Средства и способы расщепления зеараленона Российский патент 2024 года по МПК C12N15/11 C12N9/14 A23K10/00 A23L33/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[001] Настоящее изобретение относится к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы. Кроме того, настоящее изобретение относится к α/β-гидролазе, получаемой способом согласно настоящему изобретению. Также предложены α/β-гидролазы, имеющие уменьшенное общее среднее значение гидропатии (GRAVY) и/или содержащие специфические мутации. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению α/β-гидролазы согласно настоящему изобретению для деградации зеараленона (ZEN).

ОПИСАНИЕ

[002] Микотоксины представляют собой вторичные метаболиты, продуцируемые мицелиальными грибами. Важным представителем микотоксинов является зеараленон (ZEN), который ранее был известен как токсин F-2, который продуцируется различными грибами Fusarium и встречается во всем мире. Эти грибы поражают культурные растения, среди прочего, такие как различные виды зерновых, при этом заражение грибами обычно происходит до сбора урожая, когда рост грибов и/или выработка микотоксинов может происходить до хранения или даже после сбора урожая, либо перед хранением, либо при ненадлежащих условиях хранения. По оценкам Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО), 25% сельскохозяйственных продуктов во всем мире загрязнены микотоксинами, что приводит к значительным экономическим потерям. В рамках международного исследования длительностью 8 лет, с января 2004 г. по декабрь 2011 г. было проанализировано 19757 образцов; 72% из них продемонстрировали положительный результат в отношении по меньшей мере одного микотоксина, 39% оказались контаминированными несколькими микотоксинами, и 37% продемонстрировали положительный результат на наличие ZEN (Schatzmayr and Streit (2013) ‘Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: Facts and figures.’ World Mycotoxin Journal 6(3):213-222). ZEN был обнаружен во всех регионах мира и во всех протестированных типах зерновых и кормовых культур, таких как кукуруза, соевая мука, пшеница, пшеничные отруби, DDGS (сухая дробина с растворимыми веществами), а также в готовых кормовых смесях для животных с встречаемостью до 100%.

[003] ZEN связывается с рецептором эстрогена и может вызывать гормональные нарушения, абсорбируется сразу после перорального употребления и превращается млекопитающими в два стереоизомерных метаболита - α-зеараленол (α-ZEL) и/или β-зеараленол (β-ZEL). Например, α-ZEL, а также α-зеараланол (α-ZAL) и/или зеараланон (ZAN) обладают гораздо более сильным эстрогенным действием, чем ZEN. Несмотря на то, что конъюгированные производные ZEN обладают более низкой эстрогенной активностью, чем ZEN сам по себе, ZEN может снова высвобождаться из этих конъюгированных производных ZEN в пищеварительном тракте и тем самым восстанавливать свою полную эстрогенную активность.

[004] ZEN имеет LD50 при пероральном употреблении до 20000 мг/кг массы тела, подострые и/или субхронические токсические эффекты, такие как тератогенный, канцерогенный, эстрогенный и иммунодепрессивный эффекты, могут возникать у животных или людей при длительном воздействии. Корм, контаминированный ZEN, приводит к нарушениям развития у животных, представляющих собой млекопитающих. Свиньи и особенно поросята чрезвычайно чувствительны к ZEN. Концентрации ZEN более 0,5 ppm в корме вызывают нарушения развития, и концентрации более 1,5 ppm могут вызывать гиперэстрогению у свиней. У крупного рогатого скота концентрация ZEN, составляющая 12 ppm, может вызвать самопроизвольное прерывание беременности.

[005] Поскольку ZEN быстро всасывается через слизистые оболочки, в частности через слизистую оболочку желудка, а также слизистую оболочку полости рта, немедленная и количественная дезактивация имеет важное значение. Уже через 30 минут после перорального употребления ZEN можно обнаружить в кровотоке. Вследствие вредного воздействия ZEN, Европейский Союз установил обязательные верхние пределы для ZEN в пищевых продуктах, а также рекомендации по верхним пределам для ZEN в продуктах питания для животных (EC № 1881/2006).

[006] Основная стратегия снижения загрязнения ZEN пищевых продуктов и кормов для животных заключается в ограничении роста грибов, например, путем поддержания «надлежащей сельскохозяйственной практики». Это включает, среди прочего, обеспечение отсутствия заражения семян вредителями и грибами или быстрое удаление сельскохозяйственных отходов с поля. Кроме того, рост грибов в поле можно уменьшить с помощью фунгицидов. После сбора урожая собранный материал следует хранить при остаточной влажности менее 15% и при низкой температуре, чтобы предотвратить рост грибов. Аналогичным образом, материал, зараженный грибковыми инфекциями, должен быть удален перед дальнейшей обработкой. Несмотря на этот длинный список профилактических мер, даже в регионах с самыми высокими стандартами сельского хозяйства, таких как Северная Америка и Центральная Европа, было обнаружено, что до 37% протестированных образцов кукурузы загрязнены ZEN в период с 2004 по 2011 годы (Schatzmayr and Streit (2013)).

[007] Чтобы противодействовать описанным выше проблемам и дефектам, необходимо разработать дополнительные α/β-гидролазы, способные обезвредить ZEN и подходящие для применения в качестве пищевой или кормовой добавки или пищевого продукта или кормового продукта.

[008] Решение согласно настоящему изобретению описано ниже, проиллюстрировано в примерах, проиллюстрировано на фигурах и охарактеризовано в формуле изобретения.

[009] Настоящее изобретение относится к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом указанная α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1), включающему

замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислота (аминокислоты) заменены аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем заменяемая аминокислота, при этом указанный индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением тем самым α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью.

[0010] Кроме того, настоящее изобретение относится к α/β-гидролазе, получаемой способом согласно настоящему изобретению.

[0011] Также предложена α/β-гидролаза, имеющая полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное общее среднее значение гидропатии (GRAVY) по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0012] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6,

где замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, , S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и Q→K и/или

где аминокислота (аминокислоты) заменена на аминокислоту, выбранную из P, R, D, H, G или N, предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R, D, H, G или N, более предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R или N.

[0013] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0014] Кроме того, настоящее изобретение относится к применению α/β-гидролазы согласно настоящему изобретению для деградации ZEN.

[0015] Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей α/β-гидролазу согласно настоящему изобретению, предпочтительно композиция представляет собой пищевую или кормовую добавку или пищевой или кормовой продукт.

[0016] Также настоящее изобретение относится к α/β-гидролазе или композиции согласно настоящему изобретению для применения при лечении или профилактике заболевания.

[0017] Кроме того, настоящее изобретение относится к набору, содержащему α/β-гидролазу или композицию согласно настоящему изобретению.

[0018] На фигурах представлено:

[0019] Фиг. 1 Расположение CAP-доменов, VI-доменов и CAP-петель. Расположение аминокислот CAP-доменов, VI-доменов и CAP-петель в SEQ ID NO: 1-6.

[00220] Фиг. 2A-2G. Различные мутации в VI-домене и/или в CAP-петле и их влияние на значение GRAVY. 2A: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 1 на значение GRAVY для вариантов SEQ ID NO: 1. 2B: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 1 на значение GRAVY для вариантов CAP-доменов SEQ ID NO: 1. 2C: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 1 на значение GRAVY для вариантов VI-доменов SEQ ID NO: 1. 2D: Влияние модификации (модификаций) в CAP-петле в SEQ ID NO: 1 на значение GRAVY для вариантов CAP-петли SEQ ID NO: 1. 2E: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 6 на значение GRAVY для вариантов SEQ ID NO: 6. 2F: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 6 на значение GRAVY для вариантов Vl-доменов SEQ ID NO: 6. 2G: Влияние модификации (модификаций) в VI-домене в SEQ ID NO: 6 на значение GRAVY для вариантов VI-доменов SEQ ID NO: 6.

[0021] Фиг. 3A-3B Увеличение температуры стабильности ZEN-деградирующих полипептидов по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 6 в процентах. 3A: Увеличение температуры стабильности (T(50%)) ZEN-деградирующих полипептидов по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 1 в процентах. 3B: Увеличение температуры стабильности (T(50%)) ZEN-деградирующих полипептидов по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 6 в процентах.

[0022] Фиг. 4 Активность вариантов ZEN-разрушающего полипептида после инкубации при pH 4,0 по сравнению с активностями после инкубации при pH 7,5 (= стабильность pH). Остаточная активность вариантов ZEN-разрушающего полипептида после инкубации при pH 4,0 по сравнению с такими же вариантами полипептида после инкубации при pH 7,5 в процентах. Остаточная активность (стабильность в отношении рН) исходного полипептида SEQ ID NO: 1 составляет 2.5 %.

[0023] Фиг. 5 Выбранные параметры мониторинга реакции на 6500 QTrap для анализов образцов из опыта по кормлению свиней. Анализы образцов из опыта по кормлению свиней проводили с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap. Представлены выбранные параметры мониторинга реакции. Ионы продукта приведены как количественный /качественный показатель.

[0024] Фиг. 6 Результаты анализа образцов мочи из опыта по кормлению свиней по сравнению с SEQ ID NO: 1. Комбинированные количества ZEN плюс α-ZEL в образце мочи каждой группы определяли с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap (среднее на группу; n = 3). Контрольная группа получала ZEN-содержащее питание, но не получала ZEN-разрушающий полипептид. Группы, получающие SEQ ID NO: 1, вариант A и вариант B, кормили тем же питанием, что и контрольную группу, которое дополнительно содержало указанный ZEN-разрушающий полипептид в дозе 2,5 Ед/кг, 5 Ед /кг, 10 Ед /кг или 20 Ед /кг питания. Изменения количества ZEN плюс α-ZEL в моче по сравнению с SEQ ID NO: 1 показаны в процентах.

[0025] Фиг.7. Результаты анализа образцов фекалий из опыта по кормлению свиней по сравнению с SEQ ID NO: 1. Комбинированные концентрации ZEN плюс α-ZEL на г лиофильно высушенных фекалий определяли с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap (среднее на группу; n = 3). Контрольная группа получала ZEN-содержащее питание, но не получала ZEN-разрушающий полипептид. Группы, получающие SEQ ID NO: 1, вариант A и вариант B, кормили тем же питанием, что и контрольную группу, которое дополнительно содержало указанный ZEN-разрушающий полипептид в дозе 2,5 Ед /кг, 5 Ед /кг, 10 Ед /кг или 20 Ед /кг питания. Изменения концентраций ZEN плюс α-ZEL в фекалиях по сравнению с SEQ ID NO: 1 показаны в процентах.

[0026] Фиг. 8 Выбранные параметры мониторинга реакции на 6500 QTrap для анализов образцов из опыта по кормлению бройлеров. Анализы образцов из опыта по кормлению бройлеров проводили с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap. Представлены выбранные параметры мониторинга реакции. Ионы продукта приведены как количественный/качественный показатель.

[0027] Фиг. 9 Результаты анализа образцов зоба из опыта по кормлению бройлеров по сравнению с SEQ ID NO: 1. Концентрации ZEN на кг лиофильно высушенных образцов зоба определяли с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap (среднее на группу; n = 8). Контрольная группа получала ZEN-содержащее питание, но не получала ZEN-разрушающий полипептид. Другие группы получали то же питание, что и контрольная группа, которое дополнительно содержит указанные количества ферментативной активности варианта B ZEN-разрушающего полипептида. Изменения концентраций ZEN в зобе по сравнению с контрольной группой показаны в процентах.

[0028] Неожиданно было обнаружено, что α/β-гидролаза, содержащая описанную в настоящей заявке мутацию в конкретной области, а именно в VI-домене и CAP-петле, проявляет более высокую температурную стабильность и/или стабильность в отношении pH. Не ограничиваясь теорией, полагают, что VI-домен и CAP-петля играют важную роль в активности фермента, например, для входа субстрата в активный центр фермента. Высокая гибкость этой части фермента может положительно сказаться на активности, однако эта гибкость также может отрицательно сказаться на стабильности.

[0029] Авторы настоящего изобретения идентифицировали CAP-домен в SEQ ID NO: 1 как аминокислоты от положения 145 по 218, в SEQ ID NO: 2 от положения 144 до 217, в SEQ ID NO: 3, 4 и 5 от положения 145 до 218 и в SEQ ID NO: 6 от положения 161 до 235. Кроме того, авторы настоящего изобретения идентифицировали VI-домен в SEQ ID NO: 1 от аминокислоты в положении 160 до 205, в SEQ ID NO: 2 от аминокислоты в положении 159 до 204, в SEQ ID NO: 3, 4 и 5 от аминокислоты в положении 160 до 205 и в SEQ ID NO: 6 от аминокислоты в положении 176 до 222. В частности, комбинация моделирования динамики с данными дифракции рентгеновских лучей, например, вариант SEQ ID NO: 1 или 6, полученный путем обработки множества с помощью Phenix (https://www.phenix-online.org/; Burnley and Gros (2012) ‘phenix.ensemble_refinement: a test study of apo and holo BACE1‘Computational crystallography newsletter, volume 4, pp. 51-58), отражает гибкую петлю при генерации 65 структур. Область SEQ ID NO: 1, определенная положениями аминокислот с 185 по 191, определенная в настоящей заявке как CAP-петля, является частью этой гибкой петли (а также эквивалентными положениями в SEQ ID NO: 2-6, как описано в настоящей заявке).

[0030] Описанные в настоящей заявке мутации, введенные в CAP-домен, в частности в VI-домен, как определено в настоящей заявке, или, более конкретно, в CAP-петлю, как определено в настоящей заявке, обеспечивают достаточную температурную стабильность без потери свойств активности и/или стабильности в отношении pH, благодаря чему такие ферменты можно применять в технологических процессах при увеличенных температурах.

[0031] Это особенно важно, поскольку термическая обработка, такая как гранулирование, для производства гигиенически обработанных продуктов с уменьшенной микробной нагрузкой, обычно применяется в пищевой и кормовой промышленности.

[0032] Гранулирование кормов представляет собой особенно широко распространенный стандартизованный процесс для улучшения сыпучести, уменьшения пылеобразования и снижения микробной нагрузки, в частности в отношении сальмонелл. Во время процесса гранулирования сырьё обычно увлажняют с помощью горячего пара, нагревают и затем продавливают через матрицу под давлением. Такая термическая обработка ферментов или полипептидов часто приводит к снижению их ферментативной активности и/или их необратимой денатурации.

[0033] Кроме того, при применении в пище или корме ферменты часто подвергаются инактивации в условиях желудочно-кишечного тракта животных. В частности, среда с низким pH может вызвать временное или постоянное снижение или даже устранение ферментативной активности ферментов или полипептидов.

[0034] Однако ZEN-деградирующие ферменты обычно обладают низкой температурной стабильностью и/или стабильностью в отношении pH и, следовательно, не могут быть добавлены в корма или пищу как таковые. Следовательно, применение полипептидов или ферментов в качестве добавок при гранулировании пищевых продуктов или кормов представляет собой значительную технологическую проблему.

[0035] Описанные в настоящей заявке α/β-гидролазы обладают увеличенной стабильностью, особенно в отношении температурной стабильности и/или в отношении pH, и, таким образом, хорошо подходят для применения в процессах производства пищевых продуктов и кормов.

[0036] Таким образом, настоящее изобретение относится к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1), включающему

осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислоту (аминокислоты) заменяют на аминокислоту, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью, предпочтительно α/β-гидролаза имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой до замены указанной аминокислоты (аминокислот) и/или имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой, не содержащей указанной замены (замен) аминокислоты.

[0037] Настоящее изобретение также относится к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 6), включающему

осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислоту (аминокислоты) заменяют на аминокислоту, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью, предпочтительно α/β-гидролаза имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой до замены указанных аминокислот и/или имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой, не содержащей указанной замены (замен) аминокислоты.

[0038] Увеличенная стабильность в контексте настоящего изобретения может означать, что α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению имеет более высокую стабильность, чем α/β-гидролаза, содержащая последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1 (а также 3, 4, 5). В качестве альтернативы или дополнительно, увеличенная стабильность в контексте настоящего изобретения означает, что α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению имеет более высокую стабильность, чем α/β-гидролаза, содержащая последовательность, соответствующую положениям, и/или включает последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы или дополнительно также предложена α/β-гидролаза, содержащая последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6.

[0039] Увеличенная стабильность в контексте настоящей заявки также может означать, что α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению имеет более высокую стабильность, чем α/β-гидролаза SEQ ID NO: 1. В качестве альтернативы или дополнительно, увеличенная стабильность в контексте настоящей заявки также может означать, что α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению имеет более высокую стабильность, чем α/β-гидролаза SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы или дополнительно, увеличенная стабильность в контексте настоящей заявки также может означать, что α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению имеет более высокую стабильность, чем α/β-гидролаза SEQ ID NO: 6.

[0040] Она включает в себя α/β-гидролазу с увеличенной стабильностью, например, полученная способами согласно настоящему изобретению или α/β-гидролаза по настоящему изобретению имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой, не содержащей замены (замен), как описано в настоящей заявке. Аналогичным образом, α/β-гидролаза с увеличенной стабильностью, например, полученная способами согласно настоящему изобретению или α/β-гидролаза по настоящему изобретению имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой до замены аминокислоты (аминокислот), как описано в настоящей заявке.

[0041] Специалисту в данной области техники известны различные α/β-гидролазы, которые, среди прочего, описаны у Lenfant et al. (2013) ‘ESTHER, the database of the α/β-hydrolase fold superfamily of proteins: tools to explore diversity of functions’ Nucleic Acids Research, Volume 41, Issue D1, D423-D429 и Mindrebo et al. (2016) ‘Unveiling the functional diversity of the Alpha-Beta hydrolase fold in plants’ Curr Opin Struct Biol. 233-246. Вкратце, все α/β-гидролазы имеют свойство специфической укладки, называемой α/β-укладкой (альфа/бета-укладка). Укладка α/β-гидролазы является общей для ряда гидролитических ферментов самого разного филогенетического происхождения и каталитической функции. Ядро каждого фермента представляет собой α/β-структуру (а не цилиндр), содержащую 8-нитей (b1-b8), соединенных α-спиралями (aA-aF) (Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211). Следовательно, описанная в настоящей заявке α/β-гидролаза может содержать α/β-укладку. Описанная в настоящей заявке α/β-гидролаза предпочтительно включает основной домен α/β-гидролазы, состоящий из 8 β-нитей (b1-b8), расположенных на центральном β-листе, и дополнительно включает 6 перекрещивающихся α-спиралей (aA-aF).

[0042] У большинства членов семейства β-нити имеют параллельную ориентацию, но некоторые имеют инверсию первых нитей, что приводит к антипараллельной ориентации. Прототип ферментов в укладке имеет каталитическую триаду, состоящую из нуклеофильного остатка, расположенного на вершине γвитка между пятой β-спиралью и следующей α-спиралью (нуклеофильный изгиб), кислого аминокислотного остатка (глутаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты) и остатка гистидина. У некоторых других членов отсутствует один или все каталитические остатки. Поэтому некоторые члены являются неактивными; некоторые члены участвуют в распознавании поверхности. Описанная в настоящей заявке α/β-гидролаза предпочтительно включает каталитическую триаду.

[0043] Члены различных классов α/β-гидролаз, а также их структурные характеристики, среди прочего, описаны в Kourist et al. (2010) ‘The alpha/beta-hydrolase fold 3DM database (ABHDB) as a tool for protein engineering.’ Chembiochem. 11(12):1635-43).

[0044] В качестве ферментов, α/β-гидролазы часто описывают как ответственные за гидролиз сложноэфирных и пептидных связей. Однако α/β-гидролазы также участвуют в разрыве углерод-углеродных связей, реакциях декарбоксилирования и кофакторнезависимом диоксигенировании гетероароматических колец. Таким образом, α/β-гидролазы могут включать каталитические члены (ферменты) в данном суперсемействе. Неограничивающими примерами являются гидролазы (ацетилхолинэстераза, карбоксилэстераза, диенелактонгидролаза, липаза, кутиназа, тиоэстераза, серинкарбоксипептидаза, пролиниминопептидаза, пролинолигопептидаза, эпоксидгидролаза) вместе с ферментами, которые требуют активации реакции HCN, H₂O₂ или O₂ вместо H₂O для механизма реакции (галогеналкандегалогеназа, галопероксидаза, гидроксинитриллиаза). Некаталитические члены могут включать нейролигины, глутактин, нейротактин, C-концевой домен тиреоглобулина, желточные белки, CCG1-взаимодействующий фактор-B и дипептидиламинопептидазу VI.

[0045] В базе данных ESTHER собрана и прокомментирована опубликованная информация, относящаяся к последовательностям генов и белков данного суперсемейства. Таким образом, специалист в данной области может также получить α/β-гидролазы из ESTHER (http://bioweb.supagro.inra.fr/ESTHER/general?what=index), базы данных суперсемейства белков α/β-гидролаз с укладкой.

[0046] Специалист в данной области техники также может определить, содержит ли α/β-гидролаза CAP-домен. Один из способов, чтобы это осуществить, описан в примерах или как описано ниже:

1. Найти α/β-гидролазу в онлайн-базе данных ферментов или сравнить заданную последовательность с SEQ ID NO: 1-6.

2. Определить, содержит ли α/β-гидролаза CAP-домен, VI-домен или CAP-петлю, предпочтительно с применением методики, описанной в Примере 2.

3. Определить, способна ли α/β-гидролаза, содержащая CAP-домен, VI-домен или CAP-петлю, гидролизовать ZEN, предпочтительно с применением методики, описанной в Примере 4.

[0047] α/β-гидролаза согласно настоящему изобретению включает последовательность, соответствующую положениям от 145 до 218 SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1 (CAP-домен). Таким образом, любая α/β-гидролаза, содержащая эту последовательность, охватывается термином α/β-гидролаза. Данная последовательность соответствует CAP-домену α/β-гидролазы SEQ ID NO: 1.

[0048] Кроме того или в качестве альтернативы α/β-гидролаза согласно настоящей заявке также может содержать последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2 (CAP-домен). Таким образом, любая α/β-гидролаза, содержащая эту последовательность, охватывается термином α/β-гидролаза. Данная последовательность соответствует CAP-домену α/β-гидролазы SEQ ID NO: 2.

[0049] Дополнительно или в качестве альтернативы α/β-гидролаза согласно настоящей заявке также может содержать последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5 (CAP-домен). Таким образом, любая α/β-гидролаза, содержащая эту последовательность, охватывается термином α/β-гидролаза. Данная последовательность соответствует CAP-домену α/β-гидролазы SEQ ID NO: 3, 4 или 5.

[0050] Дополнительно или в качестве альтернативы α/β-гидролаза согласно настоящей заявке также может содержать последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен). Таким образом, любая α/β-гидролаза, содержащая эту последовательность, охватывается термином α/β-гидролаза. Данная последовательность соответствует CAP-домену α/β-гидролазы SEQ ID NO: 6.

[0051] Например, α/β-гидролаза может содержать последовательность, которая имеет по меньшей мере 58 %, 59 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1. Дополнительно или в качестве альтернативы, α/β-гидролаза может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 58 %, 59 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2. Дополнительно или в качестве альтернативы, α/β-гидролаза может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 58 %, 59 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, 4 и/или 5. Дополнительно или в качестве альтернативы, α/β-гидролаза может содержать последовательность, имеющую по меньшей мере 58 %, 59 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6.

[0052] Термин «полипептид» при использовании в настоящей заявке означает пептид, белок или полипептид, которые используются взаимозаменяемо и охватывают аминокислотные цепи заданной длины, в которых аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями. Настоящее изобретение также охватывает аминокислоты, отличные от 20 протеиногенных аминокислот стандартного генетического кода, известного специалисту в данной области, такие как селеноцистеин. Такие полипептиды включают любую из SEQ ID NO. 1-6.

[0053] Термин «полипептид» также относится к модификациям полипептида, и не исключает их. Модификации включают гликозилирование, ацетилирование, ацилирование, фосфорилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозитола, поперечное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование якоря GPI, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, сульфатирование, опосредованное переносом РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование; см., например, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990); 626-646, Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62.

[0054] В соответствии с настоящим изобретением термин «идентичный» или «процент идентичности» в контексте двух или более полипептидных последовательностей, таких как SEQ ID NO: 1-6, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или которые имеют указанный процент одинаковых нуклеотидов (например, идентичны по меньшей на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или в обозначенной области, при определении с применением алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области, или путем выравнивания вручную и визуального контроля. Последовательности, имеющие, например, идентичность последовательностей от 80% до 95% или более, считаются по существу идентичными. Такое определение также применяется к комплементу тестируемой последовательности. Специалисты в данной области техники знают, как определить процент идентичности между последовательностями, используя, например, алгоритмы, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), как известно в данной области техники.

[0055] Также для специалистов в данной области техники доступны алгоритмы BLAST и BLAST 2.6 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). Программа BLASTP для аминокислотных последовательностей использует по умолчанию длину сегмента (W), равную 6, ожидаемый порог, равный 10, и сравнение обеих цепей. Кроме того, можно применять оценочную матрицу BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915; Henikoff and Henikoff (1992) ‘Amino acid substitution matrices from protein blocks.‘ Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9)

[0056] Например, BLAST2.6, что означает инструмент поиска базового локального выравнивания (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), можно применять для поиска локального выравнивания последовательностей.

[0057] «CAP-домен» в настоящей заявке относится к CAP-домену α/β-гидролаз, который, например, описан на Фиг. 1 в Kourist et al. (2010) ‘The alpha/beta-hydrolase fold 3DM database (ABHDB) as a tool for protein engineering.’ Chembiochem. 11(12):1635-43, или в Carr and Ollis (2009) ‘α/β Hydrolase Fold: An Update.’ Protein & Peptide Letters, 2009, 16(10):1137-1148. Также можно предположить, что CAP-домен может быть расположен в пределах разницы между β-листом и α-спиралью, например, между b6 и aD α/β-гидролазы, например, как описано Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211. Например, CAP-домен может начинаться вскоре после C-концевого окончания b6 β-цепи основного домена α/β-гидролазы и может охватывать N-концевое начало aD α-спирали корового домена α/β-гидролазы. Предполагается, что CAP-домен может содержать α-спирали. Однако CAP-домен может также включать β-листы или другие белковые структуры.

[0058] Способ согласно настоящему изобретению включает замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6 α/β-гидролазы. Все эти положения расположены внутри Vl-домена.

[0059] В контексте настоящей заявки «VI-домен» является частью CAP-домена. Таким образом, CAP-домен включает Vl-домен. Этот VI-домен может начинаться с первой аминокислоты после мотива QXAGP (SEQ ID NO: 7), присутствующего в CAP-домене, и может охватывать до последней аминокислоты перед мотивом EYDPE (SEQ ID NO: 8), тогда как мотив EYDPE не является частью VI-домена. Эти мотивы подчеркнуты в последовательностях, представленных в Таблице 2 настоящей заявки.

[0060] Например, Vl-домен может содержать последовательность, которая соответствует положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, имеющую по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1. Дополнительно или в качестве альтернативы, Vl-домен может содержать последовательность, которая соответствует положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2. Дополнительно или в качестве альтернативы, Vl-домен может содержать последовательность, которая соответствует положениям 160-205 в SEQ ID NO: 3, 4 и/или 5, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 160-205 в SEQ ID NO: 3, 4 и/или 5. Дополнительно или в качестве альтернативы, Vl-домен может содержать последовательность, которая соответствует положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6.

[0061] Термин «положение» при использовании в соответствии с настоящим изобретением означает положение аминокислоты в аминокислотной последовательности, раскрытой в настоящей заявке. Используемый в настоящей заявке термин «соответствующий» также включает то, что положение определяется не только числом предшествующих аминокислот. Положение данной аминокислоты в соответствии с настоящим изобретением, которая может быть заменена, может варьироваться из-за делеций или дополнительных аминокислот, или может быть заменено, может варьироваться из-за делеции или добавления аминокислот в другом месте (мутантного или дикого типа) α/β-гидролазы.

[0062] Таким образом, под «соответствующим положением» в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно следует понимать, что аминокислоты могут отличаться в указанном номере, но все же могут иметь сходные соседние аминокислоты. Упомянутые аминокислоты, которые могут быть заменены, удалены или добавлены, также охватываются термином «соответствующее положение». В частности, специалист может при выравнивании эталонной последовательности (субъектной последовательности), например, любой из SEQ ID NO: 1-6, предпочтительно SEQ ID NO: 1, с представляющей интерес аминокислотной последовательностью (запрашиваемой последовательностью), например, проверить представляющую интерес последовательность на наличие последовательности SEQ ID NO: 1 (или соответствующей аминокислотной последовательности, кодирующей этот белок) при поиске положения аминокислоты, как указано в настоящей заявке (т.е. положения, соответствующего положению 185 и/или 188 аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1).

[0063] В способе согласно настоящему изобретению аминокислоту (аминокислоты) заменяют аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла.

[0064] Как описано в настоящей заявке, «аминокислотная замена/замена аминокислоты» означает замену аминокислоты относительно соответствующего положения идентифицированной SEQ ID NO, например, любого из указанных в настоящей заявке положений SEQ ID NO: 1-6. Например, в одном варианте реализации замена представляет собой аминокислотную замену аминокислоты относительно положения, соответствующего положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1.

[0065] «Индекс гидропатии», также называемый в настоящей заявке «значением гидропатии», представляет собой число, представляющее гидрофобные или гидрофильные свойства боковой цепи аминокислоты. В частности, с помощью индекса гидропатии каждой аминокислоте присвоено значение, отражающее ее относительную гидропатию. Таким образом, гидропатия аминокислоты может быть определена по индексу гидропатии. Этот индекс гидропатии аминокислоты был предложен Джеком Кайтом и Расселом Ф. Дулитлом (Kyte and Doolittle (1983) "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol. 157 (1): 105-32). Аминокислоты с наименьшим отрицательным индексом гидропатии представляют собой изолейцин (4,5) и валин (4,2). Согласно Кайту и Дулитлу, аминокислотами с наибольшим отрицательным индексом гидропатии являются аргинин (-4,5) и лизин (-3,9). Считается, что индекс гидропатии играет важную роль в структуре белка. Аминокислоты с менее отрицательным индексом гидропатии, как правило, являются внутренними (в отношении трехмерной формы белка), в то время как аминокислоты с более отрицательным индексом гидропатии чаще встречаются на поверхности белка. Индекс гидропатии Кайта и Дулитла приведен в Таблице 1:

aк aк Индекс гидропатии (Кайта и Дулитла) R Аргинин -4,50 K Лизин -3,90 N Аспарагин -3,50 Q Глутамин -3,50 D Аспарагиновая кислота -3,50 E Глутаминовая кислота -3,50 H Гистидин -3,20 P Пролин -1,60 Y Тирозин -1,30 W Триптофан -0,90 S Серин -0,80 T Треонин -0,70 G Глицин -0,40 A Аланин 1,80 M Метионин 1,90 C Цистеин 2,50 F Фенилаланин 2,80 L Лейцин 3,80 V Валин 4,20 I Изолейцин 4,50

Таблица 1: Индекс гидропатии Кайта и Дулитла

[0066] Кроме того, предполагается, что заменены по меньшей мере одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или более аминокислот.

[0067] Способ также предусматривает замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, и/или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 и/или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5 и/или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6.

Все данные положения расположены внутри CAP-петли.

[0068] В этом контексте следует отметить, что CAP-домен и Vl-домен могут дополнительно содержать петлю (последовательность/домен). Эта «петля», также называемая в настоящей заявке как «CAP-петля», может начинаться после первой аминокислоты после мотива G(F/Y)XXAA (SEQ ID NO: 9), присутствующего в VI-домене, и может охватывать до последней аминокислоты перед мотивом ARXF (SEQ ID NO: 10) (или мотивом QLFP (SEQ ID NO: 11) для SEQ ID NO: 6), тогда как мотив ARXF (или мотив QLFP для SEQ ID NO: 6) не является частью CAP-петли. Все данные мотивы подчеркнуты в Таблице 2 ниже.

[0069] Например, CAP-петля может содержать последовательность, которая соответствует положениям 185-191 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, имеющая по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 185-191 в SEQ ID NO: 1. Дополнительно или в качестве альтернативы, CAP-петля может содержать последовательность, которая соответствует положениям 184-190 в SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 184-190 в SEQ ID NO: 2. Дополнительно или в качестве альтернативы, CAP-петля может содержать последовательность, которая соответствует положениям 185-191 в SEQ ID NO: 3, 4 и/или 5, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 185-191 в SEQ ID NO: 3, 4 и/или 5. Дополнительно или в качестве альтернативы, CAP-петля может содержать последовательность, которая соответствует положениям 201-208 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 58%, 59%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% идентичности с последовательностью, которая соответствует положениям 201-208 в SEQ ID NO: 6.

[0070] Таким образом, описанные в настоящей заявке α/β-гидролазы могут содержать Vl-домен и/или CAP-петлю, как описано в настоящей заявке.

[0071] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L или V.

[0072] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T или G.

[0073] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H или P.

[0074] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из R, K, D, Q, D, N, E, P, G, T, S или H.

[0075] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из S, P, R, D, H, G или N. Аминокислота(ы) также может быть заменена аминокислотой, выбранной из R, D, H, G или N.

[0076] Также предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из P, S, R или H. Аминокислота(ы) также может быть заменена аминокислотой, выбранной из R или N.

[0077] Кроме того, предполагается, что замена аминокислоты выбрана из одной или более из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N, Q→K, F→Y и/или V→C.

[0078] Замена аминокислоты также может быть выбрана из одной или более из V160A, G185R, G185S, A186P, A186R, A188D, A188H, A188N, A188G, A188R, S189D, P190H, M191D, G199E, I200A, I200V, H203N, Q205K, F183Y и/или V197C.

[0079] Также предполагается, что замена аминокислоты выбрана из одной или более из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и/или Q→K. Замена аминокислоты также может быть выбрана из одной или более из V160A, G185R, G185S, A186P, A186R, A188D, A188H, A188N, A188G, A188R, S189D, P190H, M191D, G199E, I200A, I200V, H203N и/или Q205K.

[0080] Замена аминокислоты также может быть выбрана из G185R, A186R, A188R, A188D, A188H, A188N и/или M191D.

[0081] Кроме того, предполагается, что аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из R, D, H, G, N или P.

[0082] Также предполагается, что способ согласно настоящему изобретению включает замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, и/или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 и/или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5 и/или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6.

и при этом аминокислота (ы) замещена аминокислотой, выбранной из R, D, H, G, N или P.

[0083] Настоящее изобретение относится к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы. Увеличение стабильности может представлять собой уменьшение значения GRAVY, увеличение стабильности в отношении pH и/или увеличение температурной стабильности.

[0084] В контексте настоящей заявки «значение GRAVY» белка является мерой его относительной гидрофобности или гидрофильности. Эти два показателя объединены в шкале гидропатии или индекс гидропатии. Согласно Кайту и Дулитлу (Kyte J, Doolittle RF (May 1983). "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol. 157 (1): 105-32), значение GRAVY рассчитывают путем сложения значения гидропатии (индекса гидропатии, см. Таблицу 1 выше) для каждого остатка, и деления на количество остатков в последовательности. Таким образом, значение GRAVY может быть рассчитано как сумма значений гидропатии (индексов) всех аминокислот, деленная на количество аминокислотных остатков в последовательности (в соответствии с расчетами Кайта и Дулитла). В настоящей заявке термин «температурная стабильность» относится к свойству ферментов сохранять свою каталитическую активность после временного воздействия увеличенных температур. Температурную стабильность определяют путем измерения и сравнения ферментативной активности раствора фермента или полипептида до и после 10-минутной термообработки или без термообработки в идентичных определенных условиях.

[0085] В частности, температурную стабильность можно измерить следующим образом. Полипептиды разбавляют буфером для образцов (буфер Teorell Stenhagen с pH 7,5 (Stenhagen & Teorell. (1938) Nature 141, 415), содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) до концентрации 0,001526923 Ед/мл, и хранят на льду до дальнейшего применения. Сорок аликвот по 50 мкл разбавленного раствора полипептида переносят в пробирки в четыре 12-пробирочных стрипа (например, от starlab), пропуская первую и последнюю пробирки каждого стрипа. Стрипы закрывают колпачками для 12-пробирочных стрипов (например, от starlab). В качестве положительного контроля четыре аликвоты по 50 мкл разбавленного раствора фермента переносят в четыре пробирки для ПЦР. Все пробирки и стрипы для ПЦР держат на льду до начала стадии температурной инкубации. В качестве отрицательного контроля четыре аликвоты по 50 мкл буфера для образца переносят в четыре пробирки для ПЦР. Эти пробирки хранят при 25°C.

[0086] Четыре 12-пробирочных стрипа инкубируют в предварительно нагретом ПЦР-термоциклере с функцией градиента (например, Eppendorf Mastercycler gradient) при выбранной температуре +/- 10°C. Температурный градиент (+/- 10°C от выбранной температуры) в термоблоке ПЦР-термоциклера рассчитывается автоматически ПЦР-термоциклером. Пробирки для ПЦР, содержащие положительные контроли, инкубируют на льду, а содержащие отрицательные контроли, инкубируют при 25°C. Через 0, 5, 10 и 20 минут один стрип для ПЦР и одну пробирку с отрицательным контролем переносят на лед до конца инкубации, то есть через 20 минут после начала инкубации. После завершения всех стадий инкубации, и когда все стрипы и пробирки находятся на льду, начинают анализы деградации ZEN.

[0087] Готовят буфер для анализа деградации ZEN (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5,3 ppm ZEN), и аликвоты 660 мкл буфера для анализа переносят в 48 реакционных пробирок. Пробирки герметично закрывают и выдерживают при температуре 25°C до начала анализа деградации ZEN. Для анализов деградации 40 мкл каждого из 40 образцов, подвергнутых температурной обработке, из стрипов для ПЦР, 40 мкл каждого из четырех отрицательных контролей и 40 мкл каждого из четырех положительных контролей добавляют в пробирки, содержащие 660 мкл буфера для анализа, тем самым достигая конечной концентрации ZEN 5 ppm в реакционной смеси для анализа. Кроме того, таким образом достигают конечной концентрации полипептидов для эффективного деградации ZEN (то есть 90% -100% деградации ZEN) в течение трех часов.

[0088] Путем добавления в буфер для анализа образцов, подвергнутых температурной обработке, положительного или отрицательного контроля, начинают анализ деградации. Реакционную смесь для деградации ZEN инкубируют на предварительно нагретой водяной бане при 37°C. Сразу после начала реакции деградации смесь перемешивают встряхиванием в течение приблизительно 2 секунд, и образец, соответствующий 0 ч, объемом 100 мкл переносят в новую реакционную пробирку. Дополнительные образцы отбирают из реакционной смеси анализа деградации ZEN через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа. Сразу после отбора образца из реакционной смеси анализа деградации, фермент в этом образце инактивируют нагреванием путем инкубации в течение 10 минут при 99°C. Затем пробирку центрифугируют (2 минуты, 25°C, 14674 xg), и 90 мкл супернатанта переносят во флакон для ВЭЖХ со вставкой. Эти флаконы для ВЭЖХ хранят при 4°C до измерения посредством ВЭЖХ-ДМД, как описано в Примере 4.

[0089] Используя линейное уменьшение концентрации ZEN, как определено анализом ВЭЖХ-ДМД образцов деградации ZEN, активности ферментов рассчитывают в единицах на литр (Ед/л). Одна единица определяется как величина ферментативной активности, которая разлагает один мкмоль ZEN за одну минуту в описанных условиях. Остаточную активность после инкубации при различных температурах в течение 0, 5, 10 и 20 минут рассчитывают следующим образом: Ферментативная активность в образце после температурной обработки, деленная на среднее значение ферментативной активности положительных контролей, умноженная на 100.

[0090] Температурную стабильность (Т(50%)) определяют как температуру, при которой полипептиды имеют 50% остаточную активность после 10 минут инкубации по сравнению с положительным контролем. Следующий пример служит для иллюстрации: Исходный фермент имеет ферментативную активность 50 Ед/мл после 10-минутной инкубации на льду и активность 25 Ед/мл после 10-минутной инкубации при 59,3°C, таким образом, значение T (50%) составляет 59,3°С. Если вариант фермента имеет значение Т(50%), равное 61,0°C, относительное увеличение температурной стабильности (Т(50%)) по сравнению с исходным ферментом составляет 2,9%. Это результат разницы между двумя значениями T (50%) 1,7°C, деленной на значение T (50%) исходного фермента 59,3°C, умноженной на 100.

[0091] Таким образом, температурная стабильность, используемая в настоящей заявке, является мерой устойчивости ферментативной активности к инактивации при временном воздействии температур, выбранных из диапазона от 20°C до 85°C. Температуру, при которой остаточная активность термически обработанного фермента после инкубации в течение 10 минут составляет 50%, можно сравнить с положительным контролем. Увеличение Т(50%) варианта полипептида по сравнению с его исходным полипептидом определяется в настоящей заявке как увеличенная температурная стабильность и может быть в целом обозначена как величина в процентах или абсолютная величина в градусах Цельсия.

[0092] Термин «стабильность в отношении рН» в настоящей заявке относится к свойству полипептидов сохранять свою каталитическую активность после временной инкубации при определенном pH и, таким образом, отражается как остаточная активность полипептида после временной инкубации при определенном pH. Остаточную активность после инкубации при определенном pH определяют путем сравнения ферментативной активности раствора полипептида по разрушению ZEN после 60-минутной инкубации в буферах с разным pH с ферментативной активностью в растворе того же полипептида после 60-минутной инкубации в буфере с pH 7,5. Стабильность в отношении pH представляет собой меру устойчивости ферментов к временному воздействию окружающей среды с определенным pH. Увеличение стабильности в отношении pH определяют как увеличение остаточной активности после инкубации при pH 4,0 (= обработка pH) варианта полипептида по сравнению с остаточной активностью после инкубации при pH 4,0 исходного варианта фермента.

[0093] Стабильность в отношении pH можно измерить следующим образом. Полипептиды, деградирующие ZEN, инкубируют в буферных растворах с разными значениями pH в течение одного часа. Аликвоты, содержащие вариант полипептида, переносят в восемь пробирок для образцов, содержащих буферы для инкубации с восемью различными значениями pH. Буфер для инкубации представляет собой средний буфер для имитации желудочного сока Fed State не содержащий молока и полуконцентрированный (Jantratid et al. (2008) ’Dissolution media simulating conditions in the proximal human gastrointestinal tract: an update.’ Pharm Res. 2008 Jul;25(7):1663-76)). Значения pH буфера для инкубации в восьми пробирках для образцов устанавливали равными 3,5, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 и 6,0. Одну аликвоту варианта полипептида также переносят в одну пробирку, содержащую буфер для образца (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля 100 мкл буфера для образцов инкубируют при 37°C на предварительно нагретой водяной бане в течение одного часа. После инкубации образцы тестировали на их способность разрушать ZEN в аналитическом буферном растворе аналогично тому, как описано в другом месте в настоящей заявке или как описано в примерах (например, в Примере 4). Добавление буфера для анализа деградации ZEN обеспечивает постоянное значение pH 7,5 во всех образцах. Образцы отбирают в ходе реакции анализа деградации ZEN, и концентрации ZEN, гидролизованного зеараленона (HZEN) и декарбоксилированного гидролизованного зеараленона (DHZEN) анализируют с применением определения ВЭЖХ-ДМД, как описано, например, в Примере 4. Активности рассчитывают, например, как описано в Примере 4.

[0094] Увеличение стабильности в отношении pH определяют как увеличение остаточной активности раствора полипептида после инкубации при pH 4,0 по сравнению с остаточной активностью раствора немутантного исходного фермента после такой же обработки. Остаточную активность определяют путем сравнения активности обработанного посредством рН раствора полипептида с активностью того же раствора варианта полипептида после инкубации при pH 7,5. Остаточную активность рассчитывали следующим образом: Ферментативная активность образца, обработанного pH, разделенная на ферментативную активность контроля, инкубированного при pH 7,5, умноженная на 100. Следующий пример служит для иллюстрации: Если ферментативная активность образца полипептида после инкубации при pH 4,0 составляет 0,5 Ед/л, и ферментативная активность полипептида после инкубации при pH 7,5 составляет 2,7 Ед/л, остаточная активность составляет 18,5%. Если измеренная остаточная активность исходного полипептида SEQ ID NO: 1 после инкубации при pH 4,0 составляет 2,5%, увеличение стабильности в отношении pH варианта полипептида по сравнению с исходным полипептидом составляет 7,4 раза.

[0095] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, получаемой описанным в настоящей заявке способом.

[0096] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0097] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0098] Также предполагают, что α/β-гидролаза имеет более низкое значение GRAVY, составляющее по меньшей мере 3,0%, 4,2%, 4,8%, 6,0%, 6,6%, 7,8%, 10,2%, 12,0% или более по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

[0099] Также предполагают, что α/β-гидролаза имеет более низкое значение GRAVY, составляющее по меньшей мере 1,0%, 2,0%, 2,5%, 2,6%, 3,0%, 4,0%, 5,0%, 6,0%, 6,8% или более по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

[00100] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6,

где замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и Q→K и/или

где аминокислота (аминокислоты) заменена аминокислотой, выбранной из P, R, D, H, G или N, предпочтительно аминокислота выбрана из R, D, H, G или N, более предпочтительно аминокислота выбрана из R или N. Такие α/β-гидролазы могут иметь более высокую стабильность, чем та же самая α/β-гидролаза, не имеющая этой замены (замен) или до введения этих замен. Например, такая α/β-гидролаза может иметь более высокую стабильность по сравнению с α/β-гидролазой SEQ ID NO: 1.

[00101] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе, имеющей полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6,

где замена аминокислоты выбрана из F→Y или V→C. Такая α/β-гидролаза может иметь более высокую стабильность, чем та же самая α/β-гидролаза, не имеющая этой замены (замен) или до введения этих замен. Например, такая α/β-гидролаза может иметь более высокую стабильность по сравнению с α/β-гидролазой SEQ ID NO: 6.

[00102] Предполагают, что α/β-гидролаза, описанная в настоящей заявке, содержит замены аминокислоты

- G→R и A→N, предпочтительно G185R и A188N;

- G→S и A→R, предпочтительно G185S и A188R;

- G→R, A→R, A→H, S→D, P→H и M→D, предпочтительно G185R, A186R, A188H, S189D, P190H и M191D;

- V→A, G→R, A→N, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A188N, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→S, A→R, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185S, A188R, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G199E, I200A, H203N и Q205K,

- V→A, G→R, A→R, A→H, G→E, I→V, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, G199E, I200V, H203N и Q205K, и/или

F→Y и V→C, предпочтительно F183Y и V197C.

[00103] Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим α/β-гидролазу, как описано в настоящей заявке. Нуклеиновая кислота может быть введена или вставлена в вектор экспрессии. Термин «вектор экспрессии» относится к конструкции молекулы нуклеиновой кислоты, которая способна экспрессировать ген in vivo или in vitro. В частности, он может включать конструкции ДНК, подходящие для переноса нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в клетку-хозяина, чтобы она могла быть интегрирована в геном или свободно располагалась во внехромосомном пространстве, и для внутриклеточной экспрессии кодирующей полипептид нуклеотидной последовательности и, необязательно, транспортировать полипептид из клетки.

[00104] Вектор экспрессии, как описано в настоящей заявке, может быть экспрессирован в клетке-хозяине. Термин «клетка-хозяин» относится ко всем клеткам, содержащим либо экспрессируемую нуклеотидную последовательность, либо вектор экспрессии, которые способны продуцировать фермент или полипептид согласно настоящему изобретению. В частности, это относится к прокариотическим и/или эукариотическим клеткам, предпочтительно Pichia pastoris, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Hansenula, Trichoderma, Lactobacillus, Aspergillus, растительным клеткам и/или спорам Bacillus, Trichoderma или Aspergillus. В настоящей заявке название P. pastoris является синонимом названия Komagataella pastoris, P. pastoris является устаревшим, а K. pastoris - систематически более новым названием (Yamada et al. (1995) ‘The Phylogenetic Relationships of Methanol-assimilating Yeasts Based on the Partial Sequences of 18S and 26S Ribosomal RNAs: The Proposal of Komagataella Gen. Nov. (Saccharomycetaceae)’ Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Vol. 59, issue 3, pp. 439-444). Примечательно, что виды Komagataella pastoris недавно были повторно определены как Komagataella phaffii (Kurtzman (2009) “Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis.” J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11):1435-8). Komagataella phaffii в настоящей заявке может, например, относиться к штаммам Komagataella phaffii CBS 7435, Komagataella phaffii GS115 или Komagataella phaffii JC308.

[00105] Настоящее изобретение также относится к применению описанной в настоящей заявке α/β-гидролазы для деградации зеараленона (ZEN).

[00106] ZEN представляет собой нестероидный эстрогенный макроциклический лактон со следующей структурной формулой, синтезируемый посредством метаболического пути поликетидов:

и его название в соответствии с номенклатурой ИЮПАК представляет собой: (2E,11S)-15,17-дигидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-7,13-дион.

[00107] Однако различные производные ZEN также встречаются в природе и могут быть образованы ферментативными или химическими модификациями ZEN. Примеры включают гликозидные конъюгаты ZEN или конъюгаты, содержащие сульфат, образованные при метаболизме грибов, растений или млекопитающих, а также метаболиты ZEN, образованные в организме человека или животных, среди прочего. Под производными ZEN ниже понимаются конъюгаты ZEN или метаболиты ZEN, которые встречаются в природе или синтезируются путем химического или биохимического синтеза, но, в частности, α-зеараленол (α-ZEL; (2E,7R,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]-октадека-1(18),2,14,16-тетраен-13-он), β-зеараленол (β-ZEL; (2E,7S,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-13-он), α-зеараланол (α-ZAL; (7R,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),14,16-триен-13-он), β-зеараланол (β-ZAL; (7S,11S)-7,15,17-тригидрокси-11-метил-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(14),15,17-триен-13-он), зеараленон 14-сульфат (Z14S; [(2E,11S)-15-гидрокси-11-метил-7,13-диоксо-12-оксабицикло[12.4.0]октадека-1(18),2,14,16-тетраен-17-ил] гидросульфат), зеараленон-14-гликозид (Z14G; (2E,11S)-15-гидрокси-11-метил-17-[(3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)-тетрагидропиран-2-ил]окси-12-оксабицикло[12.4.0]октадека 1(18)2,14,16-тетраен-7,13-дион), а также зеараланон (ZAN; (11S)-15,17-дигидрокси-11-метил-12-оксабицикло-[12.4.0]октадека-1(18),14,16-триен-7,13-дион).

[00108] ZEN, а также производные ZEN, в частности α-ZEL, β-ZEL, Z14S, α-ZAL, β-ZAL, Z14G и ZAN, также могут быть обнаружены в обработанных пищевых продуктах и продуктах питания для животных, таких как хлеб или пиво, из-за их высокой химической и физической стабильности.

[00109] Гидролиз производных ZEN и ZEN осуществляют с помощью любого из полипептидов с идентификационными номерами от 1 до 6. Считается, что гидролиз ZEN или его производных происходит по сложноэфирной группе в соответствии со следующим механизмом реакции:

Гидролиз ZEN с образованием нетоксичного гидролизованного зеараленона (HZEN) и/или гидролизованных производных ZEN может происходить с помощью α/β-гидролаз согласно настоящему изобретению. Дальнейшее декарбоксилирование HZEN до декарбоксилированного гидролизованного ZEN (DHZEN) и/или декарбоксилированного гидролизованного производного ZEN, как полагают, происходит спонтанно.

[00110] Описанная в настоящей заявке α/β-гидролаза может быть способна и может подходить для деградации ZEN. Например, α/β-гидролаза может подходить для кислороднезависимого и бескофакторного гидролитического расщепления сложноэфирной группы ZEN и/или его производных.

[00111] Разрушение ZEN может быть измерено путем добавления α/β-гидролаз согласно настоящему изобретению к буферу Teorell Stenhagen (pH 7,5) с 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при температуре 37°C. Начальная концентрация субстрата в реакции составляет 15,71 мкМ ZEN. ZEN, HZEN, DHZEN и/или другие производные могут быть обнаружены в образцах, отобранных из реакционной смеси, с применением ВЭЖХ или других способов, хорошо известных специалисту в данной области.

[00112] В частности, деградация ZEN может быть измерена в буфере для образцов (буфер Teorell Stenhagen (Stenhagen & Teorell. (1938) Nature 141, 415), pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при температуре 37°C в течение 3 часов) следующим образом. Полипептид/фермент разбавляют буфером для образцов и хранят на льду до применения. В качестве отрицательного контроля инкубируют буфер для образцов, содержащий 5 мкг/мл ZEN. Для деградации буфер для образцов, содержащий 5 мкг/мл ZEN, смешивают с раствором полипептида/фермента для достижения конечной концентрации фермента, которая деградирует доступный ZEN до степени от 90% до 100% в течение 3 часов. При добавлении полипептида/фермента для деградации начинается реакция. К отрицательному контролю фермент не добавляют. Сразу после начала каждой реакции смесь встряхивают в течение приблизительно 2 секунд, и образец, соответствующий 0 ч, объемом 100 мкл переносят в новую реакционную пробирку. Реакционную смесь инкубируют на предварительно нагретой водяной бане при 37°C, образец инактивируют нагреванием путем инкубации в течение 10 минут при 99°C, центрифугируют (2 минуты, 25°C, 14674 xg), и 90 мкл супернатанта переносят во флакон для ВЭЖХ со вставкой. Образец хранят при 4°C до измерения посредством ВЭЖХ-ДМД. Отбор проб повторяют через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа.

[00113] Концентрации ZEN, HZEN и DHZEN могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ-ДМД, как описано у Vekiru et al. (Vekiru et al. (2016) ‘Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products’ World Mycotoxin Journal 9:353-363). Анализ проводят на ВЭЖХ Agilent серии 1100, оснащенном диодно-матричным детектором (DAD), работающим при 274 нм. Время удерживания аналитов составляет 7,03 мин для ZEN, 5,17 мин для HZEN и 5,95 мин для DHZEN, когда разделение выполняют на колонке Zorbax SB-Aq, 4,6 × 150 мм, 5 мкм (Agilent Technologies) при 35°C с применением растворителя A: 20% метанола в воде + 5 мМ ацетата аммония, и растворителя B: 90% метанола в воде + 5 мМ ацетата аммония, и следующего градиента: 0-0,1 мин, 0% фазы B, 0,1-3 мин линейное увеличение до 90% фазы B, 3-5 мин, линейное увеличение до 100% B, которое продолжается в течение 1,9 мин, затем снижается до 0% фазы B за 0,1 мин. Колонку восстанавливают в течение 2,0 мин перед началом следующего цикла. Скорость потока устанавливают на 0,8 мл /мин, а объем вводимой пробы на 15 мкл.

[00114] Количественное определение основано на калибровке с внешними стандартами ZEN, HZEN и DHZEN. Активность фермента в единицах на литр (Ед/л) рассчитывают по наклону линейного диапазона деградации ZEN, определяемого по графику зависимости концентрации ZEN в образце от момента времени отбора образца. Для определения активности фермента в образце в Ед/л крутизну наклона линейного диапазона на графике, как описано выше, можно рассчитать в мкМ ZEN в час и разделить на 60 для определения мкМ/мин. Путем рассмотрения возможных разбавлений и включения этих подходящих коэффициентов разбавления в расчет, активность фермента в образце может быть определена в Ед/л. Следующий пример служит для иллюстрации: Если крутизна наклона линейного диапазона составляет 10 мкМ/ч, ферментативная активность неразбавленного образца составляет 0,17 Ед/л; рассчитанная как 10/60 =0,17.

[00115] В данном контексте следует отметить, что термин «единица» или «Ед» относится к мере каталитической активности фермента и определяется как количество микромолей (мкмоль) субстрата, то есть зеараленона в данном случае, которые вступают в реакцию или разрушаются в минуту при определенных условиях. Под «активностью» раствора фермента или полипептида определяют ферментативную концентрацию раствора фермента или полипептида, которую указывают в единицах на миллилитр (Ед/мл) или в единицах на литр (Ед/л) раствора.

[00116] Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей α/β-гидролазу, как описано в настоящей заявке. Композиция может представлять собой пищевую или кормовую добавку или пищевой или кормовой продукт.

[00117] Способы получения таких пищевых и/или кормовых композиций известны специалисту в данной области техники, и среди прочего описаны в WO 99/35240.

[00118] Настоящее изобретение также относится к α/β-гидролазе или композиции, как описано в настоящей заявке, для применения при лечении или профилактике заболевания. Заболевание может представлять собой заболевание, влияющее на гормональный баланс, такой как баланс эстрогенов, особенно микотоксикоз, вызванный ZEN.

[00119] Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему α/β гидролазу или композицию, описанную в настоящей заявке.

[00120] Настоящее изобретение дополнительно отличается следующими элементами:

[00121] 1. Способ увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям161-235 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6), при этом способ включает

Осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислоту (аминокислоты) заменяют аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью.

[00122] 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что индекс гидропатии конкретной аминокислоты составляет:

ак ак Индекс гидропатии (Кайта и Дулитла) R Аргинин -4,50 K Лизин -3,90 N Аспарагин -3,50 Q Глутамин -3,50 D Аспарагиновая кислота -3,50 E Глутаминовая кислота -3,50 H Гистидин -3,20 P Пролин -1,60 Y Тирозин -1,30 W Триптофан -0,90 S Серин -0,80 T Треонин -0,70 G Глицин -0,40 A Аланин 1,80 M Метионин 1,90 C Цистеин 2,50 F Фенилаланин 2,80 L Лейцин 3,80 V Валин 4,20 I Изолейцин 4,50

[00123] 3. Способ по пп. 1 или 2, отличающийся тем, что способ включает осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, и/или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 и/или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5 и/или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6.

[00124] 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, K, D, Q, D, N, E, P, G, T, S или H.

[00125] 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L или V.

[00126] 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T или G.

[00127] 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H или P.

[00128] 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из S, P, R, D, H, G или N.

[00129] 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, D, H, G, N или P.

[00130] 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, D, H, G или N.

[00131] 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из P, S, R или H.

[00132] 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R или N.

[00133] 13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из одной или более из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и/или Q→K.

[00134] 14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из одной или более из V160A, G185R, G185S, A186P, A186R, A188D, A188H, A188N, A188G, A188R, S189D, P190H, M191D, G199E, I200A, I200V, H203N и/или Q205K.

[00135] 15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из одной или более из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и/или Q→K.

[00136] 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что замена аминокислоты выбрана из G185R, A186R, A188R, A188D, A188H, A188N и/или M191D.

[00137] 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что увеличенная стабильность представляет собой снижение значения GRAVY, увеличение стабильности в отношении pH и/или увеличение температурной стабильности.

[00138] 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что значение GRAVY рассчитывают как сумма значений гидропатии (индексов) всех аминокислот, деленная на количество аминокислотных остатков в последовательности (в соответствии с расчетами Кайта и Дулитла).

[00139] 19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что значение GRAVY рассчитывают путем деления суммы значений гидропатии (индексов) всех аминокислот в последовательности на общее количество аминокислот в последовательности.

[00140] 20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, D, H, G, N или P.

[00141] 21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ включает осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, и/или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 и/или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5 и/или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6.

и при этом аминокислота(ы) заменяют на аминокислоту, выбранную из R, D, H, G, N или P.

[00142] 22. α/β-Гидролаза, которую получают способом по любому из предыдущих пунктов.

[00143] 23. α/β-гидролаза, при этом α/β-гидролаза включает последовательность, соответствующую положениям от 145 до 218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям161-235 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6),

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

[00144] 24. α/β-гидролаза, имеющая полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет более чем 58% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6,

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

[00145] 25. α/β-гидролаза, имеющая полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям161-235 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6),

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6,

где замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N, Q→K,

F→Y и/или V→C и/или

где аминокислота (аминокислоты) заменена аминокислотой, выбранной из P, R, D, H, G или N, предпочтительно аминокислота выбрана из R, D, H, G или N, более предпочтительно аминокислота выбрана из R или N.

[00146] 26. α/β-гидролаза по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что α/β-гидролаза содержит замены аминокислоты

- G→R и A→N, предпочтительно G185R и A188N;

- G→S и A→R, предпочтительно G185S и A188R;

- G→R, A→R, A→H, S→D, P→H и M→D, предпочтительно G185R, A186R, A188H, S189D, P190H и M191D;

- V→A, G→R, A→N, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A188N, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→S, A→R, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185S, A188R, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→R, A→R, A→H, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, G199E, I200A, H203N и Q205K и/или

- V→A, G→R, A→R, A→H, G→E, I→V, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, G199E, I200V, H203N и Q205K;

- V→A, G→R, A→R, A→H, S→D, P→H, M→D, G→E, I→V, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, S189D, P190H, M191D, G199E, I200V, H203N и Q205K; и/или

- F→Y и V→C, предпочтительно F183Y и V197C.

27. Применение α/β-гидролазы по любому из предшествующих пунктов для деградации зеараленона (ZEN).

[00147] 28. Композиция, содержащая α/β-гидролазу по любому из предшествующих пунктов, предпочтительно композиция представляет собой пищевую или кормовую добавку, или пищевой продукт, или кормовой продукт.

[00148] 29. α/β-гидролаза или композиция по любому из предшествующих пунктов для применения при лечении или профилактике заболевания.

[00149] 30. Набор, содержащий α/β-гидролазу или композицию по любому из предшествующих пунктов.

[00150] 31. Способ увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6 (Vl-домен; на 58% идентичный VI-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6), включающий

замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислота (аминокислоты) заменены аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью.

[00151] 32. Способ увеличения стабильности α/β-гидролазы, отличающийся тем, что α/β-гидролаза содержит последовательность SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, при этом способ включает

замену по меньшей мере одной аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где аминокислота (аминокислоты) заменены аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем замененная аминокислота, где индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла,

с получением α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью.

[00152] 33. α/β-гидролаза, при этом α/β-гидролаза включает последовательность, соответствующую положениям от 160 до 205 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 160-205 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 159-204 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 176-222 в SEQ ID NO: 6 (Vl-домен; на 58% идентичный VI-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6), где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2, или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

[00153] 34. α/β-гидролаза, имеющая полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или содержит последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, и/или последовательность, которая имеет 58% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6 (CAP-домен; на 58% идентичный CAP-домену в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6),

где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2 или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3, 4 или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6,

где замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и Q→ K и/или

где аминокислота (аминокислоты) заменена аминокислотой, выбранной из P, R, D, H, G или N, предпочтительно аминокислота выбрана из R, D, H, G или N, более предпочтительно аминокислота выбрана из R или N.

****

[00154] Следует отметить, что в настоящей заявке неопределенные и определенные артикли единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «реагент» включает один или более таких различных реагентов, а ссылка на «способ» включает ссылку на эквивалентные стадии и способы, известные рядовым специалистам в данной области техники, которые могут быть модифицированы или заменены на способы, описанные в настоящей заявке.

[00155] Если не указано иное, термин «по меньшей мере», предшествующий серии элементов, следует понимать как относящийся к каждому элементу в серии. Специалисты в данной области техники смогут понять или установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, многие эквиваленты конкретных вариантов реализации изобретения, описанных в настоящей заявке. Подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем настоящего изобретения.

[00156] Термин «и/или», где бы он ни использовался в настоящей заявке, включает значение «и», «или» и «все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином».

[00157] Термин «менее» или, в свою очередь, «более чем» не включает конкретное число.

[00158] Например, менее 20 означает меньше указанного числа. Аналогичным образом, больше или более чем означает больше или более указанного числа, например, более 80% означает больше или более указанного числа 80%.

[00159] Во всей настоящей заявке и формуле изобретения, которая следует, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа, стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа, стадии или группы целых чисел или стадий. При использовании в настоящей заявке термин «содержащий» может быть заменен термином «содержащий» или «включающий», а иногда при использовании в настоящей заявке термином «имеющий». При использовании в настоящей заявке термин «состоящий из» исключает любой неуказанный элемент, стадию или ингредиент.

[00160] Термин «включая» означает «включая, но не ограничиваясь». «Включая» и «включая, но не ограничиваясь» являются взаимозаменяемыми.

[00161] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами, материалами, реагентами и веществами и т.д., описанными в настоящей заявке, и как таковое может варьироваться. Терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое определено только формулой изобретения.

[00162] Все публикации, цитируемые по всему тексту настоящей заявки (включая все патенты, заявки на патенты, научные публикации, инструкции и т. д.), как выше, так и ниже, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В настоящей заявке ничего не следует толковать как признание того, что настоящее изобретения не датировано более ранним числом на основании предшествующего изобретения. В той степени, в которой материал, включенный посредством ссылки, противоречит или не согласуется с настоящей заявкой, настоящая заявка заменяет любой такой материал.

[00163] Содержание всех документов и патентных документов, цитируемых в настоящей заявке, полностью включено в качестве ссылки.

[00164] В настоящей заявке применяют следующие последовательности.

SEQ ID NO Последовательность 1 MVTSPALRDVHVPHAYPEQQVDLGEITMNYAEAGDPDRPA
VLLIPEQTGSWWSYEEAMGLLSEHFHVYAVDLRGQGRSSW
TPKRYSLDNFGNDLVRFIALVVKRPVVVAGNSSGGVLAAW
LSAYSMPGQLRGVLCEDPPFFASELVPAHGHSVRQGAGPV
FELFRTYLGDQWSVGDWEGFCRAAGASASPMARSFVADGI
PQHLQEYDPEWARVFYEGTVGLSCPHERMLGQVKTPVLLT
HHMRGIDPETGNLLGALSDEQALRARRLMDSAGVTVDYES
VPDASHMMHQSAPARYVEIFTRWAAALAP 2 MADPAQRDVYVPHAYPEKQADLGEITMNYAEAGEPDMPAV
LLIPEQTGSWWGYEEAMGLLAENFHVYAVDLRGQGRSSWA
PKRYSLDNFGNDLVRFIALVVKRPVIVAGNSSGGVLAAWL
SAYSMPGQVRGALCEDAPFFASELVTTCGHSIRQAAGPMF
ELFRTYLGDQWSVGDWTGYCRAADASSSPMARYFVADEIP
QHMREYDPEWARAFWEGTVALHCPHEQLLTQVKTPVLLTH
HMRDIDPDTGHLVGALSDEQAARARLLMESAGVKVDYASV
PDALHMMHQFDPPRYVEIFTQWAATLAA 3 MVTSPALRDVHVPHAYPEQQVDLGEITMNYAEAGDPGRPA
VLLIPEQTGSWWSYEEAMGLLAEHFHVYAVDLRGQGRSSW
TPKRYSLDNFGNDLVRFIALVVRRPVVVAGNSSGGVLAAW
LSAYSMPGQIRGVLCEDPPFFASELVPAHGHSVRQGAGPV
FELFRTYLGDQWSVGDWEGFRSAADASASPMARSFVADTI
PQHLKEYDPEWARAFYEGTVGLNCPHERMLNRVNTPVLLT
HHMRGTDPETGNLLGALSDEQAAQVRRLMESAGVKVDYES
VPDASHMMHQSDPARYAEILTPWTAALAP 4 MVTSPALRDVHVPHAYPEQQVDLGEITMNYAEAGDPDRPA
VLLIPEQTGSWWSYEEAMGLLAEHFHVYAVDLRGQGRSSW
TPKRYSLDNFGNDLVRFIALVVKRPVVVAGNSSGGVLAAW
LSAYSMPGQLRGVLCEDPPFFASELVPAHGHSVRQGAGPV
FELFRTYLGDQWSVSDWEGFCRAAGASASPMARSFVADGI
PQHLKEYDPEWARAFHEGTVGLNCPHERMLGRVNTPVLLT
HHMRGTDPETGNLLGALSDEQAAQARLLMESAGVRVDYES
VPDASHMMHQSDPARYAEIFTRWAAALAP 5 MVTSPALRDVHVPHAYPEQQVDLGEITMNYAEAGDPGRPA
VLLIPEQTGSWWSYEEAMGLLAEHFHVYAVDLRGQGRSSW
TPKRYSLDNFGNDLVRFMALVVRRPVVVAGNSSGGVLAAW
LSAYSMPGQIRGVLCEDPPFFASELVPAHGHSVRQGAGPV
FELFRTYLGDQWSVGDWEGFRSAAGASASPMARSFVADTI
PQHLKEYDPEWARAFYEGTVGLNCPHERMLNRVNTPVLLT
HHMRGTDPETGNLLGALSDEQAAQARRLMESAGVKVDYES
VPDASHMMHQSDPARYAEILTPWAAALAP 6 MAEEGTRSEAADAATQARQLPDSRNIFVSHRFPERQVDLG
EVVMNFAEAGSPDNPALLLLPEQTGSWWSYEPVMGLLAEN
FHVFAVDIRGQGRSTWTPRRYSLDNFGNDLVRFIALVIKR
PVVVAGNSSGGLLAAWLSAYAMPGQIRAALCEDAPFFASE
LVPAYGHSVLQAAGPAFELYRDFLGDQWSIGDWKGFVEAA
KASPAKAMQLFPTPDEAPQNLKEYDPEWGRAFFEGTVALH
CPHDRMLSQVKTPILITHHARTIDPETGELLGALSDLQAE
HAQDIIRSAGVRVDYQSHPDALHMMHLFDPARYAEILTSW
SATLPAND 7 QXAGP 8 EYDPE 9 G(F/Y)XXAA 10 ARXF 11 QLFP

Таблица 2: Последовательности, применяемые в настоящей заявке. Мотивы, которые могут фланкировать VI-домен, как описано в настоящей заявке, показаны как SEQ ID NO: 7 и 8. Мотивы, которые могут фланкировать CAP-петлю, как описано в настоящей заявке, показаны как SEQ ID NO: 9, 10, 11. «X» в мотиве может представлять собой любую аминокислоту. Вторая аминокислота мотива SEQ ID NO: 9 может представлять собой либо F, либо Y, как указано «(F/Y)». Как VI-домен, так и CAP-петля включены в CAP-домен, который может быть расположен в пределах диапазона между β-листом и α-спиралью, например, между b6 и aD α/β-гидролазы, как описано Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211. VI-домены и CAP-петли показаны подчеркнутыми для SEQ ID NO: 1-6.

[00165] Лучшее понимание настоящего изобретения и его преимуществ будет получено из следующих примеров, предлагаемых только для иллюстративных целей. Примеры никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

[00166] Пример 1: Модификация, клонирование и экспрессия полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, расщепляющие зеараленон

[00167] Замены аминокислоты, вставки или делеции выполняли путем мутаций нуклеотидных последовательностей с помощью ПЦР с применением набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве альтернативы также были синтезированы полные нуклеотидные последовательности (например, GeneArt Gene Synthesis by Thermo Fisher Scientific). Нуклеотидные последовательности, полученные с помощью мутагенеза ПЦР, и последовательности, полученные из GeneArt, интегрировали стандартными способами в векторы экспрессии для экспрессии в E. coli. E. coli BL21 (DE3), трансформировали векторами экспрессии, и нуклеотидные последовательности экспрессировали в этом штамме (J.M. Cregg, Pichia Protocols, second Edition, ISBN-10: 1588294293, 2007; J. Sambrook et al. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor). Для этой задачи также можно применять любую другую подходящую клетку-хозяин. Растворимый клеточный лизат E. coli применяли для определения каталитических свойств вариантов полипептида.

[00168] Пример 2: Определение α/β-гидролаз, которые деградируют ZEN, их CAP-домена, их VI-домена и CAP-петли

[00169] Чтобы определить, является ли аминокислотная последовательность α/β-гидролазой, деградирующей ZEN, представляющую интерес последовательность выравнивали с последовательностью SEQ ID NO: 1 для определения идентичности последовательности. Кроме того, для интересующей последовательности осуществляли прогнозирование топологии и моделирование гомологии. Выравнивание последовательностей выполняли с помощью программы просмотра последовательностей CLC 7.8.1 со следующими параметрами: открытие гэпа 10,0, продление гэпа: 1,0, окончание гэпа: как любое другое, выравнивание: очень точное.

[00170] Прогнозирование топологии и моделирование гомологии выполняли с помощью YASARA Structure 16.7.22 (1993-2016 by Elmar Krieger, Bioinformatics 30,2981-2982) путем моделирования гомологии со следующими параметрами: Итерации PSI-BLAST: 3, PSI-BLAST E-величина: 0,5, Состояние олигомеризации: 4, Шаблоны: 5, с той же последовательностью: 1, выравнивание по шаблону: 5, скорость моделирования: быстро, концевое удлинение: 10, образцы петли: 50, применение PSSP: Да. В отчете о моделировании гомологии YASARA было приведено предсказание топологии с помощью алгоритма предсказания вторичной структуры PSI-Pred (Jones (1999) ‘Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices’ J.Mol.Biol. 292:195-202). Были приведены z-значения для всех созданных моделей гомологии. Сгенерированная модель с лучшим z-значением была взята для структурного анализа и определения структурных особенностей α/β-гидролаз и диапазонов, например, как описано Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211.

[00171] Для идентификации CAP-домена, VI-домена и CAP-петли в новой представляющей интерес последовательности вторичные структуры корового домена α/β-гидролазы должны быть помечены в соответствии с Фиг. 2a в Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211. CAP-домен, VI-домен, а также CAP-петля расположены в пределах диапазона между b6 и aD ZEN-деградирующей α/β-гидролазы. CAP-домен может начинаться вскоре после C-концевого окончания b6 β-цепи основного домена α/β-гидролазы и может охватывать N-концевое начало aD α-спирали корового домена α/β-гидролазы. VI-домен является частью CAP-домена и начинается с первой аминокислоты после мотива QXAGP, присутствующей в CAP-домене, и продолжается до последней аминокислоты перед мотивом EYDPE, тогда как мотив EYDPE не является частью VI-домена. Эта CAP-петля представляет собой часть VI-домена и начинается с первой аминокислоты после мотива G(F/Y)XXAA, присутствующего в VI-домене, и продолжается до последней аминокислоты перед мотивом ARXF (или мотивом QLFP для SEQ ID NO: 6), тогда как мотив ARXF (или мотив QLFP для SEQ ID NO: 6) не является частью CAP-петли. Например, положения CAP-доменов, VI-доменов и CAP-петель были определены, как описано в настоящей заявке для полипептидов SEQ ID NO: 1-6, и показаны на Фиг. 1.

[00172] Пример 3: Определение общего среднего значения гидропатии (GRAVY)

[00173] Общее среднее значение гидропатии (GRAVY) аминокислотной последовательности полипептида определяется суммой значений гидропатии (Кайт и Дулитл, 1982, приведено в настоящей заявке) всех аминокислот, деленной на длину полипептида, которая соответствует общему количеству аминокислот полипептида. Значения GRAVY были рассчитаны для полипептидов и определенных частей полипептидов с использованием программы ProtParam по адресу https://web.expasy.org/protparam (Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607). CAP-домен SEQ ID NO: 1 определяется частью аминокислотных положений с 145 по 218 (включая оба положения), VI-домен SEQ ID NO: 1 определяется как аминокислотная последовательность от положения аминокислот с 160 по 205 (включены оба положения), и САР-петля в SEQ ID NO: 1 определяется частью аминокислотной последовательности от положения аминокислот с 185 до 191 (оба включены). Для всего полипептида SEQ ID NO: 1 рассчитанное значение GRAVY составляет -0,167, для CAP-домена SEQ ID NO: 1 значение GRAVY составляет -0,284, для VI-домена SEQ ID NO: 1 значение GRAVY составляет -0,043, и для CAP-петли в CAP-домене SEQ ID NO: 1 значение GRAVY составляет +0,271. CAP-домен, VI-домен и CAP-петля SEQ ID NO: 6 определяются частями аминокислотных положений 161-235, 176-222, 201-208 соответственно (оба положения указанных диапазонов включены). Для всего полипептида SEQ ID NO: 6 рассчитанное значение GRAVY составляет -0,192, для CAP-домена SEQ ID NO: 6 значение GRAVY составляет -0,388, для VI-домена SEQ ID NO: 6 значение GRAVY составляет -0,468, и для CAP-петли SEQ ID NO: 6 значение GRAVY составляет -0,362.

[00174] Уменьшение значения GRAVY в процентах для всей аминокислотной последовательности полипептида, вызванное по меньшей мере одной мутацией, по отношению ко всей аминокислотной последовательности немутантного/незамещенного полипептида SEQ ID NO: 1 или 6 было рассчитано как разница между двумя значениями GRAVY, деленная на значение GRAVY для немутантного полипептида, умноженная на 100. Для иллюстрации в настоящей заявке показан расчет варианта V160A SEQ ID NO: 1: ((-0,174)-(-0,167)) / (-0,167) x 100 = 4,2 %. Результаты для дополнительных примеров приведены на Фигурах 2A и 2E.

[00175] Уменьшение значения GRAVY в процентах для CAP-домена, вызванное мутациями в пределах CAP-домена, по отношению к последовательности немутантного CAP-домена SEQ ID NO: 1 или 6 было рассчитано как разница между двумя значениями GRAVY, деленная на значение GRAVY для немутантного CAP-домена, умноженная на 100. Для иллюстрации в настоящей заявке показан расчет варианта V160A SEQ ID NO: 1: ((-0,316)-(-0,284)) / (-0,284) x 100 = 11,3 %. Результаты для дополнительных примеров приведены на Фигурах 2B и 2F.

[00176] Уменьшение значения GRAVY в процентах для VI-домена, вызванное мутациями в пределах VI-домена, по отношению к последовательности немутантного VI-домена SEQ ID NO: 1 или 6 было рассчитано как разница между двумя значениями GRAVY, деленная на значение GRAVY для немутантного VI-домена, умноженная на 100. Для иллюстрации в настоящей заявке показан расчет варианта G185R SEQ ID NO: 1: ((-0,133) - (0,043)) / (-0,043) x 100 = 209,3 %. Результаты для дополнительных примеров приведены на Фигурах 2C и 2G.

[00177] Уменьшение значения GRAVY в процентах для CAP-петли, вызванное мутациями в пределах CAP-петли, по отношению к последовательности немутантной CAP-петли SEQ ID NO: 1 или 6 было рассчитано как разница между двумя значениями GRAVY, деленная на значение GRAVY для немутантной CAP-петли, умноженная на 100. Для иллюстрации в настоящей заявке показан расчет варианта G185R SEQ ID NO: 1: ((-0,314) - (+0,271)) / (+0,271) x 100 = -215,9 %. Значение является отрицательным, так как значение GRAVY исходной CAP-петли является положительным. Чтобы упростить представление данных для дальнейших примеров мутаций, процентные значения показаны как положительные значения на Фигуре 2D.

[00178] Пример 4: Определение активности ZEN-деградирующих полипептидов

[00179] Соответствующие гены, кодирующие ZEN-деградирующие полипептиды, клонировали с применением стандартных способов, внутриклеточно экспрессировали в Escherichia coli, и полученные полипептиды были выделяли из E. coli способами, известными специалисту в данной области, например, путем лизиса с применением ячейки Френч-пресса. Определение концентрации белка проводили стандартными способами, например, способом BCA (Pierce BCA Protein Assay KitProd # 23225).

[00180] Определения активности фермента проводили в буфере для образцов (буфер Teorell Stenhagen (Stenhagen & Teorell. (1938) Nature 141, 415), pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина при температуре 37°C в течение 3 часов). Полипептиды разбавляли буфером для образцов и хранили на льду до применения. Исходный раствор ZEN в ацетонитриле с 1500 ppm (масс./об.) разбавляли 1:10 буфером для образцов и хранили при 25°C до дальнейшего разбавления для применения в реакции деградации. Пробу для деградации и один отрицательный контроль готовили в реакционных пробирках. В качестве отрицательного контроля инкубировали буфер для образцов, содержащий 5 мкг/мл ZEN. Для реакции деградации буфер для образцов смешивали с раствором полипептида для достижения конечной концентрации ZEN 5 мкг/мл и конечной концентрации фермента, которая обеспечивала деградацию ZEN от 90% до 100% в течение 3 часов. Реакция начиналась при добавлении полипептида к ZEN-содержащему буферу для образцов. К отрицательному контролю фермент не добавляли. Сразу после начала каждой реакции смесь встряхивали в течение приблизительно 2 секунд, и образец, соответствующий 0 ч, объемом 100 мкл отбирали и переносили в новую реакционную пробирку. Реакционную смесь инкубировали на предварительно нагретой водяной бане при 37°C, образец инактивировали нагреванием путем инкубации в течение 10 минут при 99°C, центрифугировали (2 минуты, 25°C, 14674 xg), и 90 мкл супернатанта переносили во флакон для ВЭЖХ со вставкой. Образец хранили при 4°C до измерения посредством ВЭЖХ-ДМД. Отбор проб повторяли через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа.

Концентрации ZEN, HZEN и DHZEN были проанализированы с помощью ВЭЖХ-ДМД, как описано у Vekiru et al. (Vekiru et al. (2016) ‘Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products’ World Mycotoxin Journal 9:353-363). Анализ проводили на ВЭЖХ Agilent серии 1100, оснащенном ДМД-детектором, работающим при 274 нм. Время удерживания аналитов составляло 7,03 мин для ZEN, 5,17 мин для HZEN и 5,95 мин для DHZEN, когда разделение выполняли на колонке Zorbax SB-Aq, 4,6 × 150 мм, 5 мкм (Agilent Technologies) при 35°C с применением растворителя A: 20% метанола в воде + 5 мМ ацетата аммония, и растворителя B: 90% метанола в воде + 5 мМ ацетата аммония, и следующего градиента: 0-0,1 мин, 0% фазы B, 0,1-3 мин линейное увеличение до 90% фазы B, 3-5 мин, линейное увеличение до 100% B, которое удерживали в течение 1,9 мин, с возвращением до 0% фазы B за 0,1 мин. Колонку восстанавливали в течение 2,0 мин перед началом следующего цикла. Скорость потока устанавливали на 0,8 мл/мин, а объем вводимой пробы на 15 мкл. Количественное определение основано на калибровке с внешними стандартами ZEN, HZEN и DHZEN. Активность фермента в единицах на литр (Ед/л) рассчитывали по крутизне наклона линейного диапазона деградации ZEN, определяемой по графику зависимости концентрации ZEN в образце от момента времени отбора образца. Для определения активности фермента в образце в Ед/л крутизну наклона линейного диапазона на графике, как описано выше, можно рассчитать в мкМ ZEN в час и разделить на 60 для определения мкМ/мин. Путем рассмотрения возможных разбавлений и включения этих подходящих коэффициентов разбавления в расчет, активность фермента в образце может быть определена в Ед/л. Следующий пример служит для иллюстрации: Если крутизна наклона линейного диапазона составляла 10 мкМ/ч, ферментативная активность неразбавленного образца составляла 0,17 Ед/л; рассчитанная как 10/60 = 0,17.

[00181] Пример 5: Температурная стабильность ZEN-деградирующих полипептидов

[00182] Получение и количественное определение ZEN-деградирующих полипептидов проводили, как описано в примерах выше. Для оценки температурной стабильности ZEN-деградирующие ферменты инкубировали в буферном растворе при различных температурах перед тестированием на их способность разрушать ZEN в оптимальных условиях. Образцы отбирали во время тепловой инкубации, и остаточную активность рассчитывали относительно контроля, не подвергавшегося термической обработке.

[00183] Для испытаний температурной стабильности полипептиды разбавляли буфером для образцов (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) до концентрации 0,001526923 Ед/мл и хранили на льду до дальнейшего применения. Сорок аликвот по 50 мкл разбавленного раствора полипептида переносили в пробирки в четыре 12-пробирочных стрипа (например, от starlab), тогда как первую пробирку каждого стрипа и последнюю пробирку каждого стрипа не использовали, но оставляли пустыми. Стрипы закрывали колпачками для 12-пробирочных стрипов (например, от starlab). В качестве положительного контроля четыре аликвоты по 50 мкл разбавленного раствора фермента переносили в четыре пробирки для ПЦР. Все пробирки и стрипы для ПЦР держали на льду до начала стадии температурной инкубации. В качестве отрицательного контроля четыре аликвоты по 50 мкл буфера для образца переносили в четыре пробирки для ПЦР. Эти пробирки хранили при 25°C.

[00184] Четыре 12-пробирочных стрипа инкубировали в предварительно нагретом ПЦР-термоциклере с функцией градиента (например, Eppendorf Mastercycler gradient) при выбранной температуре +/- 10°C. Температурный градиент (+/- 10°C от выбранной температуры) в термоблоке ПЦР-термоциклера рассчитывался автоматически ПЦР-термоциклером. Пробирки для ПЦР, содержащие положительные контроли, инкубировали на льду, а содержащие отрицательные контроли, инкубировали при 25°C. Через 0, 5, 10 и 20 минут один стрип для ПЦР и одну пробирку с отрицательным контролем переносили на лед до конца инкубации, то есть через 20 минут после начала инкубации.

[00185] После завершения всех стадий инкубации, и когда все стрипы и пробирки находились на льду, начинали анализы деградации ZEN.

[00186] Готовили буфер для анализа деградации ZEN (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5,3 ppm ZEN), и аликвоты 660 мкл буфера для анализа переносили в 48 реакционных пробирок. Пробирки герметично закрывали и выдерживали при температуре 25°C до начала анализа деградации ZEN. Для анализов деградации 40 мкл каждого из 40 образцов, подвергнутых температурной обработке, из стрипов для ПЦР, 40 мкл каждого из четырех отрицательных контролей и 40 мкл каждого из четырех положительных контролей добавляли в пробирки, содержащие 660 мкл буфера для анализа, тем самым достигая конечной концентрации ZEN 5 ppm в реакционной смеси для анализа. Кроме того, таким образом достигали конечной концентрации полипептидов для эффективного деградации ZEN (то есть 90% -100% деградации ZEN) в течение трех часов.

[00187] Путем добавления в буфер для анализа образцов, подвергнутых температурной обработке, положительного или отрицательного контроля, начинали анализ деградации. Реакционную смесь для деградации ZEN инкубировали на предварительно нагретой водяной бане при 37°C. Сразу после начала реакции деградации смесь перемешивали встряхиванием в течение приблизительно 2 секунд, и образец, соответствующий 0 ч, объемом 100 мкл переносили в новую реакционную пробирку. Дополнительные образцы отбирали из реакционной смеси анализа деградации ZEN через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа. Сразу после отбора образца из реакционной смеси анализа деградации, фермент в этом образце инактивировали нагреванием путем инкубации в течение 10 минут при 99°C. Затем пробирку центрифугировали (2 минуты, 25°C, 14674 xg), и 90 мкл супернатанта переносили во флакон для ВЭЖХ со вставкой. Эти флаконы для ВЭЖХ хранили при 4°C до измерения посредством ВЭЖХ-ДМД, как описано в Примере 4.

[00188] Используя линейное уменьшение концентрации ZEN, как определено анализом ВЭЖХ-ДМД образцов деградации ZEN, рассчитывали активности ферментов, например, в единицах на литр (Ед/л) или в единицах на миллилитр (Ед/мл). Одну единицу определяли как величину ферментативной активности, которая разлагает один мкмоль ZEN за одну минуту в описанных условиях. Остаточную активность после инкубации при различных температурах в течение 0, 5, 10 и 20 минут рассчитывали следующим образом: Ферментативная активность в образце после температурной обработки, деленная на среднее значение ферментативной активности образцов, отобранных в 0 минут, умноженная на 100.

[00189] Температурную стабильность (Т(50%)) определяли как температуру, при которой полипептиды имеют 50% остаточную активность после 10 минут инкубации по сравнению с положительным контролем.

[00190] Следующий пример служит для иллюстрации: Исходный фермент имеет ферментативную активность 50 Ед/мл после 10-минутной инкубации на льду и активность 25 Ед/мл после 10-минутной инкубации при 59,3°C, значение T (50%) составляет 59,3°С. Если вариант фермента имеет значение Т(50%), равное 61,0°C, относительное увеличение температурной стабильности (Т(50%)) по сравнению с исходным ферментом составляет 2,9%. Это результат разницы между двумя значениями T(50%) 1,7°C, деленными на значение T (50%) исходного фермента 59,3°C, умноженное на 100.

[00191] Отдельные мутации, а также комбинация мутаций показывают увеличение температурной стабильности, как продемонстрировано на Фигурах 3A и 3B.

[00192] Пример 6: pH-стабильность полипептидов, деградирующих токсин ZEN

[00193] Полипептиды, деградирующие ZEN, инкубировали в буферном растворе с различными значениями pH в течение одного часа перед тестированием на их способность разлагать ZEN в оптимальных условиях. Регулярно отбирали пробы и анализировали концентрации ZEN, HZEN и DHZEN путем измерения с помощью ВЭЖХ-ДМД.

[00194] Значения pH, используемые для эксперимента, составляли pH 3,5, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 и 6,0. Тестируемый полипептид переносили в восемь пробирок для образцов, содержащих буфер для инкубации с восемью различными значениями pH. Буфер для инкубации представлял собой средний буфер для имитации желудочного сока Fed State не содержащий молока и полуконцентрированный (Jantratid et al. (2008) ’Dissolution media simulating conditions in the proximal human gastrointestinal tract: an update.’ Pharm Res. 2008 Jul;25(7):1663-76)), с установленным каждым значением рН 3,5, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0 и 6,0. Одну аликвоту варианта полипептида также переносили в одну пробирку, содержащую буфер для образца (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) в качестве положительного контроля. Концентрация исследуемого полипептида в инкубационном растворе составляла 0,001526923 Ед/мл в объеме 100 мкл. Пробирки встряхивали в течение приблизительно 2 секунд и инкубировали при 37°C на предварительно нагретой водяной бане в течение одного часа. В качестве отрицательного контроля 100 мкл буфера для образцов инкубировали при 37°C на предварительно нагретой водяной бане в течение одного часа. После инкубации в течение одного часа проводили анализы деградации ZEN с конечной концентрацией тестируемого полипептида 8,72527E-05 Ед/мл. Для начала реакции деградации ZEN 40 мкл инкубированных образцов переносили в 660 мкл буфера для анализа (буфер Teorell Stenhagen, pH 7,5, содержащий 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5,3 ppm ZEN). Добавление буфера для анализа обеспечивало постоянное значение pH 7,5 во всех образцах. Сразу после начала каждой реакции смесь встряхивали в течение приблизительно 2 секунд, и образец, соответствующий 0 ч, объемом 100 мкл отбирали и переносили в новую реакционную пробирку. Реакционную смесь инкубировали на предварительно нагретой водяной бане при 37°C, образцы, отобранные из реакционной смеси, инактивировали нагреванием путем инкубации в течение 10 минут при 99°C, центрифугировали (2 минуты, 25°C, 14674 xg), и 90 мкл супернатанта переносили во флакон для ВЭЖХ со вставкой. Образец хранили при 4°C до измерения посредством ВЭЖХ-ДМД. Образцы отбирали из каждой реакционной смеси анализа деградации через 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 часа. ZEN, HZEN и DHZEN анализировали с помощью ВЭЖХ-ДМД, как описано в Примере 4, и рассчитывали активности, как описано в Примере 4.

[00195] Увеличение стабильности в отношении pH определяли как увеличение остаточной активности раствора полипептида после инкубации при pH 4,0 по сравнению с остаточной активностью раствора немутантного исходного фермента после такой же обработки. Остаточную активность определяли путем сравнения активности обработанного посредством рН раствора полипептида с активностью того же раствора варианта полипептида после инкубации при pH 7,5. Остаточную активность рассчитывали следующим образом: Ферментативная активность образца, обработанного pH, разделенная на ферментативную активность контроля, инкубированного при pH 7,5, умноженная на 100. Следующий пример служит для иллюстрации: Если ферментативная активность образца полипептида после инкубации при pH 4,0 составляла 0,5 Ед/л, и ферментативная активность того же образца полипептида после инкубации при pH 7,5 составляла 2,7 Ед/л, остаточная активность данного образца полипептида составляет 18,5%. К тому же, если измеренная остаточная активность варианта полипептида после инкубации при рН 4,0 составляла 18,5%, и остаточная активность исходного полипептида SEQ ID NO: 1 после инкубации при pH 4,0 составляла 2,5%, увеличение стабильности в отношении pH варианта полипептида по сравнению с исходным полипептидом составляет 7,4 раза. Данные о увеличении стабильности pH при введении описанных в настоящей заявке мутаций показаны на Фиг. 4.

[00196] Пример 7: Тестирование вариантов полипептида для детоксикации ZEN у свиней

[00197] Всего было отобрано 12 поросят-отъемышей (самки; возраст 38-40 дней), которые были рандомизированы в соответствии с условиями испытания с применением 12 индивидуальных клеток по 1 поросенку в каждой (4 группы по 3 клетки/повтор в каждой). Три тестируемые группы получали ферменты, деградирующие ZEN, и одна контрольная группа не получала никаких ферментов, деградирующих ZEN. Все поросята представляли собой поросят австрийского генотипа Ö-HYB-F1 [(Ландрас x Большой белый) x Пьетрен]. Все клетки были оборудованы решетчатым полом, индивидуальными поилками и индивидуальными кормушками. Климатические условия находились под управлением компьютера, регулировались автоматически в соответствии со стандартными рекомендациями для поросят-отъемышей и регистрировались ежедневно.

[00198] После размещения все поросята получали питание, содержащее в процентах (масс./масс.): 29,70% ячменя, 10,00% пшеницы, 9,98% кукурузы, 0,27% рапсового масла, 15,30% полножирной сои, 10,94% кукурузы, приготовленной под давлением, 5,00% картофельного белка, 5,13% декстрозы, 3,75% пальмоядрового, кокосового жира, 3,75% лактозы, 1,35% лигноцеллюлозы, 1,23% монофосфата кальция, 0,93% карбоната кальция, 0,48% хлорида натрия, 0,25% фосфата магния, 0,42% премикса витаминов/микроэлементов, 0,70% L-лизина, 0,30% L-треонина, 0,27% DL-метионина, 0,15% L-валина, 0,07% L-триптофана и 0,02% подсластителя.

[00199] В течение экспериментального периода в питание всех групп добавляли ZEN до конечной концентрации 500 мкг ZEN/кг рациона. Для тестируемых групп применяли исходный полипептид SEQ ID NO: 1 и два варианта полипептида. Полипептиды тестировали в следующих концентрациях: 2,5 Ед/кг питания, 5 Ед/кг питания, 10 Ед/кг питания и 20 Ед/кг питания. После фазы адаптации, длившейся 3 дня, применение полипептидов начинали в концентрации 2,5 Ед/кг питания в течение одного дня с последующим днем вымывания без полипептида и без ZEN в питания. После дня вымывания неконтрольные поросята получали ZEN-содержащее питание с тем же полипептидом в концентрации 5 Кд/кг питания с последующим днем вымывания и так далее. Во время испытания мочу собирали в течение 12 часов, а образцы кала брали один раз в день. Образцы хранили при -20°C до измерения посредством ЖХ-МС/МС.

[00200] Для нормализации выделяемого объема мочи измеряли концентрацию креатинина в образцах мочи. Для определения содержания креатинина образцы мочи разбавляли водой 1:5000. Образцы мочи разбавляли водой до конечной концентрации креатинина 2,5 мМ. 100 мкл разбавленного образца мочи смешивали с 20 мкл 100 мМ буфера PBS, содержащего 528 Ед бета-глюкуронидазы, и инкубировали при 37°C в течение ночи. После инкубации в течение ночи добавляли 380 мкл холодного метанола, центрифугировали при 14674 xg, супернатанты переносили во флаконы для ВЭЖХ и хранили при -20°C до анализа. Для анализа образцов фекалий 500 мг лиофилизированных фекалий экстрагировали три раза (90, 30 и 30 минут) с применением 5 мл ацетонитрила/воды (50/50, об./об.) каждый. После каждой стадии экстракции образцы осветляли центрифугированием (10 мин, 14674 xg). Аликвоты объединенных супернатантов центрифугировали, и измерение проводили с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Анализы проводили с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 QTrap. Температуру колонки устанавливали 30°C, и скорость потока - 0,25 мл/мин. Подвижные фазы A и B состояли из воды/уксусной кислоты и ацетонитрила/уксусной кислоты (обе 99,9/0,1, об./об.), соответственно. Градиент начинали с 5% B в течение 0,5 мин и продолжали с линейным увеличением до 36% B до 17,0 мин и линейным увеличением до 100% B от 17,0 до 22,0 мин, затем 100% B до 24,0 мин и резко снижали до 5% B от 24,0 до 24,1 мин. Наконец, колонку повторно уравновешивали 5% B до 27,0 мин. Объем ввода составлял 2 мкл для образцов мочи и 3 мкл для образцов кала. Разделение проводили на колонке Phenomenex Kinetex C18 (150x2,1 мм, 2,6 мкм). Количественное определение основано на калибровке с внешними стандартами ZEN, α-ZEL, HZEN и DHZEN. α-ZEL является метаболитом ZEN с более высокой эстрогенной активностью и вырабатывается у свиней путем биотрансформации в печени (Malekinejad et al. (2006) ‘Hydroxysteroid dehydrogenases in bovine and porcine granulosa cells convert zearalenone into its hydroxylated metabolites alpha-zearalenol and beta-zearalenol. Vet Res Commun:445-53). Выбранные параметры мониторинга реакции (SRM) показаны на Фигуре 5.

[00201] Два протестированных варианта полипептида с SEQ ID NO: 1, вариант A и вариант B, были протестированы в дополнение к полипептиду с SEQ ID NO: 1.

[00202] Вариант A содержал следующие мутации по сравнению с SEQ ID NO: 1: V160A/G185R/A186R/A188H/G199E/I200V/H203N/Q205K.

[00203] Вариант B содержал следующие мутации по сравнению с SEQ ID NO: 1: V160A/G185R/A186R/A188H/S189D/P190H/M191D/G199E/I200V/H203N/Q205K.

[00204] Результаты анализов образцов мочи и кала показаны на Фигурах 6 и 7. Изменение объединенных концентраций ZEN плюс α-ZEL по сравнению с SEQ ID NO: 1 в процентах представляет собой разницу между концентрациями двух групп, деленную на концентрацию группы с SEQ ID NO: 1, умноженную на 100. Увеличение концентрации ZEN плюс α-ZEL в ходе исследования кормления в контрольной группе, которая не получала ZEN-разрушающий полипептид в своем рационе, может быть вызвано энтерогепатической циркуляцией ZEN и производных ZEN у свиней и следовательно, его накопление (Biehl et al. (1993) (Biehl et al. (1993) ‘Biliary excretion and enterohepatic cycling of zearalenone in immature pigs.’ Toxicol Appl Pharmacol. 1993 Jul;121(1):152-9).

[00205] Пример 8: Тестирование различных концентраций полипептида для детоксикации ZEN у бройлеров

[00206] Для испытания по кормлению применяли 90-дневных цыплят-бройлеров смешанного пола (Ross 308). Птиц кормили двумя разными видами питания в две стадии. В период адаптации птицы получали питание фазы 1 (период жизни 1-14 день), в течение экспериментального периода птицы получали питание фазы 2 (период жизни 15-28 день). Состав питания фазы 1 в процентах (масс./масс.): 55,00% кукурузы, 29,00% соевого HP, 1,00% подсолнечного масла, 6,92% полножирной сои, 0,72% концентрата соевого белка, 1,88% пальмоядрового, кокосового жира, 1,96% карбоната кальция, 1,89% монофосфата кальция, 0,35% бикарбоната натрия, 0,23% хлорида натрия, 0,13% фосфата магния, 0,24% премикса витаминов/микроэлементов, 0,34% L-лизина, 0,12% L-треонина и 0,24% DL-метионина.

[002074] Состав питания фазы 2 в процентах (масс./масс.): 62,00% кукурузы, 23,80% соевого HP, 2,00% подсолнечного масла, 5,53% полножирной сои, 0,58% концентрата соевого белка, 1,50% пальмоядрового, кокосового жира, 1,56% карбоната кальция, 1,71% монофосфата кальция, 0,28% бикарбоната натрия, 0,19% хлорида натрия, 0,10% фосфата магния, 0,19% премикса витаминов/микроэлементов, 0,27% L-лизина, 0,10% L-треонина и 0,20% DL-метионина.

[00208] На период адаптации (14 дней) птиц случайным образом распределяли по 3 клеткам. После периода адаптации птиц равномерно распределяли по средней массе в 7 клеток (групп) по 8 птиц в каждой. Продолжительность испытания составила 14 дней. Климатические условия регулировали согласно стандартным рекомендациям племенного хозяйства. Кормление производили вручную 1 раз в сутки. Корм и вода были доступны без ограничения. Концентрация ZEN в питании составляла 400 мкг ZEN/кг питания. Контрольную группу кормили питанием, содержащим 400 мкг ZEN на кг питания, без добавления какого-либо фермента, разрушающего ZEN. Вариант полипептида А (SEQ ID NO: 1, содержащий следующие мутации V160A/G185R/A186R/A188H/G199E/I200V/H203N/Q205K) тестировали в следующих концентрациях: 5 Ед/кг питания, 10 Ед/кг питания, 20 Ед/кг питания, 40 Ед/кг питания, 80 Ед/кг питания и 160 Ед/кг питания. После эвтаназии у птиц брали образцы зоба в начале и в конце испытания. Образцы замораживали и лиофилизировали. Для анализа ZEN, HZEN и DHZEN 1 г каждого образца взвешивали в пробирке на 50 мл и дважды экстрагировали посредством 15 мл 80% ацетонитрила на роторном шейкере при 25°C в течение 30 мин. Затем пробирку центрифугировали в течение 10 минут при 2300 xg, 25°C, и супернатанты объединяли в свежую пробирку на 50 мл. 1 мл снова центрифугировали в течение 5 минут при 2300 xg, 25°C, и супернатант переносили во флакон для измерения посредством ЖХ-МС/МС. Образцы хранили при -20°C до измерения и анализировали с помощью ЖХ-МС/МС. Анализы проводили с помощью системы УВЭЖХ Agilent серии 1290, соединенной с масс-спектрометром 6500 + QTrap. Температуру колонки устанавливали 30°C, и скорость потока - 0,25 мл/мин. Подвижные фазы A и B состояли из воды/уксусной кислоты и ацетонитрила/уксусной кислоты (обе 99,9/0,1, об./об.), соответственно. Градиент начинали с 15 % B в течение 0,5 мин и продолжали с линейным увеличением до 60 % B до 13,5 мин и резким увеличением до 100% B от 13,5 до 14,0 мин, затем 100% B до 16,9 мин и резко снижали до 15 % B от 16,9 до 17,0 мин. Наконец, колонку повторно уравновешивали с применением 15 % B до 20,0 мин. Объем ввода составлял 2 мкл. Разделение проводили на колонке Phenomenex Kinetex C18 (150x2,1 мм, 2,6 мкм). Количественное определение основано на калибровке с внешними стандартами ZEN, HZEN и DHZEN. Выбранные параметры мониторинга реакции (SRM) показаны на Фигуре 8.

[00209] Результаты анализа образцов зоба по окончании испытания представлены на Фигуре 9. Снижение концентрации ZEN в процентах рассчитывали следующим образом: (Концентрация ZEN в контрольной группе минус концентрация ZEN в группе образцов), деленная на концентрацию ZEN в контрольной группе, умноженная на 100.

Перечень ссылок

Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402

Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300

Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410

Biehl et al. (1993) ‘Biliary excretion and enterohepatic cycling of zearalenone in immature pigs.’ Toxicol Appl Pharmacol. 1993 Jul;121(1):152-9

Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245

Burnley and Gros (2012) ‘phenix.ensemble_refinement: a test study of apo and holo BACE1‘Computational crystallography newsletter, volume 4, pp. 51 - 58

Cregg, Pichia Protocols, second Edition, ISBN-10: 1588294293, 2007

PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)

Elmar Krieger, Bioinformatics 30,2981-2982

Gasteiger E. et al.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, in John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, pp. 571-607

Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915

Henikoff and Henikoff (1992) ‘Amino acid substitution matrices from protein blocks.‘ Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15;89(22):10915-9

Jantratid et al. (2008) ’Dissolution media simulating conditions in the proximal human gastrointestinal tract: an update.’ Pharm Res. 2008 Jul;25(7):1663-76

Jones (1999) ‘Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices’ J.Mol.Biol. 292:195-202

POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983), pgs. 1-12; Seifter, Meth. Enzymol. 182 (1990), 626-646

Kourist et al. (2010) ‘The alpha/beta-hydrolase fold 3DM database (ABHDB) as a tool for protein engineering.’ Chembiochem. 11(12):1635-43

Kurtzman (2009) “Biotechnological strains of Komagataella (Pichia) pastoris are Komagataella phaffii as determined from multigene sequence analysis.” J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11):1435-8

Kyte and Doolittle (1983) "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol. 157 (1): 105-32

Lenfant et al. (2013) ‘ESTHER, the database of the α/β-hydrolase fold superfamily of proteins: tools to explore diversity of functions’ Nucleic Acids Research, Volume 41, Issue D1, D423-D429

Malekinejad et al. (2006) ‘Hydroxysteroid dehydrogenases in bovine and porcine granulosa cells convert zearalenone into its hydroxylated metabolites alpha-zearalenol and beta-zearalenol. Vet Res Commun:445-53

Mindrebo et al. (2016) ‘Unveiling the functional diversity of the Alpha-Beta hydrolase fold in plants’ Curr Opin Struct Biol. 233-246

Ollis et al. (1992) ‘The alpha/beta hydrolase fold‘ Protein Eng. 5(3):197-211

Rattan, Ann. NY Acad. Sci. 663 (1992); 48-62

Schatzmayr and Streit (2013) ‘Global occurrence of mycotoxins in the food and feed chain: Facts and figures.’ World Mycotoxin Journal 6(3):213-222

Sambrook et al. 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor

Stenhagen & Teorell. (1938) Nature 141, 415

Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680

Vekiru et al. (2016) ‘Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products’ World Mycotoxin Journal 9:353-363)

Yamada et al. (1995) ‘The Phylogenetic Relationships of Methanol-assimilating Yeasts Based on the Partial Sequences of 18S and 26S Ribosomal RNAs: The Proposal of Komagataella Gen. Nov. (Saccharomycetaceae)’ Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, Vol. 59, issue 3, pp. 439-444).

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ERBER AG

<120> СРЕДСТВА И СПОСОБЫ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЗЕАРАЛЕНОНА

<130> ERB16135EP

<160> 11

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 309

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 1

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu

20 25 30

Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr

35 40 45

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ser Glu His

50 55 60

Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp

65 70 75 80

Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg

85 90 95

Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly

115 120 125

Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu

130 135 140

Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val

145 150 155 160

Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp

165 170 175

Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala

180 185 190

Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Gln Glu Tyr Asp

195 200 205

Pro Glu Trp Ala Arg Val Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Ser Cys

210 215 220

Pro His Glu Arg Met Leu Gly Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr

225 230 235 240

His His Met Arg Gly Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Leu Arg Ala Arg Arg Leu Met Asp Ser Ala

260 265 270

Gly Val Thr Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met

275 280 285

His Gln Ser Ala Pro Ala Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala

290 295 300

Ala Ala Leu Ala Pro

305

<210> 2

<211> 308

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 2

Met Ala Asp Pro Ala Gln Arg Asp Val Tyr Val Pro His Ala Tyr Pro

1 5 10 15

Glu Lys Gln Ala Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu Ala

20 25 30

Gly Glu Pro Asp Met Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr Gly

35 40 45

Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn Phe

50 55 60

His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp Ala

65 70 75 80

Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg Phe

85 90 95

Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Ile Val Ala Gly Asn Ser Ser

100 105 110

Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly Gln

115 120 125

Val Arg Gly Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu Leu

130 135 140

Val Thr Thr Cys Gly His Ser Ile Arg Gln Ala Ala Gly Pro Met Phe

145 150 155 160

Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp Trp

165 170 175

Thr Gly Tyr Cys Arg Ala Ala Asp Ala Ser Ser Ser Pro Met Ala Arg

180 185 190

Tyr Phe Val Ala Asp Glu Ile Pro Gln His Met Arg Glu Tyr Asp Pro

195 200 205

Glu Trp Ala Arg Ala Phe Trp Glu Gly Thr Val Ala Leu His Cys Pro

210 215 220

His Glu Gln Leu Leu Thr Gln Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr His

225 230 235 240

His Met Arg Asp Ile Asp Pro Asp Thr Gly His Leu Val Gly Ala Leu

245 250 255

Ser Asp Glu Gln Ala Ala Arg Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala Gly

260 265 270

Val Lys Val Asp Tyr Ala Ser Val Pro Asp Ala Leu His Met Met His

275 280 285

Gln Phe Asp Pro Pro Arg Tyr Val Glu Ile Phe Thr Gln Trp Ala Ala

290 295 300

Thr Leu Ala Ala

305

<210> 3

<211> 309

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 3

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu

20 25 30

Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr

35 40 45

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His

50 55 60

Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp

65 70 75 80

Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg

85 90 95

Phe Ile Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly

115 120 125

Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu

130 135 140

Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val

145 150 155 160

Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp

165 170 175

Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala

180 185 190

Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp

195 200 205

Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys

210 215 220

Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr

225 230 235 240

His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Val Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala

260 265 270

Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met

275 280 285

His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Thr

290 295 300

Ala Ala Leu Ala Pro

305

<210> 4

<211> 309

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 4

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu

20 25 30

Ala Gly Asp Pro Asp Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr

35 40 45

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His

50 55 60

Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp

65 70 75 80

Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg

85 90 95

Phe Ile Ala Leu Val Val Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly

115 120 125

Gln Leu Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu

130 135 140

Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val

145 150 155 160

Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Ser Asp

165 170 175

Trp Glu Gly Phe Cys Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala

180 185 190

Arg Ser Phe Val Ala Asp Gly Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp

195 200 205

Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe His Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys

210 215 220

Pro His Glu Arg Met Leu Gly Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr

225 230 235 240

His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Leu Met Glu Ser Ala

260 265 270

Gly Val Arg Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met

275 280 285

His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Phe Thr Arg Trp Ala

290 295 300

Ala Ala Leu Ala Pro

305

<210> 5

<211> 309

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 5

Met Val Thr Ser Pro Ala Leu Arg Asp Val His Val Pro His Ala Tyr

1 5 10 15

Pro Glu Gln Gln Val Asp Leu Gly Glu Ile Thr Met Asn Tyr Ala Glu

20 25 30

Ala Gly Asp Pro Gly Arg Pro Ala Val Leu Leu Ile Pro Glu Gln Thr

35 40 45

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Leu Ala Glu His

50 55 60

Phe His Val Tyr Ala Val Asp Leu Arg Gly Gln Gly Arg Ser Ser Trp

65 70 75 80

Thr Pro Lys Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg

85 90 95

Phe Met Ala Leu Val Val Arg Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Val Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ser Met Pro Gly

115 120 125

Gln Ile Arg Gly Val Leu Cys Glu Asp Pro Pro Phe Phe Ala Ser Glu

130 135 140

Leu Val Pro Ala His Gly His Ser Val Arg Gln Gly Ala Gly Pro Val

145 150 155 160

Phe Glu Leu Phe Arg Thr Tyr Leu Gly Asp Gln Trp Ser Val Gly Asp

165 170 175

Trp Glu Gly Phe Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Pro Met Ala

180 185 190

Arg Ser Phe Val Ala Asp Thr Ile Pro Gln His Leu Lys Glu Tyr Asp

195 200 205

Pro Glu Trp Ala Arg Ala Phe Tyr Glu Gly Thr Val Gly Leu Asn Cys

210 215 220

Pro His Glu Arg Met Leu Asn Arg Val Asn Thr Pro Val Leu Leu Thr

225 230 235 240

His His Met Arg Gly Thr Asp Pro Glu Thr Gly Asn Leu Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Arg Leu Met Glu Ser Ala

260 265 270

Gly Val Lys Val Asp Tyr Glu Ser Val Pro Asp Ala Ser His Met Met

275 280 285

His Gln Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Pro Trp Ala

290 295 300

Ala Ala Leu Ala Pro

305

<210> 6

<211> 328

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Домен альфа/бета гидролазы

<400> 6

Met Ala Glu Glu Gly Thr Arg Ser Glu Ala Ala Asp Ala Ala Thr Gln

1 5 10 15

Ala Arg Gln Leu Pro Asp Ser Arg Asn Ile Phe Val Ser His Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Arg Gln Val Asp Leu Gly Glu Val Val Met Asn Phe Ala Glu

35 40 45

Ala Gly Ser Pro Asp Asn Pro Ala Leu Leu Leu Leu Pro Glu Gln Thr

50 55 60

Gly Ser Trp Trp Ser Tyr Glu Pro Val Met Gly Leu Leu Ala Glu Asn

65 70 75 80

Phe His Val Phe Ala Val Asp Ile Arg Gly Gln Gly Arg Ser Thr Trp

85 90 95

Thr Pro Arg Arg Tyr Ser Leu Asp Asn Phe Gly Asn Asp Leu Val Arg

100 105 110

Phe Ile Ala Leu Val Ile Lys Arg Pro Val Val Val Ala Gly Asn Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Leu Leu Ala Ala Trp Leu Ser Ala Tyr Ala Met Pro Gly

130 135 140

Gln Ile Arg Ala Ala Leu Cys Glu Asp Ala Pro Phe Phe Ala Ser Glu

145 150 155 160

Leu Val Pro Ala Tyr Gly His Ser Val Leu Gln Ala Ala Gly Pro Ala

165 170 175

Phe Glu Leu Tyr Arg Asp Phe Leu Gly Asp Gln Trp Ser Ile Gly Asp

180 185 190

Trp Lys Gly Phe Val Glu Ala Ala Lys Ala Ser Pro Ala Lys Ala Met

195 200 205

Gln Leu Phe Pro Thr Pro Asp Glu Ala Pro Gln Asn Leu Lys Glu Tyr

210 215 220

Asp Pro Glu Trp Gly Arg Ala Phe Phe Glu Gly Thr Val Ala Leu His

225 230 235 240

Cys Pro His Asp Arg Met Leu Ser Gln Val Lys Thr Pro Ile Leu Ile

245 250 255

Thr His His Ala Arg Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu Leu Leu Gly

260 265 270

Ala Leu Ser Asp Leu Gln Ala Glu His Ala Gln Asp Ile Ile Arg Ser

275 280 285

Ala Gly Val Arg Val Asp Tyr Gln Ser His Pro Asp Ala Leu His Met

290 295 300

Met His Leu Phe Asp Pro Ala Arg Tyr Ala Glu Ile Leu Thr Ser Trp

305 310 315 320

Ser Ala Thr Leu Pro Ala Asn Asp

325

<210> 7

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X представляет собой любую аминокислоту

<400> 7

Gln Xaa Ala Gly Pro

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 8

Glu Tyr Asp Pro Glu

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X представляет собой F или Y

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(4)

<223> X представляет собой любую аминокислоту

<400> 9

Gly Xaa Xaa Xaa Ala Ala

1 5

<210> 10

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X представляет собой любую аминокислоту

<400> 10

Ala Arg Xaa Phe

1

<210> 11

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Мотив

<400> 11

Gln Leu Phe Pro

1

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу увеличения стабильности α/β-гидролазы. Также предложены α/β-гидролазы, имеющие уменьшенное общее среднее значение гидропатии (GRAVY). Кроме того, настоящее изобретение относится к применению α/β-гидролазы для деградации зеараленона (ZEN). Изобретение позволяет повысить эффективность деградации зеараленона. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 2 табл., 8 пр.

1. Способ увеличения стабильности α/β-гидролазы, при этом α/β-гидролаза содержит последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, или положениям 145-218 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет 90% или более идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или положениям 144-217 в SEQ ID NO: 2, или положениям 145-218 в SEQ ID NO: 3, 4, или 5, или положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, включающий: осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты в VI-домене в пределах CAP-домена указанной α/β-гидролазы:

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1,

или

- в положении, соответствующем положению с 159 по 204 в SEQ ID NO: 2,

или

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 3,

4, или 5, или

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где указанную аминокислоту (аминокислоты) заменяют аминокислотой, которая имеет более отрицательный индекс гидропатии, чем указанная заменяемая аминокислота, при этом указанный индекс гидропатии определяют по индексу гидропатии Кайта и Дулитла, с получением тем самым α/β-гидролазы с увеличенной стабильностью по сравнению с α/β-гидролазой до введения указанной замены (замен) аминокислоты.

2. Способ по п. 1, где указанный способ включает осуществление замены по меньшей мере одной аминокислоты:

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1,

и/или

- в положении, соответствующем положению с 184 по 190 в SEQ ID NO: 2,

и/или

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 3,

4 или 5, и/или

- в положении, соответствующем положению с 201 по 208 в SEQ ID NO: 6.

3. Способ по п. 1 или 2, согласно которому аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T, G, A, M, C, F, L или V, предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R, K, N, Q, D, E, H, P, Y, W, S, T или G, более предпочтительно - из R, K, N, Q, D, E, H или P.

4. Способ по любому из пп. 1-3, согласно которому аминокислоту(ы) заменяют аминокислотой, выбранной из R, D, H, G, N или P, предпочтительно из R, D, H, G или N, более предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R или N.

5. Способ по любому из пп. 1-4, согласно которому замена аминокислоты выбрана из одной или более из: V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N, Q→K, F→Y и/или V→C, предпочтительно указанная замена аминокислоты выбрана из одной или более из: V160A, G185R, G185S, A186P, A186R, A188D, A188H, A188N, A188G, A188R, S189D, P190H, M191D, G199E, I200A, I200V, H203N, Q205K, F183Y и/или V197C, более предпочтительно указанная замена аминокислоты выбрана из G185R, A186R, A188R, A188D, A188H, A188N и/или M191D.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что увеличенная стабильность представляет собой снижение значения GRAVY, увеличение стабильности в отношении pH и/или увеличение температурной стабильности.

7. α/β-гидролаза, которая имеет полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 95% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, при этом указанная полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в VI-домене в пределах CAP-домена указанной α/β-гидролазы:

- в положении, соответствующем положению с 160 по 205 в SEQ ID NO: 1,

или

где указанная замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и Q→K

и/или

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 1.

8. α/β-гидролаза, которая имеет полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет более чем 90% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 145-218 в SEQ ID NO: 1, при этом указанная полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты в пределах CAP-петли:

- в положении, соответствующем положению с 185 по 191 в SEQ ID NO: 1, где указанная замена аминокислоты выбрана из V→A, G→R, G→S, A→P, A→R, A→D, A→H, A→N, A→G, S→D, P→H, M→D, G→E, I→A, I→V, H→N и Q→K и/или где указанная аминокислота(ы) заменена аминокислотой, выбранной из P, R, D, H, G или N, предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R, D, H, G или N, более предпочтительно указанная аминокислота выбрана из R или N, при этом указанная α/β-гидролаза имеет увеличенную стабильность по сравнению с α/β-гидролазой до введения указанной замены (замен) аминокислоты.

9. α/β-гидролаза, которая имеет полипептидную последовательность, содержащую последовательность, соответствующую положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, или последовательность, которая имеет более чем 99% идентичности с последовательностью, соответствующей положениям 161-235 в SEQ ID NO: 6, где указанная полипептидная последовательность содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты, выбранную из одной или более из F→Y и V→C

- в положении, соответствующем положению с 176 по 222 в SEQ ID NO: 6,

где α/β-гидролаза имеет более отрицательное значение GRAVY по меньшей мере на 0,6% по сравнению со значением GRAVY α/β-гидролазы, имеющей полипептидную последовательность SEQ ID NO: 6.

10. α/β-гидролаза по любому из пп. 7, 8, отличающаяся тем, что указанная α/β-гидролаза содержит замены аминокислот:

- G→R и A→N, предпочтительно G185R и A188N;

- G→S и A→R, предпочтительно G185S и A188R;

- G→R, A→R, A→H, S→D, P→H и M→D, предпочтительно G185R, A186R, A188H, S189D, P190H и M191D;

- V→A, G→R, A→N, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A188N, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→S, A→R, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185S, A188R, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→E, I→A, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G199E, I200A, H203N и Q205K;

- V→A, G→R, A→R, A→H, G→E, I→V, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, G199E, I200V, H203N и Q205K; и/или

- V→A, G→R, A→R, A→H, S→D, P→H, M→D, G→E, I→V, H→N и Q→K, предпочтительно V160A, G185R, A186R, A188H, S189D, P190H, M191D, G199E, I200V, H203N и Q205K.

11. α/β-гидролаза по п. 9, где указанная α/β-гидролаза содержит замены аминокислот F→Y и V→C, предпочтительно F183Y и V197C.

12. Применение α/β-гидролазы по любому из пп. 7-11 для деградации зеараленона (ZEN).

13. Кормовая добавка, содержащая α/β-гидролазу по любому из пп. 7-11.

14. Пищевая добавка, содержащая α/β-гидролазу по любому из пп. 7-11.

15. Кормовой продукт, содержащий α/β-гидролазу по любому из пп. 7-11.

16. Пищевой продукт, содержащий α/β-гидролазу по любому из пп. 7-11.

17. α/β-гидролаза по любому из пп. 7-11 для применения при лечении или профилактике заболевания.