КОМПЛЕКС С АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК A61K9/64 A61K31/01 A61K47/42 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии. Более подробно изобретение относится к технологии использования белковой молекулы для инкапсуляции и солюбилизации активного агента - каротиноида с целью доставки этого агента к клетке-мишени для оказания антиоксидантного действия. Изобретение может найти свое применение в медицине для лечения или профилактики некоторых заболеваний, а также для выполнения фундаментальных задач биологической науки.

Уровень техники

Каротиноиды представляют собой природные органические пигменты (тетратерпены и тетратерпеноиды), которые синтезируются многими представителями живой природы (грибами, бактериями, низшими и высшими растениями, некоторыми животными) для регуляции оксилительного стресса. Каротиноиды обладают выраженными антиоксидантными свойствами и способны эффективно утилизировать свободные радикалы (Vershinin, 1999; Landrum, 2010). Кроме того, каротиноиды способны акцептировать световую энергию и осуществлять ее трансформацию в тепловую энергию, что снижает световую нагрузку на другие пигменты живого организма и уменьшает количество генерируемых активных форм кислорода (Woodall et al., 1997b). Также каротиноиды, являясь липофильными молекулами, легко встраиваются в биомембраны и изменяют микровязкость, что может приводить к модификации свойств мембранных белков (Reszczynska et al., 2015; Seel et al., 2020). Комплексное действие каротиноидов обеспечивает проявление ими антимутагенных, антиканцерогенных, противовоспалительных, иммуномодулирующих и радиопротекторных свойств (Patel et al., 2022).

Исходно, в своей нативной форме каротиноиды крайне чувствительны к условиям хранения и обработки. При воздействии внешних факторов каротиноиды склонны к изомеризации, окислению и деградации, в результате чегко они теряют свою пищевую ценность (Tan et al., 2014). В этой связи, очень важно обеспечить их максимальную стабильность. Также существуют факторы, значительно ограничивающие эффективность каротиноидов при их поступлении в самом организме. Липофильность молекул каротиноидов затрудняет доставку агента к мишени воздействия через жидкости организма и в клетки центральной нервной системы вследствие наличия гематоэнцефалического барьера. Помимо этого, нативные каротиноиды плохо усваиваются в желудочно-кишечном тракте человека. Таким образом, биодоступность каротиноидов, применяемых в чистом виде, остается крайне низкой (Maurya et al., 2021).

Перспективы использования каротиноидов в медицинской технологии и пищевой промышленности связаны с разработкой методов эффективной направленной доставки. Биодоступность каротиноидов можно повысить, если заключить их в амфифильную макромолекулу или молекулярный комплекс. В современной научно-технической литературе ведется активное обсуждение новых методов обеспечения защиты от факторов, ухудшающих эффективность каротиноидов как в составе пищевых продуктов, так и для обеспечения высокой эффективности направленной доставки в организме человека (Mao et al., 2018).

На основании вышеизложенных недостатков самой молекулы каротиноидного типа, можно сформулировать ряд требований к платформе для направленной доставки каротиноидов:

1. Наличие липофильной полости - места локализации молекул каротиноида.

2. Наличие гидрофильной поверхности, обеспечивающей стабильность структуры в водных физиологических растворах.

3. Высокое относительное содержание каротиноида в комплексе (по массе).

4. Высокая эффективность загрузки частицы при создании комплекса с каротиноидом.

5. Эффективное высвобождение молекул каротиноида при контакте платформы для доставки с мишенью воздействия.

6. Наличие функциональных групп на поверхности частицы для обеcпечения возможности дополнительной модификации механизмами направленной доставки.

7. Увеличенная термо- и фотостабильность каротиноида в составе комплекса.

8. Отсутствие цитотоксичности.

9. Оптимальные параметры фармакодинамики, биоразлагаемость.

10. Дополнительно: возможность обеcпечить селективность платформы по отношению к связыванию конкретного вида каротиноида.

В настоящее время исследуются способы доставки молекул каротиноидов с помощью различных платформ-носителей. В частности, среди наиболее распространенных типов подобных платформ можно выделить мицеллы (Xu et al., 1999), липосомы (Woodall et al., 1997a; Moraes et al., 2013; Elkholy et al., 2020), микрокапсулы (Santos et al., 2021), включая прямые экстракты и вытяжки из каротиноид-содержащих организмов (Arvayo-Enríquez et al., 2013). Все перечисленные варианты имеют массу недостатков - отсутствие селективности, часто большие размеры транспортных частиц, отсутствие возможности оценки эффективности загрузки платформы, низкая коллоидная стабильность в физиологических средах.

Методы наноинженерии позволяют сконструировать системы наночастиц для доставки каротиноидов с возможным улучшением их биодоступности (Rehman et al., 2020), однако этот метод не всегда может обеспечить необходимую защиту каротиноидов от разрушающего воздействия внешней среды при хранении.

Методы инкапсуляции каротиноидов в везикулярные структуры по типу липосом или ниосом позволяют улучшить структурную стабильность каротиноидов, однако при этом значительно понижается биодоступность. Возможным вариантов доставки является инкапсуляция каротиноидов внутрь липосомальных наноэмульсий (Yuan et al., 2008). Было показано инкорпорирование липосом бета-каротином (Moraes et al., 2013), лютеином (Xia et al., 2012), астаксантином (Peng et al., 2010). При взаимодействии клеток с нагруженными каротиноидами липосомами может происходить доставка этих антиоксидантов в различные компартменты клетки. Однако, эффективность доставки сильно ограничена: инкубация клеток с липосомами, несущими микромолярные концентрации каротиноидов, обеспечивает в 1000 раз меньшую концентрацию каротиноидов в мембранах клеток-мишеней (Williams et al., 2000).

Исследуются механизмы адресной доставки каротиноидов в составе ниосом - коллоидных структур, образуемых поверхностно-активными веществами, инкапсулированных каротиноидами (Masjedi and Montahaei, 2021). В качестве материалов для доставки с помощью ниосом используются нейтральные полимеры, например, полоксамер P-188, позволяющий инкапсулировать бета-каротин и ликопин (Singh et al., 2017). В то же время, принципиальная синтетическая природа полимеров ограничивает биодоступность и биоразлагаемость транспортных платформ на их основе.

Широко распространен способ доставки каротиноидов с помощью наноконструкций на основе различных биосовместимых полимеров (Rehman et al., 2020). Например, для доставки каротиноидов в клетки, для которых характерно повышенное потребление глюкозы, используются наночастицы на основе полисахаридных комплексов, к которым относятся хитозан, декстрины, полифенолы, ксилолигосахариды, целлюлозные комплексы (Williams et al., 2000; Nishino et al., 2009; Зяйнитдинов et al., 2020). При этом, использование полисахаридов в качестве транспортных платформ имеет ряд функциональных недостатков. Во-первых, несмотря на относительно высокую биосовместимость, адресная доставка осуществляется преимущественно в клетки с высоким уровнем потребления глюкозы, что ограничивает область применения преимущественно патологиями онкологического характера. Во-вторых, большие концентрации некоторых полисахаридов, в частности, декстринов и декстранов, значительно повышают вязкость крови. В-третьих, для доставки таких каротиноидов, как бета-каротин, лютеин, кантаксантин, в силу структурных особенностей каротиноидной молекулы используются наночастицы размерами от 200-450 нм (Rehman et al., 2020). Прямая инъекция наночастиц таких размеров в кровоток может нести серьезные риски патологических изменении реологии крови при систематическом потреблении (Lin et al., 2012).

Белковые макромолекулы также исследуются для доставки каротиноидов. Изучаются возможности использования как животных белков (казеин (Rehan et al., 2019), желатин (Elzoghby, 2013), коллаген, альбумины, эластины (Maghsoudi et al., 2020) и др.), так и растительных (Liao et al., 2012) (глютеновые макромолекулы, глидины, зеины и др.). Основным преимуществом использования белковых молекул для транспорта является их высокая биодоступность. Однако, так как исходно данные белки не предназначены для транспорта каротиноидов, эффективность доставки в ткани невелика. Альтернативным вариантом является создание гибридных конструкций на основе моноклональных антител в качестве транспортных агентов (Bashmakov and Petyaev, 2017). Данный метод позволяет обеспечить направленную доставку и накопление в нужных тканях, однако обладает серьезными недостатками: животные антитела могут спровоцировать иммунную реакцию, а использование гуманизированных антител значительно усложняет технологию получения конечного продукта и увеличивает его стоимость.

Наиболее близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из последнего описания уровня техники, раскрыто в патентом документе RU2718065C2 «Положительно заряженные липосомы в качестве липофильных молекул-носителей», который защищает способ получения положительно заряженных липосомных везикул для применения в качестве носителей липофильных молекул, представляющих собой каротиноид, выбранный из лютеина и зеаксантина. Применение липосом с положительным зарядом здесь необходимо, в частности, для повышения эффективности метода ионтофореза в области офтальмологии. Особое внимание было уделено исследованию термо- (хранение до 6 мес. при комнатной температуре и до 3 мес. при температуре 52°С) и фотостабильности (до 48 часов облучения УФ/видимым светом) каротиноидов в составе липосом, а также цитотоксичности композиции. Из недостатков липосомальных везикул как конструкции для доставки активных соединений можно отметить большой размер частиц (в документе речь идет о липосомах с характерным размером 194 - 2482 нм в зависимости от липидной композиции после процедур гомогенизации и стерилизации), что снижает биодоступность агента. Кроме того, в документе отсутствует информация об эффективности встраивания молекул каротиноидов в липосомы, их максимальной загрузке, а также об эффективности выхода молекул каротиноида из липосомы в присутствии биологической мишени воздействия. Эти параметры являются ключевыми характеристиками эффективности конструкций для доставки активных агентов.

Другое близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из уровня техники, раскрыто в патентом документе RU2649124C2 «Фармацевтическая композиция с каротиноидом», который защищает способ инкапсуляции липофильных агентов в частицы типа хиломикрон и мицелла из варьируемой композиции липидов и сопутствующих соединений (фитостерол, триглицериды и др.). На примере бета-каротина авторы оценили эффективность инкапсуляции в 80%, при этом пероральная биодоступность на примере соланорубина составила 9.5% в случае использования формы хиломикрона и 6.8% в случае использования формы мицеллы. В загруженном виде платформа для доставки была стабильной по крайней мере в течение 3 месяцев. Из недостатков данной технологии стоит отметить существенный разброс размеров хиломикронов (75-440 нм) и их чувствительность к манипуляциям на этапе синтеза и инкапсуляции. Кроме того, в составе комплекса с хиломикроном массовая доля инкапсулированного бета-каротина была оценена в 1%, что, на наш взгляд, говорит о низкой эффективности хиломикронов как платформы для доставки.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка комплекса, обладающего антиоксидантным действием, на основе активного агента каротиноидного типа в комплексе с белком для доставки в клетки, а также способприменения такого комплекса.

Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является увеличение фотостабильности молекулы каротиноида за счет инкапсуляции в белковую глобулу ВКБ, отсутствие потери действующего агента-каротиноида при процедуре приготовления конструкции за счет уникальности аминокислотного состава белка., используемого для инкапсуляции. Повышение эффективности применения агента каротиноидного типа в качестве антиоксиданта за счет уменьшения размера частиц и как следствие снижения времени достижения максимальной концентрации каратиноидов в крови при энтеральном и парэнтеральном введении. Таким образом, комплекс ВКБ-каротиноид с антиоксидантным действием представляет собой эффективную конструкцию для доставки, удобную в аспектах как приготовления, так и непосредственно использования в биомедицинских целях.

В заявляемом изобретении предложено использование рекомбинантных аналогов нативных водорастворимых каротиноид-связывающих белков (ВКБ), их нативных вариантов или их мутантных форм, в качестве платформы для доставки молекул каротиноида, в т.ч. направленной. Использование нативных формВКБ и рекомбинантных аналогов нативных форм ВКБ предоставляет возможности для направленной доставки молекул каротиноидов и увеличения их биодоступности в медицинских и биологических приложениях. Нативные формы ВКБ и рекомбинантные аналоги нативных форм ВКБ могут быть использованы для доставки тех каротиноидов, которые синтезируются в клетках ряда организмов (цианобактерии, зеленые водоросли, растения) или специфически накапливаются в тканях организмов употребляющих потребляющих каротиноиды с пищей. Иные каротиноиды в зависимости от задач и целей доставки могут быть инкапсулированы в мутантные формы ВКБ, полученные из исходной нативной формы любым путем сайт-направленного мутагенеза, с последующими процедурами позитивного и негативного отбора до установления однозначного соответствия между формой ВКБ и конкретным каротиноидом. Инкапсулирование молекулы каротиноида осуществляется самопроизвольно вследствие высокой избирательности внутреннего гидрофобного кармана белковой глобулы ВКБ. Каротиноид может оказывать антиоксидантное действие как в составе комплекса с ВКБ, так и отдельно после завершения процесса доставки, причем выход молекулы каротиноида из ВКБ осуществляется самопроизвольно при наличии биомолекулярных функциональных мишеней, обладающих более высоким сродством к каротиноиду. Наработка рабочей конструкции каротиноид-ВКБ производится на основе генно-инженерных штаммов бактерий, со всеми последующими биохимическими процедурами выделения и очистки.

В природе существуют водорастворимые каротиноид-связывающие белки, которые могут предоставить технологические возможности для высокоэффективного направленного транспорта каротиноидов к клеткам (Sedoud et al., 2014; Harris et al., 2018; Maksimov et al., 2020). Среди них широко исследуются белки класса OCP (Orange Carotenoid Protein). Считается, что этот класс белков эволюционно направлен на осуществление наиболее оптимальной доставки молекул каротиноидов (Hagemann et al., 2010). OCP с встроенной молекулой каротиноида также является антиоксидантом, осуществляющим нефотохимическое тушение активных форм кислорода и других окислительных радикалов (Maksimov et al., 2016). Белок OCP состоит из двух структурных доменов (N- и C-домен) (Leverenz et al., 2014). Два домена соединены длинным гибким линкером. Каротиноидный хромофор располагается во внутреннем пространстве белка и охватывает оба домена. Локализация каротиноида происходит за счет водородных связей между кетогруппой каротиноида и аминокислотами белковых частей комплекса (тирозин в положении 203 и триптофан в положении 290). Стехиометрия компонентов конструкции фиксирована и составляет 1:1. Показано, что для белок-опосредованной доставки каротиноидов также могут быть использованы производные OCP, которые содержат только один из функциональных доменов.

В частности, COCP (С-domain OCP), содержащий только С-домен. Гомолог C-домена OCP, на базе водорастворимого каротинопротеина, выделенного из цианобактерий Anabaena sp. PCC 7120 (Maksimov et al., 2020) (белок Anabaena C-terminal domain homolog, AnaCTDH) способен со значительно большей, чем другие производные OCP, эффективностью связывать кетокаротиноиды (в частности, эхиненон и кантаксантин) из мембран каротиноид-синтезирующих штаммов E. coli. AnaCTDH продемонстрировал убедительные результаты по доставке каротиноида эхиненона в мембрану клеток культуры HeLa по данным спектроскопии комбинационного рассеяния. При этом доставка каротиноида с помощью AnaCTDH уменьшает последствия окислительного стресса в клетках нейробластомы Tet21N, индуцированного с помощью антимицина - разобщителя дыхательной цепи митохондрий.

В работе (Slonimskiy et al., 2022b) авторами настоящего патента было проведено исследование фотофизических свойств рекомбинантного астаксантин-связывающего белка (astaxanthin-binding protein, AstaP), выделенного из микроводорослей C. astaxanthina Ki-4. Этот белок представляет собой стабильный мономер молекулярной массой ~20 кДа, который может связывать одну молекулу каротиноида, причем не только астаксантин, но и другие ксантофиллы (кантаксантин и зеаксантин), а также, с несколько меньшей эффективностью, бета-каротин. Белок AstaP способен обеспечивать доставку каротиноидов как в мембранные структуры по типу липосом, так и в другие каротиноид-связывающие белковые системы, в частности, OCP и/или CTDH, тем самым предоставляя широкие возможности для дополнительного модулирования его антиоксидантных свойств.

Относительно недавно при исследовании шелкового фиброина - фибриллярного белка, формирующего нити коконов тутового шелкопряда Bombyx mori - было обнаружено, что за цветную окраску коконов ответственны две основные разновидности пигментов: жирорастворимые каротиноиды и водорастворимые флавоноиды (Sakudoh et al., 2007). Желтый цвет нитей коконов B. mori обусловлен накоплением каротиноидов, которые в процессе формирования кокона усваиваются гусеницами из листьев с помощью особого водорастворимого каротиноид-связывающего белка (СВР, carotenoid-binding protein). С помощью СВР часть каротиноидов интегрируется в серицин (белок, который обеспечивает склеивание фиброиновых фибрилл в процессе формирования кокона гусеницей), некоторая часть содержится в самом фиброине (Lee et al., 2020). Предполагается, что CBP может быть использован для осуществления направленного транспорта крайне широкого набора различных каротиноидов, включая бета-каротин, кетакаротиноиды и ксантофиллы.

Поставленная задача решается тем, что комплекс с антиоксидантым действием, представляет собой инкапсулированную в белковую глобулу ВКБ нековалентно связанную молекулу каротиноида, выбранного из группы: зеаксантин, лютеин и кантаксантин, в соотношении 1:1. Комплекс характеризуется антиоксидантым действием. Белковая глобула ВКБ подобрана такой формы и такого аминокислотного состава, что обеспечивает оптимальную инкапсуляцию соответствующего типа каротиноида.

Поставленная задача также решается тем, что способ получения активного агента каротиноидного типа в составе комплекса с белком включает следующие шаги:

1. Синтез ВКБ и соответствующего каротиноида в бактериальном штамме, включая конструирование плазмиды, содержащей ген, кодирующий мутантную форму ВКБ для соответствующего каратиноида, конструирование плазмиды, содержащей необходимый набор генов для биосинтеза конкретного каротиноида, трансформацию бактериального штамма, наработку клеточную массу, процедуры выделения и очистки (большая вариативность методов не позволяет осуществить более подробное описание процедур вследствие сужения области предмета, защищаемого настоящим патентом). При этом сборка конструкции ВКБ-каротиноид происходит внутри клеток самопроизвольно.

2. Оценка коллоидной стабильности конструкции каротиноид-ВКБ осуществляется методами динамического светорассеяния и спектроскопическими методами. Конкретнее, исследуют спектр поглощения препарата в буферном растворе ПБС (рН 7.0-7.4) в области 240-700 нм, а также распределение гидродинамических размеров частиц с учетом зависимости интенсивности рассеянного света от размера частиц и с использованием лазера с длиной волны более 500 нм.

3. Оценка фотостабильности каротиноида в комплексе с ВКБ осуществляется спектроскопическими методами. Конкретнее, измеряют динамику оптической плотности раствора, содержащего комплекс каротиноид-ВКБ, в области 350-600 нм при периодическом воздействии света с длиной волны 400-450 нм и мощностью более 500 мВт/см².

Поставленная задача также решается тем, что способ применения активного агента каротиноидного типа в составе комплекса с белком включает следующие шаги:

1. Создание композиции, содержащей комплекс каротиноид-ВКБ и дополнительные вещества, для конкретных задач биотехнологии, медицины и пищевой промышленности. Под дополнительными веществами могут подразумеваться любые неорганические, низкомолекулярные органические и биоорганические соединения, способствующие селективности доставки каротиноида, коллоидной стабильности композиции, эффективности усвоения композиции в зависимости от типа введения в организм.

2. Введение в организм композиции, содержащей комплекс каротиноид-ВКБ и дополнительные вещества, энтеральным или парэнтеральным способом.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 представлена схема структуры ВКБ в холо-форме (т.е. в связанном с каротиноидом состоянии): CBP, каротиноид-связывающий мономерный белок, осуществляющий доставку каротиноидов при формировании нитей коконов тутового шелкопряда Bombyx mori, способен связывать широкий спектр каротиноидов (на фиг. 1 изображен в комплексе с зеаксантином).

На фиг. 2 представлена технологическая блок-схема использования ВКБ как изобретения, представляющего собой платформу для направленной доставки каротиноидных антиоксидантов в мембраны клеток. Технологическая схема состоит из двух этапов. Первый этап - формирование комплексов ВКБ с целевым каротиноидом. Данный этап осуществляется благодаря уникальной способности ВКБ связывать каротиноиды из каротиноид-продуцирующих штаммов E.coli, так и из растворов органических растворителей (ВКБ устойчивы в ацетоне вплоть до 10%-ной доли по концентрации растворителя). Второй этап заключается в способности CBP доставлять каротиноид в мембраны клеток-мишеней. Данный этап реализуется благодаря двум факторам: принципиальной липофильной природе каротиноидов, и благодаря челночному механизму функционирования СВР, который при наличии липоидной фазы за счет специфических структурных конформаций обеспечивает такие условия, при которых связывание каротиноида мембраной становится энергетически более выгодным. Там самым создаются предпосылки для встраивания транспортируемого каротиноида в клеточную биомембрану для осуществления антиоксидантного и цитопротекторного действия.

На фиг. 3 приведена демонстрация антиоксидантного и цитопротекторного эффекта зеаксантина в комплексе с каротиноидным белком CBP в холо-форме (комплекс hCBP). Диаграммы распределений усредненных значений длительности аутофлуоресценции липофусцина в культуре клеток зрительного пигментного эпителия до и после фотоокисления (облучение с помощью светодиодной лампы, белый свет). Комплекс каротиноида зеаксантина с каротиноидным белком СВР (комплекс hCBP) обладает выраженным антиоксидантным и цитопротекторным эффектом. На фиг. 3 изображены распределения средних значений длительности флуоресценции липофусцина в клетках зрительного пигментного эпителия человека (линия ARPE-19). Липофусцин - это пигмент гликопротеиновой природы, являющийся биологическим маркером старения и различных патологий. Липофусцин накапливается в клетках в виде гранул и подвержен окислительным процессам, в результате которых в клетке накапливаются токсичные соединения. Фиг. 3 показывает, что комплекс hCBP уменьшает in vitro цитотоксический эффект липофусцина при фотоокислении. Фотоокисление было проведено путем 18-часового облучения культуры белым светом (интенсивность 0.5 мВт/см²) в клеточном инкубаторе с помощью светодиодной лампы. Были проведены измерения для следующих образцов: «необлученный hСВР-» (Образец №1, необлученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, без добавления hСВР); «необлученный hСВР+» (Образец №2, необлученные клетки, нагруженные липофусцином с добавлением hСВР в ростовую среду в концентрации 500 μМ); «облученный hСВР-» (Образец №3, облученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, без добавления hСВР); «облученный hСВР+» (Образец №4, облученные клетки, нагруженные гранулами липофусцина, с добавлением hСВР в ростовую среду в концентрации 500 μМ). Известно, что в ходе окислительного процесса существует корреляция между значением длительности флуоресценции липофусцина и выраженности его цитотоксического действия (Jung et al., 2010). Из фиг. 3 видно, что, во-первых, наличие hСВР в клеточной среде уменьшает цитотоксический эффект липофусцина даже без дополнительного облучения культуры (см. диаграммы №1 и №2). Во-вторых, еще более значителен эффект при фотоиндуцированном окислении липофусцина (образцы №3 и №4). В облученных клетках без hСВР наблюдалось значительное увеличение среднего значения длительности флуоресценции, что свидетельствует об интенсивном окислительном стрессе. В случае, когда в культуральную среду был помещен hCBP, увеличение длительности флуоресценции было менее значительно, и, следовательно, токсический эффект липофусцина был выражен слабее. Таким образом, в рамках заявленного изобретения подтверждается, что зеаксантин, внесенный в культуру в виде hСВР, оказывает выраженное антиоксидантное и противотоксическое действие.

Осуществление изобретения

Для осуществления изобретения необходимо провести биосинтез конструкции ВКБ-каротиноид внутри бактериального штамма, а затем выделить данную конструкцию в чистом виде. Конкретнее, конструируют плазмиду, содержащую ген, кодирующий белок ВКБ. Поскольку узнавание конкретного каротиноида специфично, заранее выбирают конкретную мутантную форму ВКБ с известной аминокислотной последовательностью. Плазмида подбирается с учетом работы в заранее выбранном бактериальном штамме. Аналогично, конструируют плазмиду, содержащую необходимый набор генов для биосинтеза конкретного каротиноида. Далее, осуществляют трансформацию бактериального штамма и нарабатывают клеточную массу. Сборка конструкции ВКБ-каротиноид происходит внутри клеток самопроизвольно. Затем осуществляют лизис клеток, проводят процедуры выделения и очистки искомого соединения (конструкция ВКБ-каротиноид). Полученный раствор можно модифицировать с помощью дополнительных компонентов, поддерживающих функциональность препарата при хранении.

Ниже представлены детальные примеры, описание которых не ограничивает возможные применения заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.

Пример 1.

Синтез высокоэффективного ВКБ на основе каротиноид-связывающего белка тутового шелкопряда Bombyx mori (carotenoid-binding protein, CBP).

Синтезируется кДНК, соответствующая остаткам 68-297 в генетической последовательности ВКБ BmCBP (последовательность кодирующих генов проверяется по базе Uniprot и должна соответствовать идентификационному номеру Q8MYA9). Последовательность генов подвергается кодон-оптимизации согласно методике, описанной в авторской работе (Slonimskiy et al., 2022a). После оптимизации происходит клонирование с использованием вектора pET28b-His-3C, обеспечивающего клеткам устойчивость к канамицину. Получаемый конструкт, после надлежащей генетической проверки с помощью секвенирования, обеспечивает наработку холо-формы hCBP в клетках C41(DE3), для наработки каротиноида предварительно трансформированных с помощью плазмиды pACCAR25ΔcrtX. Для ВКБ CBP доступен альтернативный вариант, в котором холо-форма hCBP содержит кантаксантин в качестве каротиноидного агента. Данный результат достигается с помощью ко-экспрессии путем активации гена crtW фермента кетолазы. Наработка белка индуцируется обработкой клеточного материала 0.1 мМ-раствором изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида в течение 12 часов при 25°С. Необходимая процедура очистки белка осуществляется с помощью иммобилизованной метал-аффинной и гель-эксклюзионной хроматографии. Для увеличения выхода холоформы BmCBP в комплексе с зеаксантином, в процессе лизирования клеток добавляется бычий сывороточный альбумин (БСА), а в качестве дополнительного этапа очистки вводится стадия очистки препарата белка на гидроксиапатитной хроматографической колонке. После очистки образцы белков замораживаются и хранятся при -80°C.

Пример 2.

Трансформация клеток E. coli для осуществления экспрессии целевых ВКБ.

Осуществляется трансформация клеток E. coli плазмидой, кодирующей кластер генов биосинтеза каротиноидов (см. Пример выше) и несущей ген устойчивости к хлорамфениколу, после чего делают трансформанты компетентными с помощью стандартных протоколов. Второй раунд трансформации проводят с помощью плазмиды, кодирующей выбранный ВКБ (например, имеющей ампициллиновую устойчивость). После трансформации клетки высевают на плашки со средой LB-агар, содержащей ампициллин (50 мкг/мл) и хлорамфеникол (34 мкг/мл) и оставляют на ночь при 37°С. Стартовые культуры получают путем забора клеточного материала из одной выросшей колонии, помещают в 10 мл среды LB и выращивают при 37°С в течение суток на орбитальном шейкере (200 rpm). Для экспрессии белка отбирают суспензию и разбавляют до оптической плотности 0.1 средой LB (конечный объем 2*500 мл), далее растят при 37°С на орбитальном шейкере (200 rpm) до показателей оптической плотности 0,8. Затем вносят изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до концентрации 500 мкМ и растят культуру при 25°С в течение 48 ч. Уровень экспрессии белка обнаруживают путем центрифугирования аликвоты суспензии - осажденные клетки должны иметь оранжево-красноватый цвет. В случае зеаксантина цвет культуры желтый. Аликвоту ресуспендируют в фосфатном буфере, содержащем 100 мг лизоцима и ингибитора протеаз Complete® (Roche), и лизируют с 3-4 циклами заморозки/оттаивания (используют сухой лед и абсолютный этанол). Полученный раствор центрифугируют (12000 g, 4°С), окрашенный супернатант подвергают очистке с помощью аффинной хроматографии. Элюцию проводят в градиенте имидазола (20-500 мМ), полученный раствор конструкции белок-каротиноид концентрируют (например, на Amicon Centrifugal Filter Units, Merck Millipore) и очищают от соли (колонка D-10 от GE Healthcare), затем хранят при -80°С в фосфатном буфере.

Пример 3.

Оценка коллоидной стабильности конструкции каротиноид-ВКБ.

Стабильность комплекса в растворе может оцениваться с помощью стандартных оптических методов, основанных на регистрации спектральных характеристик конструкции каротиноид-ВКБ и их изменений. Так, например, образование неспецифических агрегатов при денатурации белка приводит к появлению в растворе крупных частиц, помутнению раствора и выпадению осадка. Поэтому удобными способами оценки стабильности белка являются абсорбционная спектроскопия и методы регистрации гидродинамических характеристик белковых комплексов. В первом случае спектры поглощения могут быть измерены с помощью спектрофотометра, собранного на базе спектрометра Maya 2000 Pro (Ocean Optics, США) или аналогичных моделей детекторов на ПЗС-матрицах. В качестве источника белого света можно использовать стабилизированную дейтериевую лампу (SL S204, Thorlabs, USA) с выходом в многомодовое оптическое волокно, поскольку характеристики лампы позволяют проводить измерение интенсивности светового потока в УФ и видимой части спектра (от 250 до 700 нм). В экспериментах с конструкциями каротиноид-ВКБ следует обращать внимание на отношение интенсивности полосы поглощения каротиноида (видимая область) и аминокислотных остатков белка, поглощающих УФ-излучение, поскольку эта величина характеризует насыщенность комплекса каротиноидом. Также следует обращать внимание на увеличение оптической плотности, связанное с рассеянием света, поскольку это указывает на образование крупных частиц. Для оценки размеров частиц могут быть проведены эксперименты по измерению гидродинамического радиуса с помощью Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Англия) или аналогичных приборов. Коллоидная стабильность конструкции каротиноид-ВКБ может нарушаться при неоптимальных условиях хранения белкового препарата и/или наличии в растворе денатурирующих агентов.

Пример 4.

Способ применения комплекса с антиоксидантным действием.

Примером антиоксидантного и цитопротекторного эффекта конструкции каротиноид-ВКБ является результат его взаимодействия с клетками, подверженными окислительному стрессу. Например, это могут быть клетки зрительного пигментного эпителия человека, в которых накапливаются липофусциновые гранулы, которые, при облучении способны генерировать активные формы кислорода, вызывающие окислительный стресс. Каротиноиднй белок CBP в холо-форме (комплекс hCBP) способен доставлять каротиноиды, в частности зеаксантин в мембраны клеток. Дальнейшее распределение каротиноида по клеточным мембранам приводит к попаданию природного антиоксиданта в области клетки, подверженные окислительному стрессу, что позволяет предотвратить появление активных форм кислорода и связанные с этим патологические процессы. Для оценки эффектов защиты клеток от окисления с помощью CBP в холо-форме могут быть использованы методы флуоресцентной спектроскопии для регистрации распределений усредненных значений длительности аутофлуоресценции липофусцина в культуре клеток зрительного пигментного эпителия до и после фотоокисления (облучение с помощью светодиодной лампы, белый свет). Для этого наиболее удобным методом является лазерная конфокальная сканирующая микроскопия с регистрацией длительности возбужденных состояний (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM). Метод реализуется с помощью импульсного пикосекундного возбуждения образца при 473 нм с помощью пикосекундного лазера и системы время-коррелированного счета единичных фотонов SPC-150, DCC-100 с детектором HMP-100, установленного на гальвано-сканер DSC-120 (все Becker & Hickl, Германия). В результате измерения автофлуоресценции липофусцина в клетках получают гистограммы распределения времен жизни возбужденных состояний и оценивают их изменения в присутствии CBP в холо-форме в культуральной среде до и после облучения клеток.

Антиоксидантная активность CBP в холо-форме может быть использована для модуляции окислительного стресса различного рода. Например, комплекс потенциально может быть использован в виде глазных капель для предотвращения фотоповреждения сетчатки или мази на водной основе для обработки поверхностных ран.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа направленной доставки молекул каротиноидного типа. Предлагается новый подход к доставке молекул каротиноидов с помощью водорастворимых каротиноид-связывающих белков, обладающих высокой селективностью по отношению к индивидуальным каротиноидам. Подход позволит повысить эффективность загрузки действующего агента (каротиноида) в платформу для его доставки (здесь - белковая глобула) до 100%, а также повысить фотостабильность молекулы каротиноида. В качестве системы синтеза комплекса каротиноид-белок предлагается использовать биотехнологические штаммы микроорганизмов, обладающие набором генов для синтеза обоих компонентов комплекса. Изобретение обеспечивает удобство загрузки каротиноида в платформу для доставки, удобство очистки и работы с продуктом (стехиометрия комплекса фиксирована), возможность высокоточного контроля концентрации каротиноида в препарате и модификации комплекса специфическими молекулами-маркерами для осуществления направленной доставки. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 4 пр.

1. Комплекс, представляющий собой белковую глобулу hCBP, в которую инкапсулирован каротиноид зеаксантин за счет нековалентных связей между гидрокси-группой каротиноида и аминокислотами белковых частей комплекса, характеризующийся антиоксидантым действием.

2. Способ получения комплекса по п.1, включающий следующие шаги: синтез hCBP и соответствующего каротиноида в бактериальном штамме, включая конструирование плазмиды, содержащей ген hCBP, конструирование плазмиды, содержащей необходимый набор генов для биосинтеза зеаксантина, трансформацию бактериального штамма, получение клеток, в которых самопроизвольно происходит синтез конструкции hCBP-каротиноид, наработку клеточной массы, процедуры выделения и очистки.

3. Способ применения комплекса по п.1, полученного по п.2, в эксперименте, включающий следующие шаги:

А) создание композиции, содержащей комплекс каротиноид-hCBP, и полной среды культивирования для соответствующей культуры клеток;

Б) добавление композиции в концентрации до 1 мкМ к клеткам, культивируемым в условиях окислительного стресса за счет повышенной генерации активных форм кислорода для защиты клеток от повреждений активными формами кислорода и предотвращения клеточной гибели.