Способ прогнозирования эффективности терапии язвенного колита Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/569 A61B5/00 

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано в клинической лабораторной практике для прогнозирования эффективности проведенной терапии язвенного колита (ЯК).

Язвенный колит - это хроническое рецидивирующе-ремиттирующее иммуноопосредованное заболевание толстой кишки, характеризующееся непрерывным и диффузным воспалением. Глобальная распространенность ЯК колеблется от 2,42 до 505 на 100 000 населения, самая высокая распространенность отмечается в развитых странах, однако за последние 10 лет регистрируется рост заболеваемости в новых индустриальных и развивающихся странах [Ungaro R. et al., 2017; Ng S.C. et al., 2017]. Пиковый возраст дебюта заболевания - от 30 до 40 лет, клиническими симптомами являются кровь в стуле, боль в животе, императивные позывы к дефекации и/или тенезмы, лихорадка, потеря веса. Часть пациентов с ЯК страдают от внекишечных проявлений и развития инвалидизирующих осложнений. ЯК связан с риском развития колоректального рака, коррелирующим с длительностью и степенью заболевания [Ungaro R. et al., 2017; Murphy M.E. et al., 2022; Barreiro-de Acosta M. et al., 2023; D'Haens G. et al., 2019]

На сегодняшний день постулируется, что заболевание возникает вследствие сложного взаимодействия нескольких факторов - генетической предрасположенности, воздействия окружающей среды, нарушения эпителиального барьера кишки, аномального иммунного ответа, а также воздействия микробных агентов [Ungaro R. et al., 2017; Ramos G.P. et al., 2019; Porter R.J. et al., 2020]. В кишечнике человека обитает около 100 триллионов различных микроорганизмов, включая более 1000 видов бактерий, а также вирусы, грибы и простейшие [Zhou Y. et al., 2018]. Многочисленные исследования демонстрируют, что изменения в составе микробиоты кишечника являются важным фактором, оказывающим влияние как на развитие ЯК, так и на прогноз заболевания, метаболизм лекарственных препаратов и эффективность терапии [Zhou Y. et al., 2018; He X.X. et al., 2021; Wan Y. et al., 2022].

Растущая глобальная распространенность ЯК требует постоянного прогресса в диагностике и лечении [Muzammil M.A. et al., 2023]. Микробиота кишечника рассматривается как универсальный динамический биомаркер, который может использоваться для неинвазивной оценки тяжести воспалительных заболеваний кишечника и эффективности лечения [Zhou Y. et al., 2018].

Из существующего уровня техники известен способ определения в кале фекального кальпротектина (ФК) (связанный с кальцием протеин, содержащийся в нейтрофильных гранулоцитах) как маркера воспаления слизистой оболочки толстой кишки. В описании изобретения к патенту указано, что содержание ФК ниже 50 мкг/г свидетельствует об отсутствии воспаления слизистой оболочки толстой кишки («Fecal sample test device and methods of use», US, 7780915, 24.08.2010).

Недостаткам данного технического решения является отсутствие критериев для оценки активности воспалительного процесса и его ремиссии.

Известен способ прогнозирования неэффективности консервативной терапии язвенного колита при тотальном поражении толстой кишки путем проведения иммуногистологического исследования, отличающийся тем, что в сыворотке крови больного методом непрямой иммунофлюоресценции на срезах почки обезьяны определяют наличие антител к эпителиальной базальной мембране почечных канальцев, выражая результат в проценте флюоресцирующих канальцев, и при показателе более 15% прогнозируют высокую вероятность неэффективности консервативной терапии (патент РФ №. 2 501 010, опубл. 10.12.2013)

Недостатками данного аналога является возможность применения только у пациентов с тяжелой формой язвенного колита при тотальном поражении толстой кишки.

Известен способ прогнозирования риска развития рецидива язвенного колита (ЯК), включающий выявление воспалительного процесса в толстой кишке, отличающийся тем, что в крови пациента выявляют уровень значения неоптерина (НП), и при условии его значения более 20 нмоль/л определяют высокий риск развития рецидива ЯК, при повышенном значении НП от 10 нмоль/л до 19 нмоль/л - среднюю степень риска развития рецидива ЯК, а при значении менее 10 нмоль/л - низкую степень риска развития рецидива ЯК. ( патент РФ № 2 755 492, опубликован 16.09.2021)

Недостатками данного аналога является проведение оценки активности процесса в фазе его обострения и прогнозирование риска рецидива, а не ремиссии.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ прогнозирования эффективности терапии при неспецифическом язвенном колите путем проведения ректороманоскопии, отличающийся тем, что период ее проведения производят забор биоптата слизистой оболочки прямой кишки, выделяют из него взвесь мононуклеарных клеток и определяют в них в реакции иммунофлюоресценции процентное отношение иммуноглобулинсодержащих клеток классов JgG, JgM и JgA, затем рассчитывают диагностический показатель как соотношение JgG - клеток + JgM клеток/ JgA клеткам и при его величине 2,4 и более прогнозируют неэффективность консервативного лечения, а при величине 2,0 и менее - его эффективность. (патент РФ№ 2 006 033, опубл. 15.01.1994).

Недостатками данного технического решения являются его инвазивность, травматичность и сложность. Метод предполагает использование в стадии обострения заболевания.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка простого доступного неинвазивного метода прогнозирования эффективности проводимой терапии язвенного колита.

Данная задача решается за счет того, что у пациентов с язвенным колитом исследуют образец кала, анализируют методом 16S - cеквенирования толстокишечный микробиом, определяют относительную представленность бактерий родов: Enterococcus, Streptococcus, NK4A214_group, Pelomonas, Actinomyces и рассчитывают вероятность наступления ремиссии в ходе проводимой терапии по формуле:

где - относительная представленность рода Enterococcus, числовое значение;

- относительная представленность рода Streptococcus, числовое значение;

- относительная представленность рода NK4A214_group, числовое значение;

- относительная представленность рода Pelomonas, числовое значение;

- относительная представленность рода Actinomyces, числовое значение;

- основание натурального логарифма, и если величина Р составляет 39,29% и более, то прогнозируют эффективность консервативной терапии и достижение ремиссии у пациента с язвенным колитом.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является снижение травматичности метода, повышение точности и специфичности прогнозирования эффективности лечения пациентов с язвенным колитом и достижения клинической ремиссии заболевания.

Подтверждение эффективности проводимой терапии - эндоскопическое исследование с морфологической верификацией активности, это дорогостоящий и инвазивный метод, а простые лабораторные методы лишь косвенно могут указывать на активность процесса и не являются специфическими.

В литературе широко освещаются дисбиотические вариации бактериального сообщества у пациентов с язвенным колитом в зависимости от активности заболевания и вида применяемой терапии.

Наши собственные исследования показали, что определение перечня бактериальных таксонов, характерных для наступления ремиссии, и расчет вероятности ремиссии по формуле представляется удобным и неинвазивным способом контроля эффективности терапии заболевания.

Методом исследования, позволяющим подробно и полноценно изучить состав толстокишечной микробиоты на уровне вида и рода, и используемым в современных исследованиях, является 16S - cеквенирования. В зарубежной литературе широко освещаются дисбиотические вариации бактериального сообщества у пациентов с язвенным колитом в зависимости от активности заболевания и вида применяемой терапии. Однако, необходимо учитывать возможные отличия микробиологического ландшафта толстого кишечника у пациентов в зависимости от места проживания.

В нашем исследовании принял участие 21 пациент (11 в фазе рецидива и 10 в фазе клинико-эндоскопической ремиссии ЯК), изучение микробиоты копрофильтрата проводилось методом 16S - cеквенирования, в результате чего было получено содержание в процентах всех родов и видов, содержащихся в материале каждого из пациентов. Далее, с помощью статистической обработки полученных данных, был определен статистически значимый перечень микроорганизмов, встречающийся с высокой представленностью у больных с клинико-эндоскопическими и лабораторными маркерами ремиссии ЯК, в который вошли 5 родов: род Enterococcus, род Streptococcus, род NK4A214_group, род Pelomonas, род Actinomyces. Определение перечня бактериальных таксонов на уровне рода, характерных для наступления ремиссии, и расчет вероятности ремиссии по формуле представляется удобным и неинвазивным способом контроля эффективности терапии заболевания.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения

Способ осуществляют следующим образом. В лаборатории, проводящей анализ, пациенту с язвенным колитом перед исследованием, предоставляют индивидуальный пластиковый контейнер с транспортной средой для забора материала - кала. Особых требований к питанию пациента накануне сдачи анализа не предъявляется. Образец кала массой 10-20г в контейнере, содержащем транспортную среду возвращается в лабораторию на исследование. Хранится может при температуре +4°С (в течение 24 часов) или -20°С (до 3 месяцев) до выделения ДНК.

Исследование микробиоты толстой кишки из образцов кала проводят методом NGS-cеквенирования структуры V3-V4 участков бактериального гена 16S рибосомальной РНК с использованием платформы Illumina MiSeq в соответствии со спецификациями производителя - Illumina. ДНК выделяют из образцов с помощью набора QIAamp DNA Microbiome Kit (Qiagen), область V3-V4 гена 16S рРНК используют для метагеномного анализа бактериального сообщества со стандартными праймерами. Подготовку библиотеки для секвенирования проводят в соответствии с протоколом (16S Metagenomic Sequencing Library preparation) для MiSeq, Illumina.

Результат исследования: значения относительной представленности - относительное содержание рода микроорганизма, выраженное в процентах (%) от общего состава толстокишечной микробиоты, принятого за 100%. Полученные данные, выраженные абсолютными числами (числовыми значениями), подставляются в формулу для расчета Р - порогового уровня вероятности наступления ремиссии в ходе проводимой терапии по формуле:

где - относительная представленность рода Enterococcus, числовое значение;

- относительная представленность рода Streptococcus, числовое значение;

- относительная представленность рода NK4A214_group, числовое значение;

- относительная представленность рода Pelomonas, числовое значение;

- относительная представленность рода Actinomyces, числовое значение;

- основание натурального логарифма, и, если величина Р составляет 39,29% и более, то прогнозируют эффективность консервативной терапии и достижение ремиссии у пациента с язвенным колитом.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Пациент С-ов, 33 года, ЯК, тотальная форма. Анамнез ЯК - 11 лет, характер течения заболевания - часто рецидивирующее, на момент обследования находится на поддерживающей терапии препаратами 5 АСК (месалазин внутрь 2 г/сутки). При комплексном обследовании (тяжесть атаки ЯК Truelov-Witts - 0 баллов, индекс активности ЯК UCEIS - 0 баллов, Mayo ES - 0 баллов, эндоскопический индекс активности по Schroeder - 0 баллов) зарегистрированы клинико-эндоскопические признаки достижения клинико-эндоскопической ремиссии заболевания. Пациенту выполнен ряд лабораторных исследований: лейкоциты - 4,86 х10^9/л, С-реактивный белок - 3,6 мг/л, СОЭ - 11 мм/ч, фекальный кальпротектин - 19 мкг/г. При исследовании кала методом 16S - cеквенирования получены следующие показатели относительной представленности родов бактерий:

- относительная представленность рода Enterococcus = 0%,

- относительная представленность рода Streptococcus = 1.210573%,

-относительная представленность рода NK4A214_group = 0%,

- относительная представленность рода Pelomonas = 0.041888%,

-- относительная представленность рода Actinomyces = 0.062832%,

Расчитывают вероятность наступления ремиссии в ходе проводимой терапии по формуле:

Р = 53,43%, данное значение превышает 39,29%, что согласно заявляемому способу, свидетельствует об эффективности проводимой терапии и достижении у пациента ремиссии ЯК, что так же подтверждается данными, полученными инструментальными (колоноскопия) и лабораторными методами исследований.

Пример 2.

Пациент О-ев, 39 лет, ЯК, тотальная форма. Анамнез ЯК - 7 лет, характер течения заболевания - редко рецидивирующее. На момент обследования находится на поддерживающей терапии препаратами 5 АСК (месалазин внутрь 2 г/сутки). При комплексном обследовании (тяжесть атаки ЯК Truelov-Witts - 0 баллов, индекс активности ЯК UCEIS - 0 баллов, Mayo ES - 0 баллов, эндоскопический индекс активности по Schroeder - 0 баллов) зарегистрированы клинико-эндоскопические признаки достижения клинико-эндоскопической ремиссия заболевания. Пациенту выполнен ряд лабораторных исследований: лейкоциты - 5,15х10^9/л, С-реактивный белок - 2 мг/л, СОЭ - 9 мм/ч, фекальный кальпротектин - 17 мкг/г. При исследовании кала методом 16S - cеквенирования получены следующие показатели относительной представленности родов бактерий:

- относительная представленность рода Enterococcus = 0%

- относительная представленность рода Streptococcus = 1.129792%

- относительная представленность рода NK4A214_group = 1.439139%

- относительная представленность рода Pelomonas = 0.023537%

- относительная представленность рода Actinomyces = 0.030262%

Расчитывают вероятность наступления ремиссии в ходе проводимой терапии по формуле:

Р = 98,18, данное значение превышает 39,29%, что согласно заявляемому способу, свидетельствует об эффективности проводимой терапии и достижении у пациента ремиссии ЯК, а так же соответствует данным, полученным инструментальными и лабораторными методами исследований.

Пример 3.

Пациент Г-ян., 36 лет, ЯК, левосторонняя форма. Анамнез ЯК - 8 лет, характер течения заболевания - часто рецидивирующее. На момент комплексного обследования (тяжесть атаки ЯК Truelov-Witts - 5, индекс активности ЯК UCEIS - 7, Mayo ES (Schroeder) - 7, эндоскопический индекс активности по Schroeder - 2) зарегистрированы клинико-эндоскопические признаки рецидива язвенного колита. Пациенту выполнен ряд лабораторных и инструментальных исследований: лейкоциты - 9,82х10^9/л, С-реактивный белок - 16 мг/л, СОЭ - 34 мм/ч, фекальный кальпротектин - 410 мкг/г. Тяжесть атаки ЯК Truelov-Witts - 5, индекс активности ЯК UCEIS - 7, Mayo ES (Schroeder) - 7, эндоскопический индекс активности по Schroeder - 2. При исследовании кала методом 16S - cеквенирования получены следующие показатели относительной представленности родов бактерий:

- относительная представленность рода Enterococcus = 0,023325%,

- относительная представленность рода Streptococcus = 4,311551%,

- относительная представленность рода NK4A214_group = 0%,

- относительная представленность рода Pelomonas = 0,098683%,,

- относительная представленность рода Actinomyces = 0,175835%.

Рассчитывают вероятность наступления ремиссии в ходе проводимой терапии по формуле:

Р = 16,52%, данное значение менее 39,29%, что согласно заявляемому способу, свидетельствует об отсутствии эффективности проводимой терапии и наличии у пациента рецидива ЯК, а так же соответствует данным, полученным инструментальными и лабораторными методами исследований, такими как эндоскопическое, морфологическая верификация активности. Однако, это дорогостоящие и инвазивные методы. Простые лабораторные методы являются косвенными и могут указывать лишь на активность процесса, не являсь специфическими.

Нами была проведена работа по изучению таксономического разнообразия микробиоты толстой кишки у больных с язвенным колитом (ЯК). В исследование был включен 21 пациент (11 в фазе рецидива и 10 в фазе клинико-эндоскопической ремиссии ЯК). Были получены значения относительной представленности - относительное содержание рода микроорганизма, выраженное в процентах (%) от общего состава толстокишечной микробиоты, принятого за 100%. Статистический анализ микробиоты кишечника представлен тестированием гипотезы о том, что данные представляют собой выборку из нормально распределенной совокупности с помощью критериев Колмогорова-Смирнова (с коррекцией значимости Лильефорс) и Шапиро-Уилка, расчетом описательных статистик, проверкой статистической значимости различий между группой пациентов с рецидивом и группой пациентов с ремиссией язвенного колита.

Для прогнозирования развития ремиссии использован инструментарий логистической регрессии с расчетом отношения шансов, для компенсации количества наблюдений использована процедура бутстреп-оценивания. Для оценки качества прогноза использовался ROC-анализ с расчетом чувствительности и специфичности.

Статистический анализ предварен проверкой распределения на нормальность с помощью критериев Колмогорова-Смирнова (с коррекцией значимости Лильефорс) и Шапиро-Уилка. Гипотезы о соответствии распределения нормальному были отвергнуты, в связи с чем расчет описательных статистик представлен медианой и квартилями. Сравнение групп выполнено с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Статистически значимые различия между группами рецидива и ремиссии выявлены для 15 родов микроорганизмов. Для прогнозирования развития ремиссии выполнена оценка модели логистической регрессии. Корреляция уровней микроорганизмов между собой не позволила включить в модель все статистически значимо влияющие на ремиссию микроорганизмы.

Включены те, уровни которых по абсолютной величине отличаются наиболее значительно, и при этом не коррелирующие между собой. Модель статистически значима по критерию хи-квадрат (р=0,002), псевдо-коэффициент детерминации Кокса и Снелла равен 0,556, Нэйджелкерка - 0,741, что свидетельствует о достаточной объясняющей способности модели. Все коэффициенты, кроме константы, являются статистически значимыми.

Результаты многофакторного анализа влияния микроорганизмов на ремиссию язвенного колита (логистическая регрессия):

Название Коэффициент ОШ р* Enterococcus -117,244 1,2⋅10^-51 0,011 Streptococcus 1,117 3,06 0,045 NK4A214_group 2,335 10,33 0,008 Pelomonas 67,529 2,1⋅10²⁹ 0,011 Actinomyces -55,947 5,0⋅10^-25 0,008 Константа -0,528 0,59 0,201

* оценено с использованием процедуры бутстрепа на основе 756 выборок.

Была выведена формула для данной модели:

- уровень относительной представленности рода Enterococcus;

- уровень относительной представленности рода Streptococcus;

- уровень относительной представленности рода NK4A214_group;

- уровень относительной представленности рода Pelomonas;

- уровень относительной представленности рода Actinomyces;

- основание натурального логарифма.

Данная модель дает возможность прогнозирования ремиссия язвенного колита и эффективность консервативной терапии. Чувствительность модели составляет 0,833, специфичность - 1,0, площадь под ROC-кривой равна 0,909 (Фиг.1.- ROC-кривая для модели прогнозирования ремиссии язвенного колита). Таким образом, данная модель обладает достаточно высокой прогностической способностью.

Оптимальные пороги отсечения были определены на основании результатов ROC-анализа с помощью индекса Юдена. Пороговые значения уровней представленности родов составили: Enterococcus - 0,012%, Streptococcus - 0,673%, NK4A214_group - 0,597%, Pelomonas - 0,045%, Actinomyces - 0,066%. Пороговый уровень вероятности ремиссии, определенный на основе индекса Юдена, составил 39,29%.

Преимущества заявляемого способа заключаются в том, что он позволяет неинвазивно и достоверно оценить тактику лечения больного, сократить сроки госпитализации за счет расширения информативности и дифференциальной диагностики показателей. Таким образом, достигается технический результат изобретения - повышение точности и специфичности прогнозирования эффективности лечения пациентов с язвенным колитом и достижения клинической ремиссии заболевания.

Способ апробирован в клинике, показал высокую достоверность и может быть рекомендован в широкую клиническую практику.

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использовано в клинической лабораторной практике для прогнозирования эффективности проведенной терапии язвенного колита (ЯК). У пациентов с язвенным колитом исследуют образец кала, анализируют методом 16S - cеквенирования толстокишечный микробиом. Определяют относительную представленность бактерий родов: Enterococcus, Streptococcus, NK4A214_group, Pelomonas, Actinomyces и рассчитывают вероятность наступления ремиссии в ходе проводимой терапии Р по формуле. Если величина Р составляет 39,29% и более, то прогнозируют эффективность консервативной терапии и достижение ремиссии у пациента с язвенным колитом. Изобретение обеспечивает снижение травматичности метода, повышение точности и специфичности прогнозирования. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования эффективности терапии язвенного колита, отличающийся тем, что у пациентов в кале исследуют толстокишечный микробиом методом 16S – cеквенирования, детализируют относительную представленность бактерий родов: Enterococcus, Streptococcus, NK4A214_group, Pelomonas, Actinomyces и рассчитывают вероятность наступления ремиссии по формуле:

P=e^{-0,53-117,2⋅X1+1,12⋅X2+2,34⋅X3+67,5⋅X4-55,9⋅X5}/(1+e^{-0,53-117,2⋅X1+1,12⋅X2+2,34⋅X3+67,5⋅X4-55,9⋅X⋅5}),

где: X1 – относительная представленность рода Enterococcus, числовое значение;

X2 – относительная представленность рода Streptococcus, числовое значение;

X3 – относительная представленность рода NK4A214_group, числовое значение;

X4 – относительная представленность рода Pelomonas, числовое значение;

X5 – относительная представленность рода Actinomyces, числовое значение;

e – основание натурального логарифма, и если величина Р составляет 39,29% и более, то прогнозируют эффективность консервативной терапии в достижении клинико-эндоскопической ремиссии у пациента с язвенным колитом.