Способ получения фунгистатических липопептидов Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C07K14/195 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как способ получения фунгистатических липопептидов. Целевой продукт может быть в дальнейшем использован в качестве средства борьбы с возбудителями заболеваний растений - фитопатогенными грибами.

Все больше внимания уделяется производству биологических агентов для использования в сельском хозяйстве с целью предупреждения или предотвращения заболеваний растений фитопатогенными организмами. На данный момент на территории Российской Федерации необходимо восполнять недостаток биотехнологических производств в целях сокращения использования химических препаратов, которые на данный момент распространены в большей мере, несмотря на агрессивное влияние на агроценозы. Основой альтернативных им препаратов могут являться препараты на основе метаболитов микроорганизмов, за счет которых проявляется их фунгистатическая и фунгицидная активность. Например, фунгистатических липопептидов - основных метаболитов штаммов бактерий Bacillus sp., за счет которых они ингибируют рост патогенных культур.

Липопептиды являются экзометаболитами, что упрощает их отделение от микробной массы и соответственно процесс их получения в концентрированном виде. Липопептиды характерны амфифильными свойствами, за счет чего они могут свободно проникать в билипидный слой клеточной мембраны, вызывая разрушение клеток чужеродных объектов.

Известен способ получения липопептидов на основе В. subtilis методом кислотного осаждения (Патент РФ №2770481, опубл. 18.04.2022), однако их основное действие направлено на борьбу с кишечными инфекциями, что применимо в птицеводстве и животноводстве.

Недостатком данного способа является длительное температурное воздействие на действующие вещества после их получения, что без использования термо- и криопротекторов может привести к разрушению молекулярной структуры липопептидов, а также замедлить общий процесс получения целевого продукта.

Известен также способ, в котором получают липопептиды из Actinoplanes sp.DSM 7358 (Патент РФ №2117672, опубл. 08.20.1998), однако выход липопептидов при данном способе составляет лишь 1,1-3,3 г/л при лиофильном виде сушки.

В патенте «Производные липопептида, способ их получения, содержащая их фармацевтическая композиция» (Патент РФ №2141970, опубл. 27.11.1999) для получения липопептидов используют Actinoplanes utahensis. Фиксирование липопептидов осуществляют с использованием МО-геля и метанола и с применением жидкофазной хроматографии, что значительно увеличивает затраты на получение целевого продукта. Также данный и предыдущий способы уступают в том, что культивирование микроскопических грибов с целью получения метаболитов является более трудозатратным процессом, чем культивирование таких бактерий, как Bacillus sp.

Известен способ, при котором продуцентами липопептидов используют бактерии Bacillus sp.(Патент РФ №2760289, опубл. 23.11.2021). Однако в данном патенте целевым продуктом является концентрированный суперна-тант культуральной жидкости бактерий, что не обеспечивает стабильности композиции при применении и транспортировке.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения антимикробных пептидов на основе В. subtilis П19 (Патент РФ №2758060, опубл. 26.10.2021). В описанном способе пептиды получают путем закисления культуральной жидкости бактерий, добавления смеси этанола и ацетонитрила, центрифугирования, отделения осадка с. бутанолом и упариванием в сушильном шкафу, готовят липосомальную суспензию, добавляют криопротектор и лиофилизируют. Однако они действуют в основном на патогенные виды бактерий - В. anthracis, В. cereus, Staphylococcus aureus.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение фунгистатических липопептидов.

Технический результат достигается тем, что в способе получения фунгистатических липопептидов из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis путем концентрирования на клетках продуцента с последующим разделением на осадок и надосадочную жидкость, высушиванием и получением целевого продукта, согласно изобретению используют штамм Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D, являющийся продуцентом фунгистатических липопептидов сурфактина и фенгицина, и подвергают его глубинному культивированию, включающий культивирование чистой культуры штамма В. subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D на плотной питательной среде картофельно-глюкозный агар в термостате при 30°С в течение 24 часов, затем помещение суточной культуры в жидкую питательную среду следующего состава, г/л: свекловичная меласса - 20, дрожжевой экстракт - 2, сернокислый магний - 0,3, двухзамещенный фосфорнокислый калий - 0,5, колбы устанавливают в орбитальный термошейкер при перемешивании 180 об/мин при температуре 28°С и культивируют в течение двух суток до количества жизнеспособных микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл, при этом разделение на осадок и надосадочную жидкость осуществляют центрифугированием со скоростью 8000 об./мин в течение 5 минут, и в надосадочную жидкость добавляют в соотношении 4: 1 термопротектор, полученный на основе горохового крахмала, который смешивают с водой в соотношении 1:5, клейстеризуют при температуре 80-85°С до полного растворения, далее полученную смесь подвергают распылительному высушиванию потоком воздуха, создаваемым перистальтическим насосом со скоростью потока - 25 об/мин и исходящим из сопла форсунки распылителя с диаметром 2 мм, при давлении распыления - 0,22 МПа.

Новизна заключается в том, что предложен способ получения фунгистатических липопептидов на основе приготовления питательной среды со свекловичной мелассой, глубинного культивирования штамма Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D, последующим концентрированием культуральной жидкости с использованием центрифугирования и отделения от микробной массы, приготовления термопротектора, смешивания с культуральной жидкостью и последующим распылительным высушиванием композиции фунгистатических липопептидов - сурфактина и фенгицина.

Отличием и преимуществом предлагаемого изобретения является то, что в получаемую композицию входят такие группы липопептидов, как сурфактин и фенгицин, а также используется метод распылительного высушивания.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлен график с MALDI-TOF-MS спектрами липопептидов в ацетонитриле после экстракции из преципитата культуральной жидкости Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D.

На фигуре 2 представлена фотография совместного культивирования композиции липопептидов Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D и фитопато-генного комплекса грибов Fusarium oxysporum, в результате чего видно ин-гибирование роста грибов композицией фунгистатических липопептидов Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D.

На фигуре 3 представлена фотография совместного культивирования композиции липопептидов Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D и фитопато-генного комплекса грибов Alternaria sp., в результате чего видно ингибиро-вание роста Alternaria sp.композицией фунгистатических липопептидов Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D.

Возможность осуществления данного способа подтверждается следующим примером.

Продуцентом липопептидов предложен аэробный спорообразующий штамм бактерий Bacillus subtilis subsp.subtilis, зарегистрированный ВКМ ИБФМ им. Т.К. Скрябина РАН под номером ВКМ B-3516D. Данный штамм был изолирован из агроценоза пшеницы почвы чернозема выщелоченного в условиях Краснодарского края. За счет продуцирования липопептидов данный штамм обладает фунгистатическими свойствами по отношению к таким патогенным грибам, как Fusarium sp., Alternaria sp., Trichoderma harzianum и другим. При совместном культивировании с тест-фитопатогенными грибами зона задержки роста достигала минимум 10 мм.

Ранее молекулярно-генетическими методами и методом масс-спектрометрического анализа MALDI-TOF-MS было идентифицировано, какие именно семейства липопептидов продуцирует Bacillus subtilis subsp.subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D. Исходя из графика на фигуре 1, можно наблюдать, что диапазоны масс (m/z) составили 1036,9 для сурфактина и 1454,1 для фенгицина.

Культивирование штамма-продуцента Bacillus subtilis subsp.subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D и получение композиции липопептидов осуществляют следующим образом.

Чистая культура бактерий Bacillus subtilis subsp.subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D хранится при температуре 2…8°С в пробирках на скошенной плотной питательной среде картофельно-глюкозном агаре (КГА) следующего состава (г/л): картофельная настойка - 200, глюкоза - 20, натрий хлористый - 6, агар-агар - 20.

Для жидкофазного культивирования бактерии В. subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D отсеивают на агаризованную питательную среду КГ А, культивируют в термостате при 30°С 24 часа. Бактериологической петлей суточную культуру помещают в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): свекловичная меласса - 20, дрожжевой экстракт - 2, сернокислый магний - 0,3, двухзамещенный фосфорнокислый калий - 0,5. Затем колбы помещают на орбитальный термошейкер при перемешивании 180 об./мин при температуре 28°С и культивируют в течение двух суток до количества жизнеспособных микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл.

Для концентрирования липопептидов культуральную жидкость подвергают двукратному центрифугированию при 8000 об/мин в течение 5 минут, а затем отделяют от осадка-микробной массы. Наличие липопептидов в надосадочной жидкости оценивают методом тонкослойной хроматографии.

Перед распылительным высушиванием готовят термопротектор на основе горохового крахмала, который смешивают с водой в соотношении 1:5 для обеспечения более жидкой массы, клейстеризуют при температуре 80-85°С до полного растворения, а затем охлаждают. Полученный термопротектор смешивают с надосадочной жидкостью культуры в соотношении 1: 4, чтобы обеспечить сохранение ее структуры при высушивании. Для сушки целевого продукта устанавливают следующие параметры: t_{входящего воздуха}=150°С; t_{исходящего}=60°С; скорость потока перистальтического насоса - 25 об/мин; внутренний диаметр сопла форсунки распылителя - 2 мм; давление распыления - 0,22 МПа.

Целевой продукт представляет собой концентрат высушенных липопептидов светло-коричневого цвета, легкорастворимый в воде. Концентрация белка в готовом продукте составляет 35 мг/г. Далее провели контроль активности высушенного концентрата путем регидратации и нанесения последовательных разведений препарата по 10 мкл на питательную среду с газонами фитопатогенных комплексов Fusarium oxysporum и Alternaria sp.Вплоть до пятой степени разведения целевой продукт проявил фунгистатические свойства (фиг. 2-3). Это соответствует не менее 5000 единиц микробной активности (АЕ/мл), в то время как прототип проявил не менее 1600 АЕ/мл. Данный показатель у предлагаемого способа обеспечивает больший процент фунгистатической активности высушенной формы липопептидов по отношению к фитопатогенным комплексам.

Изобретение относится к области биотехнологии В предлагаемом способе фунгистатические липопептиды получают из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis путем концентрирования на клетках продуцента с последующим разделением на осадок и надосадочную жидкость, высушиванием и получением целевого продукта, согласно изобретению используют штамм Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D, являющийся продуцентом фунгистатических липопептидов сурфактина и фенгицина, и подвергают его глубинному культивированию, включающий культивирование чистой культуры штамма В. subtilis Krd-20 ВКМ В-3516D на плотной питательной среде картофельно-глюкозный агар в термостате при 30°С в течение 24 часов, затем помещение суточной культуры в жидкую питательную среду следующего состава, г/л: свекловичная меласса - 20, дрожжевой экстракт - 2, сернокислый магний - 0,3, двухзамещенный фосфорнокислый калий - 0,5, колбы устанавливают в орбитальный термошейкер при перемешивании 180 об/мин при температуре 28°С и культивируют в течение двух суток до количества жизнеспособных микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл, при этом разделение на осадок и надосадочную жидкость осуществляют центрифугированием со скоростью 8000 об/мин в течение 5 минут, и в надосадочную жидкость добавляют в соотношении 4:1 термопротектор, полученный на основе горохового крахмала, который смешивают с водой в соотношении 1:5, клейстеризуют при температуре 80-85°С до полного растворения, далее полученную смесь подвергают распылительному высушиванию потоком воздуха, создаваемым перистальтическим насосом со скоростью потока - 25 об/мин и исходящим из сопла форсунки распылителя с диаметром 2 мм, при давлении распыления - 0,22 МПа. Изобретение обеспечивает больший процент фунгистатической активности высушенной формы липопептидов по отношению к фитопатогенным комплексам. 3 ил.

Способ получения фунгистатических липопептидов из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis путем концентрирования на клетках продуцента с последующим разделением на осадок и надосадочную жидкость, высушиванием и получением целевого продукта, отличающийся тем, что используют штамм Bacillus subtilis Krd-20 ВКМ B-3516D, являющийся продуцентом фунгистатических липопептидов сурфактина и фенгицина, и подвергают его глубинному культивированию, включающий культивирование чистой культуры штамма В. subtilis Krd-20 ВКМ В-3516D на плотной питательной среде картофельно-глюкозный агар в термостате при 30°С в течение 24 часов, затем помещение суточной культуры в жидкую питательную среду следующего состава, г/л: свекловичная меласса - 20, дрожжевой экстракт - 2, сернокислый магний - 0,3, двухзамещенный фосфорнокислый калий - 0,5, колбы устанавливают в орбитальный термошейкер при перемешивании 180 об/мин при температуре 28°С и культивируют в течение двух суток до количества жизнеспособных микроорганизмов 10⁹ КОЕ/мл, при этом разделение на осадок и надосадочную жидкость осуществляют центрифугированием со скоростью 8000 об/мин в течение 5 минут, в надосадочную жидкость добавляют в соотношении 4:1 термопротектор, полученный на основе горохового крахмала, который смешивают с водой в соотношении 1:5, клейстеризуют при температуре 80-85°С до полного растворения, далее полученную смесь подвергают распылительному высушиванию потоком воздуха, создаваемым перистальтическим насосом со скоростью потока - 25 об/мин и исходящим из сопла форсунки распылителя с диаметром 2 мм, при давлении распыления - 0,22 МПа.