Ингибитор матриксных металлопротеиназ 2-го и 9-го типов из ряда производного бензоиламино(фенилсульфонил)-L-оксипролина, обладающий нейропротекторной и противоопухолевой активностью Российский патент 2024 года по МПК C07D207/48 A61K31/401 A61P35/00 A61P25/00 

Изобретение относится к химии и медицине, а именно к новому биологически активному органическому соединению, производному L-оксипролина общей формулы 1:

и его физиологически приемлемым солям, предпочтительно натриевым, которые обладаю ингибирующей активностью по отношению к матриксным металлопротеиназам 2-го и 9-го типов (ММП-2 и ММП-9), нейропротекторной и противоопухолевой активностью.

Матриксные металлопротеиназы (ММП) относятся к семейству цинк-зависимых эндопептидаз. способных разрушать основные компоненты белков внеклеточного матрнкса. который составляет основу соединительной ткани, обеспечивает механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ, а также участвует во многих физиологических процессах в организме [Cabral-Pacheco G.A. et al. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21(24): 9739-93]. Среди ММП наиболее исследованными ферментами считаются желатиназы (ММП-2 и ММП-9). В целом, все ММП имеют общие структурные элементы: сигнальный домен, пропептид (блокирующий активный центр в проэнзимах), каталитический домен с цинксодержащим активным центром, подвижный домен и гемопексиновый домен, который отвечает за связывание тканевых ингибиторов с ферментом [Rowsell S. et al. J. Mol. Biol. 2002; V. 319: 173-81] (фиг. 1).

В организме ММП вырабатываются в форме зимогенов (про-ММП), которые в процессе воспаления и окислительного стресса активируются до активных ММП [Nissinen L. et al. Biochim. Biophys. Acta. 2014; 1840(8): 2571-80], что оказывает пагубное воздействие на компоненты белков внеклеточного матрикса (например, коллаген, ламинин, фибронектин) и приводит к развитию многих патологических состояний, включая нейродегенеративные и онкологические заболевания [Рогова Л.Н. и др. Вестник Нов. Мед. Технол. 2011; XVIII(2): 86-9].

В центральной нервной системе (ЦНС) ММП-2 и ММП-9 экспрессируются нейрональными клетками, микроглией и астроцитами. Они разрушают ВКМ, что приводит к увеличению проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и повреждению миелинизированных нервных волокон [Nelson К.К. et al. Free Rad. Boil. Med. 2004; 37(6): 768-784].

Ряд исследований выявил участие активации ММП-2 и ММП-9 в окислительном стрессе и клеточном апоптозе при церебральной ишемии [Gasche Y. et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001; 21:1393-400; Haorah J. et al. J. Neurochem. 2007; 101: 566-76]. Имеющиеся литературные данные показывают, что активированные внутриядерные ММП-2 и ММП-9 в ишемизированных нейронах могут разрушать ядерные белки поли-АДФ-рибозополимеразу-1 (PARP-1) и фактор перекрестной комплементарности 1 (XRCC1) и одновременно повышать уровни окислительного повреждения ДНК у животных с МСАО [Yang Y. et al. Brain Res. 2015; 1623: 30-8].

ММП принимают участие в патогенезе болезней Альцгеймера и Паркинсона, а также рассеянного и бокового амиотрофического склероза [Brkic М. et al. Mediat. Inflamm. 2015; 2015: 620581]. При болезни Альцгеймера в мозге ММП-2 и ММП-9 экспрессируются астроцитами и провоспалительными цитокинами (IL-lβ) [Fujimoto М. et al J. Cereb. Blood Flow Metab. 2008; 28: 1674-85]. Экспрессию бета-амилоидных (Аβ) бляшек контролирует уровень секретируемых желатиназ, а частности ММП-2. Предполагают, что ММП-2 при болезни Альцгеймера играет защитную роль, а избыточная активность ММП-9 коррелирует с нейротоксичностью [Х-Х. Wang et al). Biomed Res Int. 2014; 2014: 908636].

Использование синтетических ингибиторов ММП-2 и ММП-9 в исследованиях на животных показало многообещающие результаты. Исследование Gu J. и др. показало, что селективный ингибитор ММП-9, SB-3CT, снижает травматизм при остром инсульте [Gu J. et al. J.E.M. 2005; 202(3): 415-24]. Другое соединение - производное тетрациклина миноциклин, обладающее противовоспалительным действием, снижает активацию микроглии. уменьшает количество активных каспаз и блокирует действие ММП-9. Это эффективный препарат для уменьшения повреждений при остром инсульте в острой фазе [Fagan J. et al. Street Stops and Broken Windows Revisited: The Demography and Logic of Proactive Policing in a Safe and Changing City/M. New York: NYU Press, 2010; 309-348]. Лечение ингибиторами ММП или нейтрализующими ММП антителами уменьшает размер инфаркта и предотвращает разрушение ГЭБ после очагового ишемического инсульта I Rosenberg G.A. et al. Stroke. 1998; 29(10): 2189-95], а также блокирует гибель нейронов при транзиторной фокальной ишемии [Yang Y. et al. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 2007; 27(4): 697-709].

Помимо нейродегенеративных заболеваний ММП-2 и ММП-9 принимают участие в процессе онкогенеза на нескольких этапах [Dufour A. et al. Trends Pharm. Sci. 2013, 34: 233-242]. Нарушение баланса между ММП и их эндогенными ингибиторами ТИММП приводит к прогрессированию онкологических заболеваний.

В исследованиях у больных раком гортани была выявлена взаимосвязь между экспрессией ММП-2 и наличием метастазов в лимфатических узлах [Клишо Е.В. и др. Сибирский онколог, журн. 2003; №2: 62-70]. Продукция ММП-2 опухолевыми клетками обеспечивает их инвазивный потенциал. ММП-9 в здоровых клетках принимает участие в процессе ангиогенеза, растворяя стромальные элементы, прокладывает путь для растущих капилляров. При наличии злокачественных новообразований ангиогенная активность ММП-9 способствует росту опухоли и интенсифицирует процесс метастазирования [Ранусевич И.И. Онкология. 2010; 12(1): 10-16].

Пептидные ингибиторы ММП широкого спектра действия, содержащие в себе гидроксаматную цинксвязывающую группу (CONHOH), батимастат (ВВ-94) и маримастат (ВВ-2516) являются одними из первых синтезированных ингибиторов, для которых были проведены клинические испытания [Slawomir М. et al. Invest. New Drug. 1997; 15: 61-75] ВВ-94 с IC50≤10 нг/мл, в несколько раз продлевал выживаемость животных с карциномой яичника и подавлял образование злокачественного асцита. Батимастат в экспериментах на мышах тормозил рост карциномы толстой кишки человека. Батимастат дошел до III фазы клинических испытаний. ВВ-2516, в отличие от батимастата, биодоступен при нероральном применении, обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к ММП-2 и ММП-9 (IC50(ММП-2)=6 нМ; 1С50(ММП-9)=3 нМ) [Slawomir М. et al., 1997]. В экспериментах на крысах маримастат тормозил рост опухоли карциномы молочной железы и меланомы. Является препаратом, для которого были проведены клинические исследования для лечения злокачественных новообразований легких, толстой кишки, яичников, предстательной железы, поджелудочной железы и др. Однако, для обоих соединений испытания были прерваны на III фазе, из-за наличия побочных эффектов со стороны опорно-двигательного аппарата при длительном применении [Hidalgo М. et al. J. Natl. Cancer. Inst. 2001. 93(3); 178-193]. Полусинтетическое производное тетрациклинового ряда COL-3 (NSC-683551), не являющееся антибиотиком, дошло до I фазы клинических исследований для лечения пациентов с рефрактерным метастатическим раком. Соединение в дозах до 70 мг/м² в день снижает концентрации ММП-2 и ММП-9 в плазме крови пациентов, а также продукцию ММП-9 моноцитами [Hidalgo М. et al., 2001].

Таким образом, многочисленные исследования указывают на то, что ингибиторы ММП способны блокировать гибель нейронов при нейродегенеративных заболеваниях и оказывать противоопухолевое и антиметататическое действие.

Ранее на основании структур известных ингибиторов ММП-2 и ММП-9 [Peterson T.J. et al. Circulation. 2001; 103: 2303-9], а также описанных в литературе структурных требований к ингибиторам желатиназ А и Б [Verma R.P. et al. Bioorg. Med. Chem. 2007; 5: 2223-68], нами была предложены возможные фармакофорные единицы новых ингибиторов [Григоркевич О.С. и др. Хим.- фарм. журн. 2018; 52(1): 8-14]. Фармакофор содержит в себе необходимые структурные элементы для связывания с активным центром желатиназ: цинк-связывающую карбоксильную группу, протяженную биароматическую липофильную группу для связывания с сайтом S1' и циклический участок для связывания с сайтом S1 (фиг. 2).

На основании этого фармакофора было предложено новое соединение 1-({4-[(2,4-дихлорбснзоил)амино]фенил}сульфонил-(2S.4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27) с предполагаемой ингибиторной активностью по отношению к ММП-2 и ММП-9.

Для молекулярного докинга использовались 3D структуры белков ММП-2 (PDB ID: 1HOV) и ММП-9 (PDB ID: 5CUH). Белки 5CUH(ММП-9), 1HOV(ММП-2) подготавливали с помощью Schrodinger Protein Preparation Wizard с использованием стандартного протокола [Schrodinger Release 2015-2: LigPrep, Schrodinger, LLC, NY, 2015]. Конформации лигандов рассчитывали в модуле LigPrep. Координаты сетки были отцентрированы по исходным лигандам на расстоянии 20А. Стыковку выполняли в Glide v9.1. с использованием ХР высокого предсказания [Schrodinger Release 2015-4: Maestro, Version [0.4, Schrodinger. LLC. NY, 2015]. Для оценки связывания лиганд-цинк использовали модуль Epik. Позы были визуализированы в Maestro 12.8 (фиг. 3).

Предложенное соединение содержит в себе необходимые структурные элементы для связывания с активным центром желатиназ (фиг. 4):

1. Карбоксильную группу для связывания с ионом цинка.

2. Протяженную биароматическую липофильную группу для связывания с сайтом S1'.

3. Циклический участок для связывания с сайтом S1 (L-оксипролин и др.).

В качестве сравнения были отобраны соединения - ранее описанные ингибиторы ММП-2 и ММП-9 (фиг. 5) [Peterson T.J. et al., 2001; Rohde L.E. et al. J. Am. Heart Assoc. 1999: 3063-70; Yarbrough W.M. et al. Circulation. 2003; 108: 1553-9; Becker D.P. et al. J. Med.

Chem. 2010; 53: 6653-80; Cathcart J.M. et al. Frontiers in Bioscience, Landmark, 2015; 20: 1164-78; Whittaker M. et al. Celltransmissions. 2001; 17(1): 3-14].

Визуализированные результаты молекулярного докинга в 2D- и 3D-проекциях по отношению к активному центру ММП-2 (1HOV) представлены на фиг. 7. Соединение ГГМ-27 имеет среди ключевых взаимодействий связывание карбоксильной группы с катионом цинка. Также имеется π-π-стэкинг между ароматической группой исследуемого соединения и имидазольной группой His 120. За счет водородных связей происходит взаимодействие между сульфонильной группой ГГМ-27 и Leu83 фермента. Дополнительная стабилизация происходит благодаря катион-π взаимодействию цинка с одним из ароматических колец исследуемого соединения (фиг. 6).

Визуализированные результаты молекулярного докинга в 2D- и 3D-проекциях по отношению к активному центру ММП-9 (5CUH) представлены на фиг. 8. Соединение ГГМ-27 имеет среди ключевых взаимодействий связывание карбоксильной группы с катионом цинка. За счет водородных связей происходит взаимодействие между сульфонильной группой ГГМ-27, Leul88 и Ala189, а также амидной группой и Met247. Дополнительная стабилизация происходит благодаря катион-π взаимодействию цинка с одним из ароматических колец исследуемого соединения (фиг. 7).

Таким образом сконструирован новый потенциальный ингибитор ММП-2 и ММП-9 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27).

Для упрощения проведения исследований в дальнейшем, также было решено получить водорастворимую натриевую соль 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты (ГГМ-27-Na).

Соединение, описанное в вышеприведенных ссылках, не открывает и не предполагает структуры патентуемого соединения.

Целью настоящего изобретения является разработка нового биологически-активного соединения в ряду новых ингибиторов ММП-2 и ММП-9, обладающего нейропротекторной и противоопухолевой активностью. Эта цель была достигнута путем получения ингибитора ММП-2 и ММП-9 на основе производного L-оксипролина общей формулы 1.

Соединение формулой 1, его свойства и способ получения в специальной и патентной литературе не описаны.

Соединение формулы 1 настоящего изобретения: 1-({4-[(2.4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27) и его физиологически приемлемая натриевая соль.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала лекарственных средств для лечения заболеваний и состояний организма, требующих применения средств, обладающих нейропротекторной и противоопухолевой активностью.

Синтез бензоиламино(фенилсульфонил)-L-оксипролина

Синтез 6ензоиламино(фенилсульфонил)-Г-оксипролина (ГГМ-27) и его натриевой соли (ГГМ-27-Na) осуществлялся по следующей схеме:

К избытку L-оксипролина (2) в полярных растворителях, таких как вода, тетрагидрофуран, диоксан, диметилсульфоксид, диметилформамид, в присутствии избытка акцепторов кислот, таких как, гидроксиды щелочных металлов, карбонаты щелочных металлов, аммиак или третичные амины, при температурах кипячении добавляют 4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]бензолсульфонилхлорид (1) и перемешивают 1 час, затем еще сутки при комнатной температуре. Реакционную массу подкисливают до нейтральной среды, выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой. Выпавший осадок 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты (ГГМ-27) перекристаллизовывают из спирта, в качестве которого может быть использован этанол или другой спирт.

Для получения натриевой соли 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты (ГГМ-27-Na) полученную кислоту (ГГМ-27) вводят во взаимодействие с гидроксидом натрия.

Пример 1. 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино)фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-г идроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27)

К раствору 0,386 г (0,0029 моль) L-оксипролина и 0,219 г (0,0055 моль) гидроксида натрия в 50 мл дистиллированной воды прибавляют 1 г (0,0027 моль) 4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]бензолсульфонилхлорида. Полученную массу перемешивают в течение 1 часа при нагревании на водяной бане до 75°С, затем при комнатной температуре в течение суток. Реакционную массу отфильтровывают от оставшегося осадка. К оставшемуся раствору прикапывают 0,1 М HCI до значения рН 1. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают дистиллированной водой до нейтрального значения среды и сушат при 70°С. Полученный осадок перекристаллизовывают из минимального количества 96%-ного этанола, получая 0,37 г продукта в виде белого порошка (выход 29%).

Спектр ЯМР 1H (DMSO, δ, м.д., J/Гц): 1.95 (два м, 2 H, Н₂С(3)Рrl); 3.13 (м,) Н, НС(2)Prl.); 3.45 (м, 1 H, Н₂С(4)Prl,); 4.04, 4.21 (два м, 2 Н, HC(4)Prl); 4,86 (с, 1 Н, CH-ОН); 7.60 (дд, 1 Н, Н(3), ³J=1.96 Гц, ³J₂ - 8.29 Гц); 7.67 (д, 1 H, Н(5'), ³J=8.29 Гц); 7.80 (м, 3 H, Н(3'), Н(2'), Н(6'));7.88 (д., 2 Н, Н(5), Н(6), ³J₁ - 8,75 Гц); 10.96 (с, 1 Н, NH), 12.74 (с, 1 H, С(О)-ОН). ТСХ: CHCl₃:МеОН:H₂O=26:14:3 R_ƒ=0,53. Т.пл. 79-83°С (110°C разл).

Пример 2. Натриевая соль 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино)фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты (ГГМ-27-Na)

К суспензии 0,033 г (0,072 ммоль) 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(S8,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты в 10 мл дистиллированной воды прикапывают раствор 0,003 г (0,072 ммоль) гидроксида натрия в 5 мл дистиллированной воды. Полученный раствор упаривают досуха, получая 0,01 г натриевой соли 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил }сульфонил-(28,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты в виде белого порошка (выход 3%).

Спектр ЯМР ¹Н (DMSO, δ, м.д., J/Гц): 1.23, 1.59 (два м, 2 Н. Н₂С(3)_prl.); 1.91, 2.94 (два м, 2 Н, Н₂С(5)_prl); 3.89 (м. 1 H, НС(2)_Prl.); 4.25 (м, 1 H, НС(4)_prl); 4,81 (м, 1 Н, ОН); 7.57 (дд, 1 Н, Н(3'). ³J 1.86 Гц. ³J₂ = 8.20 Гц); 7.67 (д, 1 Н. Н(5'). ³J=8.29 Гц); 7.78 (д, 1 Н, Н(6'), ³J=1.86 Гц):7.84 (дд.4 Н. Н(2'), H(6').H(2), Н(6),³J₁=4.19 Гц, ³J₂=9.13 Гц); 11.00 (с, 1 Н, NH). ТСХ: CHCl₃:МеОН:H₂O=26:14:3 R_ƒ=0,56. Т.пл.>250°С.

Пример 3. Ингибирующая активность ГГМ-27 по отношению к ММП-2 и ММП-9

Инкубационная смесь содержала 10 мкл ММП-2 (2 нМ) или ММП-9 (2 нМ) в инкубационном буфере (50 мМ Tris-HCl, рН7,5, 0,2 М NaCl, 5 мМ СаС12, 20 мкМ ZnSO₄, 0,05% Lubrol РХ), 75 мкл этого же буфера и 10 мкл ГГМ-27 в ДМСО (конечная концентрация 10%) в конечных концентрациях 1*10^-4-6*10^-6М. Смесь инкубировали 30 мин при 25°С. Затем добавляли 2,5 мкл (0,5 мкг/мл) или 5 мкл (1 мкг/мл) субстрата (Мса-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂) в Н₂О. Флуоресценцию регистрировали на микропланшетном ридере Thermo Scientifictm™ Varioskantm™ LUX при 37°C каждую минуту в течение первых 10 мин при длинах волн возбуждения и испускания 325 нм и 393 нм соответственно [Faust A. et al. Bioconjugate Chemistry. 2008; 19: 1001-1008]. Константы ингибирования каждого ингибитора рассчитывали с помощью линейного регрессионного анализа, выполненного с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software Inc., США) по методу Диксона. Скорости реакции измеряли по первым 10 мин и строили зависимость начальной скорости реакции (V0) от начальной концентрации ингибитора ([l_o]) - 1/V₀([1_o]).

Установлено, что в диапазоне концентраций 1*10^-4-6*10^-6М соединение ГГМ-27 проявляет ингибирующую активность как по отношению к ММП-2, так и по отношению к ММП-9: Ki(ММП-2)=94 мкМ, Ki(ММП-9)=900 мкМ, механизм ингибирования - конкурентный.

Фармакологическое изучение заявляемых соединений

Пример 4. Нейропротекторная активность ГГМ-27-Na

Для оценки нейропротекторной активности соединения ГГМ-27-Na использовалась модель окислительного стресса. Иммортализованные клетки гиппокампа мыши линии НТ-22 рассеивали в 96-луночных планшетах с плотностью 3,5×10³ на лунку в среде DMEM (HyClon, США), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки (Invitrogen, США) и 2 мМ L-глутамина (ICN, США), и инкубировали при 37°С в 5% СО₂ до образования монослоя.

Для моделирования окислительного стресса использовали Н₂О₂ в конечной концентрации 1,5 мМ. Клетки с Н₂О₂ инкубировали в атмосфере 5% СО₂ при 37°С 30 мин [Jackson G.R. et al. Brain Res. 1992; 592(1): 239-248]. Далее среду заменяли на нормальную и через 4 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2.5-дифенилтетразолия (МТТ) (Applichem, Германия) [UedaY. et al. Neurosci. Lett. 1994; 165: 203-7]. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре "Multiscan EX" (Thermo, США) при длине волны 600 нм.

Активность в опытах по противодействию окислительному стрессу рассчитывалась по формуле А(%)=(D_эксн - DH2o2) / (D_контр - D_H2o2) 100%, где D_эксп - оптическое поглощение раствора в опыте, D_H2o2 - оптическое поглощение раствора активного контроля (с Н₂О₂), D.контр - оптическое поглощение; пассивного контроля (без Н₂О₂).

Внесение соединений. ГГМ-27-Na за 24 ч и сразу после повреждения клеток в конечных концентрациях от 10^-5 до 10^-8 М.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Краскела-Уоллиса с последующим тестом по Даяну (ANOVA). Данные представлены с указанием стандартного отклонения Mean±S.D. Результаты считались достоверными при р≤0,05.

Окислительный стресс, вызванный H₂O₂ (1,5 мМ) приводил к достоверному снижению жизнеспособности гиппокампальных клеток линии НТ-22. Соединение ГГМ-27-Na защищало клетки от повреждения Н₂О₂ в концентрациях 10^-5-10^-6М только при внесении за 24 часа до перекиси водорода и не защищал при внесении соединения сразу после смены среды (табл. 2).

Пример 5. Противоопухолевая активность ГГМ-27

Изучение противоопухолевой активности ГГМ-27 было проведено на экспериментальной модели аденокарциномы молочной железы СА755, полученной из банка клеточных культур ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина". Штамм поддерживался двукратным пассированием культуры для получения необходимого для эксперимента количества. Взвесь опухолевых клеток (10 мг в 0,1 мл раствора Хэнкса на мышь) аденокарциномы СА755 имплантировали самкам мышей линии С57В 1/6 (n-40) с массой тела 18-22 г (ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая») подкожно, в область подмышечной впадины. Животных содержали но 5 особей в клетке в условиях вивария при естественной смене светового режима со свободным доступом к стандартному гранулированному корму (ГОСТ Р 50258-92) и воде в течение 7 суток до начала тестирования в соответствии с ГОСТ 33216-2014. Эксперименты проводили в соответствии с решением Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. №81 "Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств". Все манипуляции с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (протокол №5 от 19.04.22 г.).

Стандартная прививочная доза составляла не менее 1x10⁶ клеток/мышь. День подкожной прививки клеток опухолевого штамма считается нулевым днем развития опухоли. В качестве позитивного контроля был использован доксорубицин (Doxorubicin Ebewe, Sandoz), который вводили в/б в дозе 4 мг/кг на 2-й и 4-й день развития опухоли. Животным вводили ГГМ-27 в течение 14 дней в двух дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг.

Согласно полученным данным, при подкожной имплантации 1*10⁶ клеток аденокарциномы СА755 животным активного контроля и опытных групп и затем при курсовом 14-дневном введении ГГМ-27 в дозах 1 мг/кг и 10 мг/кг, было определено достоверное торможение роста опухоли (ТРО) на 9-е сутки развития опухоли и на 21-е сутки, через 7 дней после окончания введения препарата. При введении ГГМ-27 в дозе 1 мг/кг ТРО на 21-й день опыта составило 63%, при введении ГГМ-27 в дозе 10 мг/кг ТРО фактически не изменилось и составило 62%. При введении доксорубицина на 2-е и 4-е сутки развития аденокарциномы СА755 определено значимое ТРО на 9-е, 15-е и 21-е сутки развития опухоли, на 21-й день опыта ТРО составило 73% (табл. 3).

Согласно полученным данным, увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ) при введении ГГМ-27 в дозе 1 мг/кг составило 45%, при введении в дозе 10 мг/кг - 47%, а при введении препарата сравнения доксорубицина - 58% по сравнению с активным контролем (табл. 4).

Медиана выживаемости по методу Kaplan-Meier (фиг. 8) у животных активного контроля составила 17 дней, при введении доксорубицина - 32 дня. При введении ГГМ-27 в дозе 1 мг/кг медиана выживаемости составила 27 дней, а при введении ГГМ-27 в дозе 10 мг/кг - 25 дней. Полученные данные указывают на выраженную противоопухолевую активность ГГМ-27 при его 14-дневном введении в дозе 1 мг/кг и перспективность дальнейшего изучения противоопухолевых свойств ГГМ-27.

Таким образом установлено что соединение 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27) обладает ингибиторной активностью по отношению к ММП-2 (Ki(ММП-2)=94 мкМ) и ММП-9 (Ki(ММП-9)=900 мкМ) в микромолярных концентрациях. Причем соединение ГГМ-27 проявляет десятикратную селективность по отношению к ММП-2 по сравнению с ММП-9. Вероятно, наличие L-оксипролина и п-хлор и о-хлор группы в одном из бензольных колец является необходимым условием для проявления ингибиторной активности по отношению к желатиназам.

Натриевая соль 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты (ГГМ-27-Na) защищала клетки от повреждения H₂O₂ в концентрациях 10-5-10-6М только при внесении за 24 часа до Н₂О₂.

Соединение 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(28,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27) обладает противоопухолевым эффектом в дозах] мг/кг и 10 мг/кг, достоверное тормозя рост опухоли мышей с аденокарциномой СА755, а также увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей в исследуемых дозах.

Описание чертежей:

Фиг. 1. Общая схема структуры ММП-2 и ММП-9 (с адаптацией Kurzepa J. et al. International Journal of Neuroscience. 2014; 124(10): 707-16).

Фиг. 2. Группа бензоиламино(фенилсульфонил)-замещенных циклических аминокислот.

Фиг. 3. Координаты сетки стыковки на расстоянии 20А от лиганда SC-74020 в активном центре 1HOV проекция 3D.

Фиг. 4. Структура соединения 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота (ГГМ-27). Цинк-связывающая группа выделена красной пунктирной окружностью; биароматическая липофильная группа - синей пунктирной окружностью; циклический участок - зеленой пунктирной окружностью.

Фиг. 5. Ингибиторы ММП-2 и ММП-9. Цинк-связывающие группы выделены красными пунктирными окружностями; биароматические липофильные группы - синими пунктирными окружностями; циклические участки - зелеными пунктирными окружностями.

Фиг. 6. Результат молекулярной стыковки ГГМ-27 с 1HOV 2D- и 3D-проекции.

Фиг. 7. Результат молекулярной стыковки ГГМ-27 с 5CUH 2D- и 3D-проекции.

Фиг. 8. Влияние ГГМ-27 при 14-дневном внутрибрюшинном введении и двукратном введении доксорубицина на продолжительность жизни у мышей C57BL/6 с аденокарциномой СА755.

Изобретение относится к новому соединению 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты. Технический результат: получено новое соединение 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновой кислоты, которое обладает нейропротекторной и противоопухолевой активностью. 8 ил., 4 табл., 5 пр.

Соединение 1-({4-[(2,4-дихлорбензоил)амино]фенил}сульфонил-(2S,4R)-4-гидроксипирролидин-2-карбоновая кислота формулы 1: