Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с полипептидом регуляторной легкой цепи миозина (Myl)9, или к его Myl9-связывающему фрагменту, а также к фармацевтической композиции, содержащей указанные антитело или его Myl9-связывающий фрагмент.

[0002]

Уровень техники

CD69 представляет собой трансмембранный белок II типа, который принадлежит к семейству лектинов C-типа. CD69 широко используется в качестве индикатора активации лимфоцитов (непатентный литературный источник 1), и, как сообщалось до настоящего времени, вовлечен в воспалительные заболевания, такие как очаговое воспаление, артрит и симптомы аллергии дыхательных путей (непатентные литературные источники 2 и 3).

[0003]

В последние годы сообщалось, что CD69 взаимодействует с полипептидом регуляторной легкой цепи миозина (Myl)9, который представляет собой одну из субъединиц, составляющих миозин, и при этом были представлены стратегии терапии воспалительных заболеваний, которые нацелены на Myl9 (патентный литературный источник 1).

Ингибитор контрольных точек иммунного ответа представляет собой группу недавно разработанных противораковых лекарственных средств, и он ингибирует белки, экспрессируемые в раковых клетках и лимфоцитах (T-клетках), которые тормозят функционирование иммунной системы. Эти белки называют контрольными точками иммунного ответа. Известно, что белок 1 программируемой клеточной смерти (PD-1), лиганд 1 белка программируемой клеточной смерти (PD-L1), антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA-4), и подобные молекулы действуют в качестве контрольных точек иммунного ответа. Несколько ингибиторов контрольных точек иммунного ответа были одобрены в качестве лекарственных средств, и их пути терапевтического применения включают применение при злокачественной меланоме, немелкоклеточном раке легкого, почечноклеточной карциноме, злокачественной лимфоме, множественной миеломе, раке головы и шеи и уротелиальном раке. Кроме того, лечение ингибиторами контрольных точек иммунного ответа в отдельности или в комбинации с другим противораковым лекарственным средством является эффективным против раковых заболеваний, таких как рак ободочной и прямой кишки, рак молочной железы, гепатоцеллюлярная карцинома, рак желудка, рак пищевода, рак яичника, мелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, рак эндометрия, согласно результатам клинических испытаний.

Список использованной литературы

Патентная литература

[0004]

[Патентный литературный источник 1] WO2014/192915

Непатентная литература

[0005]

[Непатентный литературный источник 1] Testi, R. et al., Immunol. Today 15:479-483, 1994.

[Непатентный литературный источник 2] Murata, K. et al.: CD69-null mice protected from arthritis induced with anti-type II collagen antibodies. Int. Immunol. 15:987-992, 2003

[Непатентный литературный источник 3] Miki-Hosokawa, T. et al.: CD69 controls the pathogenesis of allergic airway inflammation. J. Immunol. 183; 8203-8215, 2009

Краткое описание изобретения

Техническая задача

[0006]

Антитела и антигенсвязывающие фрагменты могут становиться желаемыми терапевтическими лекарственными средствами благодаря специфичности связывания, которой они обладают. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно использовать для минимизации потенциальных побочных эффектов путем нацеливания исключительно на конкретные клетки или ткани. Существует потребность в идентификации антитела, применимого для нацеливания на Myl9, а также гуманизированного антитела, которое применяется в качестве фармацевтического средства.

[0007]

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение антитела к Myl9 или его Myl9-связывающего фрагмента, которые связываются с Myl9 и могут ингибировать взаимодействие между Myl9 и CD69 у людей, а также фармацевтической композиции, содержащей их.

Решение задачи

[0008]

В результате обширного исследования для решения вышеупомянутых задач авторы настоящего изобретения успешно получили мышиное моноклональное антитело к Myl9 мыши/человека, которое связывается с Myl9 человека и мыши и может ингибировать взаимодействие с CD69. В результате этого авторы настоящего изобретения получили гуманизированное или химерное антитело, содержащее последовательность области, определяющей комплементарность (CDR (иногда может называться "гипервариабельной областью")), указанного мышиного моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека в вариабельной области тяжелой и легкой цепей, путем идентификации CDR указанного мышиного моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека.

Другими словами, настоящее изобретение охватывает следующие отличительные признаки.

[0009] [1] Антитело к полипептиду регуляторной легкой цепи миозина (Myl)9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 28;

(b) CDR2 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 30;

(c) CDR3 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 32;

(d) CDR1 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 33;

(e) CDR2 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 34; и

(f) CDR3 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 35.

[00010]

[2] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [1], где указанное антитело представляет собой гуманизированное или химерное антитело.

[00011]

[3] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [1] или [2], где указанный Myl9 представляет собой Myl9 человека.

[00012]

[4] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1]-[3], которые ингибируют взаимодействие между Myl9 и CD69, где

указанное антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь,

вариабельная область указанной тяжелой цепи содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64, и

вариабельная область указанной легкой цепи содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 65, 66, 67 или 68.

[00013]

[5] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1]-[4], где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из следующих антител:

(1) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(2) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(3) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(4) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(5) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(6) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(7) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(8) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 60, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(9) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 61, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66;

(10) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(11) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(12) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(13) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(14) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(15) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(16) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(17) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 60, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(18) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 61, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68;

(19) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 65;

(20) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 67;

(21) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66; и

(22) антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00014]

[6] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1]-[5], которые содержат тяжелую и легкую цепи, где константная область указанной тяжелой цепи принадлежит к IgG.

[00015]

[7] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [6], где константная область указанной тяжелой цепи представляет собой константную область человеческого IgG2.

[00016]

[8] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [7], где указанная константная область человеческого IgG2 имеет мутации V234A и G237A.

[00017]

[9] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [7] или [8], где указанная константная область имеет делецию С-концевого лизинового остатка.

[00018]

[10] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [6], где константная область указанной легкой цепи включает в себя константную область человеческого Igκ.

[00019]

[11] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1]-[10], где указанные антитело или его Myl9-связывающий фрагмент ингибируют взаимодействие между Myl12a или Myl12b и CD69.

[00020]

[12] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1]-[11] и фармацевтически приемлемый носитель или добавку.

[00021]

[13] Фармацевтическая композиция согласно [12] для лечения аллергического воспаления дыхательных путей или воспалительного заболевания кишечника.

[00022]

[14] Фармацевтическая композиция согласно [13], где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит или болезнь Крона.

[00023]

[15] Фармацевтическая композиция согласно [12] для лечения опухоли, где фармацевтическая композиция применяется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунного ответа.

[00024]

[16] Фармацевтическая композиция согласно [15], где ингибитор контрольных точек иммунного ответа представляет собой ингибитор PD-1.

[00025]

[17] Фармацевтическая композиция согласно [16], где ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1.

[18] Фармацевтическая композиция согласно [16], где ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-1.

[00026]

[19] Фармацевтическая композиция согласно любому из [15]-[18], где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака ободочной и прямой кишки, злокачественной меланомы, немелкоклеточного рака легкого, почечноклеточной карциномы, злокачественной лимфомы, множественной миеломы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака пищевода, рака яичника, мелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы и рака эндометрия.

[20] Фармацевтическая композиция согласно [19], где опухоль представляет собой рак ободочной и прямой кишки.

[00027]

Кроме того, настоящее изобретение охватывает следующие отличительные признаки.

[1'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00028]

[2'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00029]

[3'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00030]

[4'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00031]

[5'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00032]

[6'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00033]

[7'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00034]

[8'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 60, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00035]

[9'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 61, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00036]

[10'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 64, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00037]

[11'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 63, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00038]

[12'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00039]

[13'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00040]

[14'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00041]

[15'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00042]

[16'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00043]

[17'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 60, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00044]

[18'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 61, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00045]

[19'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 65.

[00046]

[20'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 67.

[00047]

[21'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 66.

[00048]

[22'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 62, и вариабельную область легкой цепи, содержащую пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 68.

[00049]

[23'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1']-[22'], которые ингибируют взаимодействие между Myl9 и CD69.

[00050]

[24'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1']-[23'], которые содержат тяжелую и легкую цепи, где константная область указанной тяжелой цепи принадлежит к IgG.

[00051]

[25'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [24'], где константная область указанной тяжелой цепи представляет собой константную область человеческого IgG2.

[00052]

[26'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [25'], где указанная константная область человеческого IgG2 имеет мутации V234A и G237A.

[00053]

[27'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [25'] или [26'], где указанная константная область имеет делецию С-концевого лизинового остатка.

[00054]

[28'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно [24'], где константная область указанной легкой цепи включает в себя константную область человеческого Igκ.

[29'] Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1']-[28'], где указанные антитело или его Myl9-связывающий фрагмент ингибируют взаимодействие между Myl12a или Myl12b и CD69.

[00055]

[30'] Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его Myl9-связывающий фрагмент согласно любому из [1']-[29'] и фармацевтически приемлемый носитель или добавку.

[00056]

[31'] Фармацевтическая композиция согласно [30'] для лечения аллергического воспаления дыхательных путей или воспалительного заболевания кишечника.

[00057]

[32'] Фармацевтическая композиция согласно [31'], где воспалительное заболевание кишечника представляет собой неспецифический язвенный колит или болезнь Крона.

[00058]

[33'] Фармацевтическая композиция согласно [30'] для лечения опухоли, где фармацевтическая композиция применяется в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунного ответа.

[00059]

[34'] Фармацевтическая композиция согласно [33'], где ингибитор контрольных точек иммунного ответа представляет собой ингибитор PD-1.

[00060]

[35'] Фармацевтическая композиция согласно [34'], где ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1.

[36'] Фармацевтическая композиция согласно [34'], где ингибитор PD-1 представляет собой антитело к PD-1.

[00061]

[37'] Фармацевтическая композиция согласно любому из [33']-[36'], где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака ободочной и прямой кишки, злокачественной меланомы, немелкоклеточного рака легкого, почечноклеточной карциномы, злокачественной лимфомы, множественной миеломы, рака головы и шеи, уротелиального рака, рака молочной железы, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака пищевода, рака яичника, мелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы и рака эндометрия.

[38'] Фармацевтическая композиция согласно [37'], где опухоль представляет собой рак ободочной и прямой кишки.

[00062]

Изобретение с любой комбинацией одного или нескольких аспектов настоящего изобретения, перечисленных выше, также охватывается объемом настоящего изобретения.

Полезные эффекты изобретения

[00063]

В соответствии с настоящим изобретением представлены антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент, которые связываются с Myl9 и могут ингибировать взаимодействие между Myl9 и CD69, а также фармацевтическая композиция, содержащая их.

Краткое описание графических материалов

[00064]

На фигуре 1-1 показано каждое из сравнения аминокислотных последовательностей Myl9 мыши и Myl9 человека (A) и сравнения аминокислотных последовательностей Myl3 мыши и Myl3 человека (B). *: консервативная аминокислота; -: гэп; подчеркивание: аминокислотная последовательность пептида, применяемого для иммунизации мышей с целью получения антитела A.

На фигуре 1-2 показано каждое из сравнения аминокислотных последовательностей Myl3 мыши и Myl9 мыши (С) и сравнения аминокислотных последовательностей Myl3 человека и Myl9 человека (D). *: консервативная аминокислота; -: гэп.

На фигуре 2 представлен результат, демонстрирующий способность моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) к связыванию с Myl9 мыши и Myl9 человека, а также с Myl3 мыши и Myl3 человека.

На фигуре 3 показано зависимое от концентрации связывание CD69 мыши с сахарной цепью (A) или без нее (B) с Myl9 мыши, а также то, что указанное связывание в значительной степени ингибировалось моноклональным антителом к Myl9 мыши/человека (антителом A) (C).

На фигуре 4-1 показан подавляющий эффект введения моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) в отношении инфильтрации клеток вокруг бронхиолы, индуцируемой во время воспаления дыхательных путей. На фигуре 4A показаны результаты окрашивания гематоксилином/эозином (окрашивания HE) и окрашивания PAS после введения моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) мышам с индуцированным воспалением дыхательных путей. На фигуре 4B показано число инфильтрирующих клеток, наблюдаемых в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, и типы инфильтрирующих клеток после введения моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) мышам с индуцированным воспалением дыхательных путей. На фигуре 4С показано количество цитокина, вырабатываемого после введения моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) мышам с индуцированным воспалением дыхательных путей.

На фигуре 4-2 показано сравнение индуцированного метахолином сопротивления дыхательных путей в день 17 после индуцирования воспаления дыхательных путей между группой введения антитела А (D), группой введения поликлонального антитела к Myl9/12 (E) и группами введения контрольного антитела (D, E).

На фигуре 5 показаны результаты потери веса (верхняя фигура) и индекс активности заболевания (DAI) (нижняя фигура) вследствие влияния моноклонального антитела к Myl9 мыши/человека (антитела A) в модели воспалительного заболевания кишечника с переносом CD4-положительных CD45RB-резко положительных (CD4+ CD45RB^{высокий}) T-лимфоцитов.

На фигуре 6-1 показаны результаты ELISA, дающие оценку способности химерных и гуманизированных антител, полученных из антитела A, к связыванию с Myl9 человека.

На фигуре 6-2 показаны результаты ELISA, дающие оценку способности химерных и гуманизированных антител, полученных из антитела A, к связыванию с Myl9 человека.

На фигуре 6-3 показаны результаты ELISA, дающие оценку способности химерных и гуманизированных антител, полученных из антитела A, к связыванию с Myl9 человека.

На фигуре 7 показано каждое из сравнения аминокислотных последовательностей Myl9 мыши, Myl12a мыши и Myl12b мыши (A) и сравнения аминокислотных последовательностей Myl9 человека, Myl12a человека и Myl12b человека (B). *: консервативная аминокислота; -: гэп; подчеркивание: аминокислотная последовательность пептида, применяемого для иммунизации мышей с целью получения антитела A.

На фигуре 8 показаны результаты ELISA, дающие оценку способности антитела A к связыванию с Myl9 мыши, Myl12a мыши и Myl12b мыши (A), а также с Myl9 человека, Myl12a человека и Myl12b человека (B).

На фигуре 9A показаны результаты ELISA, дающие оценку способности химерных и гуманизированных антител, полученных из антитела A, к связыванию с Myl12a и 12b человека.

На фигуре 9В показаны результаты ELISA, дающие оценку способности гуманизированного антитела, полученного из антитела A, к связыванию с Myl12a и 12b человека.

На фигуре 9С показаны результаты ELISA, дающие оценку способности гуманизированного антитела, полученного из антитела A, к связыванию с Myl12a и 12b человека.

На фигуре 10 показано сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных областей CD69 человека и мыши.

На фигуре 11 показано зависимое от концентрации связывание внеклеточной области CD69 человека с Myl9 человека, а также Myl12a и 12b, характеризующимися высокой степенью гомологии в отношении Myl9 человека.

На фигуре 12 показаны результаты зависимого от концентрации ингибирования антителом A связывания между внеклеточными областями CD69 человека и Myl9 человека (A), Myl12a человека (B) или Myl12b человека (C).

На фигуре 13-1 показаны результаты зависимого от концентрации ингибирования химерными и гуманизированными антителами, полученными из антитела A, связывания между Myl9 человека и внеклеточной областью CD69 человека.

Фигура 13-2 является продолжением фигуры 13-1.

Фигура 13-3 является продолжением фигуры 13-2.

Фигура 13-4 является продолжением фигуры 13-3.

Фигура 13-5 является продолжением фигуры 13-4.

На фигуре 14-1 показаны результаты зависимого от концентрации ингибирования химерными и гуманизированными антителами, полученными из антитела A, связывания между Myl12a человека или Myl12b человека и внеклеточной областью CD69 человека.

Фигура 14-2 является продолжением фигуры 14-1.

Фигура 14-3 является продолжением фигуры 14-2.

Фигура 14-4 является продолжением фигуры 14-3.

На фигуре 15 показаны результаты анализа экспрессии Myl9, Myl12a и Myl12b в ткани подкожной опухоли в линии мышиных раковых клеток ободочной и прямой кишки CT26.WT.

На фигуре 16 показано ингибирование роста опухоли в контрольной группе (A), группе введения антитела А в отдельности (B), группе введения антитела к PD-1 в отдельности (C) и группе введения комбинации антитела А и антитела к PD-1 (D) в моделях подкожной трансплантации линии мышиных раковых клеток ободочной и прямой кишки CT26.WT.

Описание вариантов осуществления

[00065]

Настоящее изобретение относится к антителу к Myl9, которое связывается с полипептидом регуляторной легкой цепи миозина (далее в данном документе называемым Myl) 9.

[00066]

Антитело к Myl9, применяемое в настоящем изобретении, представляет собой антитело, которое может распознавать и связывать Myl9, и, как описывается ниже, указанное антитело может представлять собой интактное антитело. В качестве альтернативы, антитело к Myl9, применяемое в настоящем изобретении, может представлять собой рекомбинантное антитело (такое как химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело) или химически синтезированное антитело, а также его антигенсвязывающий фрагмент, при условии, что они обладают аффинностью связывания с Myl9. В настоящем документе Myl9 можно понимать как означающий Myl9, происходящий от человека или мыши. Аминокислотная последовательность Myl9, происходящего от человека или мыши, может быть получена из общедоступных баз данных, где регистрируется информация о последовательностях генов и аминокислотных последовательностях, таких как Genbank, предоставляемая Национальным центром биотехнологической информации США, или аминокислотная последовательность может быть определена на основании информации о последовательности гена Myl9, получаемой путем разработки праймера на основании информации о последовательности оснований в Myl9 близкородственного вида животного и клонирования из РНК, экстрагированной из животных желаемых видов. Например, информация об аминокислотной последовательности Myl9 человека и мыши зарегистрирована в базе данных под № доступа в Genbank NP_006088.2 (SEQ ID NO: 2) и № доступа в Genbank NP_742116.1 (SEQ ID NO: 1) соответственно.

[00067]

В одном аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 1, или пептид, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной аминокислотной последовательности. "Несколько", как используется в настоящем документе в отношении Myl9, не ограничено при условии сохранения функциональных свойств, эквивалентных таковым у пептида, представленного его исходной аминокислотной последовательностью, и составляет от 2 до 20, например, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6 или от 2 до 5. В другом аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 1.

[00068]

Как используется в настоящем документе, "степень гомологии" аминокислотной последовательности означает степень гомологии, вычисленную с помощью алгоритма CLUSTALW с использованием попарного выравнивания при следующей установке параметров:

Размер участка максимального совпадения (слова): 1

Размер окна: 5

Штраф за введение гэпа: 3

Число непрерывно совпадающих к-плетов: 5

Метод оценки: ПРОЦЕНТНЫЙ

[00069]

В одном аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 2, или пептид, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной аминокислотной последовательности. "Несколько", как используется в настоящем документе в отношении Myl9, не ограничено при условии сохранения функциональных свойств, эквивалентных таковым у пептида, представленного его исходной аминокислотной последовательностью, и составляет от 2 до 20, например, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6 или от 2 до 5. В другом аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 2.

[00070]

В одном аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 3, или пептид, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной аминокислотной последовательности. "Несколько", как используется в настоящем документе в отношении Myl9, не ограничено при условии сохранения функциональных свойств, эквивалентных таковым у пептида, представленного его исходной аминокислотной последовательностью, и составляет от 2 до 20, например, от 2 до 15, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6 или от 2 до 5. В другом аспекте настоящего изобретения Myl9 содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 3.

[00071]

В одном аспекте настоящего изобретения аминокислотные последовательности Myl9 мыши и Myl12a мыши, а также Myl9 мыши и Myl12b мыши соответственно характеризуются 94,2% и 93,6% степенью гомологии, а Myl12a мыши и Myl12b мыши характеризуются 97,7% степенью гомологии. Аминокислотные последовательности Myl9 человека и Myl12a человека, а также Myl9 человека и Myl12b человека соответственно характеризуются 91,8% и 93,0% степенью гомологии, а Myl12a человека и Myl12b человека характеризуются 96,5% степенью гомологии. По этой причине антитело, которое распознает Myl9, иногда распознает Myl12a. Более того, антитело, которое распознает Myl9, иногда распознает Myl12b. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением также могут распознавать Myl12a и/или Myl12b.

[00072]

В одном аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляют собой антитело, которое ингибирует связывание между Myl9 и внеклеточной областью CD69. Например, антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые ингибируют связывание между любой частью внеклеточной области CD69 и Myl9, который содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 4, или пептид, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной аминокислотной последовательности. "Несколько", как используется в настоящем документе в отношении внеклеточной области CD69, составляет без ограничения от 2 до 15, например, от 2 до 14, от 2 до 13, от 2 до 12, от 2 до 11, от 2 до 10, от 2 до 9, от 2 до 8, от 2 до 7, от 2 до 6 или от 2 до 5. В другом аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые ингибируют связывание между любой частью внеклеточной области CD69, которая содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 4, и Myl9.

[00073]

В другом аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляют собой антитело, которое ингибирует связывание между Myl12a и/или Myl12b и внеклеточной областью CD69. Например, антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые ингибируют связывание между любой частью внеклеточной области CD69, которая содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 97, или пептид, представленный аминокислотной последовательностью, имеющей замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной аминокислотной последовательности, и Myl12a и/или Myl12b. В другом аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые ингибируют связывание между любой частью внеклеточной области CD69, которая содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении аминокислотной последовательности, приведенной под SEQ ID NO: 97, и Myl12a и/или Myl12b.

[00074]

В одном аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент могут связываться с Myl9 млекопитающего (например, грызунов, таких как мышь, крыса, или кролика, обезьяны, коровы, лошади, козы, человека и т. п.) с ингибированием взаимодействия между Myl9 и CD69 и предпочтительно могут связываться с Myl9 человека с ингибированием взаимодействия между Myl9 человека и CD69 человека. "Ингибирует взаимодействие между Myl9 и CD69" в настоящем документе означает исчезновение или снижение взаимодействия между Myl9 и CD69. Взаимодействие между Myl9 и CD69 можно оценить путем измерения изменения функции CD69, которое является результатом совместного действия Myl9 и CD69 (например, экспрессии или усиления функции CD69 или физиологической функции в результате изменения функции CD69 вследствие действия Myl9), или путем измерения миграции CD4+ T-клеток, которые имеют экспрессируемый CD69, в костный мозг.

[00075]

В другом аспекте настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент также могут связываться с Myl12a и/или Myl12b млекопитающего (например, грызунов, таких как мышь, крыса, или кролика, обезьяны, коровы, лошади, козы, человека и т. п.) с ингибированием взаимодействия между Myl12a и/или Myl12b и CD69 и предпочтительно также могут связываться с Myl12a человека и/или Myl12b человека с ингибированием взаимодействия между Myl12a человека и/или Myal12b человека и CD69 человека. "Ингибирует взаимодействие между Myl12a и/или Myl12b и CD69" в настоящем документе означает исчезновение или снижение взаимодействия между Myl12a и/или Myl12b и CD69. Взаимодействие между Myl12a и/или Myl12b и CD69 можно оценить путем измерения изменения функции CD69, которое является результатом совместного действия Myl12a и/или Myl12b и CD69 (например, экспрессии или усиления функции CD69 или физиологической функции в результате изменения функции CD69 вследствие действия Myl12a и/или Myl12b), или путем измерения миграции CD4+ T-клеток, которые имеют экспрессируемый CD69, в костный мозг.

[00076]

Способом, используемым для измерения свойства связывания антигена (такого как аффинность связывания и межвидовая реактивность) у антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, может являться способ, хорошо известный специалистам в данной области. Например, аффинность связывания можно измерить с помощью, без ограничения, биосенсора Biacore^®, биосенсора KinExA, сцинтилляционного анализа сближения, ELISA, иммунологического анализа ORIGEN (IGEN Inc.), проточной цитометрии, тушения флуоресценции, флуоресцентного перехода, дрожжевого дисплея или иммуноокрашивания и т.п. Нейтрализующую активность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в отношении связывания между Myl9 и CD69 можно измерить с помощью, без ограничения, биосенсора Biacore^®, ELISA или проточной цитометрии и т.п.

[00077]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно могут представлять собой любое из моноклонального антитела, поликлонального антитела или их Myl9-связывающего фрагмента, которые связываются с Myl9 или другими пептидными молекулами, имеющими аминокислотную последовательность области связывания Myl9 с указанным антителом.

[00078]

Моноклональное антитело в настоящем документе может означать антитело, полученное из популяции практически однородных антител. Другими словами, отдельные антитела, содержащиеся в указанной популяции, являются идентичными, за исключением возможного присутствия небольшого количества существующих в природе мутантных форм. Моноклональное антитело направлено против одного сайта антигена. Кроме того, в отличие от типичного поликлонального антитела, которое нацеливается на разные антигены или разные эпитопы, каждое моноклональное антитело нацеливается на один эпитоп антигена. Определение "моноклональное" указывает на свойство антитела, полученного из популяции практически однородных антител, и оно не должно истолковываться как ограниченное необходимостью получения антител конкретным способом.

[00079]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением в настоящем документе могут принадлежать к любому классу, такому как IgG, IgA или IgM (или их подклассу), и не ограничены конкретным классом. Иммуноглобулины разделяют на различные классы в зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи (иногда называемой Н-цепью) антитела. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, некоторые из которых могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), такие как IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные области тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, соответственно называются α, δ, ε, γ и μ. Более того, типы легкой цепи (иногда называемой L-цепью) антитела включают в себя λ- и κ-цепи.

[00080]

В одном аспекте антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут представлять собой антитело IgG, например, антитело IgG₁ или антитело IgG₂ и т. п. Более того, антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут находиться в форме мономера, димера или мультимера.

[00081]

Myl9-связывающий фрагмент в настоящем документе представляет собой функциональный и структурный фрагмент антитела к Myl9 и конкретно не ограничен, при условии, что он обладает способностью к связыванию с Myl9. Примеры такого Myl9-связывающего фрагмента могут включать в себя без ограничения Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, одноцепочечный (ScFv), их варианты, слитый белок или слитый пептид, содержащие часть антитела, другие модифицированные структуры иммуноглобулиновой молекулы, содержащие сайт распознавания Myl9, и т. п.

[00082]

Myl9-связывающий фрагмент антитела к Myl9 может быть получен путем протеолитического расщепления полного антитела с помощью, например, протеазы, такой как папаин или пепсин, или может непосредственно вырабатываться рекомбинантной клеткой-хозяином (например, эукариотической, такой как дрожжевая клетка, растительная клетка, клетка насекомого или клетка млекопитающего, или прокариотической, такой как клетка E. coli). Например, F(ab')₂-фрагмент можно образовать путем отбора Fab'-SH-фрагментов непосредственно из E. coli и осуществления с ними химического связывания. F(ab')₂ также можно образовать путем применения лейциновой "застежки" GCN4, которая способствует сборке молекул F(ab')₂. Более того, при получении scFv с помощью технологии химического синтеза можно применять автоматический синтезатор. При получении scFv с помощью технологии генетической рекомбинации подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий scFv, можно вводить в подходящую клетку-хозяина (например, эукариотическую, такую как дрожжевая клетка, растительная клетка, клетка насекомого или клетка млекопитающего, или прокариотическую, такую как клетка E. coli). Полинуклеотид, кодирующий scFv, представляющий интерес, можно получить с помощью хорошо известной операции, такой как лигирование полинуклеотидов. Полученный в результате scFv можно выделять с помощью стандартной технологии очистки белка, хорошо известной из уровня техники.

[00083]

Вариабельная область антитела в настоящем документе означает вариабельную область легкой цепи антитела, вариабельную область тяжелой цепи антитела или как то, так и другое. Более того, константная область антитела в настоящем документе означает константную область легкой цепи антитела, константную область тяжелой цепи антитела или как то, так и другое. Каждая вариабельная область тяжелой и легкой цепей состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя CDR, также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вблизи друг от друга с помощью FR и вместе с CDR в другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта в антителе. Технология определения CDR может включать без ограничения, например, (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (такой как в Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD); и (2) подход, основанный на исследовании кристаллической структуры комплексов антиген-антитело (Al-Lazikani et al., 1997 J. Molec. Biol. 273:927-948). Эти или другие подходы можно использовать в комбинации.

[00084]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляют собой рекомбинантное антитело (такое как химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело) или химически синтезированное антитело, антитело млекопитающего, отличного от человека (например, грызунов, таких как мышь, крыса, или кролика, обезьяны, коровы, лошади, козы и т.п.), или их Myl9-связывающий фрагмент. Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляют собой гуманизированное или химерное антитело, предпочтительно гуманизированное антитело. Химерное антитело представляет собой, например, антитело, в котором вариабельная область антитела, отличного от человеческого (как, например, мышиного или крысиного), введена в константную область человеческого антитела, и относится, например, к антителу, в котором вариабельная область получена из антитела, отличного от человеческого, а константная область получена из человеческого антитела. Гуманизированное антитело представляет собой, например, антитело, в котором гипервариабельная область антитела, отличного от человеческого, введена в человеческое антитело, и относится, например, к антителу, в котором CDR получена из антитела, отличного от человеческого, а остальные области антитела получены из человеческого антитела. Следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением граница между химерным антителом и гуманизированным антителом не обязательно должна быть четкой, и антитело может находиться в состоянии, которое может называться химерным антителом или гуманизированным антителом. Аспектом предпочтительного гуманизированного антитела в настоящем документе является антитело, в котором CDR получена из антитела грызуна, а остальные области антитела получены из человеческого антитела, особенно предпочтительно антитело, в котором CDR получена из мышиного антитела, а остальные области антитела получены из человеческого антитела. Гуманизацию также можно осуществлять путем введения последовательности CDR, полученной из антитела, например, грызуна, в соответствующий сайт человеческого антитела посредством способа пересадки CDR (см. Jones et al., Nature 321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327(1988); и Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536(1988); Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001), и Tsurushita et al., Methods 36:69-83 (2005)). В некоторых случаях гуманизированное антитело также может представлять собой гуманизированное антитело, в котором несколько аминокислотных остатков в FR замещены аминокислотными остатками, полученными из аналогичного сайта в антителе, отличном от человеческого.

[00085]

Для снижения антигенности может быть важно, чтобы при получении гуманизированного антитела было выбрано применение вариабельных областей человека как для легких, так и для тяжелых цепей. Аминокислотную последовательность вариабельной области антитела грызунов, таких как мышь, крыса или кролик, подвергают скринингу по всей библиотеке известных последовательностей человеческих FR. Затем аминокислотную последовательность человеческого антитела, наиболее близкую к последовательности антитела грызуна, принимают в качестве человеческой FR гуманизированного антитела. Например, в качестве литературного источника можно использовать O'Brien and Jones, Antibody Engineering (Springer Lab Manual), 567-590. Согласно другому способу используют конкретную каркасную область, полученную из последовательности, общей для всех человеческих антител в конкретной подгруппе легкой или тяжелой цепи. Одну и ту же каркасную область можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител. Например, в качестве литературного источника можно использовать Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992), и Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993).

[00086]

Кроме того, желательно, чтобы гуманизированное антитело в целом сохраняло высокую аффинность связывания с антигенами и другие предпочтительные биологические признаки. Для достижения этой цели согласно одному способу гуманизированное антитело получают с помощью стадии анализа исходной последовательности и различных концептуальных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели исходной последовательности и гуманизированной последовательности. Как правило, трехмерная модель иммуноглобулина доступна для применения и известна специалистам в данной области. Доступна для применения компьютерная программа, которая иллюстрирует и представляет потенциальную трехмерную конформацию выбранной последовательности иммуноглобулина-кандидата. Посредством исследования этих иллюстрируемых трехмерных конформаций возможен анализ аминокислотных остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. С помощью данного способа можно разработать остатки FR так, что будет достигнуто желаемое свойство антитела, такое как сохранение аффинности связывания с одним или несколькими целевыми антигенами (такими как Myl9 или его фрагмент).

[00087]

Антитело, в котором представленное выше на примере химерное или гуманизированное антитело соответствующим образом изменено (например, путем модификации антитела или частичных замены, добавления или делеции аминокислотной последовательности антитела) с сохранением при этом функции указанного антитела (или с целью дополнения или улучшения функции указанного антитела), также охватывается антителом в соответствии с настоящим изобретением. В частности, антитело, в котором лизин (Lys), расположенный на карбоксильном конце (C-конце) тяжелой цепи, подвергнут делеции искусственным способом, таким как генетическая модификация, для уменьшения неоднородности антител, вырабатываемых антителообразующими клетками, также охватывается объемом настоящего изобретения. Примеры другой частичной замены могут включать в себя без ограничения антитело, в котором аминокислотный остаток в положении 234 в тяжелой цепи подвергнут мутации по типу замены валина (V) на аланин (A), антитело, в котором аминокислотный остаток в положении 237 в тяжелой цепи подвергнут мутации по типу замены глицина (G) на аланин (A), а также их комбинация и т.п. Следует отметить, что указанные мутации соответственно описаны в настоящем документе как V234A и G237A.

[00088]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут быть модифицированы при необходимости. Модификация антитела к Myl9 или его Myl9-связывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой модификацию, в результате которой изменяется (a) трехмерная структура аминокислотной последовательности в модифицированной области, такая как листовая или спиральная конформация; (b) заряд или состояние гидрофобности молекулы в целевом сайте или (c) эффект модификации в отношении поддержания объема боковой цепи, или, в качестве альтернативы, может быть реализована модификация, при которой эти изменения не являются четко выраженными.

[00089]

Модификацию антитела к Myl9 или его Myl9-связывающего фрагмента в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять путем, например, замены, делеции, добавления и т. п. аминокислотных остатков, задающих конфигурацию.

[00090]

Аминокислота в настоящем документе используется в самом широком своем смысле и включает в себя не только природные аминокислоты, такие как серин (Ser), аспарагин (Asn), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), аланин (Ala), тирозин (Tyr), глицин (Gly), лизин (Lys), аргинин (Arg), гистидин (His), аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu), глутамин (Gln), треонин (Thr), цистеин (Cys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp) и пролин (Pro), но также и неприродные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот. Специалистам в данной области будет понятно с учетом данного широкого определения, что примеры аминокислот в настоящем документе могут включать в себя L-аминокислоты; D-аминокислоты; химически модифицированные аминокислоты, такие как варианты и производные аминокислот; аминокислоты, которые не являются материалами, задающими конфигурацию белков in vivo, такие как норлейцин, β-аланин и орнитин; и химически синтезированные соединения, обладающие свойствами аминокислот, хорошо известные специалистам в данной области. Примеры неприродной аминокислоты могут включать в себя α-метиламинокислоты (такие как α-метилаланин), D-аминокислоты (такие как D-аспарагиновая кислота и D-глутаминовая кислота), гистидиноподобные аминокислоты (такие как 2-аминогистидин, β-гидроксигистидин, гомогистидин, α-фторметилгистидин и α-метилгистидин), аминокислоты с избытком метиленовых групп в боковой цепи (гомоаминокислоты) и аминокислоты, в которых карбоксилатная функциональная группа в боковой цепи аминокислоты замещена сульфонатной группой (такие как цистеиновая кислота).

[00091]

Остатки встречающихся в природе аминокислот могут быть разделены, например, на следующие группы на основании общих свойств боковой цепи:

(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu и Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser и Thr;

(3) кислые: Asp и Glu;

(4) основные: Asn, Gln, His, Lys и Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly и Pro; и

(6) ароматические: Trp, Tyr и Phe.

[00092]

Неконсервативную замену в аминокислотной последовательности, задающей конфигурацию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, можно выполнить путем изменения аминокислоты, которая принадлежит к одной из этих групп, на аминокислоту, которая принадлежит к другой группе. Более консервативную замену можно выполнить путем изменения аминокислоты, которая принадлежит к одной из этих групп, на другую аминокислоту, которая принадлежит к той же группе. Аналогично можно соответствующим образом выполнить делецию или замену в аминокислотной последовательности.

[00093]

Модификация аминокислоты, задающей конфигурацию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, может представлять собой, например, посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование с помощью сахара, ацетилирование или фосфорилирование. Антитело может быть гликозилированным в консервативном положении в своей константной области. Гликозилирование антитела, как правило, является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное означает связывание сахарного фрагмента с боковой цепью аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин, аспарагин-X-треонин и аспарагин-X-цистеин (где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от пролина) являются последовательностями распознавания для ферментативного добавления сахарного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Потенциальный сайт гликозилирования присутствует, если любая из этих трипептидных последовательностей присутствует в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте. O-связанное гликозилирование может представлять собой связывание N-ацетилгалактозамина, галактозы либо ксилозы с гидроксиаминокислотой (такой как серин или треонин), а в некоторых случаях может представлять собой связывание с 5-гидроксипролином или 5-гидроксилизином. Условие гликозилирования (например, если гликозилирование выполняют с помощью биологического способа, тип клетки-хозяина или среды для культивирования клеток, pH и т. п.) может быть соответствующим образом выбрано специалистом в данной области в соответствии с целью.

[00094]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением можно дополнительно модифицировать на основании общих технических принципов, хорошо известных специалистам в данной области, с помощью других способов модификации в отдельности или в комбинации.

[00095]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением можно получать с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области. Например, антитело можно получать с помощью гибридомы, которая вырабатывает антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, или антитело можно получать путем интеграции гена, кодирующего антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, в вектор экспрессии и введения указанного вектора экспрессии в клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) и т.п. Ген, кодирующий антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно имеет ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, и более предпочтительно имеет ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, на 5'-конце ДНК, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, и ДНК, кодирующей вариабельную область легкой цепи. Сигнальная последовательность представляет собой аминокислотные остатки, присутствующие на N-конце белка, которые необходимы секреторному белку или интегральному мембранному белку для прохождения через липидный бислой после его синтеза на рибосоме. Сигнальная последовательность в настоящем документе конкретно не ограничена, при условии, что она представляет собой последовательность, обладающую этой функцией. Сигнальная последовательность, которая может содержаться в антителе к Myl9 или его Myl9-связывающем фрагменте в соответствии с настоящим изобретением, могут включать в себя сигнальные последовательности, происходящие от человека, мыши, крысы, кролика, осла, козы, лошади, птицы, собаки, кошки, дрожжей и т.п. Сигнальная последовательность в одном конкретном аспекте может включать в себя пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 12, в качестве сигнальной последовательности, соответствующей тяжелой цепи, и пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 14, в качестве сигнальной последовательности, соответствующей легкой цепи. Более того, замена, добавление или делеция одной или нескольких (например, 2, 3, 4 или 5) аминокислот могут присутствовать в аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 12, или в аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 14, при условии, что они являются функционально эквивалентными.

[00096]

Антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением могут быть выделяемыми или очищаемыми согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области. В настоящем документе "выделенный" или "очищенный" означает искусственные выделение или очистку из естественного состояния. Если молекула или композиция встречается в природе, то это означает, что она является "выделенной" или "очищенной", если ее изменили или удалили из среды ее естественного существования, или обладает обеими этими характеристиками. Примеры способа выделения или очистки могут включать в себя без ограничения электрофорез, молекулярно-биологические, иммунологические или хроматографические способы и т.п., в частности, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию или обращенно-фазовую HPLC-хроматографию, или изоэлектрическое фокусирование и т.п.

[00097]

"Ингибитор контрольных точек иммунного ответа" в настоящем документе означает ингибитор молекулы-контрольной точки иммунного ответа, которая принимает участие в механизме контрольных точек иммунного ответа, системе подавления T-клеточной активации, и включает в себя ингибитор PD-1 и ингибитор CTLA-4. Термин "молекула-контрольная точка иммунного ответа" охватывает как рецепторы, так и лиганды, которые функционируют в качестве контрольных точек иммунного ответа.

[00098]

Термин "применяемый в комбинации с ингибитором контрольных точек иммунного ответа" в настоящем документе означает, что фармацевтическую композицию, содержащую антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель или добавку, вводят пациенту с опухолью вместе с ингибитором контрольных точек иммунного ответа примерно в одно и то же время в качестве части терапевтического режима. Фармацевтическую композицию и ингибитор контрольных точек иммунного ответа можно вводить пациенту одновременно, раздельно, непрерывно или через определенные интервалы времени с эффективным количеством каждого из них при введении в комбинации. Терапевтический режим может предусматривать другое противораковое средство. Фармацевтическую композицию и ингибитор контрольных точек иммунного ответа можно вводить пациенту в отдельных циклах введения. Если фармацевтическая композиция и ингибитор контрольных точек иммунного ответа вводятся одновременно, то можно вводить один комбинированный препарат, содержащий их.

[00099]

"Ингибитор PD-1" в настоящем документе означает вещество, которое непосредственно или опосредованно действует на PD-1 с ингибированием подавляющего действия PD-1 в отношении T-клеток. Ингибитор PD-1 включает в себя низкомолекулярное соединение, пептид и антитело к PD-1, которые связываются с PD-1 с ингибированием его подавляющего действия в отношении T-клеток, а также низкомолекулярное соединение, пептид и антитело к PD-L1, которые связываются с PD-L1 и ингибируют его активность связывания с PD-1 с ингибированием подавляющего действия PD-1 в отношении T-клеток. Антитело к PD-1 включает в себя без ограничения пембролизумаб, ниволумаб и MEDI0680 (AMP-514). Антитело к PD-L1 включает в себя без ограничения атезолизумаб, дурвалумаб и авелумаб.

[000100]

"Ингибитор CTLA-4" в настоящем документе означает вещество, которое действует на CTLA-4 с ингибированием подавляющего действия CTLA-4 в отношении T-клеток. Ингибитор CTLA-4 включает в себя низкомолекулярное соединение, пептид и антитело к CTLA-4, которые связываются с CTLA-4 с ингибированием его подавляющего действия в отношении T-клеток. Антитело к CTLA-4 включает в себя без ограничения ипилимумаб и тремелимумаб.

[000101]

"Злокачественная лимфома" в настоящем документе означает группу злокачественных опухолей системы крови, которые развиваются из лимфатических тканей. Злокачественная лимфома включает в себя лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, а последняя включает в себя диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому и т.п.

[000102]

"Рак головы и шеи" в настоящем документе означает общий термин для злокачественной опухоли, которая развивается в области от лица до шеи и включает в себя в качестве части плоскоклеточный рак головы и шеи.

[000103]

"Уротелиальный рак" в настоящем документе означает злокачественную эпителиальную опухоль, которая развивается из уротелиальных клеток и включает в себя рак почечной лоханки, рак мочевыводящих путей и рак мочевого пузыря в качестве более узких терминов.

[000104]

"Рак молочной железы" в настоящем документе означает карциному, которая развивается в тканях молочной железы. Частью рака молочной железы является трижды негативный рак молочной железы, при котором не экспрессируются эстрогеновые рецепторы, прогестероновые рецепторы и рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER-2).

[000105]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент имеют следующую CDR:

(a) CDR1 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 28;

(b) CDR2 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 30;

(c) CDR3 тяжелой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 32;

(d) CDR1 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 33;

(e) CDR2 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 34; и

(f) CDR3 легкой цепи, состоящую из пептида, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 35.

[000106]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент содержат тяжелую и легкую цепи, при этом вариабельная область указанной тяжелой цепи содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 или 64, а вариабельная область указанной легкой цепи содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, приведенной под SEQ ID NO: 65, 66, 67 или 68.

[000107]

Аминокислотная последовательность вариабельной области указанной тяжелой или легкой цепи может содержать замену, добавление или делецию одной или нескольких аминокислот в указанной последовательности. "Несколько", как используется в настоящем документе, не ограничено, при условии, что аффинность связывания с Myl9 сохраняется, а взаимодействие между Myl9 и CD69 ингибируется, и составляет от 2 до 15, более предпочтительно от 2 до 10, например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2. В качестве альтернативы, аминокислотная последовательность вариабельной области указанной тяжелой или легкой цепи содержит пептид, представленный аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 90%, например, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%, степенью гомологии в отношении указанной последовательности.

[000108]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к Myl9 или его Myl9-связывающий фрагмент представляют собой антитело, которое содержит вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, состоящие из следующих комбинаций: