ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОЦЕНКИ СТИМУЛЯЦИИ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ МОДЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ, НАПРАВЛЕННЫМИ НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ СПЕРМАТОГЕНЕЗА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и фармации и может быть использовано для оценки эффективности in vitro терапевтических агентов, направленных на восстановление ниши стволовой клетки, в том числе для лечения нарушений фертильности, вызванной нарушением функции сперматогенной ткани семенников.

Уровень техники

Для проверки биологической активности препаратов требуются тест-системы, которые бы позволяли оценить их воздействие на функцию специфического типа клеток (специфическая активность), особенно в условиях повреждения данных клеток. Однако на данный момент такие тест-системы отсутствуют, а основным источником информации о воздействии препаратов на поведение клеток является использование соответствующих животных моделей.

Так, например, для исследования воздействия препаратов на повреждённую нишу сперматогониальной стволовой клетки, включающую клетки Лейдига, клетки Сертоли, эндотелиальные клетки, макрофаги и др., используют моделирование крипторхизма (https://doi.org/10.3109/00365599609181297, https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.10.174), нокаутных по определённым генам животных (10.1038/nrg911), моделирование лекарственно-индуцированных повреждений (https://doi.org/10.29188/2222-8543-2021-14-4-95-101, https://doi.org/10.1002/j.1939-4640.2005.tb02883.x) и другие подходы. Однако использование животных для изучения лекарственных препаратов требует внушительных трудозатрат и денежных ресурсов. Важно подчеркнуть, что использование лабораторных животных для первичного скрининга активности препарата уже ведёт к использованию значительного количества особей, что зачастую противоречит введёному Расселом и Берчем в 1959 году правилу «трёх R» (замена (Replacement), сокращение (Reduction) и уточнение (Refinement), (Directive 2010/63/EU).

В то же время использование клеточных тест-систем позволяет снизить количество используемых животных, а также сократить трудозатраты и объёмы требуемого финансирования. Из уровня техники (https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0041008X91901204, https://sci-hub.ru/https://doi.org/10.1016/0890-6238(93)90066-G, 10.1159/000460822) известен способ для оценки токсического действия препаратов, который предполагает использование

теста используются первичные или линейные (например, MIN6) β клетки поджелудочной железы. Клетки высаживают в 96-луночный планшет, после чего депривируют в течение 1 ч и инкубируют 1 ч вместе с тестируемым веществом. Количество секретируемого инсулина измеряют иммуноферментным анализом, люциферазным тестом или с помощью аналогичных подходов. Оценивают активность препарата по изменению секреции клетками инсулина. К недостаткам данной модели можно отнести отсутствие моделирования повреждения, а также отсутствие точной “шкалы” для оценки биологической активности препарата. Кроме того, отсутствуют прямые данные, описывающие возможность использования замороженных образцов клеток. Также дифференцированные клетки поджелудочной железы нельзя отнести к клеткам, поддерживающим функцию ниши стволовых клеток.

Таким образом, техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу за счет создания эффективных тест-системы и способа оценки специфической активности препаратов, стимулирующих регенерацию тканей и направленных на восстановление поврежденных ниш стволовых клеток через управление секреторной активностью клеток, участвующих в формировании ниш.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка тест-системы, позволяющей эффективно оценить воздействие тестируемого вещества на восстановление секреторной активности клеток, поддерживающих ниши стволовых клеток. Эффективность определяется использованием модельных клеток, входящих в состав тест-системы и специфичных для повреждённых ниш стволовых клеток, градуировкой тест-системы за счет двукратного измерения специфического секреторного фактора, отражающего секреторную активность модельных клеток, на разных сроках их культивирования с целью получения «шкалы», которая необходима для оценки специфической активности терапевтического агента.

Технический результат достигается тест-системой для определения специфической активности терапевтического агента, стимулирующего регенерацию ткани, с помощью оценки секреторной активности поддерживающих клеток ниши стволовой клетки, включающей модельные клетки предварительно выделенные и высаженные на поверхность культуральной ёмкости, или замороженные сразу после выделения из ткани, культуральную среду, поддерживающую их рост и секреторную активность, среду для кондиционирования клеток, раствор для отмывки клеток, набор для измерения

получения кондиционированной среды модельных клеток необходимо собрать среду в лунках К1 (группа «контроль 1»), К2 (группа «контроль 2») и в лунках с терапевтическим агентом, избавиться от дебриса методом центрифугирования 300 g 5-10 мин и собрать полученный супернатант для дальнейшего анализа специфического секреторного фактора. Измерение концентрации факторов, секретируемых целевыми клетками, проводят методами иммуноферментного, хроматографического или спектроскопического анализа, или методами вестерн-блоттинга.

Вывод о специфической активности терапевтического агента делают на основании сравнения уровня секреции относительно контролей. При этом, если терапевтический агент не изменяет уровень секреции относительно контроля 2, говорит об отсутствии эффективности. В случае, если терапевтический агент снижает уровень секреции относительно контроля 2, делают вывод о его ингибирующем воздействии на секрецию. Если терапевтический агент увеличивает уровень секреции относительно контроля 2, но не достигает значений контроля 1, то делают вывод о частичном восстановлении секреторной функции. Если терапевтический агент достигает значений контроля 1, то делают вывод о полном восстановлении секреторной функции. В случае если терапевтический агент приводит к превышению значений контроля 1, то делают вывод о гиперстимулирующей активности.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлена микрофотография, демонстрирующая морфологию клеток Лейдига яичек крысы через 24 и 96 ч после выделения. А-клетки Лейдига через 24 ч после выделения. Б-клетки Лейдига через 96 ч после выделения.

На фиг. 2 представлен график, иллюстрирующий снижение концентрации тестостерона при культивировании и способность секретома мезенхимных стромальных клеток восстанавливать секрецию тестостерона относительно отрицательного контроля К1. К-1 (контроль 1): уровень секреции тестостерона через 48 ч после выделения; К-2 (контроль 2): уровень секреции через 96 ч после выделения; секретом МСК - добавление секретома МСК из жира человека к клеткам Лейдига в концентрации 10х. N=5.

На фиг. 3 представлен график, иллюстрирующий относительную концентрацию тестостерона в среде размороженных клеток Лейдига крысы. К-1 (контроль 1): уровень секреции тестостерона через 48 ч после выделения; К-2 (контроль 2): уровень секреции через 96 часов после выделения; секретом МСК - добавление секретома МСК из жира человека к клеткам Лейдига в концентрации 10х. N=2.

На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий относительную концентрацию тестостерона в среде клеток Лейдига мыши. К-1 (контроль 1): уровень секреции тестостерона через 48 ч после выделения; К-2 (контроль 2): уровень секреции через 96 ч после выделения; секретом МСК - добавление секретома стромальной фракции яичек мыши без клеток Лейдига к клеткам Лейдига мыши в концентрации 10х. N=2.

На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий зависимость интенсивности секреции тестостерона клетками Лейдига от концентрации VEGF в составе секретома мезенхимных стромальных клеток.

На фиг. 6 представлена диаграмма, иллюстрирующая вклад секретома МСК и VEGF в его составе в восстановление сперматогенеза.

Фиг. 7. Введение доксорубицина приводит к повреждению семенных канальцев. Однократное введение секретома МСК не восстанавливает морфологию семенных канальцев (А), но имеется тенденция к увеличению восстанавливающихся канальцев через 150 дней после инъекции доксорубицина (В). Данные представлены в виде медианы, 25-й и 75-й процентилей, показаны минимальные и максимальные значения для каждой группы. Общая (C) и подвижная (D) фракции сперматозоидов через 150 дней после завершения инъекций доксорубицина. Желтым цветом показано количество животных с общей численностью, превышающей порог, а серым цветом указано количество животных с общей численностью, не превышающей порог. p > 0,05 между группой доксо+секретом МСК и группой доксо + секретом МСК + АТ VEGF. Использовался точный критерий Фишера. N= 8 для группы доксо + секретом МСК, n = 5 для группы доксо, N = 2 для группы доксо + секретом МСК+АТ VEGF и N = 3 доксо + секретом МСК + изотипические АТ VEGF. (E) Микрофотографии срезов семенников мышей, окраска гематоксилин-эозин. 1- доксо, 2 - доксо + секретом МСК, 3 - доксо + секретом МСК+АТ VEGF.

Осуществление изобретения

Предлагаемая тест-система основана на использовании специализированных модельных клеток, предварительно выделенных из тканей, воздействие на регенерацию которых терапевтическим агентом необходимо оценить, или замороженных сразу после выделения с последующим размораживанием и культивированием в среде, поддерживающей их рост и секреторную активность, до достижения количества, достаточного для детекции специфического секреторного фактора.

В отличие от аналога эффективность и физиологическое соответствие модели повреждению in vivo обеспечивается за счет использования клеток, секреторная активность (секреция маркерного специфического фактора, вовлеченного в поддержание функционировании ниши) которых уменьшается при культивировании. Уменьшение секреторной активности при культивировании позволяет считать данную тест-систему релевантной для отображения “физиологического повреждения” клеток ниши, при котором также происходит снижение секреторной активности клеток ниши.

В отличие от аналога, в котором в качестве модельного объекта используют терминально дифференцированные клетки органа, функция которых направлена на поддержание всего организма, в данном изобретении предложено использовать клетки, чья паракринная активность направлена преимущественно на поддержание нормальной работы ниши стволовой клетки. В качестве таких клеток допустимо использовать описанные в литературе тканеспецифичные клетки ниши, такие как клетки Лейдига, клетки Сертоли, в т.ч. иммортализованные клетки, или другие, отвечающие заданным свойствам. Для выделенных клеток подбирается индивидуальная среда для культивирования. Так, в наиболее близком аналоге для культивирования b-клеток поджелудочной железы используется среда ДМЕМ с 15% фетальной бычьей сывороткой, 1% антибиотика пенициллин/стрептомицин, 0,1% b-меркаптоэтанола и 0,5% G418. Для клеток Лейдига использовалась среда ДМЕМ-Ф12 с 1х антибиотиком, 1х глутамата, 1х пирувата, 2% фетальную бычью сыворотку и 1% ITS.

В отличие от аналога точность оценки эффективности препарата достигается за счёт наличия в модели двух контрольных групп, в отличии от прототипа, в котором использовали одну контрольную группу, в которой измеряли базовый в норме для клеток уровень секреции специфического секреторного фактора. В предлагаемой тест-системе первая контрольная группа представляет собою модельные клетки, секреторная активность которых оценивается непосредственно после начала тестирования в течение первых 48-72 ч культивирования, что позволяет оценить физиологическое поведение клеток, приближенное к норме (группа контроль 1, “норма”). Исследуемое вещество (терапевтический агент) добавляют к клеткам на том сроке культивирования, когда их секреторная активность снижена, что позволяет оценить именно восстановление функциональной активности клеток. Вторая контрольная группа представляет собою клетки, к которым не добавляют исследуемое вещество, что делает возможным оценку секреторной активности клетки в ситуации повреждения ниши in vitro (группа контроль 2, “повреждение”). В остальные экспериментальные лунки наносят терапевтический агент, разведённый в базальной бессывороточной среде. При этом способ получения секретома модельных клеток включает в себя отмывку клеток буферным раствором, кондицинирование в бессывороточной среде без или с добавлением терапевтического агента, отбор среды культивирования, содержащей продукты секреции модельных клеток, очистку от остатков клеток. Специфический секреторный фактор в секретоме модельных клеток измеряют методами иммуноферментного анализа (10.1038/jid.2013.287), хроматографического анализа, спектроскопического анализа (10.1016/j.abb.2012.11.007) или методом вестерн-блот (10.1155/2014/361590).

Таким образом, в отличие от прототипа, в котором не приведен способ точной оценки эффективности препарата, а проводили лишь сравнительную оценку секретируемого маркерного вещества (больше, чем в контроле - меньше, чем в контроле) с использованием предлагаемой тест-системы возможна более точная оценка препарата, не обладающего цитотоксичностью, по уровню эффективности:

- подавление секреторной активности (статистически ниже уровня группы “повреждение”);

- отсутствие эффекта (статистически не отличается от уровня группы “повреждение”);

- увеличение секреторной активности клеток (статистически выше группы “повреждение”, но меньше группы “норма”);

- восстановление секреторной активности клеток (статистически не отличается от группы “норма”);

- стимулирование гиперсекреции клеток (статистически выше “норма”).

Техническим преимуществом тест-системы является доказанная возможность работы на замороженных образцах клеток. В отличие от прототипа, в котором не уточняется возможность работы на замороженных и размороженных образцах клеток, была показана возможность работы на замороженных образцах клеток, не приводящая к снижению возможности получения достоверных результатов на модели, что потенциально снижает количество необходимых для работы донорских тканей или количество животных.

Ещё одним преимуществом модели является возможность оценки обязательного показателя качества биологических препаратов - специфической активности. На модели можно in vitro изучать механизмы действия терапевтических агентов. В качестве терапевтических агентов с помощью предлагаемой тест-системы можно исследовать лекарственные средства, в том числе высокотехнологичные лекарственные препараты, растительные препараты, малые молекулы, БАДы, препараты на основе соматических клеток и другие агенты, предполагаемым механизмом действия которых является стимуляция регенерации тканей за счет воздействия на секреторную активность клеток в нишах стволовых клеток. Кроме того, для терапевтических агентов, представляющих собой многокомпонентную смесь активных веществ, на данной тест-системе можно изучать вклад каждого из компонентов. Определение ключевых факторов позволит изучать механизмы действия, а также выбрать суррогатный фактор для косвенного определения специфической активности.

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификациям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний.

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25 °C.

Пример 1. Получение МСК жировой ткани человека

МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone) содержащим 5-кратную концентрацию антибиотика 500 ед/мл (HyClone).В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM^™ (HyClone) /500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед/мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37 °С в течение 30-45 мин при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200 g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM^™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM^™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).

Выделенные МСК высевают в концентрации 200 тыс. в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37 °C и при 5%-ой концентрации CO₂. При достижении 80% монослоя МСК ЖТ клетки пассируют. Для этого перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию. Затем клетки рассевают в соотношении 1:4.

Пример 2. Получение секретома МСК жировой ткани человека

Для получения секретома МСК жировой ткани 4-5 пассажа, достигшие 80% конфлюентности, промывали трёхкратно раствором Хэнкса с солями кальция и магния («ПанЭко», Россия). К чашкам добавляли среду DMEM с низким содержанием глюкозы DMEM containing low glucose, GlutaMAX™ Supplement, pyruvate (Gibco, США), далее DMEM, или среду, разработанную для поддержания роста МСК, NutriStem XF Medium (Biological Industries, Израиль) (далее - NutriStem), содержащих 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали в течение 3-14 дней, после чего кондиционированную среду, содержающую компоненты секретома МСК, собирали, очищали от клеточного дебриса путём центрифугирования в течение 10 мин при 300 g.

Пример 3. Концентрирование секретома МСК

Для концентрирования использовали фильтры для центрифуги «Amicon» (#Z740186, Merck, Германия) с размером пор, предназначенным для отсечения молекул размером меньше 10кДа. Новые фильтры очищали и «забивали» белком за счет концентрирования 5 мл стерильной 1% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, США) в растворе фосфатно-солевого буфера (ПанЭко, Россия) до минимального остаточного объема. Затем фильтр промывали 3 раза 70% этанолом за счет пропускания полного объема спирта через фильтры, а также 3 раза смесью 2% раствора пенициллина - стрептомицина в фосфатно-солевом буфере. Затем помещали в фильтры секретом МСК и откручивали его на фильтрах на скорости 3000 g до уменьшения объема концентрата в 25 раз по сравнению с начальным. Полученный концентрат отбирали для дальнейшего использования. После работы фильтры промывали раствором фосфатного солевого буфера, содержащего 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина. В том же растворе хранили фильтры при температуре +4С до следующего использования.

Пример 4. Метод оценки концентрации VEGF, опосредованно стимулирующего сперматогенез, в секретоме мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека

Для определения концентрации VEGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat#DVE00) или аналогичный.

Используя стандартизированный раствор VEGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл VEGF, каждая последующая содержала VEGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора VEGF троекратно наносят в лунки 96-луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 ч при 4 °С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против VEGF человека. Через 3 ч инкубации планшеты отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 ч планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата TMB/E. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.

Пример 6. Способ стимуляции восстановления сперматогенеза с помощью введения секретома МСК человека на модели химиотерапевтического повреждения доксорубицином

Повреждающий агент доксорубицин для создания модели исследования вводили молодым половозрелым самцам мышей линии Black в виде раствора, приготовленного из лиофилазата, внутрибрюшинно. Исследования на животных проводили в соответствии с Директивой ЕС 201/63/EU и в согласовании с биоэтическим комитетом МГУ имени М.В. Ломоносова (номер заявки 90-ж). Животные взяты из питомника ИЦиГ СО РАН.

Эксперименты выполняли на 45 половозрелых молодых мышах-самцах линии Black стандартных весовых характеристик. Все эксперименты выполняли в соответствии с

требованием Хельсинкского соглашения о гуманном обращении с животными. Этим животным внутрибрюшинно вводили доксорубицин в виде раствора, приготовленного из лиофилизата. Доксорубицин вводился внутрибрюшинно с периодичностью 1 раз в 2 дня в дозе 1 мг/кг до достижения суммарной дозы 10 мг/кг. После окончания курса доксорубицина животным под белочную оболочку яичка вводили секретом МСК. Перед введением секретом МСК в 50-кратной концентрации смешивали с 2% гелем свиного коллагена (МакМеди, Москва, Россия) в объемном соотношении 1:4 до достижения 10-кратной концентрации для инъекций.

Оценку выраженности развившихся повреждений в яичках после курса доксорубицина и эффективность терапии секретомом МСК оценивали через 1 и 5 мес. Для этого удаляли яички с придатками и забирали образцы ткани яичек для гистологического исследования, которое проводили по стандартной методике с окраской гистологических срезом гематоксилином и эозином. Выраженность нарушения сперматогенеза оценивали по определению доли нормальных, восстанавливающихся и повреждённых семенных канальцев. Придатки яичка гомогенизировали в растворе 5% глюкозы в соотношении ткань/раствор 1:10 с последующим определением в надосадочной жидкости количества активно-подвижных и неподвижных сперматозоидов в камере Горяева по стандартной методике анализа спермограммы.

Количество канальцев в экспериментальной группе значимо не изменяется по сравнению с группой нелеченных животных.

Результаты изучения количества сперматозоидов и их подвижности показали, что в группе, получающей инъекцию секретома МСК, через 5 мес. после введения общее количество сперматозоидов составляет 6,2512*10^6, а количество подвижных сперматозоидов 0,12316875*10^6, что значимо превышает данные показатели у животных с повреждением без терапии: 0,412*10^6 и 0,000687*10^6 соответственно.

Пример 6. Способ изучения вклада VEGF в восстановление сперматогенеза на модели химиотерапевтического повреждения доксорубицином.

Для изучения вклада VEGF в восстановление сперматогенеза мы смоделировали повреждение сперматогенеза доксорубицином по способу, описанному в примере 5. Были сформированы группы интактных мышей, мышей с повреждением сперматогенеза, мышей с терапией секретомом МСК, мышей, которые получили инъекцию секретома МСК с антителами к VEGF в концентрации 0,1 мкг/мл (ab36424, Abcam, США) и мышей, которые получили инъекцию секретома МСК с изотипическими контрольными антителами в концентрации в объёмной концентрации 1:10000 (910801, Biolegend, USA). Перед введением секретом МСК или продукт секретома МСК с антителами в 50-кратной концентрации смешивали с 2% гелем свиного коллагена (МакМеди, Москва, Россия) в объемном соотношении 1:4 до достижения 10-кратной концентрации для инъекций.

Оценку выраженности эффекта блокирования VEGF антителами оценивали через 1 и 5 мес. Для этого удаляли яички с придатками и забирали образцы ткани яичек для гистологического исследования, которое проводили по стандартной методике с окраской гистологических срезом гематоксилином и эозином. Выраженность нарушения сперматогенеза оценивали по определению доли нормальных, восстанавливающихся и повреждённых семенных канальцев. Придатки яичка гомогенизировали в растворе 5% глюкозы в соотношении ткань/раствор 1:10 с последующим определением в надосадочной жидкости количества активно-подвижных и неподвижных сперматозоидов в камере Горяева по стандартной методике анализа спермограммы.

Количество канальцев в экспериментальной группе значимо не изменяется по сравнению с группой нелеченных животных и животных с терапией секретомом МСК.

Результаты изучения количества сперматозоидов и их подвижности показали, что в группе, получающей инъекцию секретома МСК, через 5 мес. после введения общее количество сперматозоидов составляет 6,2512*10^6, а количество подвижных сперматозоидов 0,12316875*10^6, при этом в группе, получающей инъекцию секретома МСК с антителами к VEGF, через 5 мес. после введения общее количество сперматозоидов составляет 0,25*10^6, а количество подвижных сперматозоидов 0, что говорит о значимом снижении эффекта восстановления сперматогенеза при блокировании VEGF в секретоме МСК.

Пример 7. Способ получения клеток Лейдига из яичек крыс

Восьмимесячных самцов крыс Wistar анестезировали в эксикаторе с использованием CO₂ и скорости потока, которая вытесняла не менее 20% объема камеры в минуту. После остановки дыхания и отсутствия реакции на сдавливание подушечки лапы эвтанизировали крыс путем смещения шейных позвонков. Семенники крыс выделяли в раствор Хэнкса (ПанЭко, Россия) с 5% антибиотиком пенициллином/стрептомицином (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) или аналогичным, переносили в 100-мм чашки для культивирования, удаляли белочную оболочку и затем промывали раствором Хэнкса 3 раза по 5 мл. Затем семенники переносили в 7-10 мл среды DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) с 2,5 мг/мл трипсина и 10 мкг/мл ДНКазы на 4-10 мин при 34-35 °С, периодически встряхивая. В результате интерстициальные клетки отделяются от семенных канальцев и находятся в суспензии в среде DMEM. Для инактивации ферментов добавляли 15-20 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), осторожно перемешивали, переворачивая пробирку, а затем оставляли на 5-20 мин до оседания канальцев. Жидкую фракцию надосадочной жидкости с интерстициальными клетками переносили в новую пробирку. Процедуру перемешивания канальцев и удаления надосадочной жидкости повторяли 5 раз. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 300×g и ресуспендировали в DMEM:F12 с 1х пенициллином/стрептомицином, 1× Glutamax-I (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 1× пируват (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 2% фетальной бычьей сыворотки и 1× инсулин-трансферрин-селен добавки (ITS, ПанЭко, Россия). Затем суспензию клеток Лейдига пропускали через фильтр 100 мкм. Клетки Лейдига высаживали в 48-луночные планшеты и помещали в инкубатор с СО₂ при 35 °С.

Пример 8. Способ воспроизведения модели оценки стимуляции секреторной активности клеток Лейдига

Фракцию, обогащённую клетками Лейдига, высаживали в 48-луночный планшет в количестве от 100 до 200 тыс. на 1 см². Клетки Лейдига высаживали в 48-луночный планшет в среде DMEM:F12 с добавлением 1× пенициллин/стрептомицин, 1× Glutamax-I, 1× пируват, 2% фетальной бычьей сыворотки и 1× инсулин-трансферрин-селен (ITS). Объем среды составлял 350 мкл на лунку. Затем планшеты с клетками Лейдига помещали в СО₂-инкубатор при 35 °С. На следующий день все лунки трижды промывали 500 мкл раствора Хэнкса («ПанЭко», Россия) и добавляли свежую среду для культивирования. В лунки контроля “2 день” добавляли среду DMEM:F12 без фенолового красного с низкой концентрацией глюкозы, содержащую 1× пенициллин/стрептомицин. 1× глутамакс-I и 1× пируват. На следующий день лунки трижды промывали 500 мкл раствора Хэнкса и добавляли либо секретом МСК, либо среду DMEM:F12 без фенолового красного с низкой концентрацией глюкозы, содержащую 1× пенициллин/стрептомицин. 1× глутамакс-I и 1× пируват. Из лунок контроля “2 день” секретом клеток Лейдига собирали и центрифугировали при 300×g в течение 10 мин. Полученный супернатант помещали на -80 °С. Через два дня секретом клеток Лейдига из оставшихся лунок собирали и центрифугировали при 300×g в течение 10 мин. Полученный супернатант помещали на -80 °С.

Пример 9. Способ использования замороженных клеток Лейдига

Поскольку не всегда возможно использовать клетки Лейдига сразу для эксперимента (например, для получения секретома МСК необходимо время), была опробована тест-система на замороженных клетках Лейдига для проверки их жизнеспособности и возможности после заморозки отвечать на стимуляцию секретомом МСК. Кроме того, возможность заморозки большого количества клеток позволит использовать меньшее число животных, что целесообразно с этической точки зрения.

Суспензию клеток Лейдига, полученную по примеру 7, центрифугировали 300g 10 минут, удаляли супернатант. Полученный осадок ресуспендировали в необходимом количестве смеси, содержащей 10% DMSO и 90% фетальной бычьей сыворотки до достижения концентрации 1 млн клеток в 1 мл смеси. Затем полученную суспензию замораживали в аликвотах в криовиалах объёмом 1 мл на -80 °С. Аликвоты хранили в жидком азоте.

При необходимости аликвоты размораживались, разводились двумя объемами среды DMEM, центрифугировались 300 g 5 мин, затем разводились необходимым количеством культивируемой среды. Клетки Лейдига высаживали в 48-луночные планшеты и помещали в инкубатор с СО₂ при 35 °С.

Было показано, что клетки Лейдига выживают после заморозки и сохраняют способность отвечать на исследуемые сигналы.

Пример 10. Способ получения клеток Лейдига из яичек мыши

Трёхмесячных самцов мышей Black анестезировали в эксикаторе с использованием CO₂ и скорости потока, которая вытесняла не менее 20% объема камеры в минуту. После остановки дыхания и отсутствия реакции на сдавливание подушечки лапы эвтанизировали крыс путем смещения шейных позвонков. Семенники крыс выделяли в раствор Хэнкса (ПанЭко, Россия) с 5% антибиотиком пенициллином/стрептомицином (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) или аналогичным, переносили в 100-мм чашки для культивирования, удаляли белочную оболочку и затем промывали раствором Хэнкса 3 раза по 5 мл. Затем семенники переносили в 7-10 мл среды DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) с 2,5 мг/мл трипсина и 10 мкг/мл ДНКазы на 4-10 мин при 34-35 °С, периодически встряхивая. В результате интерстициальные клетки отделяются от семенных канальцев и находятся в суспензии в среде DMEM. Для инактивации ферментов добавляли 15-20 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), осторожно перемешивали, переворачивая пробирку, а затем оставляли на 5-20 мин до оседания канальцев. Жидкую фракцию надосадочной жидкости с интерстициальными клетками переносили в новую пробирку. Процедуру перемешивания канальцев и удаления надосадочной жидкости повторяли 5 раз. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 300×g и ресуспендировали в DMEM:F12 с 1х пенициллином/стрептомицином, 1× Glutamax-I (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 1× пируват (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США), 2% фетальной бычьей сыворотки и 1× инсулин-трансферрин-селен добавки (ITS, ПанЭко, Россия). Затем суспензию клеток Лейдига пропускали через фильтр 100 мкм и разводили в 1 мл среды DMEM. Полученный объём наносили на градиент Перколла и центрифугировали 800g 30 мин и 200g 10 мин. Фракцию Перкола, содержащую клетки Лейдига, отбирали, разводили в объёме среды DMEM, перемешивали и центрифугировали 300 g 10 мин. Супернатант отбирали, а осадок с клетками Лейдига ресуспендировали в необходимом растворе среды культивирования. Клетки Лейдига высаживали в 48-луночные планшеты и помещали в инкубатор с СО₂ при 35 °С.

Изобретение относится к области медицины и фармации и может быть использовано для оценки эффективности in vitro терапевтических агентов, направленных на восстановление ниши стволовой клетки, в том числе для лечения нарушений фертильности, вызванной нарушением функции сперматогенной ткани семенников. Заявлен эффективный способ оценки специфической активности препаратов, стимулирующих регенерацию тканей и направленных на восстановление поврежденных ниш стволовых клеток через управление секреторной активностью клеток, участвующих в формировании ниш. Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка клеточной модели (тест-системы), позволяющей эффективно оценить воздействие тестируемого вещества на восстановление секреторной активности клеток, поддерживающих ниши стволовых клеток. Эффективность определяется использованием модельных клеток, входящих в состав тест-системы и специфичных для поврежденных ниш стволовых клеток, градуировкой тест-системы за счет двукратного измерения специфического секреторного фактора, отражающего секреторную активность модельных клеток, на разных сроках их культивирования с целью получения «шкалы», которая необходима для оценки специфической активности терапевтического агента. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 пр.

1. Тест-система для определения специфической активности терапевтического агента, стимулирующего восстановление сперматогенеза, выяснения клеточных механизмов действия терапевтических агентов или выявления ключевого действующего компонента в составе многокомпонентного терапевтического агента с помощью оценки секреторной активности модельных клеток, включающая модельные клетки, представляющие собой клетки Лейдига, предварительно выделенные и высаженные на поверхность культуральной ёмкости, или замороженные сразу после выделения из ткани, культуральную среду, среду для кондиционирования клеток, поддерживающую жизнеспособность клеток в течение всего срока кондиционирования и не содержащую измеряемых секретируемых факторов в детектируемых количествах, раствор для отмывки клеток, набор для измерения специфического секреторного фактора методом иммуноферментного анализа.

2. Способ оценки секреторной активности клеток с использованием тест-системы по п. 1, характеризующийся тем, что модельные клетки культивируют до достижения количества не менее 120 тыс. на см² культуральной емкости в культуральной среде, взятой в количестве не менее 100 мкл на 25-50 тыс. клеток, отмывают клетки, осуществляют кондиционирование с добавлением терапевтического агента, через 48±24 часов после его добавления измеряют уровень секреции специфического секреторного фактора, при этом используют две контрольные группы клеток, к которым не добавляют исследуемое вещество: первая группа - контроль 1 - это группа модельных клеток, секреторная активность которых оценивается в течение первых 48-72 часов культивирования, вторая - контроль 2 - группа клеток, секреторная активность которых оценивается через 96-120 часов культивирования, если терапевтический агент не изменяет уровень секреции относительно контроля 2, делают вывод об отсутствии эффективности, если терапевтический агент снижает уровень секреции относительно контроля 2, то делают вывод о его ингибирующем воздействии на секрецию, если терапевтический агент увеличивает уровень секреции относительно контроля 2, но не достигает значений контроля 1, то делают вывод о частичном восстановлении секреторной функции, если значение терапевтического агента достигает значений контроля 1, то делают вывод о полном восстановлении секреторной функции, если терапевтический агент приводит к превышению значений контроля 1, то делают вывод о гиперстимулирующей активности.

3. Способ по п. 2, где терапевтический агент разводят в базальной бессывороточной среде.

4. Способ по п. 2, где к клеткам добавляют терапевтический агент, воздействующий на секреторную активность модельных клеток в количестве 100 мкл на 25-50 тыс. клеток.

5. Способ по п. 2, где модельные клетки высаживают в культуральные емкости, способствующие прикреплению и распластыванию клеток и поддержанию их жизнеспособности в питательной среде роста.

6. Способ по п. 5, где в качестве питательной среды роста используют культуральную среду ДМЕМ-Ф12 с 1х антибиотиком, 1х глутамата, 1х пирувата, 2% фетальную бычью сыворотку и 1% ITS.

7. Способ по п. 5, где в качестве культуральных емкостей используют 48-луночные и 96-луночные планшеты.

8. Способ по п. 2, где в качестве среды для кондиционирования используют культуральную среду ДМЕМ с содержанием глюкозы не более 1 г/л без фенолового красного.

9. Способ по п. 8, где наносят 350±50 мкл в 48-луночный и 150±50 мкл в 96-луночный планшет среды для клеток или тестируемого агента.

10. Способ по п. 2, где в качестве модельных клеток используют иммортализованные клетки.

11. Способ по п. 2, где модельные клетки выделяют из семенников животных.

12. Способ по п. 11, где в качестве животных могут быть использованы мыши или крысы, при этом первое измерение уровня секреции клетками специфического секреторного фактора проводят через 48 часов для клеток крыс и через 72 часа для клеток мышей, а второе измерение проводят через 96 часов для клеток крыс и через 120 часов для клеток мышей после начала тестирования.

13. Способ по п. 2, где для оценки секреторной активности клеток Лейдига измеряют тестостерон.

14. Способ по п. 13, где тестостерон измеряют методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора, в состав которого входят стандартные растворы тестостерона, буфер для отмывки, раствор концентрата конъюгата HRP, субстрат TMB, раствор для прекращения реакции, 96-луночный планшет с антителами к тестостерону.

15. Способ по п. 13, где уровень тестостерона через 96-120 часов после выделения клеток Лейдига определяют ниже уровня тестостерона через 48-72 часов после выделения клеток Лейдига не менее чем на 15%.

16. Способ по п. 2, где кондиционирование модельных клеток для накопления секретируемого фактора проводят в течение 24-48 часов.

17. Способ по п. 2, где в качестве буферного раствора для отмывки модельных клеток от компонентов среды роста используют раствор Хэнкса, при этом отмывку клеток осуществляют три-пять раз из расчета 0,1-0,2 мл раствора на см² клеток на 5-10 мин.

18. Способ по п. 2, где проводят измерение концентрации специфического секреторного фактора в кондиционированной среде модельных клеток.

19. Способ по п. 2, где для получения кондиционированной среды удаляют клеточный дебрис методом центрифугирования при 200-300 g 5-10 минут и собирают полученный супернатант для дальнейшего анализа специфического секреторного фактора.

20. Способ по п. 2, где в качестве терапевтических агентов могут быть использованы как препараты с одним действующим веществом, так и многокомпонентные препараты.