N-галлаты синтетических пептидов с антиоксидантной активностью Российский патент 2024 года по МПК C07K5/68 C07K5/107 C07K7/06 C07K7/08 A61K38/05 A61K38/07 A61K38/08 A61K38/10 A61K47/64 A61P39/06 

Изобретение относится к органической химии и представляет собой способ получения производных синтетических пептидов, модифицированных галловой кислотой с потенциальной антиоксидантной активностью.

Препараты синтетических пептидов в настоящее время активно испытываются, внедряются и используются в терапевтической практике в России. Помимо специфического действия, основанного на способности пептидов к взаимодействию с рецепторами, как, например, у окситоцина, пептиды могут обладать широким спектром неспецифической активности. К активности такого типа можно отнести противовирусное и противомикробное действие, а также антиоксидантный эффект [1-6].

Окислительный стресс является важнейшим звеном множества патологических процессов, в том числе инфекционных. Движущей силой окислительного стресса является избыточное образование реактивных форм кислорода в клетках, при котором собственные антиоксидантные системы организма не способны полностью их нейтрализовать, в результате чего клетки повреждаются и гибнут [7-9].

Экзогенные антиоксиданты обладают известной эффективностью в подавлении окислительного стресса. Среди них можно выделить полифенольные соединения, в частности, флавоноиды и галловую кислоту, для которых показана антиоксидантная активность на уровне организма. Данные соединения являются природными и содержатся в пище и препаратах растительного происхождения. Механизм антиоксидантной активности фенольных соединений обусловлен их высокой окислительной лабильностью: фенолы легко окисляются с образованием, в частности, хинонов. Отличительной чертой полифенолов является их способность к образованию в ходе окисления стабильных резонансных структур, также обладающих относительно низким окислительно-восстановительным потенциалом, в связи с чем одна молекула полифенола может относительно легко связать несколько кислородных радикалов [10, 11].

Тем не менее, природные полифенолы гидрофобны, в связи с чем имеют относительно низкую биодоступность. Данный недостаток обуславливает проявление антиоксидантного эффекта лишь как накопительного. Мировая эпидемия новой коронавирусной инфекции, в свою очередь, показала недостаток безопасных и изученных средств экстренного купирования окислительного стресса в номенклатуре российской фармакологии. Потенциальным решением данной проблемы является получение и характеризация инновационных антиоксидантов пептидной и пептидно-полифенольной структуры.

Собственная антиоксидантная активность пептидов проявляется обычно за счет остатков цистеина и метионина, способных окисляться с образованием органосульфидов и сульфонов, тирозина, обладающего фенольным гидроксилом, и триптофана, легко окисляющегося с разрывом гетероциклического участка. В отличие от полифенолов, пептиды обычно обладают высокой биодоступностью, в том числе способны к проникновению внутрь клеток, однако, способность к связыванию реактивных форм кислорода у пептидов значительно менее выражена, чем у полифенолов. Пептиды, состоящие из протеиногенных аминокислот, способны к полной биодеградации без образования токсичных метаболитов [13, 14].

Получение соединений пептидной природы с добавленными полифенольными фрагментами потенциально способно исключить недостатки обеих групп соединений и привести к созданию новых эффективных терапевтических средств с антиоксидантной активностью.

В ходе поисковой деятельности по получению БАВ дендримерной пептидной природы целесообразно применение твердофазного пептидного синтеза; введение в пептидную последовательность полифенольных фрагментов может посредством реакций нуклеофильного замещения и нуклеофильного присоединения через бифункциональные соединения с задействованием амино- и тиольных групп пептидов соответственно [15, 16].

Изобретение US 7601802 B2 относится к области биохимии и направлено на создание альфа-спиральных супрамолекулярных структур на основе аполипопептидных соединений - линейных полипептидов с остатками цистеина, метионина, триптофана и тирозина. Предполагается, что данные пептиды предотвращают перекисное окисление липидов в физиологических условиях. Патент не описывает разветвленные пептиды, а также полифенольные производные пептидов.

Изобретение CN 101775429 B относится к области технологии и направлено на получение продуктов лизиса белков молочной сыворотки, выделяемых в виде примесей при получении пищевых продуктов. Предполагается, что образующиеся в ходе лизиса пептиды обладают антиоксидантной активностью, устойчивы к гидролизу. Пептиды - линейные, полифенольные производные пептидов не приводятся. Способ получения не относится к твердофазному пептидному синтезу.

Изобретение RU 2782881 относится к медицине и ветеринарии и описывает применение трипептида L-Glu-L-Trp-D-Ala для достижения гепатопротекторного эффекта за счет, в том числе, предполагаемой антиоксидантной активности пептида. Описанный трипептид является линейным пептидом, содержит непротеиногенную аминокислоту D-Ала, является С-карбоксилом. Пептид получен посредством химического синтеза; твердофазный пептидный синтез не упоминается. Полифенольные производные не упоминаются.

Изобретение US 20220047707 A1 относится к технологии и описывает получение комплексов полифенолов с протеинами для применения в качестве нутрицефтических продуктов. Процесс получения комплексов не предполагает ковалентное присоединение полифенолов к белкам и пептидам. Химический синтез пептидов не упоминается.

Из US 7601802 B2 известно, что добавление свободного тиола на гидрофобно-гидрофильной границе раздела амфипатической альфа-спирали синтетических пептидов, которые имитируют белки, родственные ЛПВП, придает этим пептидам уникальную антиоксидантную активность, которая ингибирует перекисное окисление липидов и защищает фосфолипиды от водорастворимых инициаторов свободных радикалов. Эти пептиды можно использовать в качестве терапевтических средств для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями, ишемией, заболеваниями костей и другими заболеваниями, связанными с воспалительными процессами.

Модификация катионных пептидов природными полифенолами, и в частности, фенольными кислотами, позволяет им приобретать сильную антиоксидантную активность. Компоновка в одной молекуле различных фармакофоров позволяет в ряде случаев повышать биологическую эффективность таких гибридов за счет сочетания различных механизмов действия. Полифенолы, как известно, обладают очень низкой биодоступностью, однако применение пептидов, обладающих высокой проникающей активностью через биологические мембраны, могут выступать как носители полифенолов и способствовать повышению их биодоступности. Такие соединения могут быть востребованы как препараты для антиоксидантной терапии, в том числе для терапии вирусных, онкологических и нейродегенеративных заболеваний.

Таким образом, изобретение раскрывает способ синтеза линейных и дендримерных амфифильных катионных пептидов с высоким позитивным зарядом, которые модифицированы галловой кислотой (ГК). ГК является нетоксичным природным антиоксидантом и важным функциональным элементом многих флавоноидов.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении линейных и дендримерных амфифильных катионных пептидов, модифицированных галловой кислотой, обладающих антиоксидантной, антирадикальной активностью, низкой токсичностью и незначительной гемолитической активностью. Повышение антиоксидантной активности в 3-4 раза полученных пептидов достигается путем включения N-концевых остатков галловой кислоты. Также производные пептидов, обладающие высокой проникающей активностью через биологические мембраны выступают как носители полифенолов. Модифицированные пептиды проявляли существенную трансфекционную активность при доставке в клетки молекул ДНК (плазмид), причем некоторые пептиды обладали также антибактериальной активностью.

Было получено производное пептида, обладающее антиоксидантной активностью, которое включает: (а) пептид, характеризующийся структурной формулой: YYKK, YYLK, (KKIRRLK)2KYAC, KKIRARLKYAC, (KKIRARLK)2KYAC, KK, AKKYRRFRYKYKGKYFYAC, где С-концевая аминокислота находится в форме амида, свободные аминогруппы протонированы, находятся в форме соли с трифторуксусной кислотой, Y представляет собой тирозин, K - лизин, L - лейцин, R - аргинин; I - изолейцин, С - цистеин, А - аланин, Р - пролин, G - глицин, F-фенилаланин, и (b) 3,4,5-тригидроксибензоат, связанный с N-концом указанного пептида (а).

Производное синтетического пептида содержит катионные аминокислоты аргинин и лизин. Производное синтетического пептида, где пептид модифицирован по N-концевой аминокислоте полифенольной кислотой, в частности тригидроксибензойной кислотой. Производное синтетического пептида, где аминокислотные последовательности выбираются с учетом создания амфифильной структуры, обеспечивающие пептиду клеточно-проникающие свойства.

Таким образом, применение полученных производных синтетических пептидов в качестве средства, обладающего антиоксидантной, антирадикальной активностью, низкой токсичностью и низкой гемолитической активностью. Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами.

Краткое описание графических материалов.

Фигура 1. Структурная формула производного пептида АВ-11. Фигура 2. Структурная формула производного пептида АВ-12. Фигура 3. Структурная формула производного пептида АВ-15. Фигура 4. Структурная формула производного пептида АВ-9. Фигура 5. Структурная формула производного пептида АВ-10. Фигура 6. Структурная формула производного пептида АВ-33.

Фигура 7. Масс-спектры производных синтетических пептидов.

Фигура 8. УФ-спектры: слева - немодифицированный пептид, справа - ГК-модифицированный пептид.

Фигура 9. Гемолитическая активность пептидов, % от гемолиза эритроцитов в дистиллированной воде 1 - АВ-10, 2 - АВ-11, 3 - АВ-12, 4 - АВ-13, 5 - АВ-14, 6 - АВ-15, 7 -ST-10, 8-AST-1.

Фигура 10. Уровень флуоресценции (538 нм) внутриклеточного сенсора HyPer в присутствии пептидов, измеренных перед добавлением и после добавления пероксида водорода. 1 - положительный контроль, 2 - АВ-10, 3 - АВ-11, 4 - АВ-12, 5 - АВ-13, 6 - АВ-14, 7 - АВ-15, 8 - AST-1, 9 - ST-10. * - наиболее существенно снижающие концентрацию пероксида.

Фигура 11. Отношение интенсивностей флуоресценции (538 нм) внутриклеточного сенсора HyPer в присутствии пептидов, измеренных перед добавлением и после добавления пероксида водорода.

Фигура 12. Сравнительная активность пептидов в стимуляции трансфекции плазмиды pGL3, кодирующей репортерный ген люциферазы. 1 - Lipofectamine 3000, 2 - АВ-10, 3 - АВ-11, 4 - АВ-12, 5 - АВ-13, 6 - АВ-14, 7 - АВ-15, 8 - АВ-32 9 - АВ-33 10 -AST-1 11 - ST-1.

В основу изобретения положена цель по получению новых потенциальных антиоксидантных средств на основе синтетических пептидов.

Изобретение представляет собой N-галлаты синтетических пептидов, обладающих приведенными далее физико-химическими свойствами и потенциальной антиоксидантной активностью, а также метод получения N-концевых галлатов синтетических пептидов. Пептиды обладают наименованиями и аминокислотными последовательностями, указанными в таблице 1; структурные формулы приведены на фиг.1-6.

ПРИМЕР 1

Все пептиды получены методом твердофазного синтеза от С-конца к N-концу по общей методике:

238 мг полимера H-Rink-Amide-Chemmatrix или аналог с емкостью 0,42 мэкв (далее - смола) помещается в реактор для пептидного синтеза, представляющий собой стеклянный мелкопористый фильтр. Данная загрузка полимера содержит 0,1 ммоль аминогрупп. Может использоваться как нутч-фильтр, так и друк-фильтр; в последнем случае давление создается инертным обезвоженным газом, например, азотом; перемешивание может быть механическим или за счет барботажа. Смола покрывается двукратным объемом ДМФА и перемешивается в нем в течение 30 минут для максимального набухания. Растворитель удаляется фильтрацией. После набухания смолы готовится активированная Fmoc-аминокислота, например, цистеин. Для этого 117 мг Fmoc-Cys(Trt)-OH (0,2 ммоль) помещается в емкость для активации, например, во флакон объемом 5 мл из пластика Nalgene. В тот же флакон помещается 76 мг ГБТУ (эквимолярно кислоте). Содержимое флакон растворяется в 3 мл 0,4 М раствора ММ при перемешивании в течение 30 секунд. Содержимое флакона переносится в реактор. Флакон промывается 3 мл ДМФА для сбора остатков активированной аминокислоты, промывной объем переносится в реактор. В реактор добавляется объем ДМФА для покрытия смолы. Содержимое реактора перемешивается в течение 60 минут. Раствор удаляется фильтрацией. Ретентат промывается ДМФА пять раз. Далее производится удаление Fmoc-защиты. Для этого смола в реакторе покрывается объемом 30% раствора ТГП в ДМФА, суспензия перемешивается в течение 5 минут, раствор удаляется фильтрацией. Данная операция производится дважды для каждого удаления Fmoc-защиты. После удаления ТГП смола промывается объемом ДМФА 6 раз. После последней промывки смола готова к присоединению следующей аминокислоты. Данные операции повторяются до присоединения N-концевой аминокислоты, после чего производится присоединение галловой кислоты.

Далее приведен пример получения N-галлата пептида KKIRARLKYAC (АВ-12). Полученный пептидил-полимер с расчетным содержанием аминогрупп в 0,1 ммоль находится в реакторе для пептидного синтеза. 136,1 мг галловой кислоты, 113,6 мг Oxyma Pure (эквимолярно) помещаются в колбу Эрленмейера объемом 10 мл, растворяются в 5 мл ДМФА, смешиваются с 0,784 мл 1 М раствора ДИК в ДМФА (0,98 мэкв.). Через 10 минут перемешивания в закрытой колбе реакционная смесь переносится в реактор с пептидил-полимером. Контроль замещения производится по исчезновению окраски 2% раствора нингидрина в н-бутаноле. Окраска исчезает в течение 2-4 часов, после чего раствор удаляется фильтрацией. Смола промывается трижды. Ретентат подвергается ацидолизу для выделения полифенольного производного. Для этого смола переносится на отдельный нутч-фильтр и промывается ХМ и СЭ, после чего помещается в предварительно взвешенную емкость для ацидолиза, например, закрываемый крышкой из ПВХ сосуд номинальным объемом 10 мл (далее - пенициллинка). Открытая пенициллинка со смолой помещается в эксикатор, выдерживается в нем в течение 30 минут при давлении ~50 мбар. После осушения пенициллинка повторно взвешивается, в нее помещается якорь для магнитной мешалки, она закрывается и охлаждается. Далее готовится и используется немедленно смесь для ацидолиза. Для этого 10 мл ТФУ смешивают с 0,5 мл воды, 0,25 мл ЭДТ, 0,5 мл тиоанзиола, 0,5 мг фенола в отдельной пенициллинке. Полученная смесь переносится в пенициллинку со смолой, последняя немедленно закрывается и помещается на магнитную мешалку на 2 часа. Перемешивание - интенсивное. После окончания ацидолиза полученная суспензия фильтруется со сбором пермеата. Сбор остатков раствора из пенициллинки происходит с использованием ХМ, остатки пропускаются через тот же фильтр к первичному пермеату, который после этого концентрируется в три раза с использованием роторного испарителя. К полученному концентрату добавляется 50-кратный объемный избыток СЭ. Суспензия выдерживается при температуре ~15°С непотревоженной в течение 30 минут, после чего осадок концентрируется на фильтре. Ретентат смывается водой в отдельную круглодонную колбу. Для ученного раствора регистрируется МС. В случае наличия на масс-спектре целевого пика раствор замораживается и лиофилизируется. Из лиофилизата (далее - сырца) далее очищается пептид. Для этого сырец растворяется непосредственно перед очисткой в элюенте А, после чего вводится в хроматограф высокого давления с параметрами, приведенными в таблице 2. Собранные фракции анализируются МС. Фракции, на масс-спектрах которых целевой пик обладает 100% относительной интенсивностью, подвергаются упариванию ацетонитрила с использованием роторного испарителя, заморозке и лиофилизации.

Для определения данных параметров используются приведенные далее методики.

МАЛДИ-ВП-МС: Подлинность пептидов определяли с использованием спектрометра Bruker Microflex LT (Bruker, ФРГ). Матрица - насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в смеси ацетонитрила и 0,1% водного раствора ТФУ. Диапазон m/z - 1000-8000. Режим обнаружения положительных ионов.

ЗКЭ: Чистоту пептидов определяли с использованием капиллярной электрофоретической установки Капель-105М (Люмекс, Россия). Детекция - фотометрическая при 226 нм. Для анализа использовали кварцевый незаполненный капилляр, (l общая - 60 см, l эффективная - 50 см, d внутренний - 75 мкм), в качестве фонового электролита использовали водный раствор 0,1 М фосфорной кислоты и 0,05 М трис-(гидроксиметил)-аминометана.

АЭА: Количественное содержание пептидов определяли по азоту с использованием анализатора VELP ЕМА502 (VELP, Италия) с микровесами AND BM-20G (AND, Япония). Калибровка осуществлялась по стандартам сульфаниловой кислоты от производителя анализатора.

Таким образом, была проведена оптимизации условий присоединения ГК, учитывая реакционную способность ее фенольных гидроксилов, которые могут участвовать в реакциях конденсации. Эксперименты показали, что приемлемым вариантом оказалось применение 8-16-кратных избытков ГК в присутствии эквивалентных количеств диизопропилкарбодиимида и Оксима, применяемого в качестве катализатора конденсации. Избыточное количество ГК и побочных продуктов отделялись фильтрацией при промывке смолы растворителями на стадии отщепления пептида от смолы. Последнюю операцию проводили в среде трифторуксусной кислоты в присутствии фенола, воды, этандитиола или диметилсульфида. Очистку модифицированных и немодифицированных пептидов проводили путем ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой С18.

Было синтезировано 11 катионных пептидов, включая линейные и дендримерные структуры, из них 7 пептидов содержали ГК (таблица 1). Структуру полученных соединений на основе идентичности масс подтверждали масс-спектрами (фиг.7). Наличие фенольного компонента в пептидах было также подтверждено УФ-спектрами, по наличию полосы с максимумом при 270 нм, одинаковой для всех ГК-модифицированных пептидов (фиг.8).

У всех пептидов С-концевая аминокислота находится в форме амида, свободные аминогруппы протонированы, находятся в форме соли с трифторуксусной кислотой, чье мольное содержание равно числу позитивного заряда пептида при нейтральном рН.

Описываемые пептиды содержат от 11 до 20 аминокислотных остатков и могут быть использованы в разработке активных фармацевтических субстанций с потенциальной антиоксидантной активностью для терапии патологий, протекающих с развитием окислительного стресса.

Полученные пептидные соединения анализировали на наличие гемолитической, цитотоксической, антиоксидантной и трансфекционной активностей.

ПРИМЕР 2

Для анализа степени гемолиза были использованы эритроциты человека. В качестве положительного контроля использовали дистиллированную воду, что обеспечивало близкий к 100% лизис клеток (фигура 9). Таким образом, среди пептидов заметной гемолитической активностью обладал только немодифицированный дендримерный пептид АВ-14. Степень лизиса в его присутствии составляла около 24%, для остальных же пептидов данный показатель составлял менее 3% (рисунок 3). Вероятная причина литической активности АВ-14, по-видимому, обусловлена тем, что его длинная ветвь с последовательностью WKKIRVRLS, содержит гидрофобный N-концевой триптофан и чередующиеся гидрофобные и гидрофильные аминокислоты, формирующие позитивно заряженную амфифильную структуру, способную вызывать нарушение липидной мембраны клетки. При этом модификация пептида галловой кислотой по N-концу существенно не влияла на степень гемолиза. Из данных следует, что полученный соединения не обладают значительной гемолитической активностью, что положительно характеризует их потенциальную безопасность.

Токсичность полученных соединений оценивали in vitro путем проведения МТТ-анализа, основанного на восстановлении красителя метилтетразолиевого синего (МТТ), под действием восстановленной формы НАД-Н в митохондриях в нерастворимый в воде формазан. МТТ имеет желтую окраску, а формазан окрашен в фиолетово-синий цвет. Число живых клеток пропорционально количеству восстановленного формазана, поскольку он способен встраиваться только в жизнеспособные клетки. Анализ проводили на линии клеток HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека), А549 (аденокарцинома легкого человека), melIs (меланома человека), Wi-38 (диплоидная линия фибробластов человека). В качестве контрольного препарата с цитостатическим действием был выбран Эпирубицин. Результаты тестирования показали, что токсический эффект пептидов менялся в зависимости от типа клеток. Следует отметить, что присоединение галловой кислоты не приводило к заметному повышению токсичности соединения. Однако, два пептида АВ-14 и АВ-15 показали токсичность для опухолевых линий А549 и melIs, которая была близка к токсичности Эпирубицина (выделено жирным шрифтом), однако для нормальных клеток (культура Wi-38) указанные пептиды не проявляли такой значительной токсичности, как Эпирубицин. В целом, следует отметить, что все полученные короткие ГК-содержащие пептиды отличались низкой токсичностью.

ПРИМЕР 3

Определение антиоксидантной активности синтетических пептидов. Изобретенные производные пептидов, имеющие приведенные физико-химические свойства, обладают потенциальной антиоксидантной активностью и могут быть использованы в разработке средства для получения антиоксидантных лекарственных препаратов.

На следующем этапе работы, мы изучали антиоксидантную активность полученных соединений путем постановки 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил-теста (ДФПГ-тест). ДФПГ-тест является одним из наиболее известных методов исследования антиоксидантной активности, основанных на способности восстанавливать стабильный ДФПГ-радикал. Этот метод широко используется для оценки индивидуальных фенольных веществ в фармакологии и пищевой индустрии. Полученные результаты подтвердили, что присоединение галловой кислоты к КП резко увеличивает их антиоксидантную активность, в 2-3 раза превышающую таковую аскорбиновой кислоты. Антиоксидантная активность пептидов без галловой кислоты была на порядок меньше, при этом уровень заряда пептида не оказывал влияния на данную активность (табл.1).

ПРИМЕР 4

Для оценки антиоксидантной активности исследуемых образцов в тесте с ДФПГ-радикалом использовали раствор ДФПГ в метаноле в различных концентрациях. Для этого сделали следующую раститровку: 200 мкг/мл, 150 мкг/мл, 100 мкг/мл, 75 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, чистый метанол (в качестве контроля). Переносили в дубликатах по 200 мкл в 96-луночный планшет.Проводили измерения на приборе Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 520 нм, после которых установили, что за точку отсчета принимается концентрацию 50 мкг/мл (значение поглощения <1).

Затем готовили растворы пептидов с молярными концентрациями 2,6-2,8 мкмоль/мл. Растворы также переносили в дубликатах по 2.5 мкл в 96-луночный планшет, после чего в каждую лунку вносили раствор ДФПГ (50 мкг/мл) в объеме 200 мкл. Наблюдали визуальные изменения в окраске, а также проводили измерения приборе Multiscan FC при длине волны 520 нм.

Для подтверждения влияния остатков галловой кислоты на антиоксидантную активность пептидов данный тест был проведен для веществ АВ-32 (AKKYRRFRYKYKGKYFYAC) и АВ-33 (Gal-AKKYRRFRYKYKGKYFYAC), полученных приведенным выше способом. Данные приведены в таблице 3. Эти пептиды полностью идентичны за исключением N-концевых остатков галловой кислоты у АВ-33, и за счет этой модификации антиоксидантная активность АВ-33 превышает таковую у АВ-32 примерно в 4 раза. Результаты подтверждают влияние N-концевых остатков галловой кислоты на антиоксидантную активность пептидов.

ПРИМЕР 5

Второй способ оценки антиоксидантной активности пептидов уже на клеточном уровне основан на использовании генетически-кодируемого биосенсора HyPer и позволяет проводить анализ изменений концентрации перекиси водорода внутри клетки. В отличие от обычно используемых производных дихлорфлуоресцеина (DCF), HyPer обладает высокой специфичностью к пероксиду, не продуцирует АФК под действием света и не чувствителен к супероксиду, окисленному глутатиону, оксиду азота и пероксинитриту. Благодаря белковой природе, HyPer может быть непосредственно экспрессирован в клетках-мишенях или направлен в клеточные органеллы для регистрации внутриклеточных изменений концентрации H2O2. Окисленный HyPer способен к самовосстановлению, что позволяет проводить многократные измерения внутри одной и той же клетки или клеточной структуры. Реакция биосенсора на изменение концентрации перекиси под действием пептидов очевидно зависит от двух факторов: от способности их транспорта в цитоплазму клетки и непосредственного их взаимодействия с пероксидом в цитоплазме. Вначале клетки инкубировали с пептидами (4 ч), а затем вносили пероксид с практически одновременным измерением флуоресценции.

Полученные результаты отображены на диаграмме (фиг.10), где показаны уровни флуоресценции внутриклеточного сенсора HyPer в присутствии пептидов, измеренных перед добавлением и после добавления пероксида водорода. Видно, что пептиды влияют на уровень флуоресценции сенсора до добавления пептида, снижая его по сравнению с контролем (ФСБ). Чтобы нивелировать этот эффект для сравнения пероксид-подавляющей активности пептидов, мы в качестве параметра сравнения использовали отношение интенсивностей флуоресценции HyPer, измеренных перед добавлением и после добавления пероксида (фиг.11).

ПРИМЕР 6

Эксперименты по трансфекции имели целью прояснить вопрос проникновения этих пептидов в цитоплазму. На фигуре 12 показана активность пептидов (log-шкала) как носителей для доставки плазмиды в клетки HEK 293. Производное синтетического пептида, где аминокислотные последовательности выбираются с учетом создания амфифильной структуры, обеспечивающие пептиду клеточно-проникающие свойства.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Fmoc-9-флуоренилметоксикарбонил

Fmoc-Cys(Trt)-OH-N-флуоренилметоксикарбонил-S-тритил-цистеин

Gal- - остаток галловой кислоты

Oxyma Pure - этил-(2Z)-2-циано-2-(гидроксиимино)ацетат

АЭА - автоматический элементный анализ

ГБТУ - 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторофосфат

ДИК - N,N'-диизопропилкарбодиимид

ДМФА - N,N-диметилформамид

ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил

ЗКЭ - зонный капиллярный электрофорез

МАЛДИ-ВП-МС - масс-спектрометрия с матрично-активационной лазерной десорбцией/ионизацией и время-пролетным анализатором

ММ - N-метилморфолин

МС - масс-спектрометрия мэкв. - молярный эквивалент

СЭ - серный эфир

ТГП - тетрагидропиррол

ТФУ - трифторуксусная кислота

ХМ - хлористый метилен

ЭДТ - 1,2-этандитиол

ГК - галловая кислота

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Keeble А.Н. et al. Approaching infinite affinity through engineering of peptide-protein interaction // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2019. - Т. 116. - №. 52. - C. 26523-26533.

2. Magana M. et al. The value of antimicrobial peptides in the age of resistance // The Lancet Infectious Diseases. - 2020. - T. 20. - №. 9. - C. e216-e230.

3. Browne K. et al. A new era of antibiotics: the clinical potential of antimicrobial peptides // International journal of molecular sciences. - 2020. - T. 21. - №. 19. - C. 7047.

4. Vilas Boas L.C.P. et al. Antiviral peptides as promising therapeutic drugs // Cellular and Molecular Life Sciences. - 2019. - T. 76. - C. 3525-3542.

5. Mardani M. et al. Antioxidant peptides: Overview of production, properties, and applications in food systems // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. - 2023. - T. 22. - №. 1. - C. 46-106.

6. Lv R. et al. Advances in the activity evaluation and cellular regulation pathways of food-derived antioxidant peptides // Trends in Food Science & Technology. - 2022.

7. Orellana-Urzúa S. et al. Pathophysiology of ischemic stroke: role of oxidative stress // Current Pharmaceutical Design. - 2020. - T. 26. - №. 34. - C. 4246-4260.

8. Ntyonga-Pono M. P. COVID-19 infection and oxidative stress: an under-explored approach for prevention and treatment? // The Pan African Medical Journal. - 2020. - T. 35. - №. Suppl 2.

9. Muhammad Y. et al. Deficiency of antioxidants and increased oxidative stress in COVID-19 patients: A cross-sectional comparative study in Jigawa, Northwestern Nigeria // SAGE open medicine. - 2021. - T. 9. - C. 2050312121991246.

10. Garcia-Sanchez A., Miranda-Diaz A. G, Cardona-Munoz E. G. The role of oxidative stress in physiopathology and pharmacological treatment with pro-and antioxidant properties in chronic diseases // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2020. - T. 2020.

11. Rudrapal M. et al. Dietary polyphenols and their role in oxidative stress-induced human diseases: insights into protective effects, antioxidant potentials and mechanism (s) of action //Frontiers in pharmacology. - 2022. - T. 13. - C. 283.

12. Yan W. et al. Studies on the bioactivities and molecular mechanism of antioxidant peptides by 3D-QSAR, in vitro evaluation and molecular dynamic simulations //Food & function. - 2020. - T. 11. - №. 4. - C. 3043-3052.

13. Ruseska I., Zimmer A. Internalization mechanisms of cell-penetrating peptides //Beilstein journal of nanotechnology. - 2020. - Т. 11. - №. 1. - C. 101-123.

14. Isidro-Llobet A. et al. Sustainability challenges in peptide synthesis and purification: from R&D to production // The Journal of Organic Chemistry. - 2019. - T. 84. - №. 8. - C. 4615-4628.

15. Wang C. et al. Antimicrobial peptides towards clinical application: Delivery and formulation // Advanced drug delivery reviews. - 2021. - T. 175. - C. 113818.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><!DOCTYPE ST26SequenceListing

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN"

"ST26SequenceListing_V1_3.dtd"><ST26SequenceListing

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="N-галлаты синтетических пептидов с антиоксидантной

активностью.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-02-27">

<ApplicantFileReference>2023126338</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;ГНЦ Институт

иммунологии&quot; ФМБА России</ApplicantName> <ApplicantNameLatin>NRC

Institute of Immunology of FMBA of Russia</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">N-галлаты синтетических пептидов с

антиоксидантной активностью</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>8</SequenceTotalQuantity> <SequenceData

sequenceIDNumber="1"> <INSDSeq> <INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q38">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q39">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_sequence>XYYKK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q37">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q40">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_sequence>XYYLK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq> <INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q31">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q25">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The side chain of this lysine residue is linked

via an amide linkage to another sequence.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Боковая цепь данного остатка лизина

связана амидной связью с другой

последовательностью.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q46">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XKKIRRLKKYAC</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="4"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q32">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>8</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q27">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>This sequece is one part of a branched amino

acid sequence.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Эта последовательность является частью

разветвлённой аминоксилотной

последовательности.</NonEnglishQualifier_value> </INSDQualifier>

</INSDFeature_quals> </INSDFeature> <INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q41">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XKKIRRLK</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="5"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q33">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q42">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XKKIRARLKYAC</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="6"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q36">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>10</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The side chain of this lysine residue is linked

via an amide linkage to another sequence.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Боковая цепь данного остатка лизина

связана амидной связью с другой

последовательностью.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q43">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XKKIRARLKKYAC</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="7"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>9</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q35">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>SITE</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>9</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q28">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>This sequece is one part of a branched amino

acid sequence.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Эта последовательность является частью

разветвлённой аминоксилотной

последовательности.</NonEnglishQualifier_value> </INSDQualifier>

</INSDFeature_quals> </INSDFeature> <INSDFeature>

<INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q44">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XKKIRARLK</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData> <SequenceData sequenceIDNumber="8"> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> <INSDQualifier id="q34">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

<INSDFeature> <INSDFeature_key>VARIANT</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDQualifier id="q45">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>X is galic acid linked via amide linkage to the

first amino acid.</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>X является галловой кислотой, связанной

амидной связью с первой аминокислотой.</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDFeature_quals> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>XAKKYRRFRYKYKGKYFYAC</INSDSeq_sequence> </INSDSeq>

</SequenceData></ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области органической химии. Предложены производные синтетических пептидов, модифицированных галловой кислотой с потенциальной антиоксидантной активностью. Для данных пептидов установлена потенциальная антиоксидантная активность методом ДФПГ-теста. Пептиды могут быть использованы в разработке активных фармацевтических субстанций с потенциальной антиоксидантной активностью для терапии патологий, протекающих с развитием окислительного стресса. 12 ил., 3 табл., 6 пр.

Производное пептида, обладающее антиоксидантной активностью, которое включает: (а) пептид, характеризующийся структурной формулой: YYKK, YYLK, (KKIRRLK)2KYAC, KKIRARLKYAC, (KKIRARLK)2KYAC, KK, AKKYRRFRYKYKGKYFYAC, где С-концевая аминокислота находится в форме амида, свободные аминогруппы протонированы, находятся в форме соли с трифторуксусной кислотой, Y представляет собой тирозин, K - лизин, L - лейцин, R - аргинин; I - изолейцин, С - цистеин, А - аланин, Р - пролин, G - глицин, F - фенилаланин, и (b) 3,4,5-тригидроксибензоат, связанный с N-концом указанного пептида (а).