуществления, B-клетками. В других вариантах осуществления, Т-клетки характеризуют как NK-клетки, хелперные Т-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), TIL, наивные Т-клетки или их комбинации. Следует понимать, что Т-клетки, которые являются первичными, или клеточные линии, клоны и т.д., должны рассматриваться как часть этого изобретения. В другом варианте осуществления, Т-клетками являются CTL или линии CTL, клоны CTL или CTL, выделенные из опухолевых, воспалительных или других инфильтратов.

В другом варианте осуществления, гемопоэтические стволовые или ранние клетки-предшественники включают популяции клеток, используемые в настоящем изобретении. В другом варианте осуществления, такие популяции выделяют или получают лейкаферезом. В другом варианте осуществления, лейкаферез следует за введением цитокинов из костного мозга, периферической крови (PB) или неонатальной пуповинной крови. В другом варианте осуществления, стволовые клетки или клетки-предшественники характеризуются своей поверхностной экспрессией поверхностного антигенного маркера, известного как CD34⁺, и исключением экспрессии антигенных маркеров поверхностного слоя, Lin-.

В другом варианте осуществления, субъекту вводят пептид, композицию или вакцину по настоящему изобретению вместе с клетками костного мозга. В другом варианте осуществления, введение вместе с вариантом осуществления клеток костного мозга следует после облучения субъекта, как часть курса терапии, для подавления, ингибирования или лечения рака у субъекта.

В другом варианте осуществления, фраза «контакт с клеткой» или «контакт с популяцией» относится к способу воздействия, который, в других вариантах осуществления, может быть прямым или косвенным. В другом варианте осуществления, такой контакт включает прямую инъекцию клетки любыми средствами, хорошо известными в данной области техники, такими как микроинъекция. В другом варианте осуществления, также предусмотрено, что подача в клетку является косвенной, например, через подачу в культуральную среду, окружающую клетку, или введения субъекту любым путем, хорошо известным в данной области техники, и как описано в настоящем документе.

В другом варианте осуществления, получение CTL способами по настоящему изобретению осуществляется in vivo и осуществляется путем введения субъекту антигенпрезентирующей клетки, контактировавшей in vitro с пептидом по настоящему изобретению (см., например, Paglia et al. (1996) J. Exp. Med. 183:317-322), вводимой вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки.

В другом варианте осуществления, пептиды способов и композиций по настоящему изобретению доставляют в антигенпрезентирующие клетки (APC).

В другом варианте осуществления, пептиды доставляют в APC в форме кДНК, кодирующей пептиды. В другом варианте осуществления, термин «антигенпрезентирующие клетки» относится к дендритным клеткам (DC), моноцитам/макрофагам, B-лимфоцитам или другим типам клеток, экспрессирующим необходимые MHC/костимуляторные молекулы, которые эффективно позволяют распознавать Т-клетки презентированного пептида. В другом варианте осуществления, APC является раковая клетка. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. В каждом варианте осуществления, вакцина или APC, или любая форма доставки пептида пациенту или субъекту вводится вместе с, по меньшей мере, одним ингибитором контрольной точки. Как отмечено в настоящем документе, введение, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки необязательно должно происходить в одной вакцине, составе, месте введения или во время введения вакцины WT1 или ее альтернативных форм. Как представлено в настоящем документе, введение ингибитора контрольной точки одновременно с вакциной WT1 в любой из ее различных форм усиливает образование WT1-специфических CTL у субъекта, нуждающегося в этом.

В другом варианте осуществления, CTL контактируют с двумя или несколькими популяциями антигенпрезентирующих клеток вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки. В другом варианте осуществления, две или более популяций антигенпрезентирующих клеток презентируют разные пептиды. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, методы, которые приводят к экспрессии антигена в цитозоле APC (например, DC), используют для доставки пептидов к APC. Способы экспрессии антигенов на APC хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления, методы включают (1) введение в APC «голой» ДНК, кодирующей пептид по настоящему изобретению, (2) инфицирование APC рекомбинантными векторами, экспрессирующими пептид по настоящему изобретению, и (3) введение пептида по настоящему изобретению в цитозоль APC с использованием липосом. (См. Boczkowski D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184:465-472; Rouse et al. (1994) J. Virol. 68:5685-5689; и Nair et al. (1992) J. Exp. Med. 175:609-612).

В другом варианте осуществления, используют полученные антигенпрезентирующие клетки, такие как клетки, полученные из клеточной линии человека 174xCEM.T2, обозначенные как T2, которые содержат мутацию в своем пути процессинга антигена, который ограничивает ассоциацию эндогенных пептидов с молекулами MHC класса I на клеточной поверхности (Zweerink et al. (1993) J. Immunol. 150:1763-1771), как представлено в настоящем документе.

В другом варианте осуществления, любой из описанных в настоящем документе способов используют для индуцирования CTL, которые индуцируются in vitro. В другом варианте осуществления, CTL индуцируются ex vivo. В другом варианте осуществления, CTL индуцируются in vitro. Полученные CTL, в другом варианте осуществления, вводят субъекту, тем самым обеспечивая лечение состояния, ассоциированное с пептидом, продуктом экспрессии, содержащим пептид, или его гомологом, вводимыми вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, способы по настоящему изобретению включают введение генетической последовательности, кодирующей комбинацию, по меньшей мере, семи WT1 пептидов по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота может быть включена в один или несколько векторов; таким образом, в другом варианте осуществления, способ включает введение субъекту вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует пептид по настоящему изобретению (Tindle, R.W. et al. Virology (1994) 200:54). В другом варианте осуществления, способ включает введение субъекту голой нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которая кодирует пептид, или, в другом варианте осуществления, два или несколько пептидов по настоящему изобретению (Nabel, et al. PNAS-USA (1990) 90: 11307). В другом варианте осуществления, используют мультиэпитопные противораковые вакцины на основе аналогов (Fikes et al., Expert Opin Biol Ther., 2003, Sep; 3(6):985-993). Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. В каждом из вышеупомянутых вариантов осуществления, нуклеиновая кислота может кодировать каждый WT1 пептид индивидуально или комбинации до семи или нескольких WT1 пептидов. Нуклеиновые кислоты, кодирующие WT1 пептиды, представляют собой одну из форм агента доставки WT1. Комбинация, по меньшей мере, семи WT1 пептидов может быть доставлена одной формой агента доставки WT1, такой как пептиды, или нуклеиновые кислоты, или иммунные клетки, или любой комбинацией двух или трех из вышеперечисленных.

Нуклеиновая кислота может кодировать один WT1 пептид из семи WT1 пептидов, или нуклеиновая кислота может кодировать несколько из семи WT1 пептидов (например, два, три, четыре, пять, шесть или все семь WT1 пептидов). Аналогичным образом, нуклеиновая кислота может кодировать один или несколько дополнительных WT1 пептидов, если используются. Таким образом, композиции и способы по изобретению могут использовать одну нуклеиновую кислоту или несколько нуклеиновых кислот, которые служат в качестве агентов доставки WT1. В композициях и способах по изобретению можно использовать один вектор доставки, по меньшей мере, семи WT1 пептидов, или множество векторов.

Нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) могут быть введены субъекту любыми способами, известными в данной области техники, включая парентеральное или внутривенное введение, или, в другом варианте осуществления, с помощью генной пушки. В другом варианте осуществления, нуклеиновые кислоты вводят в композиции, которая соответствует, в других вариантах осуществления, любому варианту осуществления, перечисленному в настоящем документе. ДНК или РНК могут быть введены субъекту в виде голой нуклеиновой кислоты или перенесена с помощью вектора.

Векторы для использования в соответствии со способами данного изобретения могут содержать, в другом варианте осуществления, любой вектор, который облегчает или позволяет экспрессию пептида по настоящему изобретению (например, одного или нескольких из, по меньшей мере, семи WT1 пептидов) в клетке in vitro или у субъекта in vivo. Термин «вектор» используют для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды, вируса, частицы), используемой для переноса информации кодирования последовательности (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей WT1 пептид) к клетке или субъекту. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против нескольких видов рака уже прошли клинические испытания (Wahren B et al., “DNA Vaccines: Recent Developments and the Future,” Vaccines, 2014, 2:785-796; Fioretti D. et al., “DNA Vaccines: Developing New Strategies Against Cancer, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010, 2010(938):174378). Известны стратегии размножения функциональных WT1-специфических Т-клеток с использованием ДНК-вакцины (Chaise C et al., “DNA vaccination induces WT1-specific T-cell responses with potential clinical relevance,” Blood, 2008, 112(7):2956-2964). В одном варианте осуществления, вектором является вирусный вектор. В другом варианте осуществления, вектором является не вирусный вектор. В одном варианте осуществления, не вирусным вектором является вектор нуклеиновой кислоты, такой как вектор плазмидной ДНК или мРНК (см., например, Weide B. et al, “Plasmid DNA- and messenger RNA-based Anti-Cancer Vaccination,” Immunol Lett, 2008, 115(1):33-42); Kim H. et al., “Self-Assembled Messenger RNA Nanoparticles (mRNA-NPs) for Efficient Gene Expression,” Sci Rep, 2015, 5:12737); Ulmer J.B. et al. “RNA-based Vaccines”, Vaccine, 2012, 30:4414-4418). В другом варианте осуществления, «векторы» включают ослабленные вирусы, такие как коровья оспа или оспа птиц, такие как описанные, например, в патенте США №4,722,848, включенный в настоящий документ посредством ссылки. В другом варианте осуществления, вектором является BCG (Bacille Calmette Guerin), такая как описана у Stover et al. (Nature 351:456-460 (1991)). Другие векторы, полезные для терапевтического введения или иммунизации пептидов по изобретению, например векторы Salmonella typhi и подобные, будут очевидны специалистам в данной области техники из описания в настоящем документе. Неограничивающие примеры векторов, которые можно использовать для введения молекул нуклеиновой кислоты субъектам in vivo и в клетки in vitro, включают аденовирус, аденоассоциированный вирус, ретровирус, лентивирус, вирус оспы, вирус герпеса, вирусоподобные частицы (VLP), плазмиды, катионные липиды, липосомы и наночастицы.

«Кодирующей последовательностью» является последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется в мРНК и/или транслируется в полипептид. Границы кодирующей последовательности определяются инициирующим кодоном трансляции на 5'-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать, без ограничения, мРНК, кДНК и рекомбинантные полинуклеотидные последовательности. Варианты или аналоги могут быть получены удалением части кодирующей последовательности, вставкой последовательности и/или заменой одного или нескольких нуклеотидов в последовательности. Методы модификации последовательностей нуклеиновых кислот, такие как сайт-направленный мутагенез, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989; DNA Cloning, Vols. I and II, D. N. Glover ed., 1985). Необязательно, последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, а также композиция и способы по настоящему изобретению, в которых используются такие полинуклеотиды, могут включать не кодирующие последовательности.

Термин «функционально связанный» используется в настоящем документе для обозначения положения фланкирующих контрольных последовательностей, где фланкирующие последовательности, описанные таким образом, сконфигурированы или собраны так, чтобы выполнять свою обычную функцию. Таким образом, фланкирующая контрольная последовательность функционально связанная с кодирующей последовательностью, может быть способна осуществлять репликацию, транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Например, кодирующая последовательность функционально связана с промотором, когда промотор способен управлять транскрипцией этой кодирующей последовательности. Фланкирующая последовательность не обязательно должна быть непрерывной с кодирующей последовательностью, при условии, что она функционирует правильно. Так, например, промежуточные еще нетранслированные транскрибированные последовательности могут присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, и последовательность промотора все еще может считаться «функционально связанной» с кодирующей последовательностью. Каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид (например, WT1 пептид), обычно будет иметь свою собственную функционально связанную промоторную последовательность.

В другом варианте осуществления, вектор дополнительно кодирует иммуномодулирующее соединение, как описано в настоящем документе. В другом варианте осуществления, субъекту вводят дополнительный вектор, кодирующий его же, одновременно, до или после введения субъекту вектора, кодирующего пептид по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления, агенты доставки WT1, CTL, композиции и вакцины по настоящему изобретению вводят субъекту или используют в способах по настоящему изобретению в сочетании с другими противораковыми соединениями и химиотерапевтическими агентами, включая моноклональные антитела, направленные против альтернативных раковых антигенов или, в другом варианте осуществления, эпитопы, которые состоят из последовательности AA, которая соответствует или частично соответствует той, из которой получают пептиды по настоящему изобретению. Это в дополнение к использованию, по меньшей мере, одного ингибитора контрольной точки на практике различных вариантов осуществления изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет способ обнаружения WT1-специфического ответа CD4⁺ Т-клеток у субъекта, где способ включает введение субъекту агента доставки WT1, вакцины или композиции по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, тест гиперчувствительности замедленного типа используют для обнаружения WT1-специфического ответа CD4⁺ Т-клеток. В другом варианте осуществления, пептид по настоящему изобретению превосходит свой не мутированный аналог при индуцировании ответа CD4⁺ Т-клеток у субъекта. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

В настоящем документе, термины «пациент», «субъект» и «индивидуум» используют взаимозаменяемо и предназначены для включения людей и животных, не относящихся к человеку. Например, субъектом может быть человек или млекопитающее, не являющееся человеком. В некоторых вариантах осуществления, субъектом является модель животного, не являющегося человеком, или ветеринарного пациента. Субъект может быть любого возраста и пола.

Иммуногенная композиция способов и композиций по настоящему изобретению включает, в другом варианте осуществления, APC, связанную с одним или несколькими агентами доставки WT1 и/или CTL по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция состоит из APC, связанной с одним или несколькими агентами доставки WT1 и/или CTL по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления, иммуногенная композиция содержит или состоит из APC, связанных с комбинацией, по меньшей мере, семи WT1 пептидов.

В другом варианте осуществления, композицией способов и композиций по настоящему изобретению является иммуногенная композиция. В другом варианте осуществления, композицией является фармацевтическая композиция. В другом варианте осуществления, композицией является композиция любого другого типа, известная в данной области техники. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения. Каждая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, один ингибитор контрольной точки.

В настоящем изобретении представлены различные варианты диапазонов дозировок. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 20 мкг на пептид в сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 10 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 30 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 40 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 60 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 80 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 100 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 150 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 200 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 300 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 400 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 600 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 800 мкг/пептид/сутки. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 1000 мкг/пептид/сутки.

В другом варианте осуществления, дозировка составляет 10 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 30 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 40 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 60 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 80 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 100 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 150 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 200 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 300 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 400 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 600 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 800 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 1000 мкг/пептид/дозу.

В другом варианте осуществления, дозировка составляет 10-20 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 20-30 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 20-40 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 30-60 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 40-80 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 50-100 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 50-150 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 100-200 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 200-300 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 300-400 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 400-600 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 500-800 мкг/пептид/дозу. В другом варианте осуществления, дозировка составляет 800-1000 мкг/пептид/дозу.

В другом варианте осуществления, общее количество пептида на дозу или в сутки составляет одно из вышеуказанных количеств. В другом варианте осуществления, общая доза пептида на дозу составляет одно из вышеуказанных количеств.

Каждая из вышеуказанных доз является отдельный вариант осуществления настоящего изобретения.

В другом варианте осуществления, настоящее изобретение представляет набор, содержащий пептид, композицию или вакцину по настоящему изобретению вместе, по меньшей мере, с одним ингибитором контрольной точки. В другом варианте осуществления, набор дополнительно включает этикетку или вкладыш в упаковку. В другом варианте осуществления, набор используют для обнаружения ответа CD4, специфичного для WT1, с помощью теста гиперчувствительности замедленного типа. В другом варианте осуществления, набор используют для любого другого способа, перечисленного в настоящем документе. В другом варианте осуществления, набор используют для любого другого способа, известного в данной области техники. Каждая возможность является отдельным вариантом осуществления настоящего изобретения.

ПРИМЕР

Оценка эффективности гептавалентной иммунотерапевтической композиции WT1, вводимой вместе с ниволумабом, у пациентов с раком яичников

Соответствующим критериям пациентам с диагнозом рака яичников начинают вакцинацию в течение 4 месяцев после завершения химиотерапии. Первоначально пациенты получают 6 вакцинаций WT1 пептидами в течение 12 недель и 7 инфузий ингибитора иммунных контрольных точек ниволумаба в течение 14 недель. Оценку токсичности проводят с каждой дозой вакцины и через 3 недели после завершения терапии на 15 неделе. Исследователи наблюдают пациентов в течение 30 минут после лечения. Повышение дозы не планируют. Обычную оценку токсичности продолжают в течение всего испытания.

Пациентам, у которых не наблюдается прогрессирование заболевания на 15 неделе обследования, разрешают получить 4 дополнительные вакцины, вводимые примерно каждые 8 недель. Этот поддерживающий курс вакцин начинают на 19 неделе.

Иммунные ответы оценивают на образцах 40 мл гепаринизированной крови в 6 различных временных точках: исходный уровень (при согласии и перед первой дозой для определения исходных вариаций), перед вакцинами 5 и 6, а также через 3 недели после последней инфузии ниволумаба. Если возможно, через 3 месяца последующего наблюдения берут дополнительный анализ крови.

С помощью ELISA измеряют уровни антител, образовавшихся против 4 WT1 пептидов в вакцине. Антитела обычно присутствуют после завершения четвертой вакцинации. Анализы пролиферативного ответа Т-клеток проводят на лимфоцитах периферической крови, включая: проточную цитометрию для фенотипического анализа с FACS, включая анализ субпопуляции лейкоцитов, анализ регуляторных Т-клеток (включая CD3, CD4, CD8, FOXP3, ICOS и PD1) и супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC, CD14+HLA-DRlow клетки) в периферической крови, а также в опухоли (если получена необязательная биопсия). WT1 T-клеточный специфический пролиферативный ответ CD4 и CD8 измеряют с использованием полифункционального внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) и анализов цитотоксичности на основе проточной цитометрии с использованием системы Meso Scale Discovery System с функциональностью, измеряемой по продуцированию IFN-гамма. Подробные процедуры обработки образцов крови, мониторинга Т-клеток, ELISA антител и анализа полифункциональных Т-лимфоцитов, описаны в [29].

Исходные значения и результаты ответа Т-лимфоцитов коррелируют с продолжительностью клинической ремиссии.

Если пациент исключен из исследования до 15 недели, получают кровь для иммунологического исследования после исследования. КТ выполняют в начале и на 15 неделе (или раньше, если это будет сочтено необходимым по медицинским показаниям), а затем каждые 3 месяца в течение 1 года до прогрессирования заболевания. МРТ брюшной полости и таза можно использовать вместо КТ брюшной полости и таза. Обычный рентгенолог использует критерии иммунного ответа для определения прогрессирования заболевания [57]. CA125 получают на исходном уровне, на 6 и 15 неделях, а затем каждые 3 месяца в течение 1 года до прогрессирования заболевания. CA125 не используют для определения прогрессирования заболевания из-за возможности возникновения воспаления у вакцинированных пациентов. Пациенты продолжают участие в исследовании до момента прогрессирования, развития неприемлемой токсичности, завершения вакцинации или прекращения вакцинации.

Вакцина WT1: вакцина, которая используется в этом исследовании, содержит семь отдельных WT1 пептидов:

- YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124; WT1-A1): пептид HLA класса I с мутированной аминокислотой R126Y для стимуляции ответов CD8+.

- SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125; длинный WT1-122A1): пептид HLA класса II, содержащий встроенную гетероклитическую последовательность WT1-A1 в более длинном пептиде для стимуляции ответов как CD4+, так и CD8+ в соответствии с данными доклинических исследований и исследований фазы 1.

- RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1; длинный WT1-427) и PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2; длинный WT1-331): пептиды HLA класса II, индуцирующие ответы CD4+, которые могут способствовать долгосрочным ответам Т-клеток CD8+.

- NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21; короткий NLM),

- WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26; длинный NLM) и

- WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205; длинный NYM).

Лекарственный продукт: семь пептидов представлены в стерильном растворе с фосфатно-солевым буфером для получения вакцинного продукта («WT1 Vax»). Каждый флакон содержит 280 мкг каждого пептида в общем объеме 0,7 мл (0,4 мг/мл каждого пептида, избыток 40%). Проводят заполнение флаконов в условиях GMP и тестирование стерильности. Эмульсию вакцины индивидуально готовят перед использованием. Для этого требуется смесь раствора пептида с иммунологическим адъювантом Монтанид ISA 51 VG.

Предполагаемая доза: выбрана доза 200 мкг для каждого пептида, поскольку она находится в диапазоне безопасных и активных доз, используемых другими. Пептидные вакцины вызывают иммунный и клинический ответ в широком диапазоне доз (введено 100-2000 мкг) без четких доказательств зависимости доза-ответ. Более высокие дозы имеют теоретическую возможность стимулировать TCR с более низким сродством к Т-клеткам и вызывать пониженный ответ [30, 33, 34]. Размер флакона: Каждый флакон с однократной дозой содержит 0,7 мл. Способ введения: Подкожно.

Ниволумаб: Предполагаемая доза: 3 мг/кг; Размер флакона: 10 мл; Способ применения: внутривенно. Ниволумаб дозируют в дозе 3 мг/кг и вводят внутривенно в виде 60-минутной ВВ инфузии один раз в 2 недели. По окончании инфузии промывают линию достаточным количеством изотонического раствора. Если масса тела субъекта отличается >10% от предыдущей массы тела, использованной для расчета требуемой дозы, необходимо рассчитать скорректированную дозу. Повышение или снижение дозы ниволумаба не допускается. Для первого приема ниволумаба не рекомендуется никаких премедикаций.

Субъектам вводят дозу не менее чем через 12 дней между дозами ниволумаба и не более чем через 3 дня после запланированной даты дозирования. Доза, введенная после трехдневного окна, считается отсрочкой приема дозы. Лечение может быть отложено максимум на 6 недель от предыдущей дозы.

Оценку опухолей с помощью КТ или МРТ продолжают в соответствии с протоколом, даже если дозирование задерживается.

ПЛАН ЛЕЧЕНИЯ/ВМЕШАТЕЛЬСТВА

- Пациентов лечат амбулаторно.

- Вакцины WT1 вводят на 0, 2, 4, 6, 8 и 10 неделях.

- Все инъекции вводят подкожно с попеременным использованием конечностей.

- Все пациенты получают 70 мкг сарграмостима (GM-CSF) подкожно в дни 0 и -2. Пациенты могут самостоятельно вводить GM-CSF, если они были должным образом проинструктированы о введении инъекции SQ. Пациентов информируют об ожидаемых реакциях, таких как раздражение в месте инъекции. Пациенты ведут журнал, в котором отмечают время и место инъекции.

- Пациенты также получают 1,0 мл эмульсии WT1 пептидов с монтанидом. Его вводит медсестра (нельзя вводить самостоятельно) подкожно в том же анатомическом месте, что и GM-CSF.

- После вакцинации пациенты находятся под наблюдением в течение примерно 30 минут.

- Ниволумаб вводят внутривенно в виде 60-минутной инфузии на неделях 0, 2, 4, 6, 8, 10 и 12. Субъектам можно вводить дозу не менее чем через 12 дней между дозами ниволумаба и не более чем через 3 дня после запланированной даты дозирования. Доза, введенная после трехдневного окна, считается отсрочкой приема дозы. Лечение может быть отложено максимум на 6 недель от предыдущей дозы.

Ожидается, что комбинированное лечение вакциной WT1 и ниволумабом увеличит популяцию WT1-специфических CTL у пациента и обеспечит повышенную активность против опухоли, экспрессирующей WT1, по сравнению с вакцинацией WT1 отдельно или лечением только ниволумабом.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Siegel, R., D. Naishadham, and A. Jemal, Cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2012. 62(1): p. 10-29.

2. Hoskins, W.J., C.A. Perez, and R.C. Young, Principles and practice of gynecologic oncology. 3rd ed. 2000, Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. xxi, 1268 p.

3. Barnhill, D.R., et al., The second-look surgical reassessment for epithelial ovarian carcinoma. Gynecol Oncol, 1984. 19(2): p. 148-54.

4. Rubin, S.C., et al., Recurrence after negative second-look laparotomy for ovarian cancer: analysis of risk factors. Am J Obstet Gynecol, 1988. 159(5): p. 1094-8.

5. Markman, M., et al., Second-line platinum therapy in patients with ovarian cancer previously treated with cisplatin. J Clin Oncol, 1991. 9(3): p. 389-93.

6. Zhang, H., et al., Antibodies against GD2 ganglioside can eradicate syngeneic cancer micrometastases. Cancer Res, 1998. 58(13): p. 2844-9.

7. Zhang, L., et al., Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med, 2003. 348(3): p. 203-13.

8. Curiel, T.J., et al., Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med, 2004. 10(9): p. 942-9.

9. Iasonos, A., et al., Identifying clinical improvement in consolidation single-arm phase 2 trials in patients with ovarian cancer in second or greater clinical remission. Int J Gynecol Cancer, 2012. 22(1): p. 63-9.

10. Berek, J.S., et al., Randomized, placebo-controlled study of oregovomab for consolidation of clinical remission in patients with advanced ovarian cancer. J Clin Oncol, 2004. 22(17): p. 3507-16.

11. Reinartz, S., et al., Vaccination of patients with advanced ovarian carcinoma with the anti-idiotype ACA125: immunological response and survival (phase Ib/II). Clin Cancer Res, 2004. 10(5): p. 1580-7.

12. Bookman, M.A., et al., Evaluation of monoclonal humanized anti-HER2 antibody, trastuzumab, in patients with recurrent or refractory ovarian or primary peritoneal carcinoma with overexpression of HER2: a phase II trial of the Gynecologic Oncology Group. J Clin Oncol, 2003. 21(2): p. 283-90.

13. Allavena, P., et al., Intraperitoneal recombinant gamma-interferon in patients with recurrent ascitic ovarian carcinoma: modulation of cytotoxicity and cytokine production in tumor-associated effectors and of major histocompatibility antigen expression on tumor cells. Cancer Res, 1990. 50(22): p. 7318-23.

14. Pujade-Lauraine, E., et al., Intraperitoneal recombinant interferon gamma in ovarian cancer patients with residual disease at second-look laparotomy. J Clin Oncol, 1996. 14(2): p. 343-50.

15. Recchia, F., et al., Interleukin-2 and 13-cis retinoic acid as maintenance therapy in advanced ovarian cancer. Int J Oncol, 2005. 27(4): p. 1039-46.

16. Sabbatini, P.J., et al., Immunization of ovarian cancer patients with a synthetic Lewis(y)-protein conjugate vaccine: a phase 1 trial. Int J Cancer, 2000. 87(1): p. 79-85.

17. Nicholson, S., et al., A phase I trial of idiotypic vaccination with HMFG1 in ovarian cancer. Cancer Immunol Immunother, 2004. 53(9): p. 809-16.

18. Diefenbach, C.S., et al., Safety and immunogenicity study of NY-ESO-1b peptide and montanide ISA-51 vaccination of patients with epithelial ovarian cancer in high-risk first remission. Clin Cancer Res, 2008. 14(9): p. 2740-8.

19. Keilholz, U., et al., Wilms' tumour gene 1 (WT1) in human neoplasia. Leukemia, 2005. 19(8): p. 1318-23.

20. Oji, Y., et al., Expression of the Wilms' tumor gene WT1 in solid tumors and its involvement in tumor cell growth. Jpn J Cancer Res, 1999. 90(2): p. 194-204.

21. Scharnhorst, V., et al., Internal translation initiation generates novel WT1 protein isoforms with distinct biological properties. J Biol Chem, 1999. 274(33): p. 23456-62.

22. Haber, D.A., et al., Alternative splicing and genomic structure of the Wilms tumor gene WT1. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(21): p. 9618-22.

23. Mundlos, S., et al., Nuclear localization of the protein encoded by the Wilms' tumor gene WT1 in embryonic and adult tissues. Development, 1993. 119(4): p. 1329-41.

24. Buckler, A.J., et al., Isolation, characterization, and expression of the murine Wilms' tumor gene (WT1) during kidney development. Mol Cell Biol, 1991. 11(3): p. 1707-12.

25. Fraizer, G.C., et al., Expression of the tumor suppressor gene WT1 in both human and mouse bone marrow. Blood, 1995. 86(12): p. 4704-6.

26. Al-Hussaini, M., et al., WT1 assists in distinguishing ovarian from uterine serous carcinoma and in distinguishing between serous and endometrioid ovarian carcinoma. Histopathology, 2004. 44(2): p. 109-15.

27. Pinilla-Ibarz, J., et al., Improved human T-cell responses against synthetic HLA-0201 analog peptides derived from the WT1 oncoprotein. Leukemia, 2006. 20(11): p. 2025-33.

28. May, R.J., et al., Peptide epitopes from the Wilms' tumor 1 oncoprotein stimulate CD4+ and CD8+ T cells that recognize and kill human malignant mesothelioma tumor cells. Clin Cancer Res, 2007. 13(15 Pt 1): p. 4547-55.

29. Krug, L.M., et al., WT1 peptide vaccinations induce CD4 and CD8 T cell immune responses in patients with mesothelioma and non-small cell lung cancer. Cancer Immunol Immunother, 2010. 59(10): p. 1467-79.

30. Oka, Y., et al., Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(38): p. 13885-90.

31. Letsch, A., et al., Effect of vaccination of leukemia patients with a MHC class I peptide of Wilms tumor gene 1 (WT1) peptide with unspecific T helper stimulation on WT1-specific IgM responses and on IgG responses. J Clin Oncol, 2008. 26: p. Abstr 3054.

32. Ohno, S., et al., Wilms' tumor 1 (WT1) peptide immunotherapy for gynecological malignancy. Anticancer Res, 2009. 29(11): p. 4779-84.

33. Schaed, S.G., et al., T-cell responses against tyrosinase 368-376(370D) peptide in HLA*A0201+ melanoma patients: randomized trial comparing incomplete Freund's adjuvant, granulocyte macrophage colony-stimulating factor, and QS-21 as immunological adjuvants. Clin Cancer Res, 2002. 8(5): p. 967-72.

34. Slingluff, C.L., Jr., et al., Clinical and immunologic results of a randomized phase II trial of vaccination using four melanoma peptides either administered in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in adjuvant or pulsed on dendritic cells. J Clin Oncol, 2003. 21(21): p. 4016-26.

35. Faries, M.B., et al., Effect of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on vaccination with an allogeneic whole-cell melanoma vaccine. Clin Cancer Res, 2009. 15(22): p. 7029-35.

36. Keilholz, U., et al., A clinical and immunologic phase 2 trial of Wilms tumor gene product 1 (WT1) peptide vaccination in patients with AML and MDS. Blood, 2009. 113(26): p. 6541-8.

37. Weber, J., et al., Granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor added to a multipeptide vaccine for resected Stage II melanoma. Cancer, 2003. 97(1): p. 186-200.

38. Keir, M.E., et al., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 2008. 26: p. 677-704.

39. Freeman, G.J., et al., Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med, 2000. 192(7): p. 1027-34.

40. Latchman, Y., et al., PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation. Nat Immunol, 2001. 2(3): p. 261-8.

41. Hamanishi, J., et al., Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(9): p. 3360-5.

42. Mu, C.Y., et al., High expression of PD-L1 in lung cancer may contribute to poor prognosis and tumor cells immune escape through suppressing tumor infiltrating dendritic cells maturation. Med Oncol, 2011. 28(3): p. 682-8.

43. Pardoll, D.M., The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer, 2012. 12(4): p. 252-64.

44. Nivolumab (BMS-936558) Investigator Brochure, Version 12. 2013.

45. Hwang, W.T., et al., Prognostic significance of tumor-infiltrating T cells in ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecol Oncol, 2012. 124(2): p. 192-8.

46. Matsuzaki, J., et al., Tumor-infiltrating NY-ESO-1-specific CD8+ T cells are negatively regulated by LAG-3 and PD-1 in human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(17): p. 7875-80.

47. Brahmer, J.R., et al., Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer. N Engl J Med, 2012. 366(26): p. 2455-65.

48. Page, D.B., et al., Immune modulation in cancer with antibodies. Annu Rev Med, 2014. 65: p. 185-202.

49. Harrison, M.L., et al., Duration of second or greater complete clinical remission in ovarian cancer: exploring potential endpoints for clinical trials. Gynecol Oncol, 2007. 106(3): p. 469-75.

50. Juretzka, M., et al., A phase 2 trial of oral imatinib in patients with epithelial ovarian, fallopian tube, or peritoneal carcinoma in second or greater remission. Eur J Gynaecol Oncol, 2008. 29(6): p. 568-72.

51. Levine, D., et al., A phase II evaluation of goserelin and bicalutamide in patients with ovarian cancer in second or higher complete clinical disease remission. Cancer, 2007. 110(11): p. 2448-56.

52. Walter, S., et al., Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nat Med, 2012.

53. Wolchok, J.D., et al., Development of ipilimumab: a novel immunotherapeutic approach for the treatment of advanced melanoma. Ann N Y Acad Sci, 2013. 1291(1): p. 1-13.

54. Hodi, F.S., et al., Immunologic and clinical effects of antibody blockade of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 in previously vaccinated cancer patients. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(8): p. 3005-10.

55. Quezada, S.A., et al., CTLA4 blockade and GM-CSF combination immunotherapy alters the intratumor balance of effector and regulatory T cells. J Clin Invest, 2006. 116(7): p. 1935-45.

56. Duraiswamy, J., et al., Dual blockade of PD-1 and CTLA-4 combined with tumor vaccine effectively restores T-cell rejection function in tumors. Cancer Res, 2013. 73(12): p. 3591-603.

57. Wolchok, J.D., et al., Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin Cancer Res, 2009. 15(23): p. 7412-20.

58. Dupont, J., et al., Wilms Tumor Gene (WT1) and p53 expression in endometrial carcinomas: a study of 130 cases using a tissue microarray. Gynecol Oncol, 2004. 94(2): p. 449-55.

59. Eisenhauer, E.A., et al., New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer, 2009. 45(2): p. 228-47.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SLSG LIMITED LLC

MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER

<120> МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ

ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ WT1-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РАКОВ

<130> SEL.102XC1PCT

<150> US 62/832,244

<151> 2019-04-10

<160> 205

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met

1 5 10 15

Thr Lys Leu

<210> 2

<211> 22

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His

1 5 10 15

Ser Arg Lys His Thr Gly

20

<210> 3

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg

1 5 10 15

<210> 5

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys

1 5 10 15

Leu Glu Ser

<210> 6

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

Cys Met Thr Trp Met Gln Met Asn Leu

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 17

Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 18

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 19

Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 20

Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 21

Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 22

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 23

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 23

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 24

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 25

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 26

Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 27

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 28

Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 29

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 30

Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 31

Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 32

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 32

Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 33

Met Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 34

Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 35

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 35

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 36

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 36

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 37

Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 38

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 39

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 39

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 40

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 40

Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 41

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 42

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 43

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 43

Cys Met Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 47

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 47

Gly Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Leu

1 5

<210> 49

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Tyr Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 50

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 50

Gly Leu Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 51

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 51

Arg Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 52

Arg Tyr Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 53

Tyr Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 54

Arg Leu Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 55

Arg Ile Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 56

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 57

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 57

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Leu

1 5

<210> 58

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 58

Arg Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 59

Arg Leu Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 60

Arg Ile Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 61

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 61

Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 62

Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln

1 5 10 15

<210> 63

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 63

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 64

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Tyr

1 5

<210> 65

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 65

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Lys

1 5

<210> 66

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 66

Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Tyr Lys Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 67

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 67

Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10 15

<210> 68

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 68

Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 69

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 69

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn

1 5

<210> 70

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 70

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Tyr

1 5

<210> 71

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 71

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Lys

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 72

Arg Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 73

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 74

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 74

Pro Leu Pro His Phe Pro Pro Ser Leu

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 75

His Phe Pro Pro Ser Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 76

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 76

Thr His Ser Pro Thr His Pro Pro Arg

1 5

<210> 77

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 77

Ala Ile Leu Asp Phe Leu Leu Leu Gln

1 5

<210> 78

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 78

Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln

1 5

<210> 79

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 79

Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly

1 5 10

<210> 80

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 80

Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala Ser Ala

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 81

Ala Ser Gly Ser Glu Pro Gln Gln Met

1 5

<210> 82

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 82

Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val

1 5 10

<210> 83

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 83

Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 84

Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 85

Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser

1 5

<210> 86

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 86

Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr

1 5 10

<210> 87

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 87

Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 88

Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 89

Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro

1 5

<210> 90

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 90

Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 91

Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 92

Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 93

Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe

1 5

<210> 94

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 94

His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 95

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met

1 5

<210> 96

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 96

Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 97

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 98

Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala

1 5

<210> 99

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 99

Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu

1 5

<210> 100

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 100

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu

1 5 10

<210> 101

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 101

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr

1 5

<210> 102

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 102

Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 103

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 103

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys

1 5 10

<210> 104

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 104

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 105

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 105

Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5

<210> 106

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 106

Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10

<210> 107

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 107

Thr Leu Gly Val Ala Ala Gly Ser

1 5

<210> 108

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 108

Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr

1 5

<210> 109

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 109

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 110

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 110

Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys

1 5 10

<210> 111

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 111

Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu

1 5

<210> 112

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 112

Leu Lys Thr His Thr Thr Arg Thr His Thr

1 5 10

<210> 113

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 113

Asn Met His Gln Arg Asn His Thr Lys Leu

1 5 10

<210> 114

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 114

Leu Leu Ala Ala Ile Leu Asp Phe Leu

1 5

<210> 115

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 115

Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly Val

1 5 10

<210> 116

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 116

Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val

1 5

<210> 117

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 117

Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu

1 5

<210> 118

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 118

Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala

1 5

<210> 119

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 119

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu

1 5

<210> 120

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 120

Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr

1 5 10

<210> 121

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 121

Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys Pro Leu

1 5 10

<210> 122

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 122

Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe

1 5

<210> 123

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 123

Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly

1 5 10 15

<210> 124

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 124

Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu

1 5

<210> 125

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 125

Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys

1 5 10 15

Leu Glu Ser

<210> 126

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 126

Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu

1 5 10 15

<210> 127

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 127

Tyr Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val

1 5

<210> 128

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 128

Tyr Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu

1 5

<210> 129

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 129

Tyr Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5

<210> 130

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 130

Tyr Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val

1 5

<210> 131

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 131

Gly Leu Arg Arg Gly Ile Gln Asp Val

1 5

<210> 132

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 132

Lys Leu Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu

1 5

<210> 133

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 133

Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Val

1 5

<210> 134

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 134

Tyr Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu

1 5

<210> 135

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 135

Asn Met Tyr Gln Arg Asn Met Thr Lys

1 5

<210> 136

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 136

Asn Met His Gln Arg Val Met Thr Lys

1 5

<210> 137

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 137

Asn Met Tyr Gln Arg Val Met Thr Lys

1 5

<210> 138

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 138

Gln Met Tyr Leu Gly Ala Thr Leu Lys

1 5

<210> 139

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 139

Gln Met Asn Leu Gly Val Thr Leu Lys

1 5

<210> 140

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 140

Gln Met Tyr Leu Gly Val Thr Leu Lys

1 5

<210> 141

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 141

Phe Met Tyr Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 142

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 142

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Phe Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 143

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 143

Phe Met Tyr Ala Tyr Pro Phe Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 144

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 144

Lys Leu Tyr His Leu Gln Met His Ser Arg

1 5 10

<210> 145

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 145

Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Lys

1 5 10

<210> 146

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 146

Lys Leu Tyr His Leu Gln Met His Ser Lys

1 5 10

<210> 147

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 147

Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 148

<400> 148

000

<210> 149

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 149

Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu

1 5

<210> 150

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 150

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 151

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 151

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 152

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 152

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 153

<400> 153

000

<210> 154

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 154

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 155

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 155

Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 156

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 156

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

<210> 157

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 157

Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 158

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 158

Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 159

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 159

Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 160

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 160

Met Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

<210> 161

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 161

Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala

1 5 10 15

<210> 162

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 162

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 163

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 163

Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr

1 5

<210> 164

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 164

Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala

1 5

<210> 165

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 165

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 166

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 166

Cys Met Thr Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 167

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 167

Trp Asn Leu Met Asn Leu Gly Ala Thr

1 5

<210> 168

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 168

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5

<210> 169

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 169

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 170

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 170

Cys Met Thr Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val

1 5 10 15

Ala

<210> 171

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 171

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly

1 5

<210> 172

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 172

Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly

1 5

<210> 173

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 173

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 174

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 174

Gly Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 175

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 175

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Leu

1 5

<210> 176

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 176

Tyr Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 177

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 177

Gly Leu Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 178

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 178

Arg Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 179

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 179

Arg Tyr Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 180

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 180

Tyr Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 181

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 181

Arg Leu Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 182

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 182

Arg Ile Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 183

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 183

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Cys

1 5

<210> 184

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 184

Gly Ala Leu Arg Asn Pro Thr Ala Leu

1 5

<210> 185

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 185

Arg Gln Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 186

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 186

Arg Leu Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 187

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 187

Arg Ile Arg Pro His Pro Gly Ala Leu

1 5

<210> 188

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 188

Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln

1 5 10 15

<210> 189

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 189

Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln

1 5 10 15

<210> 190

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 190

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 191

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Tyr

1 5

<210> 192

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 192

His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Lys

1 5

<210> 193

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 193

Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Tyr Lys Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 194

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 194

Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10 15

<210> 195

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 195

Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

1 5 10

<210> 196

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 196

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn

1 5

<210> 197

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 197

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Tyr

1 5

<210> 198

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 198

Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Lys

1 5

<210> 199

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 199

Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro

1 5 10 15

Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala

20 25 30

Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr

35 40 45

Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro

50 55 60

Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly

65 70 75 80

Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe

85 90 95

Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe

100 105 110

Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe

115 120 125

Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile

130 135 140

Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr

145 150 155 160

Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe

165 170 175

Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln

180 185 190

Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser

195 200 205

Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp

210 215 220

Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln

225 230 235 240

Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser

245 250 255

Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu

260 265 270

Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile

275 280 285

His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro

290 295 300

Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys

305 310 315 320

Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys

325 330 335

Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro

340 345 350

Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp

355 360 365

Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln

370 375 380

Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr

385 390 395 400

His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys

405 410 415

Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val

420 425 430

Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala

435 440 445

Leu

<210> 200

<211> 453

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 200

Ala Ala Glu Ala Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ser Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu

20 25 30

Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys

35 40 45

Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe

50 55 60

Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro

65 70 75 80

Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile

85 90 95

Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys

100 105 110

Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala

115 120 125

Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala

130 135 140

Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser

145 150 155 160

Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val

165 170 175

Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala

180 185 190

Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln

195 200 205

Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr

210 215 220

Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu

225 230 235 240

Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln

245 250 255

Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys

260 265 270

Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu

275 280 285

Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile

290 295 300

Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser

305 310 315 320

Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly

325 330 335

Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg

340 345 350

Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu

355 360 365

Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His

370 375 380

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser

385 390 395 400

Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys

405 410 415

Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser

420 425 430

Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys

435 440 445

Leu Gln Leu Ala Leu

450

<210> 201

<211> 514

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 201

Met Gln Asp Pro Ala Ser Thr Cys Val Pro Glu Pro Ala Ser Gln His

1 5 10 15

Thr Leu Arg Ser Gly Pro Gly Cys Leu Gln Gln Pro Glu Gln Gln Gly

20 25 30

Val Arg Asp Pro Gly Gly Ile Trp Ala Lys Leu Gly Ala Ala Glu Ala

35 40 45

Ser Ala Glu Arg Leu Gln Gly Arg Arg Ser Arg Gly Ala Ser Gly Ser

50 55 60

Glu Pro Gln Gln Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu

65 70 75 80

Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val

85 90 95

Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly

100 105 110

Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro

115 120 125

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro

130 135 140

Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe

145 150 155 160

Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg

165 170 175

Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln

180 185 190

Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser

195 200 205

Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly

210 215 220

Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro

225 230 235 240

Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu

245 250 255

Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr

260 265 270

Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro

275 280 285

Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met

290 295 300

Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

305 310 315 320

Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser

325 330 335

Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala

340 345 350

Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val

355 360 365

Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu

370 375 380

Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys

385 390 395 400

Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr

405 410 415

Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe

420 425 430

Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val

435 440 445

Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp

450 455 460

His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser

465 470 475 480

Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu

485 490 495

Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu

500 505 510

Ala Leu

<210> 202

<211> 168

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 202

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His

1 5 10 15

Ile Glu Gly Arg His Met Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu

20 25 30

Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala

35 40 45

Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met

50 55 60

His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys

65 70 75 80

Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln

85 90 95

Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg

100 105 110

Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr

115 120 125

Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe

130 135 140

Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn

145 150 155 160

Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu

165

<210> 203

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 203

Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys

1 5 10 15

Trp Thr

<210> 204

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 204

Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp Thr

1 5 10 15

<210> 205

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мутированный Homo sapiens

<400> 205

Trp Asn Tyr Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: иммунотерапевтическая композиция для лечения экспрессирующего WT1 рака, снижения заболеваемости WT1 экспрессирующим раком или индуцирования иммунных ответов против WT1 экспрессирующего рака, содержащая: а) комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов, (b) одну или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а); или (c) иммунную клетку, содержащую одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащую или презентирующую, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или (d) цитотоксические Т-клетки (CTL) против экспрессирующего WT1 рака, индуцированные комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а); или (е) комбинацию двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d). Также раскрыты способы лечения рака, снижения заболеваемости раком, индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего WT1, индуцирования образования и пролиферации Т-клеток, специфичных для рака. Изобретение может быть использовано для лечения рака у нуждающегося в этом субъекта. 5 н. и 46 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

1. Иммунотерапевтическая композиция для лечения экспрессирующего WT1 рака, снижения заболеваемости WT1 экспрессирующим раком или индуцирования иммунных ответов против WT1 экспрессирующего рака, содержащая:

(а) комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов, состоящую из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) одну или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а), содержащих (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 124; (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 1; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 2; (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 125; (v) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 21; (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 26; и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 205; или

(c) иммунную клетку, содержащую одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащую или презентирующую, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) цитотоксические Т-клетки (CTL) против экспрессирующего WT1 рака, индуцированные комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а); или

(е) комбинацию двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d).

2. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит (а) комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов, состоящую из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205).

3. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит (b) одну или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию из, по меньшей мере, семи выделенных пептидов, содержащих:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 124;

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 1;

(iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 2;

(iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 125;

(v) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 21;

(vi) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 26; и

(vii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 205.

4. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что одна или более молекул нуклеиновых кислот по (b) находятся в одном или более вирусных или не вирусных векторах или иным образом связана с ним.

5. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит (c) иммунную клетку, содержащую одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (a), и/или содержащую или презентирующую, по меньшей мере, семь пептидов из (a):

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205).

6. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит (d) CTL против экспрессирующего WT1 рака, индуцированные комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (a), и отличающаяся тем, что CTL продуцируются in vitro, или продуцируются ex vivo, или продуцируются in vivo и получены от донора.

7. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция содержит (e) комбинацию двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d).

8. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что композиция полезна для лечения опухоли, экспрессирующей WT1, или индуцирования in vitro, ex vivo или in vivo образования и пролиферации Т-клеток, специфичных для рака, экспрессирующего WT1, и отличающаяся тем, что комбинация оказывает синергетический эффект на одно или несколько из вышеперечисленных.

9. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что комбинация пептидов состоит только из семи выделенных пептидов.

10. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, дополнительно содержащая антигенпрезентирующую клетку, носитель, наполнитель, разбавитель или адъювант.

11. Иммунотерапевтическая композиция по п. 10, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит адъювант и адъювантом является QS21, неполный адъювант Фрейнда, фосфат алюминия, гидроксид алюминия, BCG, квасцы, фактор роста, цитокин, хемокин, интерлейкин, Монтанид ISA 51 или GM-CSF.

12. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что семь пептидов присутствуют в равных количествах.

13. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что семь пептидов не присутствуют в равных количествах.

14. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что комбинация пептидов индуцирует ответ класса I и ответ класса II.

15. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что комбинация пептидов индуцирует ответ CD4+, ответ CD8+ или их комбинацию.

16. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что Т-клетки образуются у субъектов, имеющих HLA*A02, HLA*A03, HLA*B07, HLA*A24 или любую комбинацию двух или нескольких из вышеперечисленных.

17. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что соотношение семи пептидов включает от 0,1 до 10 частей YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124), от 0,1 до 10 частей RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1), от 0,1 до 10 частей PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2), от 0,1 до 10 частей SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125), от 0,1 до 10 частей NLMNLGATL (SEQ ID NO: 103), от 0,1 до 10 частей WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и от 0,1 до 10 частей WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205).

18. Иммунотерапевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что соотношение семи пептидов друг к другу пропорционально относительной силе оценок связывания HLA семи пептидов из одного или нескольких алгоритмов прогнозирования (например, BIMAS, RANKPEP, SYFPEITHI, Net MCH).

19. Способ лечения рака, экспрессирующего WT1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких из следующих:

(а) комбинации не менее семи выделенных пептидов, состоящей из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) одной или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а), содержащих (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 124; (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 1; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 2; (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 125; (v) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 21; (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 26; и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 205; или

(c) иммунной клетки, содержащей одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащей или презентирующей, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) цитотоксических Т-клеток (CTL) против рака, экспрессирующего WT1, где CTL индуцируются комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (a); или

(е) комбинации двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d).

20. Способ снижения заболеваемости рака, экспрессирующего WT1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких из следующих:

(а) комбинации не менее семи выделенных пептидов, состоящей из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) одной или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а), содержащих (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 124; (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 1; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 2; (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 125; (v) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 21; (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 26; и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 205; или

(c) иммунной клетки, содержащей одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующуюих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащей или презентирующей, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) цитотоксических Т-клеток (CTL) против рака, экспрессирующего WT1, где CTL индуцируются комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (a); или

(е) комбинации двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d).

21. Способ индуцирования иммунного ответа против рака, экспрессирующего WT1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких из следующих:

(а) комбинации не менее семи выделенных пептидов, состоящей из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) одной или более молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а), содержащих (i) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 124; (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 1; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 2; (iv) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 125; (v) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 21; (vi) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 26; и (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид SEQ ID NO: 205; или

(c) иммунной клетки, содержащей одну или более молекул нуклеиновых кислот согласно (b), кодирующуюих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащей или презентирующей, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) цитотоксических Т-клеток (CTL) против рака, экспрессирующего WT1, где CTL индуцируются комбинацией, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (a); или

(е) комбинации двух, трех или всех четырех из (a), (b), (c) и (d).

22. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (а) вводят субъекту, и где, по меньшей мере, семь выделенных WT1 пептидов вводят в одной композиции.

23. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (а) вводят субъекту, где, по меньшей мере, семь выделенных WT1 пептидов вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит один или несколько из семи выделенных WT1 пептидов.

24. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (b) вводят субъекту, и где одну или более молекул нуклеиновых кислот вводят в одной композиции.

25. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (b) вводят субъекту, где одну или более нуклеиновых кислот вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько из семи выделенных WT1 пептидов.

26. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что одна или более молекул нуклеиновых кислот по (b) находится в одном или более вирусных или не вирусных векторах или иным образом связана с ним.

27. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (c) вводят субъекту, и где иммунную клетку вводят в виде единой композиции.

28. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (c) вводят субъекту, где иммунную клетку вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит иммунную клетку, содержащую одну или более молекул нуклеиновых кислот по (b), кодирующих одну или несколько из, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащую или презентирующую один или несколько из, по меньшей мере, семи пептидов из (а).

29. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (d) вводят субъекту, и где CTL продуцируются in vitro, или продуцируются ex vivo, или продуцируются in vivo и получены от донора.

30. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что (е) вводят субъекту.

31. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является солидная опухоль.

32. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является гематологическое злокачественное новообразование.

33. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является лейкоз, десмопластическая мелкоклеточная опухоль, рак желудка, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак легких, рак груди, опухоль зародышевых клеток, рак яичников, рак матки, рак щитовидной железы, рак печени, рак почек, саркома Капоши, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, опухоль Вильмса, острый миелоидный лейкоз (AML), множественная миелома, миелодиспластический синдром (MDS), мезотелиома (например, злокачественная мезотелиома плевры) или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

34. Способ по любому из пп. 19-21, дополнительно включающий введение субъекту по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки.

35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что ингибитор контрольной точки блокирует или ингибирует белок контрольной точки, выбранный из CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, киназы CHK 1 и киназы CHK2, A2aR и лиганда семейства B-7.

36. Способ по п. 34, отличающийся тем, что ингибитор контрольной точки выбран из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, BMS 936559, MPDL328OA, MEDI0680 (AMP-514), AMP-224, AUNP-12, атезолизумаба (MPDL3280A), дурвалумаба (MEDI4736), авелумаба (MSB0010718C), BMS935559 (MDX-1105), rHIgM12B7, BMS-986016, GSK2831781, IMP321, лирилумаба (BMS-986015), IPH2101 (1-7F9), индоксимода (NLG 9189), NLG 919, INCB024360, PF-05082566, урелумаба (BMS-663513) и MEDI6469.

37. Способ индуцирования образования и пролиферации Т-клеток, специфичных для рака, экспрессирующего WT1, у субъекта, включающий введение субъекту одного или нескольких из следующих агентов доставки WT1:

(а) комбинации не менее семи выделенных пептидов, состоящей из:

YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 124),

RSDELVRHHNMHQRNMTKL (SEQ ID NO: 1),

PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (SEQ ID NO: 2),

SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 125),

NLMNLGATL (SEQ ID NO: 21),

WNLMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 26) и

WNYMNLGATLKGVAA (SEQ ID NO: 205);

(b) комбинации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи выделенных пептидов из (а);

(c) иммунной клетки, содержащей одну или более молекул нуклеиновых кислот по (b), кодирующих комбинацию, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащей или презентирующей, по меньшей мере, семь пептидов из (а); или

(d) комбинации двух или трех из (a), (b) и (c).

38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (а) вводят субъекту, и где, по меньшей мере, семь выделенных WT1 пептидов вводят в одной композиции.

39. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (а) вводят субъекту, где, по меньшей мере, семь выделенных WT1 пептидов вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит один или несколько из семи выделенных WT1 пептидов.

40. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (b) вводят субъекту, и где одну или более молекул нуклеиновых кислот вводят в одной композиции.

41. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (b) вводят субъекту, где одну или более молекул нуклеиновых кислот вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько из семи выделенных WT1 пептидов.

42. Способ по п. 37, отличающийся тем, что одна или более молекул нуклеиновых кислот по (b) находится в одном или более вирусных или не вирусных векторах или иным образом связана с ним.

43. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (c) вводят субъекту, и где иммунную клетку вводят в одной композиции.

44. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (c) вводят субъекту, где иммунную клетку вводят во множестве композиций, где каждая композиция содержит иммунную клетку, содержащую одну или более молекул нуклеиновых кислот по (b), кодирующих одну или несколько из, по меньшей мере, семи пептидов из (а), и/или содержащую или презентирующую один или несколько из, по меньшей мере, семи пептидов из (а).

45. Способ по п. 37, отличающийся тем, что (d) вводят субъекту.

46. Способ по п. 37, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является солидная опухоль.

47. Способ по п. 37, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является гематологическое злокачественное новообразование.

48. Способ по п. 37, отличающийся тем, что раком, экспрессирующим WT1, является лейкоз, десмопластическая мелкоклеточная опухоль, рак желудка, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак легких, рак груди, опухоль зародышевых клеток, рак яичников, рак матки, рак щитовидной железы, рак печени, рак почек, саркома Капоши, саркома, гепатоцеллюлярная карцинома, опухоль Вильмса, острый миелоидный лейкоз (AML), множественная миелома, миелодиспластический синдром (MDS), мезотелиома (например, злокачественная мезотелиома плевры) или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

49. Способ по п. 37, дополнительно включающий введение субъекту по меньшей мере одного ингибитора контрольной точки.

50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что ингибитор контрольной точки блокирует или ингибирует белок контрольной точки, выбранный из CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, киназы CHK 1 и киназы CHK2, A2aR и лиганда семейства B-7.

51. Способ по п. 49, отличающийся тем, что ингибитор контрольной точки выбран из ниволумаба, пембролизумаба, пидилизумаба, BMS 936559, MPDL328OA, MEDI0680 (AMP-514), AMP-224, AUNP-12, атезолизумаба (MPDL3280A), дурвалумаба (MEDI4736), авелумаба (MSB0010718C), BMS935559 (MDX-1105), rHIgM12B7, BMS-986016, GSK2831781, IMP321, лирилумаба (BMS-986015), IPH2101 (1-7F9), индоксимода (NLG 9189), NLG 919, INCB024360, PF-05082566, урелумаба (BMS-663513) и MEDI6469.