ПЕПТИДЫ В КОМБИНАЦИИ С ИНГИБИТОРАМИ ИММУННЫХ КОНТРОЛЬНЫХ ТОЧЕК ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ РАКА Российский патент 2024 года по МПК C07K16/28 A61K38/00 A61K38/17 A61K39/395 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Пептид WNT5A или его производные для применения в лечении рака у субъекта, восприимчивого к ингибиторам контрольных точек.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Связь между иммунной системой и раком осознавали в течение длительного времени. Иммунная система действует для охраны и защиты индивида посредством выявления «не своего» и сверхэкспрессируемых антигенов от патогенов или инфицированных/злокачественных клеток; нацеливания на и разрушения патогена или инфицированных/злокачественных клеток при защите хозяина; и она развивает иммунологическую память посредством адаптивных иммунных ответов для последующих защитных механизмов.

Ингибиторы контрольных точек (ICI) представляют собой тип лекарственного средства, которое блокирует так называемые иммунные контрольные точки. Лиганды иммунных контрольных точек появляются на поверхности опухолевых клеток и иммунно ослабленных иммунных клеток, в то время как когнатные молекулы появляются на поверхности реагирующих на опухоль клеток иммунной системы, таких как Т-клетки и клетки-природные киллеры. Данные молекулы помогают ослаблять иммунные ответы и предупреждать чрезмерную активацию иммунной системы. Когда опухолеспецифичные Т-клетки не ингибируются иммунными контрольными точками, данные Т-клетки будут умерщвлять раковые клетки. Примеры иммунных контрольных точек, находящихся на Т-клетках или раковых клетках, включают молекулу PD-1 и ее лиганд PD-L1, и CTLA-4, которая конкурирует с костимулирующей молекулой CD28 за связывание с В7-1/В7-2.

Поскольку многие иммунные контрольные точки регулируются взаимодействиями между парами специфичных молекул и лигандов, для блокирования данного взаимодействия и предупреждения иммунодепрессии можно использовать моноклональные антитела или другие агенты. Ингибиторы иммунных контрольных точек, таким образом, используются в лечении рака посредством их способности блокировать молекулы белка контрольных точек, вызывающие ингибирование Т-клеток. Примеры известных в настоящее время ICI блокируют антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4; т.е. ипилимумаб), рецептор программируемой гибели 1 (PD-1; т.е. ниволумаб, пембролизумаб, цемиплимаб), или лиганд программируемой гибели 1 (PD-L1; т.е. атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб).

Некоторые белки, участвующие в иммунных контрольных точках, используя В7-1/В7-2 в качестве примера, помогают сообщать, чтобы Т-клетки становились активными посредством сигнализации через костимулирующий рецептор CD28, например, когда присутствует инфекция. Однако, если Т-клетки являются активными в течение слишком длительного времени или неподходящим образом реагируют на мишени, они могут начинать разрушать здоровые клетки и ткани, и молекула иммунных контрольных точек - CTLA4 - блокирует взаимодействие между CD28 и В7-1/В7-2.

Некоторые раковые клетки продуцируют высокие уровни белков-лигандов контрольных точек, вызывая выключение Т-клеток, когда они, в идеале, должны атаковать раковые клетки. Таким образом, раковые клетки нажимают на кнопку «стоп» иммунной системы. Это является категорией раковых пациентов, которые будут иметь тенденцию отвечать на терапию ICI. Показатели ответа на лечение ингибиторами контрольных точек остаются относительно низкими, варьируя от 15 до 40%, в зависимости от типа рака.

Первичная и приобретенная резистентность представляют собой ключевые клинические барьеры для дальнейшего улучшения результативности лечения пациента для некоторых типов рака, и известные механизмы, лежащие в основе каждой, включают разные компоненты ракового иммунного цикла и взаимодействия между многочисленными молекулами сигнализации и путями. Из-за этой сложности современное знание по механизмам резистентности все еще является неполным. Преодоление резистентности к терапии требует тщательного понимания механизмов, лежащих в основе ускользания опухолей от иммунологического надзора.

Делали попытки предложения комбинированных терапий. Например, анализировали лучевую терапию в комбинации с ингибиторами контрольных точек, а также лечение комбинацией ингибиторов контрольных точек. Одним недостатком с такими терапиями является то, что комбинированная терапия может быть более токсичной для пациента, чем одиночное лечение.

На этой основе целью настоящего изобретения является предложение улучшенных терапий, которые, среди прочего, служат для применения в лечении рака, причем такие терапии являются скорее нетоксичными или менее токсичными для пациента и включающими введение терапевтического средства, которое является более подходящим для нужд пациентов. Другой целью настоящего изобретения является улучшение эффекта ингибиторов контрольных точек.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен пептид WNT5A или его производные в комбинации с одним или более ингибиторами контрольных точек для применения в лечении рака у субъекта, нуждающегося в этом, причем пептид WNT5A содержит X_ADGX_BEL (SEQ ID NO 2) или его формилированное производное, где Х_А представляет собой метионин (М) или норлейцин, Х_в представляет собой цистеин (С) или аланин (А), где общая длина данного пептида равна или меньше, чем 50 аминокислот, где указанный пептид и указанный ингибитор контрольных точек являются либо объединенными, либо отдельными и/или вводятся либо одновременно, либо последовательно. Аминокислотные остатки указанного пептида WNT5A, за исключением глицина, могут находиться либо в L-, либо в D-стереоизомерной форме.

Обнаружили, что пептиды WNT5A и производные описанной выше формы в комбинации с одним или более ингибиторами контрольных точек можно использовать для уменьшения роста опухоли и, следовательно, в лечении рака у некоторых субъектов. В настоящее время считают, что пептиды WNT5A вызывают меньший уровень экспрессии контрольных точек на раковых клетках. Меньшая экспрессия контрольных точек означает, что будет необходимо меньшее количество ингибитора контрольной точки, или что может наблюдаться более высокая эффективность. Механизм, лежащий в основе этого, однако, в настоящее время недостаточно понятен.

В некоторых воплощениях указанный субъект определяется как чувствительный или восприимчивый к ингибиторам иммунных контрольных точек. Восприимчивость к ингибиторам иммунных контрольных точек следует понимать как то, что субъекты имеют контрольные точки, предпочтительно экспрессию CTLA-4, PD-L1 и/или CD47 любыми опухолевыми клетками или инфильтрующими иммунными клетками, а также соответствующие им пары.

В некоторых воплощениях общая длина пептида WNT5A равна или меньше, чем 20 аминокислот.

В некоторых воплощениях по меньшей мере один ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор иммунной контрольной точки, выбранной из группы, состоящей из CTLA-4, PD-L1 и CD47, наиболее предпочтительно CD47. В других воплощениях ингибитор контрольной точки представляет собой антитело, такое как антитело против CTLA-4, антитело против PD-L1 и/или антитело против CD47. Рассматривается то, что ингибитор контрольной точки может представлять собой антитело против CTLA-4 ипилимумаб или тремелимумаб, антитела, блокирующие PD-1, такие как ниволумаб, или антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб или пембролизумаб, или комбинацию антител против него.

Ипилимумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование полностью человеческого моноклонального антитела против CTLA-4 (IgG1κ), и оно в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием ипилимумаба является Ервой®.

Тремелимумаб представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело против CTLA-4.

Ниволумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование человеческого моноклонального антитела (HuMAb) - иммуноглобулина G4 (IgG4), оно связывается с рецептором программируемой гибели-1 (PD-1) и блокирует взаимодействие с лигандом 1 программируемой гибели (PD-L1) и лигандом 2 программируемой гибели (PD-L2), и в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием ниволумаба является Опдиво®.

Атезолизумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование монокпонального антитела против лиганда 1 программируемой гибели (PD-L1) - гуманизированного IgG1 с генетически модифицированным Fc, оно в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием атезолизумаба является Тецентрик®.

Авелумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование человеческого моноклонального антитела IgG1, направленного против иммуномодулирующего лиганда и белка PD-L1 клеточной поверхности, и оно в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием авелумаба является Бавенцио®.

Дурвалумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование моноклонального антинеоластического антитела, которое потенцирует ответ Т-клеток, включающий противоопухолевый ответ, через блокаду связывания PD-L1 с PD-1, и оно в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием дурвалумаба является Имфинзи®.

Пембролизумаб представляет собой международное непатентованное название (INN) или общепринятое наименование гуманизированного моноклонального антитела против рецептора программируемой гибели-1 (PD-1) (IgC4/изотип каппа со стабилизирующим изменением последовательности в области Fc), и оно в настоящее время продуцируется в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомяка, посредством методов генной инженерии. Торговым наименованием пембролизумаба является Кейтруда®.

Пептид WNT5A или его производные в комбинации с одним или более ингибиторами контрольных точек для применения в лечении рака у субъекта, нуждающегося в этом, обеспечивают снижение дозировки используемого ингибитора контрольных точек по сравнению с дозировкой, используемой без введения WNT5A одновременно или последовательно. Данный синергический эффект по изобретению является особенно полезным в показателях соблюдения пациентом схемы и режима лечения, поскольку уменьшаются побочные эффекты как его последствие.

Низкая экспрессия WNT5A при раковых опухолях молочной железы, толстой кишки и простаты коррелировала с увеличенным числом рецидивов заболевания и сокращенным временем выживания пациента (Mehdawi LM1, Prasad СР1, Ehrnstrom R2, Andersson T1, Sjolander A, Non-canonical WNT5A signaling up-regulates the expression of the tumor suppressor 15-PGDH and induces differentiation of colon cancer cells. Mol Oncol. 2016 Nov;10(9):1415-1429).

Неканоническая сигнализация WNT5A осуществляет повышающую регуляцию экспрессии супрессора опухолей 15-PGDH и индуцирует дифференциацию клеток рака толстой кишки.

Известно, что WNT5A ингибирует миграцию клеток данных типов рака в организме, и было показано то, что добавление рекомбинантного WNT5A ухудшает миграцию данных клеток. Предпочтительно данное раковое заболевание представляет собой рак толстой кишки, такой как коло ректальный рак или рак молочной железы.

Субъект, у которого диагностирован рак, может демонстрировать повышенную опухолевую экспрессию одной или более чем одной иммунных контрольных точек, выбранной из группы, состоящей из CTLA-4, PD-L1 и CD47, по сравнению с нормальными клетками у субъекта.

Пептид WNT5A подходящим образом вводится совместно с антителом против PD-L1 и/или антителом против CTLA4, и где субъект, нуждающийся в этом, имеет повышенную опухолевую экспрессию CTLA-4 и/или PD-L1.

В контексте данного изобретения повышенная экспрессия означает то, что в клетке увеличивается количество клеточного компонента, такого как CTLA-4 и/или PD-L1, в ответ на внешний стимул, такой как обработка пептидом WNT5A или Foxy-5. Комплементарный процесс, который включает уменьшение уровня таких компонентов, называется понижающей регуляцией

Пептид WNT5A и производные, используемые в лечении рака у субъекта, нуждающегося в этом, где по меньшей мере один пептид выбран из группы, состоящей из следующих:

В одном воплощении пептид WNT5A в комбинации с одним или более ингибиторами контрольных точек для применения в лечении рака у субъекта, нуждающегося в этом, представляет собой гексапептид MDGCEL или его формилированное производное. Его формилированное производное в данном документе иногда называется Foxy-5.

В другом аспекте пептид WNT5A или его производные используются в лечении рака у субъекта, причем указанный субъект определяется как восприимчивый к ингибиторам иммунных контрольных точек, причем данный пептид WNT5A содержит X_ADGX_BEL (SEQ ID NO 2) или его формилированное производное, где Х_А представляет собой метионин (М) или норлейцин, Х_в представляет собой цистеин (С) или аланин (А), где общая длина данного пептида равна или меньше, чем 50 аминокислот.

В некоторых воплощениях субъект с диагностированным раком имеет повышенную опухолевую экспрессию одной или более чем одной иммунных контрольных точек, выбранной из группы, состоящей из CTLA-4, PD-L1 и CD47.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Данное изобретение будет более подробно описано ниже посредством неограничивающего примера воплощений и со ссылкой на графические материалы, в которых:

На Фиг. 1 показано влияние совместной обработки FOXY-5 и ICI на Т-клеточные ответы, специфичные для клеток рака молочной железы 4Т1. Клетки, образующие пятна IFNγ (интерферон-гамма), были подсчитаны после стимуляции пептидом, происходящим из gp70 MuLV (вирус лейкоза мышей).

На Фиг. 2a-2d показан объем опухоли после подкожной имплантации раковых клеток молочной железы 4Т1 мышам BALB-C с обработкой ICI и Foxy-5 и без нее.

На Фиг. 3 показано влияние Foxy-5 на экспрессию CD47 в клетках тройного негативного рака молочной железы мышей 4Т1 (при определении посредством вестерн-блоттинга и последующей денситометрии).

На Фиг. 4 показано влияние IFNγ и Foxy-5 на экспрессию PD-L1 в клетках тройного негативного рака молочной железы мышей 4Т1 (при определении посредством вестерн-блоттинга и последующей денситометрии).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Семейство белков WNT (сайт интеграции, связанный с Wingless) содержит высококонсервативные белки, которые играют роль в эмбриональном развитии, как, например, в формировании оси организма, пролиферации и миграции клеток. Пути сигнализации WNT являются либо каноническими, либо неканоническими, и они, прежде всего, запускают регуляцию транскрипции генов и повышенную пролиферацию посредством канонической сигнализации или регуляции нескольких непролиферативных функций через активацию разных неканонических путей сигнализации в клетках. Белки WNT дополнительно участвуют в регенерации тканей в костном мозге, коже и кишечнике взрослых. Генетическая мутация в пути сигнализации WNT может вызывать рак молочной железы, рак простаты, глиобластому, диабет типа II и другие заболевания.

Канонический путь WNT активирует β-катенин и является интегральным в регуляции самообновления нормальных стволовых клеток, а подрыв канонической сигнализации WNT связывали с онкогенезом. В отличие от этого, неканоническая сигнализация WNT отличается отсутствием увеличения сигнализации β-катенина, и была исследована ее роль в эмбриональном формообразовании, гаструляции и органогенезе. Кроме того, предлагали то, что неканоническая сигнализация WNT оказывает антагонистический эффект на каноническую сигнализацию. WNT5A является примером неканонического лиганда WNT. WNT5A является опухолеподавляющим при остром миелобластном лейкозе (AML), раке толстой кишки, включающем коло ректальный рак, раке молочной железы и простаты, и карциноме яичника.

WNT5A является белком, экспрессируемым многими нормальными клетками в организме. WNT5A секретируется из клеток и оказывает его действие на те же самые или соседние клетки посредством связывания с и активации рецепторного комплекса, главным образом, с участием рецептора Frizzled. Известно то, что белок WNT5A активирует разные рецепторы Frizzled. При активации рецептора Frizzled 5 активируется ряд событий сигнализации внутри клеток, где одним из первых событий является генерация короткоживущего увеличения уровня кальция внутри клетки - так называемый кальциевый сигнал. Данный кальциевый сигнал, в свою очередь, запускает ряд следующих событий сигнализации, приводя к изменению функций клеток, таких как адгезия и миграция. Таким образом, активация такого рецептора Frizzled приводит к событиям сигнализации внутри клетки, приводя к повышенной адгезии клетки с ее соседними клетками и ее адгезии с окружающей соединительной тканью, приводя к пониженной способности опухолевой клетки к миграции в структуры поблизости, такие как лимфатические узлы и кровеносные сосуды. В здоровых эпителиальных клетках молочной железы, например, WNT5A высоко экспрессируется и обеспечивает прочную адгезию между клетками и с окружающей базальной мембраной, и, посредством этого, ограничивает миграцию клеток.

Для того чтобы восстановить сигнализацию WNT5A в раковой ткани, в которой отсутствует эндогенная экспрессия WNT5A, разработали и затем дополнительно модифицировали маленький пептид, т.е. равный или меньший, чем 20 аминокислот, происходящих из аминокислотной последовательности молекулы WNT5A. Примером такого пептида является Foxy-5, который является подлинным агонистом WNT5A в том, что он запускает те же самые события сигнализации и функциональные ответы, что и WNT5A, и, по сравнению с WNT5A, он является значительно более простой молекулой и может вводиться системно и все еще достигать опухолевой ткани. Таким образом, термин «свойства сигнализации» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает связывание WNT5A или пептида Foxy-5, прежде всего, с белком-рецептором Frizzled (Fz), с последующим каскадом внутриклеточной сигнализации в клетке, в конечном счете приводящим к уменьшению уровня молекул контрольных точек, таких как PD-L1, CTLA4 и CD47. Таким образом, пептиды Wnt5A, включая Foxy-5, представляют собой агонисты, которые имитируют функцию WNT5A и, таким образом, не являются ингибиторами пути WNT.

Термин «окружающие нераковые клетки» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает морфологически нормальные клетки того же самого типа ткани, из которого возникла опухоль, закрывающие или окружающие опухолевую ткань.

Термин «контрольная точка» в контексте данного изобретения определяется как любой из белков, экспрессируемых опухолевой клеткой, Т-клеткой или NK-клеткой. Белок, экспрессируемый опухолевой клеткой, также иногда конкретно обозначается как лиганд контрольной точки, таким образом, что конкретный белок обозначается «L» в названии, как, например, PD-L1.

Термин «ингибитор контрольной точки» в контексте данного изобретения определяется как молекула, которая специфично связывается с белком контрольной точки, экспрессируемым любой опухолевой клеткой, Т-клеткой или NK-клеткой, как определено выше.

Термин «повышенная экспрессия» следует понимать как увеличение количества клеточного компонента, такого как CTLA-4 и/или PD-L1 в клетке, в ответ на внешний стимул, такой как обработка пептидом WNT5A или Foxy-5, по сравнению с клеткой, которая не подвергалась воздействию такого внешнего стимула.

Термин «восприимчивый» или «чувствительный» к ингибиторам иммунных контрольных точек следует понимать как субъектов, имеющих контрольные точки, предпочтительно экспрессию CTLA-4, PD-L1 и/или CD47 любыми опухолевыми клетками или инфильтрующими иммунными клетками, а также соответствующих им партнеров.

Термин «агонист» следует понимать как вещество, которое инициирует физиологический ответ при объединении с рецептором, в отличие от антагониста, который представляет собой вещество, которое препятствует или ингибирует физиологическое действию другого.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 (протокол LEV 197)

Цель: анализ иммунного ответа против ракового антигена, индуцированного после заражения опухолью, и лечение с использованием иммунотерапии у мышей BALB/c. Животных приобретали в возрасте 6-8 недель у Envigo, и давали им отдохнуть 1 неделю или более после прибытия перед включением в эксперименты.

• Заражение опухолью: сутки 0: 5*10^4 клеток 4T1-Luc в 100 мкл п.к. (подкожно).

• Инъекция Foxy-5 (в.б. (внутрибрюшинно), 100 мкл, 40 мкг на мышь): сутки 0, 4, 8, 12, 16 -> всего 200 мкг/мышь

• Когда большая часть опухолей является пальпируемой: инъекция PD-L1 (BioXcell ВЕ0146) и CTLA-4 (BioXcell ВЕ0164) (в.б., 100 мкл):

1-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 200 мкг

2-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 100 мкг

3-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 100 мкг

• Мышей умерщвляли

Результат на Фиг. 1. Заключение: от подкожных опухолей 4Т1-специфичные ответы Т-клеток с совместной обработкой Foxy-5 и ингибитором CTLA-4 или PD-L1 были непосредственно наблюдаемыми ex-vivo. Число клеток, образующих пятна IFNγ, возрастало после стимуляции пептидом gp70 MuLV в клетках от животных с совместной обработкой по сравнению с контролем в виде PBS или животными с одиночной обработкой.

Пример 2 (протокол LEV 221)

Цель: анализ иммунного ответа против ракового антигена, индуцированного после заражения опухолью и лечения с использованием иммунотерапии у мышей BALB/c.

• Заражение опухолью: сутки 0: 5*10^5 клеток 4Т1 в 100 мкл п.к.

• Инъекция Foxy-5 (в.б., 100 мкл, 40 мкг на мышь): сутки 0, 4, 8, 12, 16 -> всего необходимо 200 мкг/мышь

• Инъекция PD-L1 (BioXcell ВЕ0146) и CTLA-4 (BioXcell ВЕ0164) (в.б., 100 мкл) в сутки 8, 12 и 16:

1-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 200 мкг

2-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 100 мкг

3-я инъекция: PD-L1 - 200 мкг / CTLA-4 - 100 мкг

• Мышей умерщвляли в сутки 17.

Результат на Фиг. 2a-d. Заключение: высокодозовая имплантация клеток 4Tluc приводила к значимо меньшему росту опухолей (р меньше 0,05 при последних двух измерениях) в группах, обработанных ингибитором PD-L1 и CTLA-4, но, что наиболее любопытно, сверх совокупного эффекта в группе с объединенной обработкой Foxy-5/ICI.

Пример 3 (Фиг. 3 и 4 соответственно)

Цель: в данном контексте проверяли способность WNT5A - агониста, обозначенного Foxy-5, уменьшать экспрессию PD-L1 и CD47 на поверхности раковых клеток молочной железы и толстой кишки. Хорошо установлено то, что противофагоцитозная молекула клеточной поверхности CD47, генерирующая сигнал «не ешь меня», широко сверхэкспрессируется среди разных типов опухолей.

Исследование связи между сигнализацией WNT5A и экспрессией CD47 начали в линии клеток 4Т1 тройного негативного и WNTSA-негативного рака молочной железы. Результаты продемонстрировали существенную экспрессию CD47 в данных клетках, которая значимо снижалась при стимуляции Foxy-5 (24 ч, n равно 4).

Затем исследовали как Foxy-5 возможно влиял бы на экспрессию PD-L1 в клетках 4Т1. Наблюдали, что нестимулированные клетки 4Т1 в культуре ткани экспрессируют ограниченное количество PD-L1. Следовательно, происходила предварительная стимуляция (6 ч) интерфероном-гамма (IFNγ) - известным индуктором PD-L1 в раковых клетках, который присутствует в микроокружении опухоли. Обработка предварительно стимулированных IFNγ клеткок, которые «покоились» в течение ночи в отсутствие каких-либо стимулов, затем стимулировалась Foxy-5 (24 ч).

Заключение: известно, что CD47 представляет собой иммуносупрессивную контрольную точку, хотя он не исследовался также много как PD-1/PD-L1 в качестве иммунотерапевтической мишени при лечении рака у человека. Результаты на Фиг. 3 свидетельствуют о том, что Foxy-5 уменьшает экспрессию CD47, тем самым поддерживая его применение в лечении рака.

Обработка Foxy-5 приводила к значимо сниженной экспрессии PD-L1 в клетках, стимулированных IFNγ (Фиг. 4, n равно 5). Данные результаты подтверждают роль Foxy-5 в комбинированной терапии, продвигая существующие процессы лечения с использованием ингибиторов контрольных точек, посредством обеспечения снижения экспрессии PD-L1 для дополнения блокады PD-L1 и, в частности, посредством ингибирования CD47, который, как известно, действует синергически с блокадой PD-L1.

Уменьшение экспрессии CD47 малой молекулой будет весьма ценным, так как для блокады CD47 требуются крайне высокие дозы для достижения эффектвных уровней у человека.

Пример 4

Цель: проверка цитотоксического эффекта Foxy-5 и антитела против PD-L1, взятых отдельно или в комбинации, в анализе функционального иммунного ответа с разными линиями клеток рака молочной железы.

Способ

Одноядерные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из цельной крови с использованием центрифугирования в градиенте плотности на основе Ficoll Paque.

Клетки SKBR3 (с низким уровнем PD L1, обозначенные PD L1+) или НСС1954 (с высоким уровнем PD L1, обозначенные PD L1+++) окрашивали 0,1 мМ CFSE (сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина).

Эффекторные клетки (ЕС), т.е. РММС и клетки-мишени (ТС), т.к. клетки SKBR3 и НСС1954, соответственно, доводили до концентрации 2×10⁵ клеток/мл.

Клетки обрабатывали или не обрабатывали FoxyS (100 мкМ), данные клетки также обрабатывали или не обрабатывали пембролизумабом (10 мкг/мкл).

Клетки высаживали на чашки при соотношениях ЕС:ТС 1:1 (первый столбик), 5:1 (второй столбик) и 10:1 (третий столбик), наряду с контролями базовой гибели клеток и контролями гибели всех клеток. Сразу после посадки клетки осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 12 часов. Через 12 часов клетки повторно суспендировали с 5 мкг/мл 7AAD. Затем анализировали клетки на проточном цитометре Guava.

На основе картин окрашивания можно определять живую/мертвую клетку и дифференциацию иммунных/раковых клеток, и рассчитывали прямую цитотоксичность в показателях процентной доли гибели клеток.

Результаты на Фиг. 5 - линия клеток SKBR3

A. SKBR3, цитотоксичность относительно контроля в виде носителя:

Прямая цитотоксичность, вызванная РВМС против линии клеток SKBR3 в присутствии FOXY-5 и/или пембролизумаба по отношению к контролю в виде носителя. Показаны соотношения ЕС:ТС 1:1 (первый столбик), 5:1 (второй столбик) и 10:1 (третий столбик). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение экспериментов в тройной технической повторности. Для определения статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента. * обозначает р меньше 0,05.

B. SKBR3, комбинация в сравнении с одиночными агентами:

Прямая цитотоксичность, вызванная РВМС против линии клеток SKBR3 в присутствии FOXY-5 и пембролизумаба относительно любой из одиночных обработок. Показаны соотношения ЕС:ТС 1:1 (первый столбик), 5:1 (второй столбик) и 10:1 (третий столбик). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение экспериментов в тройной технической повторности. Для определения статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента. * обозначает р меньше 0,05.

Результаты на Фиг. 6 - линия клеток НСС1954

A. НСС1954, цитотоксичность относительно контроля в виде носителя:

Прямая цитотоксичность, вызванная РВМС против линии клеток НСС1954 в присутствии FOXY-5 и/или пембролизумаба относительно контроля в виде носителя. Показаны соотношения ЕС:ТС 1:1 (первый столбик), 5:1 (второй столбик) и 10:1 (третий столбик). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение экспериментов в тройной технической повторности. Для определения статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента. * обозначает р меньше 0,05.

B. НСС1954 - комбинация в сравнении с одиночными агентами:

Прямая цитотоксичность, вызванная РВМС против линии клеток SKBR3 в присутствии FOXY-5 и пембролизумаба относительно любой из одиночных обработок. Показаны соотношения ЕС:ТС 1:1 (первый столбик), 5:1 (второй столбик) и 10:1 (третий столбик). Планки погрешностей представляют стандартное отклонение экспериментов в тройной технической повторности. Для определения статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента. * обозначает р меньше 0,05.

Дальнейшее описание результатов:

SKBR3 (низкий уровень PD L1)

Относительно контроля в виде носителя: один Foxy5 не имел влияния на прямую цитотоксичность РВМС или трастузумаба, опоседованную ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность). Один пембролизумаб увеличивал прямую цитотоксичность РВМС при соотношении 10:1 и снижал опосредованную трастузумабом ADCC при соотношениях 10:1 и 5:1, Foxy5 плюс пембролизумаб увеличивали прямую цитотоксичность РВМС при всех трех соотношениях (1:1, 5:1 и 10:1).

Комбинация в сравнении с одиночными агентами: комбинация Foxy5 и пембролизумаба увеличивала прямую цитотоксичность при всех трех соотношениях.

НСС1954 (высокий уровень PD L1)

Относительно контроля в виде носителя: один Foxy5 увеличивал прямую цитотоксичность РВМС при соотношениях 5:1 и 10:1. Один пембролизумаб увеличивал прямую цитотоксичность РВМС при соотношениях 5:1 и 10:1. Foxy5 плюс пембролизумаб увеличивали прямую цитотоксичность РВМС при всех трех соотношениях, и снижали опосредованную трастузумабом ADCC при соотношениях 5:1 и 10:1. Foxy5 увеличивал общую цитотоксичность при соотношениях 1:1 и 5:1 при использовании одиночно и в комбинации с пембролизумабом.

Комбинация в сравнении с одиночными агентами

Foxy-5 увеличивал прямую цитотоксичность и общую цитотоксичность при добавлении к пембролизумабу при соотношениях 1:1 и 5:1. Пембролизумаб увеличивал прямую цитотоксичность при добавлении к Foxy-5 при соотношениях 1:1 и 10:1.

Пембролизумаб также обозначается пембро, Foxy-5 также обозначается F.

Заключение

В заключение, в приведенных выше экспериментах показано, что обработка клеток SKBR3 и НСС1954 с использованием Foxy-5 в комбинации с пембролизумабом - ингибитором контрольных точек PD-L1 - является цитотоксической для раковых клеток, и что комбинация двух данных лекарственных средств является более цитотоксической для клеток, чем при обработке клеток данными лекарственными средствами по отдельности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> WntResearch AB

<120> ПЕПТИДЫ В КОМБИНАЦИИ С ИНГИБИТОРАМИ ИММУННЫХ КОНТРОЛЬНЫХ ТОЧЕК ДЛЯ

ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ РАКА

<130> 139396

<160> 17

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 380

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens WNT5A

<400> 1

Met Lys Lys Ser Ile Gly Ile Leu Ser Pro Gly Val Ala Leu Gly Met

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val Ala Leu Ala Ile

20 25 30

Phe Phe Ser Phe Ala Gln Val Val Ile Glu Ala Asn Ser Trp Trp Ser

35 40 45

Leu Gly Met Asn Asn Pro Val Gln Met Ser Glu Val Tyr Ile Ile Gly

50 55 60

Ala Gln Pro Leu Cys Ser Gln Leu Ala Gly Leu Ser Gln Gly Gln Lys

65 70 75 80

Lys Leu Cys His Leu Tyr Gln Asp His Met Gln Tyr Ile Gly Glu Gly

85 90 95

Ala Lys Thr Gly Ile Lys Glu Cys Gln Tyr Gln Phe Arg His Arg Arg

100 105 110

Trp Asn Cys Ser Thr Val Asp Asn Thr Ser Val Phe Gly Arg Val Met

115 120 125

Gln Ile Gly Ser Arg Glu Thr Ala Phe Thr Tyr Ala Val Ser Ala Ala

130 135 140

Gly Val Val Asn Ala Met Ser Arg Ala Cys Arg Glu Gly Glu Leu Ser

145 150 155 160

Thr Cys Gly Cys Ser Arg Ala Ala Arg Pro Lys Asp Leu Pro Arg Asp

165 170 175

Trp Leu Trp Gly Gly Cys Gly Asp Asn Ile Asp Tyr Gly Tyr Arg Phe

180 185 190

Ala Lys Glu Phe Val Asp Ala Arg Glu Arg Glu Arg Ile His Ala Lys

195 200 205

Gly Ser Tyr Glu Ser Ala Arg Ile Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu

210 215 220

Ala Gly Arg Arg Thr Val Tyr Asn Leu Ala Asp Val Ala Cys Lys Cys

225 230 235 240

His Gly Val Ser Gly Ser Cys Ser Leu Lys Thr Cys Trp Leu Gln Leu

245 250 255

Ala Asp Phe Arg Lys Val Gly Asp Ala Leu Lys Glu Lys Tyr Asp Ser

260 265 270

Ala Ala Ala Met Arg Leu Asn Ser Arg Gly Lys Leu Val Gln Val Asn

275 280 285

Ser Arg Phe Asn Ser Pro Thr Thr Gln Asp Leu Val Tyr Ile Asp Pro

290 295 300

Ser Pro Asp Tyr Cys Val Arg Asn Glu Ser Thr Gly Ser Leu Gly Thr

305 310 315 320

Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu

325 330 335

Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asp Gln Phe Lys Thr Val Gln Thr

340 345 350

Glu Arg Cys His Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Lys

355 360 365

Lys Cys Thr Glu Ile Val Asp Gln Phe Val Cys Lys

370 375 380

<210> 2

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1..1

<223> Xaa в положении 1 представляет собой метионин или норлейцин

<220>

<221> MOD_RES

<222> 4..4

<223> Xaa в положении 4 представляет собой цистеин или аланин

<400> 2

Xaa Asp Gly Xaa Glu Leu

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 7

Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 8

Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 9

Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 10

Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 14

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 11

Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 12

Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 17

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 14

Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu

1 5 10 15

Leu

<210> 15

<211> 18

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 15

Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys

1 5 10 15

Glu Leu

<210> 16

<211> 19

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 16

Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly

1 5 10 15

Cys Glu Leu

<210> 17

<211> 20

<212> ПРТ

<213> Homo sapiens

<400> 17

Leu Gly Thr Gln Gly Arg Leu Cys Asn Lys Thr Ser Glu Gly Met Asp

1 5 10 15

Gly Cys Glu Leu

20

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает возможность осуществления комбинированной терапии различных онкологических заболеваний с применением пептида WNT5A или его формилированного производного в комбинации с одним или более ингибитором контрольных точек. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек для применения в лечении рака толстой кишки, колоректального рака или рака молочной железы у субъекта, нуждающегося в этом,

причем указанный пептид WNT5A содержит XADGXBEL (SEQ ID NO: 2) или ее формилированное производное, где ХА представляет собой метионин (М) или норлейцин, XB представляет собой цистеин (С) или аланин (А),

при этом общая длина указанного пептида равна или меньше чем 50 аминокислот,

где по меньшей мере один ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор молекулы иммунной контрольной точки, выбранной из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, PD-L1 и CD47.

2. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по п. 1, где указанный субъект определяется как восприимчивый к ингибиторам иммунных контрольных точек.

3. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1, 2, где ингибитор контрольной точки представляет собой антитело против CTLA-4, антитело против PD-1, антитело против PD-L1 и/или антитело против CD47.

4. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по п. 3, где антитело против CTLA-4 представляет собой ипилимумаб или тремелимумаб.

5. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по п. 3, где антитело против PD-L1 представляет собой атезолизумаб, авелумаб, дурвалумаб или пембролизумаб.

6. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1-5, где используемая дозировка ингибитора контрольной точки снижена по сравнению с дозировкой, используемой без одновременного или последовательного введения WNT5A.

7. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1-6, где субъект, нуждающийся в лечении, имеет повышенную опухолевую экспрессию одной или более молекул иммунных контрольных точек, выбранных из группы, состоящей из CTLA-4, PD-L1 и/или CD47.

8. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1-7, где ингибитор контрольной точки представляет собой антитело против PD-L1 и/или антитело против CTLA4, и где субъект, нуждающийся в лечении, имеет повышенную опухолевую экспрессию CTLA-4, PD-L1 и/или CD47.

9. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1-8, где пептид WNT5A выбран из группы, состоящей из:

MDGCEL (SEQ ID NO 3),

GMDGCEL (SEQ ID NO 4),

EGMDGCEL (SEQ ID NO 5),

SEGMDGCEL (SEQ ID NO 6),

TSEGMDGCEL (SEQ ID NO 7),

KTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 8),

NKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 9),

CNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 10),

LCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 11),

RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 12),

GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 13),

QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 14),

TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 15),

GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 16) и

LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 17).

10. Комбинация пептида WNT5A или его формилированного производного и одного или более ингибиторов контрольных точек по любому из пп. 1-9, где пептид WNT5A представляет собой гексапептид MDGCEL (SEQ ID NO 3).

11. Применение пептида WNT5A или его формилированного производного в лечении рака толстой кишки, колоректального рака или рака молочной железы у субъекта,

причем указанный субъект определяется как восприимчивый к ингибиторам иммунных контрольных точек, и

указанный субъект имеет повышенную опухолевую экспрессию одной или более молекул иммунных контрольных точек, выбранных из группы, состоящей из CTLA-4, PD-L1 и/или CD47,

причем указанный пептид WNT5A содержит XADGXBEL (SEQ ID NO 2) или ее формилированное производное, где ХА представляет собой метионин (М) или норлейцин, XB представляет собой цистеин (С) или аланин (А), при этом общая длина указанного пептида равна или меньше, чем 50 аминокислот.

12. Применение пептида WNT5A или его формилированного производного по п. 11, где указанный пептид WNT5A выбран из

группы, состоящей из:

MDGCEL (SEQ ID NO 3),

GMDGCEL (SEQ ID NO 4),

EGMDGCEL (SEQ ID NO 5),

SEGMDGCEL (SEQ ID NO 6),

TSEGMDGCEL (SEQ ID NO 7),

KTSEG MDGCEL (SEQ ID NO 8),

NKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 9),

CNKTS EGMDGCEL (SEQ ID NO 10),

LCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 11),

RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 12),

GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 13),

QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 14),

TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 15),

GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 16) и

LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ ID NO 17).