Способ редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии Российский патент 2024 года по МПК C12N7/01 C12N15/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к созданию способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

В последние годы наблюдается широкое распространение заразного узелкового дерматита КРС (ЗУД КРС) в северном и восточном направлениях от Африканского континента, что вызвано климатическими изменениями, расширением торговых связей и региональными военными конфликтами. Возбудитель ЗУД провоцирует сезонные эпизоотии у КРС и причиняет серьезный экономический ущерб животноводству [1].

ЗУД КРС вызывается вирусом рода Capripoxvirus, семейства Poxviridae. Геном возбудителя представлен двухцепочечной молекулой ДНК, состоящей из 151 тыс. пар нуклеотидов (п.н.), кодирующих 156 генов [2].

Одним из основных способов борьбы с ЗУД является вакцинация, осуществляемая, как с помощью гетерологичных вакцин (на основе вирусов оспы овец и коз), так и гомологичных вакцин на основе аттенуированного вируса ЗУД КРС типа Neethling. Вакцинные вирусы типа Neethling вызывают у вакцинированного поголовья поствакцинальные реакции, проявляющиеся в снижении удоя и появлении кожных поражений (Neethling disease) [3, 4, 5, 6].

Исходя из этого, необходимы новые подходы для разработки вакцинных штаммов с внесением требуемых, «полезных» геномных изменений и вакцин на их основе, способных защищать животных от ЗУД [4, 7]. Для реализации данной глобальной задачи, требуется разработать способ редактирования генома вируса ЗУД. Задача данного исследования заключается в разработке на основе CRISPR-Cas9 технологии способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита КРС, культивируемого с использованием чувствительной перевиваемой монослойной культуры клеток MDBK (почка теленка).

Система редактирования CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) позволяет проводить генетические манипуляции выбранных локусов с целью редактирования генома вирусов [8].

Cas9 («CRISPR-ассоциированный белок 9») представляет собой энзим, который использует последовательности CRISPR в качестве инструмента для распознавания и расщепления специфических цепей ДНК, комплементарных последовательности CRISPR. Ферменты Cas9 вместе с последовательностями CRISPR позволяют применять CRISPR-Cas9 технологию для редактирования генов [9, 10].

Сущность CRISPR-Cas9 технологии заключается в том, что применяя нуклеазу Cas9 в комплексе с синтетической направляющей РНК (gRNA), геном можно разрезать в нужном месте, что позволяет редактировать гены in vivo [11].

Возможность и преимущества использования CRISPR-Cas9 технологии заключается в том, что для реакции требуется два компонента: «указывающая путь» молекула РНК - РНК-гид (guideRNA, gRNA, размер около 80 п.н.), комплементарная целевому гену, и фермент Cas9, который расщепляет этот ген. gРНК-гид состоит из 5’-концевой последовательности (спейсер, 20 нуклеотидов), комплементарной нужному участку ДНК, и «шпильки» для правильной ориентации комплекса. Дизайн РНК-гида должен учитывать один момент, связанный с выбором комплементарной цели. Гены этих двух компонентов встраивают в плазмиду и доставляют в клетку, где проводится их экспрессия [12].

Представленная методика позволяет доставить для этого процесса сразу несколько РНК-гидов, комплементарных разным генам-мишеням, а ферменту Cas9 - их разрезать [13]. Энзим Cas9 разрезает обе цепи геномной ДНК в месте, с которым связывается РНК-гид. За «целевым» участком ДНК, который будет разрезаться, должны следовать два цитозиновых нуклеотида, поскольку gRNA лучше связывается с ДНК на том участке, где комплементарная цепь этой ДНК содержит консенсус 5′-NGG-3′ (PAM - protospacer adjacent motif) [11].

Преимущества CRISPR-Cas9 технологии заключаются в возможности редактировать геномы in vivo с высокой точностью. При этом данный метод является дешевым и быстрым в исполнении [10, 12].

CRISPR-Cas9 технология была успешно применена для редактирования ДНК-содержащих вирусов, в частности, вируса осповакцины (VACV), аденовируса птиц 4 типа (FAdV-4) и др [9, 13].

Задачей настоящего изобретения является разработка способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии для дальнейшего создания генно-инженерных штаммов возбудителя данного заболевания. Реконструировать генно-инженерный штамм, который будет обладать важнейшими биологическими свойствами для создания вакцинных препаратов - безопасных и эффективных вакцин против ЗУД. Для решения данной задачи требуется разработать современный способ редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Редактирование генома является одним из видов генной инженерии, в котором может быть проведено включение, удаление или перемещение фрагментов ДНК в геноме организма, с использованием специфически спроектированных эндонуклеаз [10]. Данные нуклеазы создают сайт-специфичные двухцепочечные разрывы в ДНК в определённом участке генома. Индуцированные двухцепочечные разрывы репарируются в процессе рекомбинации, что позволяет получать направленные мутации.

Прототипным способом является классический процесс редактирования генома вируса ЗУД с помощью стандартных эндонуклеаз (прототип), однако данный способ не позволяет с высокой точностью проводить геномное редактирование, а также является достаточно дорогим и трудоемким в исполнении [2]. Исходя из этого, актуально разработать альтернативный способ редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Настоящее изобретение позволяет учесть недостатки прототипного способа по редактированию генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.

Данная задача решена благодаря разработке способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Сущность изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность с высокой точностью проводить редактирование генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии, при этом позволяет: 1) создавать РНК-гид в исследуемой плазмиде; 2) использовать Overlap-ПЦР для получения РНК-гид в центре конструкции с интересующей последовательностью нуклеотидов; 3) конструировать РНК-гид к гену ORF LD144 вируса ЗУД; 4) получить отредактированные (генно-инженерные) штаммы вируса ЗУД КРС, которые могут быть использованы в качестве кандидатов при создании отечественных вакцин.

Технический результат от изобретения заключается в расширении арсенала средств для проведения редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота in vivo с высокой точностью, с применением которого возможно создавать новые генно-модифицированные штаммы.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Схема расчета дизайна праймеров для РНК-гиды в плазмиде P1.

Примечание: А - Структура плазмиды Р1; Б - Схема расчета дизайна праймеров для амплификации участка РНК-гид длиной 20 п.н. в плазмиде P1. 2-А: внешние праймеры - U6F и 6R; внутренние праймеры - gR1_R и gR1_F, бирюзовым цветом - позиция последовательности РНК-гид из 20 п.н; оранжевым цветом - промотор для транскрипции. 2-Б: Обведены фиолетовым цветом внешние праймеры (U6F и 6R); выделены желтым цветом внутренние праймеры (gR1_R и gR1_F), при этом название данных праймеров меняется в зависимости от «хвоста» (выделены красным цветом), который они несут.

Фиг. 2 - Схематическое изображение двух полученных ПЦР-продуктов для создания РНК-гид. Примечание: внешние праймеры - U6F и 6R; внутренние праймеры - gR1_R и gR1_F, бирюзовый цвет - позиция последовательности РНК-гид из 20 п.н.

Фиг. 3 - Схема клонирования ПЦР-продукта в плазмиду P1. Примечание: черный цвет - плазмида P1; красный цвет - фрагмент для клонирования в P1 и содержащий 20 п.н. (РНК-гид).

Фиг. 4 - Позиции всех праймеров по отношению к плазмиде P1. Примечание: бирюзовый цвет - позиция последовательности РНК-гид из 20 п.н; оранжевый цвет - промотор для транскрипции; зеленый цвет - поли-А хвост, который добавляется к РНК для его трансляции.

Фиг. 5 - Данные электрофоретического разделения ПЦР-продуктов, полученных при амплификации двух фрагментов для конструкции РНК-гид с использованием разных праймеров. Примечание: M - маркер молекулярного веса 1 kbp plus, I - ампликон I для гида ЗУД_РНК-гид1, II- ампликон II для гида ЗУД_РНК-гид1.

Фиг. 6 - Результат электрофоретического разделения объединенных ПЦР-продуктов. Примечание: Kb-1 - маркер молекулярной массы 100-10 000 п.н.

Фиг. 7 - Результат электрофоретического разделения плазмиды Р1 после рестрикции. Примечание: М - маркер молекулярной массы 100-10000 п.н.

Фиг. 8 - Клоны, полученные на LB-агаре после проведения клонирования продуктов геномного редактирования вируса ЗУД.

Фиг. 9 - Результаты секвенирования РНК-гиды для подтверждения наличии участка размером 20 п.н., который специфичен для генома вируса ЗУД. Примечание: Выделено в черной рамке последовательности комплементарных гену ORF LD144. Последовательность NNN - сайт где должна последовательность РНК-гида быть клонирована, а буква «N» обозначает любой нуклеотид.

Фиг. 10 - Схема проведения редактирования по гомологичной рекомбинация с использованием технологии CRISPR-Cas9.

Фиг. 11 - Схема для получения челночного вектора.

Фиг. 12 - Фотографии клеточной линии MDBK, зараженной штаммом «Курган» вируса ЗУД. Примечание: А - 5 сутки после заражения, Б - 2 сутки после заражения (светящиеся бляшки), В -3 сутки после заражения (светящиеся бляшки).

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов ДНК гена ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД, используемого для редактирования генома с помощью разработанного способа;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых геном ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД, используемого для редактирования генома с помощью разработанного способа.

На первом этапе работы по разработке способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии проводят расчет дизайна последовательности для синтеза плазмиды, кодирующей РНК-гиду. Работу провели на примере штамма «Курган» вируса ЗУД. Для вставки РНК-гиды размером 20 п.н. в плазмиду разрабатывают две пары праймеров: первая пара будет амплифицировать участок плазмиды, где будет клонирована РНК-гида; вторая пара праймеров - будет иметь «хвост» размером 20 п.н. (табл. 1). Для проведения исследования применяют программное обеспечение Chop-chop для расчета РНК-гиды к вирусу ЗУД. В результате получают последовательности по 20 п.н.

На втором этапе работы проводят клонирование последовательностей в плазмиду P1. Для внесения нужной последовательности РНК-гиды длиной 20 п.н. в плазмиду P1 проводят 3 раунда ПЦР-реакции с использованием специфических пар олигонуклеотидных праймеров U6F и ЗУД_gR1_R, ЗУД_gR1_F и 6R. Для объединения ПЦР-фрагментов используют Overlap-ПЦР в соответствии со стандартными протоколами проведения реакции. Для проведения редактирования генома вируса ЗУД по сайту ORF LD144 проводят расчет праймеров для синтеза РНК-гид. Для клонирования используют фрагмент, полученный при постановки ПЦР, проведенной по сайтам рестрикции BamHI и XbaI (есть в плазмиде P1).

Репликацию плазмиды P1 проводят согласно протоколу №26, который описан в рукописи «Молекулярное клонирование» [14], которую затем выделяют из бактериальной суспензии с использованием набора Miniprep plasmid extraction kit («Евроген», г.Москва).

Для проведения ПЦР для первого и второго ампликонов (реакция I и II) реакционную смесь готовят с учетом компонентного состава, представленного в таблице 2. Режимы термоциклирования отражены в таблице 3. Полученные ПЦР-продукты исследуют с помощью гель-электрофореза в 1,0% геле агарозы. На электрофореграмме отмечают позиции двух ампликонов.

После этого полученные ампликоны (фрагменты) используют в качестве ДНК матрицы для проведения ПЦР-реакции III (Overlap) с праймерами U6-F и 6R. На данном этапе происходит объединение ПЦР-продуктов в один единый фрагмент для последующего клонирования. Протокол постановки ПЦР-реакции третьего этапа исследования отражен в таблице 4. Режимы термоциклирования при проведении реакции амплификации по протоколу Overlap ПЦР представлены в таблице 5. Полученные ПЦР-продукты после реакции III исследованы с помощью гель-электрофореза в 1,0% агарозном геле.

Полученный в ходе последней реакции ПЦР-продукт выделяют из агарозного геля для дальнейшего клонирования в плазмиду Р1. Для этого проводят рестрикцию плазмиды Р1 и ПЦР-продуктов по сайтам XbaI и BamHI. Протокол для проведения анализа представлен в таблице 6.

Поскольку Xba-I и BamHI работают в одинаковых условиях, реакцию рестрикции с XbaI и BamHI осуществляют одновременно при температуре 37,0°C в течение 3 часов. Для отделения исходной плазмиды Р1 от линеаризованной после осуществления рестрикции проводят разделение фрагментов в 1% агарозном геле.

Проводят выделение линеаризованной плазмиды Р1 из агарозного геля и её лигирование по липким концам с ДНК-фрагментом, полученным при Overlap ПЦР III в реакционной смеси, состав которой представлен в таблице 7.

Полученную в результате вышеописанных действий пробирку с легазной смесью инкубировали 1 час при комнатной температуре, затем в течение ночи (12 часов) при температуре +16°C.

На следующем этапе исследования лигазную смесь используют для последующей трансформации компетентных клеток XL-1 Blue, заранее приготовленных с использованием хлорида кальция CaCl₂. Постановку реакции осуществляют, проводя следующие этапы работы: 1) размораживание клеток на льду; 2) добавление к 100 мкл клеток 30 мкл лигазной смеси; 3) инкубирование на льду в течение 20-30 минут; 4) осуществление «Heat-shock» при температуре 42°C в течение 35 секунд; 5) охлаждение на льду в течение 3 минут; 6) добавление 400 мкл питательной среда LB; 7) инкубация при температуре 37,0°C в течение 1 часа; 8) центрифугирование при скорости 2000 об/мин в течение 1 минуты и периодическое удаление супернатанта; 9) ресуспендирование клеток в 100 мкл LB; 10) внесение на агар LB с ампициллином; 11) инкубация при температуре 37,0°C в течение ночи (10-12 часов).

На следующий (второй) день на агаре LB появляются клоны, которые требуют индивидуального изучения для отбора клонов, соответствующих требуемым параметрам (наличие 20 п.н. последовательность РНК-гиды).

После отбора индивидуальных клонов, их используют в последующих этапах. С целью проверки полученных на LB агаре клонов (РНК-гид) проводят секвенирование.

Для этого образцы гомогенизируют и разбавляют до 10% суспензии в стерильном 1/15 М растворе ФБР. Выделение геномной последовательности ДНК (гДНК) проводят фенол-хлороформным методом. Для каждого образца с использованием набора Nextera XT («Illumina», США) создана библиотека секвенирования. Секвенирование нового поколения (NGS) выполняют с использованием набора реагентов MiSeq v2 с 2×250 п.н. при парном секвенировании на настольном секвенаторе MiSeq (Illumina, США). Сборку последовательностей проводят с помощью CLC Genomics Workbench v9 («Qiagen», Германия). Выравнивание осуществляют с помощью программы «BioEdit».

На следующем этапе работы осуществляют конструирование челночного вектора. Помимо Cas9 и РНК-гид для редактирования вируса требуется помогающая плазмида (Shuttle), несущая 2 фрагмента генома вируса, которые фланкируют гены для удаления. Эти фрагменты называются Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm). Такой вид редактирования называется гомологичной рекомбинацией.

Челночный вектор (Shuttle) изготавливают на основе плазмиды pJET1.2, содержащей 2 фрагмента генома штамма «Курган» вируса ЗУД, которые фланкируют ген ORF LD144 для его делеции. Между фрагментами клонируют маркер для выделения вируса после его модификации. В качестве маркера используют ген RFP. Это красный флуоресцентный белок (Red fluorescent protein, RFP) - белок-флуорофор, выделенный из кораллов рода Discosoma отряда морских анемон, который при возбуждении флуоресцирует в красно-оранжевом диапазоне.

На следующем этапе работы проводят трансформацию культуры клеток MDBK плазмидой Р1 (РНК-гид), челночным вектором и p-Cas9/No NLS (Nuclear localization signal-используется для экспрессии белков в ядре). Для этой процедуры используют культуру клеток MDBK, которую высевают на 96-луночных культуральных планшетах, а также применяют челночный вектор, ЗУД_РНК-гиду, p-Cas9/No NLS. Это необходимо для получения всех необходимых факторов для редактирования с помощью технологии CRISPR-Cas9. Для трансформации используют набор «Lipofectamine 3000» («Invetrogen») в соответствии с рекомендациями производителя. Этапы проведения данного анализа представлены в таблице 8.

Для того чтобы получить генетически чистый вируссодержащий материл проводят 7 последовательных пассажей. Полученный вирус хранят при температуре минус 80±2°С.

Таким образом, редактирование генома вируса ЗУД и получение клона генетического модифицированного вируса возможно с применение Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии, что подтверждено на примере штамма «Курган».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Создание дизайна последовательности для синтеза плазмиды, кодирующей РНК-гиду для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии

Процесс конструирования гидовой плазмиды заключался в клонировании фрагмента для экспрессии РНК-гиды, которая служит в качестве якоря (комплементарна участку генома штамма «Курган» вируса ЗУД) для внесения разрыва в плазмиду P1. Фрагменты, кодирующие последовательность РНК-гид, учитываются в составе праймеров для амплификации участка плазмиды согласно схеме, представленной на фиг. 1.

Как показано на фиг. 1, для вставки РНК-гиды размером 20 п.н. в плазмиду, требуется 2 пары праймеров: первая пара U6F и 6R (обведена на фиг. 1 фиолетовым) амплифицирует участок плазмиды, где будет клонирована РНК-гида (бирюзовый цвет на фиг. 1); вторая пара праймеров - внутренняя (обведена желтым на фиг. 1), имеющая «хвост» (красная последовательность, т.е. РНК-гида), размером 20 п.н.

В данном этапе использовали программное обеспечение «Chop-chop» для расчета РНК-гиды к штамму «Курган» вируса ЗУД. РНК-гида создана по принципу комплементарности относительно гена ORF144 штамма «Курган» вируса ЗУД. В результате были получены последовательности 20 п.н. (5'-atcaaatttagataatccag-3') и (5'-ctggattatctaaatttgat-3') (табл. 1).

Таким образом, созданы дизайны последовательностей праймеров для РНК-гиды с учетом нуклеотидного состава гена ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Пример 2. Клонирование последовательностей в плазмиду P1 при разработке способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

При клонирование последовательностей в плазмиду P1 - для внесения РНК-гиды длиной 20 п.н. в плазмиду P1 провели 3 следующие раунда реакции амплификации: 1) с использованием праймеров U6F и ЗУД_gR1_R (в результате этого получили ПЦР-продукт №I на основе плазмиды P1 (фиг. 2) и содержащий нужную последовательность размером в 20 п.н. в правом конце РНК-гиды; 2) с использованием праймеров ЗУД gR1_F и 6R (в результате этого получили ПЦР-продукт №II на основе плазмиды P1 и содержащий нужную последовательность размером в 20 п.н. в левом конце РНК-гиды; 3) на основе полученных ПЦР-продуктов в ходе реакции I и II (№I и №II) проведена третья ПЦР с использованием праймеров U6F и 6R для получения полноразмерного ПЦР-продукта - РНК-гиды, содержащей нужную последовательность в размере 20 п.н. в центре конструкции.

Поскольку у ПЦР-продукта №I на правом конце находится 20 п.н. РНК-гиды и у ПЦР-продукта №II на левом конце находится 20 п.н. РНК-гиды, то с помощью Overlap-ПЦР (ПЦР для соединения перекрывающихся ампликонов) можно их объединить в один фрагмент, содержащий данные 20 п.н. РНК-гиды в центре.

Данные, представленные на фиг. 2, показывают, что ПЦР-продукты №I и №II имеют перекрывающуюся комплементарную последовательность (п.н. РНК-гиды выделены красным цветом). В связи с этим данные фрагменты могут быть объединены с помощью Overlap-ПЦР (реакция III).

Для клонирования использовали фрагмент, полученный при постановки ПЦР III, проведенной по сайтам рестрикции BamHI и XbaI (они имеются в плазмиде P1), как представлено на фиг. 3.

Данные, представленные на фиг. 3, демонстрируют наличие специфического фрагмента после реакции III (красная полоса) и плазмиды Р1 (черный фрагмент). Представленная схема реализована для получения РНК-гиды по отношению к гену ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД (ЗУД_РНК-гида).

Для проведения редактирования генома штамма «Курган» вируса ЗУД по сайту гена ORF LD144 осуществили расчет праймеров для синтеза РНК-гид, результаты которого отражены в таблице 1 и описаны в примере 1. Данные последовательности праймеров на 5'-конце имеют «хвост» (кодирует последовательность РНК-гиды) размером 20 п.н. (выделено красным цветом). Эти праймеры схематично представлены на фиг.4.

На фиг. 4 представлена линейная схема полученной плазмиды Р1, где фиолетовым цветом выделены позиции всех использованных в данной работе праймеров, оранжевым цветом выделен промотор U6, который отвечает за получение РНК из любой последовательности ДНК (в данном случае 20 п.н. РНК-гиды). После промотора находится сама РНК-гида (выделена бирюзовым цветом на фиг. 1 и 4).

Репликацию плазмиды проводили, как указано выше. Далее ее выделяли из бактериальной суспензии с использованием набора Miniprep plasmid extraction kit («Евроген»). После проведения очистки на колонках концентрация плазмиды составляла 55,36±0,02 нг/мкл (n=5, p<0,005).

Для проведения ПЦР для первого и второго ампликонов (реакция I и II) реакционную смесь готовили с учетом состава, отраженного в таблице 2. Режимы термоциклирования представлены в таблице 3.

Полученные ампликоны проанализированы с помощью гель-электрофореза в 1,0% геле агарозы. Результаты анализа отражены на фиг. 5, на которой видно, что получены два ПЦР-продукта для гиды: первый фрагмент имеет размер 327 п.н. (верхние лунки геля), второй фрагмент - 113 п.н. (нижние лунки геля). Для увеличения выхода ПЦР-продукта после выделения из агарозного геля каждую реакцию проводили трёхкратно.

После этого полученные ампликоны использовали в качестве ДНК-матрицы для проведения ПЦР-реакции III (Overlap) этапа с олигонуклеотидными праймерами U6-F и 6R (табл. 4). На данном этапе происходило объединение ампликонов в один единый фрагмент размером 460 п.н. для последующего клонирования.

Постановку реакции амплификации провели по протоколу Overlap (табл. 5). Полученные ПЦР-продукты после реакции III были проанализированы с помощью гель-электрофореза в 1,0% агарозном геле, результаты которого представлены на фиг. 6, из которой видно, что полученные фрагменты соответствовали ожидаемым размерам (размер 460 п.н.).

Полученный в ходе последней реакции ПЦР-продукт (№III) был выделен из агарозного геля для дальнейшего клонирования в плазмиду Р1. Для этого провели рестрикцию плазмиды Р1 и ПЦР-продуктов по сайтам XbaI и BamHI. Состав реакционных смесей представлен в таблице 6. Поскольку данные ферменты работают в одинаковых условиях, реакцию рестрикции с XbaI и BamHI осуществляли одновременно при температуре 37,0°C в течение 3 часов. Для отделения исходной плазмиды Р1 от линеаризованной после осуществления рестрикции проводили разделение фрагментов в 1% агарозном геле. Результаты электрофореза представлены на фиг. 7, из которой видно, что выделенная из агарозного геля верхняя полоса ампликонов является требуемой линеаризованной плазмидой.

На следующем этапе исследования провели выделение из агарозного геля линеаризованной плазмиды Р1 (верхняя полоса) и её лигирование по липким концам с ДНК-фрагментом, полученным при Overlap ПЦР III (фиг. 7) в следующем реакционном составе (табл. 7).

Полученную в результате вышеописанных действий пробирку с лигазной смесью инкубировали 1 час при комнатной температуре, затем в течение ночи (12 часов) при температуре +16⁰C.

На следующем этапе исследования лигазную смесь использовали для последующей трансформации компетентных клеток XL-1 Blue, заранее приготовленных с использованием хлорида кальция CaCl₂. Постановку реакции осуществляли, проводя следующие этапы работы: 1) размораживание клеток на льду; 2) добавление к 100 мкл клеток 30 мкл лигазной смеси; 3) инкубирование на льду в течение 20-30 минут; 4) осуществление «Heat-shock» при температуре 42°C в течение 35 секунд; 5) охлаждение на льду в течение 3 минут; 6) добавление 400 мкл питательной среда LB; 7) инкубация при температуре 37,0°C в течение 1 часа; 8) центрифугирование при скорости 2000 об/мин в течение 1 минуты и периодическое удаление супернатанта; 9) ресуспендирование клеток в 100 мкл LB; 10) внесение на агар LB с ампициллином; 11) инкубация при температуре 37,0°C в течение ночи (10-12 часов).

На следующий день на агаре LB появились клоны, отраженные на фиг. 8, которые индивидуально изучали для отбора соответствующих требуемым параметрам (наличие 20 п.н. последовательность РНК-гиды). Как видно из фиг. 8, необходимо было выбрать индивидуальные клоны для их использования на следующих этапах работы.

С целью проверки полученных на LB агаре клонов (РНК-гид) провели секвенирование, результаты которого представлены на фиг. 9. Полученные в ходе секвенирования последовательности наглядно показывают, что РНК-гида имеет нужные последовательности для гена ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД.

Таким образом, проведено клонирование последовательностей в плазмиду P1 для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Пример 3. Конструирование челночного вектора для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Помимо Cas9 и РНК-гиды для редактирования вируса ЗУД использовали помогающую плазмиду (челночный вектор, Shuttle), несущую два фрагмента генома возбудителя данного заболевания. Эти фрагменты, фланкирующие гены, которые планируется удалить, называются Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm). Такой вид редактирования называется гомологичная рекомбинация и представлен на фиг. 10.

Челночный вектор (Shuttle) изготавливали на основе плазмиды pJET1.2, содержащей два фрагмента генома штамма «Курган» вируса ЗУД, которые фланкируют ген ORF LD144 для его делеции. Между фрагментами клонировали маркер для выделения вируса штамма «Курган» после его модификации. В качестве маркера применяли ген красного флуоресцирующего белка RFP.

Для этого была рассчитана схема для получения данного челночного вектора, которая представлена на фиг. 11. Как показано на фиг. 11, необходимо присутствие четырех важных участков в векторе для проведения данной работы: первая часть - это левая фланкирующая последовательность, вторая часть - промотор 7.5 Vaccinia Virus, третья часть - целевой ген RFP, четвертая часть - правая фланкирующая последовательность.

Таким образом, в ходе данного этапа работы провели конструирование челночного вектора для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Пример 4. Трансформация культуры клеток MDBK плазмидой Р1 (РНК-гида), челночным вектором и p-Cas9/No NLS для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Трансформацию культуры клеток MDBK плазмидой Р1 (РНК-гида), челночным вектором и p-Cas9/No NLS проводили с использованием культуры клеток MDBK, которую высевали на 96-луночных культуральных планшетах, а также применяли челночный вектор, ЗУД_РНК-гиду, p-Cas9/No NLS. Это было необходимо для получения всех необходимых факторов для редактирования штамма «Курган» вируса ЗУД с помощью технологии CRISPR-Cas9. Для трансформации использовали набор «Lipofectamine 3000» («Invetrogen») в соответствии с рекомендациями производителя. Этапы проведения данного анализа представлен в таблице 8.

Таким образом, на данном этапе работы провели трансформацию культуры клеток MDBK плазмидой Р1 (РНК-гида), челночным вектором и p-Cas9/No NLS для разработки способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Пример 5. Заражение культуры клеток MDBK вирусом ЗУД при разработке способа редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

После трансформации культуры клеток MDBK плазмидами через сутки после экспрессии проводили заражение данной монослойной клеточной линии штаммом «Курган» вируса ЗУД с титром инфекционной активности 5,0±0,04 lg ТЦД₅₀/0,2 см³.

Для получения культурального вируссодержащего материала монослойную культуру клеток MDBK (24-48-часовой монослой клеточной линии, выращенный в стационарных условиях) заражали с последующей адсорбцией вируса на клетках. Штамм «Курган» вируса ЗУД вносили после удаления ростовой среды, инкубировали в термостате при температуре (37±0,1)°С в течение 1 ч, а затем вносили поддерживающую среду ПСП (или аналог) с добавлением 1-2% фетальной сыворотки крови КРС и инкубировали в течение 5 суток.

Репродуктивную способность вируса ЗУД штамма «Курган» оценивали с помощью инвертированного микроскопа по степени развития цитопатического действия (ЦПД) в виде бляшек (фиг. 12). После развития ЦПД до 95-90% площади монослоя, заражённые клетки исследовали с помощью люминесцентного микроскопа, выявляя бляшки с характерным свечением. Отобранный материал пассировали в культуре клеток MDBK по описанной выше схеме. Для того чтобы получить генетически чистый вируссодержащий материал было проведено 7 последовательных пассажей. Полученный генно-модифицированный вирус из штамма «Курган» хранили при температуре минус 80±2°С.

Таким образом, использованные в данном изобретении технологии и конструированные плазмиды позволили нам разработать способ редактирования генома штамма «Курган» вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии. Разработанный способ предполагал создание РНК-гиды в исследуемой плазмиде P1; использование Overlap-ПЦР для получения РНК-гид в центре конструкции с интересующей последовательностью нуклеотидов; конструирование РНК-гиды к гену ORF LD144 штамма «Курган» вируса ЗУД. Разработанный способ позволил с высокой точностью провести редактирование генома штамма «Курган» вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Способ редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии»:

1. Sprygin A, Pestova Y, Wallace DB, Tuppurainen E, Kononov AV. Transmission of lumpy skin disease virus: A short review. Virus Res. 2019 Aug;269:197637.

2. Ma J, Yuan Y, Shao J, Sun M, He W, Chen J, Liu Q. Genomic characterization of lumpy skin disease virus in southern China. Transbound Emerg Dis. 2022 Sep;69(5):2788-2799.

3. Khan YR, Ali A, Hussain K, Ijaz M, Rabbani AH, Khan RL, Abbas SN, Aziz MU, Ghaffar A, Sajid HA. A review: Surveillance of lumpy skin disease (LSD) a growing problem in Asia. Microb Pathog. 2021 Sep;158:105050.

4. Gupta T, Patial V, Bali D, Angaria S, Sharma M, Chahota R. A review: Lumpy skin disease and its emergence in India. Vet Res Commun. 2020 Nov;44(3-4):111-118.

5. Tuppurainen E, Dietze K, Wolff J, Bergmann H, Beltran-Alcrudo D, Fahrion A, Lamien CE, Busch F, Sauter-Louis C, Conraths FJ, De Clercq K, Hoffmann B, Knauf S. Review: Vaccines and Vaccination against Lumpy Skin Disease. Vaccines (Basel). 2021 Oct 6;9(10):1136.

6. Namazi F, Khodakaram Tafti A. Lumpy skin disease, an emerging transboundary viral disease: A review. Vet Med Sci. 2021 May;7(3):888-896.

7. Sethi RK, Senapati SK, Selim AM, Acharya AP, Mishra C, Das M, Hegazy YM, Biswal SS. Molecular epidemiology of lumpy skin disease outbreak in Odisha, India. Vet Res Commun. 2022 Sep;46(3):711-717.

8. Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, Cai JB, Zhang PF, Cui YH, Ke AW. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022 Feb 21;21(1):57.

9. Gowripalan, A., Smith, S., Stefanovic, T., & Tscharke, D. C. (2020). Rapid poxvirus engineering using CRISPR/Cas9 as a selection tool. Communications biology, 3(1), 643.

10. Ma Y, Zhang L, Huang X. Genome modification by CRISPR/Cas9. FEBS J. 2014 Dec;281(23):5186-93.

11. Zhan T, Rindtorff N, Betge J, Ebert MP, Boutros M. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Semin Cancer Biol. 2019 Apr;55:106-119.

12. Hryhorowicz M, Lipiński D, Zeyland J, Słomski R. CRISPR/Cas9 Immune System as a Tool for Genome Engineering. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2017 Jun;65(3):233-240.

13. Lu, H., Xie, Q., Zhang, W., Zhang, J., Wang, W., Lian, M., Zhao, Z., Ren, D., Xie, S., Lin, Y., Li, T., Mu, Y., Wan, Z., Shao, H., Qin, A., & Ye, J. (2022). A Novel Recombinant FAdV-4 Virus with Fiber of FAdV-8b Provides Efficient Protection against Both FAdV-4 and FAdV-8b. Viruses, 14(2), 376.

14. Протокол №26 «Молекулярное клонирование». URL: https://www.skygen.com/podderzhka/obzory/26-molekulyarnoe-klonirovanie (Дата обращения: 26.05.2023).

Таблица 1
Дизайн праймеров с последовательностями РНК-гид для гена ORF LD144
штамма «Курган» вируса ЗУД Название праймера Нуклеотидная последовательность (5’- 3’) ЗУД_gR1_R ctggattatctaaatttgat GCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT ЗУД_gR1_F atcaaatttagataatccag GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA

Таблица 2
Состав реакционной смеси для постановки ПЦР для получения двух ампликонов (реакции I и II) ПЦР для первого ампликона (реакция I) ПЦР для второго ампликона (реакция II) Taq-Buffer (10x) 2,0 мкл Taq-Buffer (10x) 2,0 мкл MgCl₂ (25mM) 2,5 мкл MgCl₂ (25mM) 2,5 мкл Fwd Primer (U6-F) 1,0 мкл Fwd Primer (РНК-гид-F) 1,0 мкл Rvs Primer (РНК-гид-R) 1,0 мкл Rvs Primer (6R) 1,0 мкл dNTP (2,5mM каждого) 0,5 мкл dNTP (2,5mM каждого) 0,5 мкл Taq-polymerase (5U) 0,5 мкл Taq-polymerase (5U) 0,5 мкл Плазмида (P1) 2,0 мкл Плазмида (P1) 2,0 мкл ddH2O 11 мкл ddH2O 11 мкл Общий объем: 20 мкл Общий объем: 20 мкл

Таблица 3
Режим термоциклирования при проведения ПЦР для получения двух ампликонов (реакция I и II) Этап Температура,
⁰С Время Количество циклов Денатурация 98 30 с 1 цикл Денатурация 98 10 с 35 циклов Отжиг 59 15 с Элонгация 72 15 с Элонгация 72 2 мин 1 цикл

Таблица 4
Протокол постановки ПЦР-реакции третьего этапа работы Состав реакционной смеси Количества компонентов на 1 реакцию Taq-Buffer (10x) 2,0 мкл MgCl₂ (25mM) 2,5 мкл Fwd Primer (U6-F) 1,0 мкл Rvs Primer (6R) 1,0 мкл dNTP (2,5mM каждого) 0,5 мкл Taq-polymerase (5U) 0,5 мкл Фрагмент 1 и фрагмент 2 4 мкл (2 мкл каждого фрагмента) ddH2O 9 мкл Общий объем: 20 мкл

Таблица 5
Режим термоциклирования при проведении реакции амплификации по протоколу Overlap ПЦР Этап Температура, °С Время Количество циклов Денатурация 98 30 с 1 цикл Денатурация 98 15 с 3 цикла Отжиг 55 20 с Элонгация 72 10 с Денатурация 98 15 с 27 циклов Отжиг 61 20 с Элонгация 72 10 с Элонгация 72 2 мин. 1 цикл

Таблица 6
Состав реакционной смеси для рестрикции плазмиды Р1 и ПЦР-продуктов по сайтам XbaI и BamHI Состав реакционной смеси Объем для получения ПЦР-продукта (на 1 реакцию) Объем для плазмиды Р1 (на 1 реакцию) Буфер для рестриктаз 10Х Fast digest 2 мкл 2 мкл XbaI 1 мкл 1 мкл BamHI 1 мкл 1мкл ДНК 10 мкл 10 мкл Вода 6 мкл 6 мкл Общий объем: 20 мкл 20 мкл

Таблица 7
Состав реакционной смеси для лигирования по липким концам с ДНК-фрагментом, полученным при Overlap-ПЦР III Состав реакционной смеси Объем компонентов (на 1 реакцию) T4 буфер для лигирования (10х) 3 мкл T4 лигаза (5U) 2 мкл ДНК 15 мкл Р1 7,5 мкл Деионизированная вода 0,5 мкл 10 мМ ATP 2,0 мкл Общий объем: 30 мкл

Таблица 8
Этапы проведения трансформации культуры клеток MDBK
с использованием набора «Lipofectamine 3000» № этапа п/п День эксперимента Описание этапа работы 1 1 Посев культуры клеток в лунки 96-луночного культурального планшета для достижения 85-90% монослоя 2 2 Разбавление липофектамина 3000
в среде Opti-MEM (5 мкл Opti-MEM и 0,3 мкл липофектамина в среде) 3 Приготовление мастер-микса, разбавляя плазмиды в среде Opti MEM™, добавление реагента P3000™. Перемешивание следующих компонентов: 10 мкл Opti-MEM, 0,2 мкг плазмид и 0,4 мкл P3000. 4 Добавление разбавленных растворов плазмид в пробирку с разбавленного Липофектамина™ 3000
(соотношение 1:1) 5 Инкубирование в течение 15 минут при комнатной температуре 6 Добавление в культуру клеток полученной суспензии в п. 5 7 Заражение культуру клеток штаммом «Курган»
вируса ЗУД 8 3 Визуализация/анализ
трансфицированных клеток 4 5 6 7

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="ЗУД_1715063301709.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2024-05-07">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-30</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>520</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-06-30</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ редактирования генома

вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с

помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1641</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1641</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lumpy skin disease of

bovine</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtattcattttacgaattacgtaaatactgcgatgtatcaatatgtt

ttaatgatgtgattaaaattaaaggtcataaaataattttatcaaattcatctaaatactttgataccat

gtttagtaataaatattttatagaaaaccaaaaaaatgacataagtattaatatatcaaatttagataat

ccagaggtatcaataaatgagataattaaatttatgtataacgggaaattagataaaactcttaaagatt

atgtaatcttaaaagatatgcttaaaatagcagattatcttattatagatgatattatcccactttgtat

aacatctatagttaaaattatagattttaataattgtctcgatgcgtgtattttttcagaattttataac

ttaaaaaaactaaataggtttacttataaatttatacgaaaaaatatacgtaaaatatatttaaaaaaag

attttatttatttatcatttaacgttattaatcttcttttacgagataaaaaaactgtattttataatga

agatgatgtattatgtattatattacaatggcttaataatgaagaaaataataaatattttcatgatgtt

ttaaaagtaataagattttcacttttgtcagaagaatgtgccaacaagcttaagataaaatataaatact

tatttcctgatagtttattaagtaagtcattattttcctcaaaaatgtcacgcagagaatcaacgtttgg

atcgtttatatatatatccgacccaaattggtatagtaaaaaatatgatattatgtacataagaacattt

aattatattacaaaaagagttaaaacaatagatagtataccgtttgttgaaaagtttcattctgtattac

ataatgacgttatttactttttaagatttgaaggtagtaataataaaaataaatttgataggaattttaa

cagttatgatattgtaactaaatcatggaacagttttccaaaaatagacgattgtgaaaatttttcatcc

tgtgtattaaataataaaatgtacctaattggtggtgaaattaatggtatttcaacaaatagggtattgt

ggtgggattttaaatctaattattggaaccaaacaactcctatgcgttttccaaaatctgaatcatgtgt

ggtaccggctgaaaattttatatttgtaataggtggaaaagatatgtactcattagatgtagttgaaagg

tttgatacaaaaacacaatcttggtcaactttaatgcatttacctatacgattaaaaagaagttctggta

tatatcataaaggatttatttatatagtagggggtatcagttacgctagtgctgagctcggaataggcta

tgaaggttttgttaataaaatatatagatatgatatatcaaataactattggattgaattaaacccatta

agacatacaaaaataaatgttaatctgggtatattagataatgacaataaaatatatgcaattggaggcg

ataaaaataatacaatagaagtgtataatatatcaacaaatacatggagtatgtttggtagatcgttttg

taatttaattaactcaaagcaatgtaatatatttacaaaaagtgtttttttg</INSDSeq_sequence

>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>547</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..547</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Lumpy skin disease of

bovine</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MYSFYELRKYCDVSICFNDVIKIKGHKIILSNSSKYFDTMFSNKYFIEN

QKNDISINISNLDNPEVSINEIIKFMYNGKLDKTLKDYVILKDMLKIADYLIIDDIIPLCITSIVKIIDF

NNCLDACIFSEFYNLKKLNRFTYKFIRKNIRKIYLKKDFIYLSFNVINLLLRDKKTVFYNEDDVLCIILQ

WLNNEENNKYFHDVLKVIRFSLLSEECANKLKIKYKYLFPDSLLSKSLFSSKMSRRESTFGSFIYISDPN

WYSKKYDIMYIRTFNYITKRVKTIDSIPFVEKFHSVLHNDVIYFLRFEGSNNKNKFDRNFNSYDIVTKSW

NSFPKIDDCENFSSCVLNNKMYLIGGEINGISTNRVLWWDFKSNYWNQTTPMRFPKSESCVVPAENFIFV

IGGKDMYSLDVVERFDTKTQSWSTLMHLPIRLKRSSGIYHKGFIYIVGGISYASAELGIGYEGFVNKIYR

YDISNNYWIELNPLRHTKINVNLGILDNDNKIYAIGGDKNNTIEVYNISTNTWSMFGRSFCNLINSKQCN

IFTKSVFL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Neethling disease</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggattatctaaatttgatgccggtgtttcgtcctttccacaagat</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Neethling disease</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atcaaatttagataatccaggttttagagctagaaatagcaagtta</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота. Указанный способ осуществляют с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии, причем способ включает: создание дизайна последовательности праймеров для синтеза плазмиды, кодирующей РНК-гид: клонирование последовательностей в плазмиду P1; конструирование челночного вектора; трансформация культуры клеток MDBK плазмидой Р1, кодирующей РНК-гид, челночным вектором и p-Cas9/No NLS; заражение культуры клеток MDBK вирусом ЗУД; получение генно-модифицированного вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота. Изобретение обеспечивает редактирование генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота in vivo с высокой точностью. 1 з.п. ф-лы, 12 ил., 8 табл., 5 пр.

1. Способ редактирования генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии, включающий следующие этапы анализа:

- создание дизайна последовательности праймеров для синтеза плазмиды, кодирующей РНК-гид:

ЗУД_gR1_R - ctggattatctaaatttgat GCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGAT,

ЗУД_gR1_F - atcaaatttagataatccag GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA;

- клонирование последовательностей в плазмиду P1;

- конструирование челночного вектора;

- трансформация культуры клеток MDBK плазмидой Р1, кодирующей РНК-гид, челночным вектором и p-Cas9/No NLS;

- заражение культуры клеток MDBK вирусом ЗУД;

- получение генно-модифицированного вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дает возможность с высокой точностью проводить редактирование генома вируса заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота с помощью Overlap-ПЦР и CRISPR-Cas9 технологии.