Штамм микроводорослей, обладающий стимулирующим действием на рост растений, и его применение Российский патент 2025 года по МПК C12N1/12 C05F11/08 C12R1/89 A01N65/03 A01P21/00 

Область изобретения

Перекрестная ссылка на родственные заявки на изобретения

В настоящей заявке на изобретение заявлен приоритет, основанный на заявке на патент Кореи №10-2021-0125207, поданной 17 сентября 2021 года, и все содержание, раскрытое в документах соответствующей заявки на патент Кореи, включено путем ссылки как часть описания настоящего изобретения.

Настоящая заявка относится к новому штамму микроводорослей, обладающему стимулирующим действием на рост растений, и к его применению.

Предшествующий уровень техники

По мере расширения масштабов биоиндустрии могут быть получены различные продукты, основанные на технологии ферментирования микроорганизмов, и, в частности, с недавним ростом области White Bio, растет и отрасль микробного ферментирования. Тем не менее, поскольку ферментирование в основном представляет собой процесс, который выделяет диоксид углерода, по мере развития промышленности в области микробного ферментирования существует проблема, заключающаяся в том, что выделение парниковых газов, образующихся в результате ферментирования, значительно увеличивается. Кроме того, по мере того, как во всем мире возникают проблемы изменения климата, усилия по сокращению выбросов парниковых газов, которые, как указывается, являются одной из основных причин изменения климата, предпринимаются с различных точек зрения, и, таким образом, сокращение выбросов парниковых газов в результате микробного ферментирования также становится основной проблемой.

К настоящему времени технологии, которые могут вносить вклад в сокращение выбросов углерода главным образом путем подавления выбросов самого парникового газа, были коммерциализированы, но считается, что очень трудно уменьшить выбросы диоксида углерода в процессе микробного ферментирования. Кроме того, разработка технологии, которая может непосредственно улавливать и уменьшать выброс парникового газа, все еще находится на минимальном уровне и, в частности, поскольку диоксид углерода присутствует в атмосфере в очень низкой концентрации и является стабильным материалом с очень низкой реакционной способностью, существует сложность в разработке технологии уменьшения уровня уже выброшенного диоксида углерода. В этом отношении в качестве разновидности технологий биологического восстановления углерода можно рассматривать способ использования фотосинтетического организма, но существует проблема, заключающаяся в том, что его трудно применить к реальной промышленности, поскольку структура прибыли, отличающаяся от задачи сокращения выброса углерода, не ясна. Соответственно, существует потребность в разработке промышленно применимой технологии сокращения выброса углерода, в то же время способной уменьшать выброс диоксида углерода, образующегося в результате микробного ферментирования путем, благоприятным для окружающей среды.

Описание изобретения

Техническая задача

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа КСТС14659 ВР.

Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы предложить композицию для стимулирования роста растений, содержащую одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанной культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата; и лизата указанного высушенного материала.

Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы предложить удобрение для растений, содержащее композицию для стимулирования роста растений.

Также задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, включающий культивирование штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР, в присутствии газа, выделяемого при ферментировании.

Задача настоящего изобретения также заключается в том, чтобы предложить способ стимулирования роста растений, включающий получение композиции для стимулирования роста растений, содержащей любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанных культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата; и лизата указанного высушенного материала; и приведение композиции для стимулирования роста растений в контакт с растением.

Также задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение для изготовления удобрения для растений или применение для стимулирования роста растений штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР.

Также задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить применение для изготовления удобрения для растений или применение для стимулирования роста растений композиции, содержащей любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего эффектом стимулирования роста растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанных культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата; и лизата указанного высушенного материала.

Техническое решение

Каждое описание и воплощение, раскрытое в настоящей заявке, может быть применено к каждому другому описанию и воплощению. Другими словами, все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящей заявке, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, нельзя считать, что объем настоящего изобретения ограничен конкретным описанием, приведенным ниже. Кроме того, специалисты в данной области техники могут признать или подтвердить множество эквивалентов конкретного аспекта настоящего изобретения, описанного в настоящей заявке, используя только обычные эксперименты. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты предназначены для включения в настоящее изобретение.

В одном из воплощений настоящего изобретения предложен штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа СТС14659 ВР.

Растение может представлять собой растение рода Arabidopsis. Например, растение рода Arabidopsis может представлять собой Arabidopsis thaliana, но не ограничиваться этим.

Используемый в настоящем описании термин "рост растений" означает процесс, в котором семя растения прорастает с образованием корней, стеблей и листьев или с последующим постепенным увеличением размера и массы, а термин "стимулирование роста растений" означает стимулирование прорастания семени растения или увеличения размера и/или массы проросшего растения.

Штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 может иметь нуклеотидную последовательность 18S рРНК (рибосомальная РНК) SEQ ID NO: 1, но не ограничиваясь этим. Например, штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 может иметь 18S рРНК, состоящую из нуклеотидной последовательности, имеющей идентичность последовательности 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, 98% или более или 99% или более с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, но не ограничиваясь этим.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для стимулирования роста растений, содержащая любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанных культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата; и лизата указанного высушенного материала.

Штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 является таким, как описано выше.

"Культура" штамма относится к продукту, полученному путем культивирования штамма, и, в частности, может представлять собой культуральный раствор, содержащий штамм, а "культуральный супернатант" может представлять собой культуральный фильтрат, в котором штамм удален из культуры или культурального раствора указанного штамма. "Концентрат" может означать концентрат указанных культуры или культурального супернатанта. "Высушенный материал" представляет собой культуру, культуральный супернатант указанного штамма или их концентрат, из которого удалена влага, и, например, он может находиться в форме высушенной микробной клетки штамма, но не ограничивается этим. Кроме того, "лизат" указанного высушенного материала является общим термином для обозначения результата лизирования указанного высушенного материала, из которого удалена влага, и, например, может представлять собой высушенный порошок микробных клеток указанного штамма, но не ограничиваясь этим. Культура штамма может быть получена в соответствии со способом культивирования, известным в данной области техники, путем инокулирования штамма в культуральную среду, или может быть получена способом, включающим культивирование штамма в присутствии газа, выделяемого при ферментировании. Указанные концентрат, высушенный материал или его лизат могут быть получены при помощи способа обработки или сушки микроводорослей, известного в данной области техники, или их культуры.

Растение может представлять растение рода Arabidopsis. Например, растение рода Arabidopsis может представлять собой Arabidopsis thaliana, но не ограничиваясь этим.

Композиция для стимулирования роста растений может содержать консервант, стабилизатор, смачивающий агент или эмульгатор, криопротектор или экспициент и тому подобное.

Консервант, стабилизатор или экспициент могут содержаться в указанной композиции в эффективной дозе, достаточной для снижения ухудшения качества композиции.

Используемый в настоящем описании термин "ухудшение качества" может включать в себя снижение количества, снижение активности или их комбинацию штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, содержащегося в композиции, и тому подобного.

Например, композиция может представлять собой композицию, в которой штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 выживает или остается активным в композиции в течение более длительного периода времени, в отличие от штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, присутствующего в природе, путем включения в нее эффективной дозы консерванта, стабилизатора или эксципиента, достаточной для снижения ухудшения качества композиции.

Консервант, стабилизатор или эксципиент, обычно используемые в данной области техники, могут быть использованы без ограничений до тех пор, пока они могут снижать ухудшение качества композиции. Например, стабилизатор может представлять собой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из альгината, альгината натрия, казеина, казеина натрия, целлюлозы, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы натрия, пектина, желатина, аравийской камеди, ксантановой камеди, декстрана, циклодекстрина и крахмала.

Криопротектор может содержаться в композиции в эффективной дозе, достаточной для снижения ухудшения качества композиции, когда композиция высушена путем лиофилизации. Например, в отличие от штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, присутствующего в природе, композиция может быть такой, в которой штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 выживает или остается активным в течение более длительного периода времени в этой композиции благодаря наличию в ней эффективной дозы криопротектора, достаточной для снижения ухудшения качества композиции в лиофилизированном состоянии.

Криопротектор, обычно используемый в области техники, может быть использован без ограничений до тех пор, пока он может снижать ухудшение качества композиции в лиофилизированном состоянии. Например, криопротектор может представлять собой любой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из глицерина, этиленгликоля, пропиленгликоля, диметилсульфоксида (DMSO), глюкозы, трегалозы, мальтодекстрина, декстрина, обезжиренного молока и крахмала.

Композицию можно добавлять в удобрение для растения путем погружения, распыления или смешивания.

В другом аспекте предложено удобрение для растений, содержащее композицию для стимулирования роста растений.

Композиция для стимулирования роста растений является такой, как описано выше.

Растение может представлять собой растение рода Arabidopsis. Например, растение рода Arabidopsis может представлять собой Arabidopsis thaliana, но не ограничивается этим.

Удобрение для растений может быть получено при помощи способа получения, обычно используемого в области техники. Например, удобрение для растений может дополнительно содержать эксципиент или носитель, обычно используемый в области техники, и может быть приготовлено в композиции обычного удобрения для растений, известного в данной области техники.

Удобрение для растений может представлять собой экологически чистое удобрение, способное заменить химическое удобрение.

Удобрение для растений может быть использовано для стимулирования роста растений.

В другом аспекте предложен способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, включающий культивирование штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР, в присутствии газа, выделяемого при ферментировании.

Штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 является таким, как описано выше.

Газ, выделяемый при ферментировании, может содержать диоксид углерода в концентрации от 0,5 до 20% (об./об.). Например, газ, выделяемый при ферментировании, может содержать диоксид углерода в концентрации от 0,5 до 18% (об./об.), от 0,5 до 16% (об./об.), от 0,5 до 14% (об./об.), от 0,5 до 12% (об./об.), от 0,8 до 18% (об./об.), от 0,8 до 16% (об./об.), от 0,8 до 14% (об./об.) или от 0,8 до 12% (об./об.).

Газ, выделяемый при ферментировании, может образовываться в результате микробного ферментирования. Например, газ, выделяемый при ферментировании, может содержать диоксид углерода, образующийся в результате микробного ферментирования. Микроорганизм может включать все микроорганизмы, генерирующие диоксид углерода в ходе ферментирования или процесса культивирования без ограничения.

Культивирование может быть осуществлено путем подачи в ферментатор газа, выделяемого при ферментировании. Например, газ, выделяемый при ферментировании, может подавать газ, выделяемый при микробном ферментировании, в ферментатор путем его фильтрования. Газ, выделяемый при ферментировании, может подаваться в ферментатор со скоростью от 0,001 до 1 об./об./мин. Например, газ, выделяемый при ферментировании, может подаваться в ферментатор со скоростью от 0,001 до 1 об./об./мин, от 0,001 до 0,7 об./об./мин, от 0,001 до 0,5 об./об./мин, от 0,001 до 0,3 об./об./мин, от 0,001 до 0,2 об./об./мин, от 0,005 до 1 об./об./мин, от 0,005 до 0,7 об./об./мин, от 0,005 до 0,5 об./об./мин, от 0,005 до 0,3 об./об./мин, от 0,005 до 0,2 об./об./мин, от 0,01 до 1 об./об./мин, от 0,01 до 0,7 об./об./мин, от 0,01 до 0,5 об./об./мин, от 0,01 до 0,3 об./об./мин или от 0,01 до 0,2 об./об./мин.

Культивирование может быть осуществлено при 20-40°С. Например, культивирование можно осуществлять при 20-30°С.

Культивирование может быть осуществлено в присутствии света. Например, культивирование может быть осуществлено при облучении источником света, достаточного для культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002. Источник света может представлять собой, например, светодиодный источник света (LED), но не ограничивается этим.

Культивирование может быть осуществлено в течение 30 суток или менее. Например, культивирование может быть осуществлено в течение 3-30 суток, 3-20 суток, 3-15 суток, 3-12 суток или 3-10 суток.

Культивирование может быть осуществлено при помощи известного способа периодического культивирования, способа непрерывного культивирования, способа периодического культивирования с подпиткой и т.п., но не ограничиваться ими. Любая среда и другие условия культивирования, используемые для культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 в соответствии с настоящей заявкой на изобретение, могут быть использованы без конкретного ограничения до тех пор, пока она представляет собой среду, используемую для культивирования обычного штамма Chlorella vulgaris, и, например, может быть использована среда BG-11. В частности, штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 в соответствии с настоящим изобретением можно культивировать путем регулирования температуры, рН и т.п. в обычной среде, содержащей подходящий источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин и тому подобное. В частности, надлежащий рН можно корректировать, используя основное соединение (например, гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак) или кислотное соединение (например, фосфорную кислоту или серную кислоту), но не ограничиваясь этим.

В еще одном аспекте предложен способ стимулирования роста растений, включающий получение композиции для стимулирования роста растений, содержащей любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанной культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата и лизата указанного высушенного материала; и приведение указанной композиции для стимулирования роста растений в контакт с растением.

Штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 и композиция для стимулирования роста растений являются такими, как описано выше.

Культура или культуральный супернатант штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 могут быть выделены с использованием соответствующего способа, известного в данной области техники. Кроме того, для получения композиции для стимулирования роста растений, может использоваться соответствующий способ, известный в области техники. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и тому подобное, и дополнительно может быть включена очистка, и она может включать метод концентрирования, сушки и тому подобное микроводорослей или их культуры, известный в данной области техники.

Приведение в контакт может быть осуществлено при помощи метода обработки композицией для стимулирования роста растений почвы, растений или семян растений. Например, приведение в контакт может быть осуществлено методом распыления композиции для стимулирования роста растений на листья растений, но не ограничиваясь этим.

В еще одном аспекте предложено применение для получения удобрения для растений или применение для стимулирования роста растений, штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером КСТС14659 ВР.

В еще одном аспекте предложено применение для получения удобрения для растений или применение для стимулирования роста растений композиции, содержащей любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанной культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата и лизата указанного высушенного материала; и приведение указанной композиции для стимулирования роста растений в контакт с растением.

БЛАГОПРИЯТНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Новый штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 в соответствии с первым аспектом обладает быстрой скоростью роста и высокой эффективностью фотосинтеза при культивировании в присутствии газа, выделяемого при ферментировании, таким образом, что газ, выделяемый при микробном ферментировании, может эффективно уменьшаться, и когда культурой или культуральным супернатантом указанного штамма обрабатывают растения, имеет место эффект стимулирования роста растений и, таким образом, он может быть использован в качестве удобрения для растений и, таким образом, его можно с пользой использовать в качестве новой технологии, уменьшающей выброс углерода, которая является экологически чистой и обладает широким промышленным применением.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой график результата измерения сухой массы клеток (DCW) после культивирования каждого из 4 видов штаммов Chlorella vulgaris.

Фиг.2 представляет собой график результата измерения массы надземной части растения (верхней части) Arabidopsis thaliana после обработки разведенным раствором культурального супернатанта каждого из 4 видов DW, жидкой среды BG-11, Acadian 29 или Chlorella vulgaris, соответственно.

СПОСОБ В СООТВЕТСТВИИ С ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Далее настоящее изобретение будет описано подробней при помощи примеров. Однако эти примеры предназначены для иллюстративного описания одного или более чем одного конкретного примера, и объем настоящей заявки не ограничен этими примерами.

Пример 1. Выделение новой зеленой водоросли дикого типа

Образцы были собраны в общей сложности из 5 речных районов в Suwon, Gyeonggi-do, Корея, и микроводоросли, относящиеся к зеленым водорослям, были выделены с использованием метода прямой посадки.

В частности, после отбора образцов из них выделяли микроводоросли в течение 2-3 суток, и образцы, имеющие зеленый цвет и содержащие сферическую морфологию, распределяли на твердой среде BG-11 (1,5 г/л NaNO₃, 40 мг/л К₂НРО₄, 75 мг/л MgSO₄ 7Н₂O, 36 мг/л СаСl₂^⋅2Н₂O, 6 мг/л лимонной кислоты H₂О, 6 мг/л цитрата трехвалентного аммония, 1 мг/л Na₂EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)⋅2Н₂О, 20 мг/л Na₂CO₃, 2,86 мг/л Н₃ВО₃, 1,81 мг/л МnСl₂ 4Н₂O, 0,22 мг/л ZnSO₄ 7Н₂O, 0,39 мг/л Na₂MoO₄ 2Н₂O, 0,079 мг/л CuSO₄ 5Н₂O, 0,049 мг/л Со(NО₃)₂ 6Н₂O, 15 г/л агара) для выделения микробов. Полученные колонии выделяли с чистотой путем субкультивирования в твердой среде BG-11, вводимой путем корректирования концентрации раствора коктейля смеси антибиотиков (0-500 мг/л сульфата стрептомицина, 0-500 мг/л ампициллина, 0-500 мг/л сульфата канамицина).

Пример 2. Идентификация последовательности ДНК у выделенных микроводорослей

Для молекулярной биологической идентификации микроводорослей, выделенных в Примере 1 выше, анализировали последовательность 18s рРНК.

В частности, после экстракции ДНК из чисто выделенных колоний с использованием праймеров для амплификации гена области 18s рРНК (Таблица 1) проводили PCR (полимеразная цепная реакция).

Реакцию PCR осуществляли путем денатурации при 95°С в течение 5 минут и затем повторной денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 2 минут 35 раз, а затем полимеризации при 72°С в течение 5 минут. В результате анализа нуклеотидной последовательности с использованием амплифицированного реакционного раствора получали нуклеотидную последовательность размером около 1565 п. н. (SEQ ID NO: 1). В результате ее поиска BLAST в NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), было подтверждено, что она имеет гомологию 99,68% со штаммом Chlorella vulgaris КММСС FC-42, и выделенный штамм был обозначен как Chlorella vulgaris CD02-3002 и депонирован в Корейском научно-исследовательском институте биологических наук и биотехнологии, Корейская коллекция типовых культур (КСТС), представляющей собой международный депозитарий в соответствии с Будапештским договором, 23 августа 2021 года, и ему был присвоен номер доступа КСТС14659 ВР.

Пример 3. Подтверждение способности роста штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 в условиях культивирования при свете, основанных на газе, выделяемом при ферментировании

Для подтверждения того, является ли выделенный новый штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 штаммом, способным расти в условиях культивирования при свете, основанных на газе, выделяемом при ферментировании, способность к росту оценивали и сравнивали с различными типами штаммов Chlorella vulgaris.

В качестве контрольного штамма использовали штамм Chlorella vulgaris UTEX265, полученный из UTEX Коллекции культур водорослей в институте UT-Austin, и в качестве группы сравнения использовали штаммы Chlorella vulgaris CD11-2001 и CD11-2003, выделенные при помощи такого же способа, как описанный в Примере 1. Каждый штамм инокулировали в 100 мл стерилизованной жидкой среды BG-11 (1,5 г/л NaNO₃, 40 мг/л К₂НРО₄, 75 мг/л MgSO₄^⋅7H₂O, 36 мг/л СаСl₂⋅2Н₂O, 6 мг/л лимонной кислоты Н₂О, 6 мг/л цитрата трехвалентного аммония, 1 мг/л Na₂EDTA⋅2H₂O, 20 мг/л Na₂CO₃, 2,86 мг/л Н₃ВО₃, 1,81 мг/л МnСl₂⋅4Н₂O, 0,22 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O, 0,39 мг/л Na₂MoO₄⋅2H₂O, 0,079 мг/л CuSO₄^⋅5H₂O, 0,049 мг/л Со(МО₃)₂⋅6Н₂O), а затем культивировали в течение 4-7 суток, в то время как свет излучался непрерывно светодиодным источником света и концентрацию СO₂ 1-10% (об./об.) подавали со скоростью 0,01-0,1 об./об./мин. После этого культуральный раствор инокулировали в 900 мл новой стерилизованной жидкой среды BG-11 и культивировали в течение 3-5 суток, в то время как свет непрерывно излучался светодиодным источником света, и в течение периода культивирования газ, выделяемый при ферментировании, непосредственно подавали в культуральный раствор со скоростью 0,01-0,5 об./об./мин после прохождения через воздушный фильтр. В качестве газа, выделяемого при ферментировании, используют газ, образующийся во время периодического культивирования с подпиткой штамма Eschehchia coli CJ181 (KFCC 10902) (публикация патента США US 2008/0299644 А1) в ферментаторе при поддержании температуры культивирования 30°С, рН культивирования 6,9-7,1 (корректирование рН при помощи аммиачной воды), аэрации 0,5-1,0 об./об./мин и скорости перемешивания 500-700 об/мин.

После завершения культивирования 10 мл культурального раствора каждого штамма фильтровали через фильтр 0,45 мкм и затем сушили в печи при 60°С в течение 24 часов, и затем, рассчитывая разность массы фильтра до фильтрования и массы фильтра, содержащего высушенные клетки после сушки, рассчитывают значение сухой массы клеток (DCW).

В результате, как показано на Фиг. 1, было подтверждено, что штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 имел значительно более высокую сухую массу клеток по сравнению с полученным штаммом Chlorella vulgaris (UTEX265) или новыми выделенными другими штаммами Chlorella vulgaris (CD 11-2001 и CD 11-2003). Благодаря этому может быть установлено, что штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 представлял собой штамм с наиболее превосходной скоростью роста в условиях культивирования при свете, основанных на газе, выделяемом при ферментированииции, по сравнению с другими штаммами Chlorella vulgaris.

Пример 4. Подтверждение эффекта стимулирования роста растений культурального супернатанта штамма Chlorella vulgaris CD02-3002

Для подтверждения эффекта стимулирования роста растений культурального супернатанта штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 оценивали стимулирование роста для

Arabidopsis thaliana.

В частности, семена Arabidopsis thaliana дикого типа готовили путем поверхностной стерилизации в 70%-ном этаноле в течение 1 минуты и 1%-ном растворе NaOCl в течение 3 минут и затем промывали стерилизованной дистиллированной водой. Arabidopsis thaliana охлаждали (4°С) в течение 2 суток и затем высаживали в верхний слой почвы (Dongbu Farm Hannong Co., Ltd.), а затем культивировали в термостате при 21°С в течение приблизительно 1 недели в темновом состоянии, при котором свет излучался в течение 12 часов и не излучался в течение 12 часов.

Всего 4 типа Chlorella vulgaris UTEX265, CD11-2001, CD02-3002 и CD11-2003 инокулировали в 200 мл стерилизованной жидкой среды BG-11 и затем культивировали при 25°С в течение 5-7 суток при облучении светодиодным источником света и непрерывной подаче 1-10% СО₂ (об./об.) со скоростью 0,1 об./об./мин. Культивированную посевную культуру инокулировали в 1,8 л стерилизованной жидкой среды BG-11 и культивировали в тех же условиях в течение максимум 10 суток. После завершения культивирования культуру центрифугировали с получением культурального супернатанта каждого штамма.

Для оценки эффекта стимулирования роста растений культивируемые Arabidopsis thaliana обрабатывали 10-1000-кратным разведением культурального супернатанта каждого штамма в количестве 1 мл/растение, и обработку листьев проводили три раза с интервалом 4 суток. В качестве контрольной группы была установлена группа, которую эквивалентно обрабатывали дистиллированной водой (DW), а в качестве группы сравнения была добавлена группа, которую эквивалентно обрабатывали средой, используемой для культивирования микроводорослей при свете (жидкая среда BG-11) или коммерческое жидкое удобрение из экстракта морских водорослей (Acadian 29). Живую массу надземной части (массу надземной части) измеряли как индекс измерения роста Arabidopsis thaliana. Среднее значение и стандартное отклонение живой массы верхней части рассчитывали и демонстрировали путем осуществления повторных экспериментов с 8 экземплярами Arabidopsis thaliana для каждой тестируемой группы.

В результате, как показано на Фиг. 2, было продемонстрировано, что другие штаммы Chlorella vulgaris оказывали небольшой эффект или вообще не оказывали эффекта стимулирования роста по сравнению с контрольной группой, в то время как штамм Chlorella vulgaris CD02-3002 продемонстрировал значительно превосходящий эффект стимулирования роста, и можно было подтвердить, что это был существенно значительный превосходный эффект по сравнению с коммерческим удобрением Acadian 29.

Из приведенного выше описания специалисты в данной области техники, к которой относится настоящая заявка, смогут понять, что настоящая заявка может быть воплощена в других конкретных формах без изменения технической сущности или существенных признаков. В этом отношении следует понимать, что примеры, описанные выше, являются иллюстративными, а не ограничительными во всех аспектах. Объем настоящей заявки следует толковать как включающий все изменения или модификации в объеме настоящей заявки на изобретение, вытекающие из значения и объема формулы изобретения, которые будут описаны ниже, и эквивалентных концепций, а не подробного вышеприведенного описания.

НОМЕР ДОСТУПА

Название депозитария: Корейский научно-исследовательский институт биологических наук и биотехнологии, Корейская коллекция типовых культур (КСТС) Номер доступа: КСТС14659 ВР Дата депонирования: 20210823.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="P23740RU-st26-RU.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-12-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>KR</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>PCT/KR2022/011885</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-08-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>P23740RU</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>KR</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>10-2021-0125207</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2021-09-17</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">СИДЖЕЙ ЧЕИЛДЖЕДАНГ КОРПОРЕЙШН

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>CJ CHEILJEDANG CORPORATION</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм микроводорослей, обладающий

стимулирующим действием на рост растений, и его

применение</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1565</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1565</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>18S rRNA sequence of Chlorella vulgaris

CD02-3002 strain</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Последовательность 18S рРНК штамма

Chlorella vulgaris CD02-3002</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1565</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcgacttcctggaagggacgtatttattagataaaaggccgaccgggct

ctgcccgactcgcggtgaatcatgataacttcacgaatcgcatggccttgtgccggcgatgtttcattca

aatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggaggatt

agggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaat

tacccaatcctgacacagggaggtagtgacaataaataacaatactgggccttttcaggtctggtaattg

gaatgagtacaatctaaaccccttaacgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggta

attccagctccaatagcgtatatttaagttgctgcagttaaaaagctcgtagttggatttcgggtggggc

ctgccggtccgccgtttcggtgtgcactggcagggcccaccttgttgccggggacgggctcctgggcttc

actgtccgggactcggagtcggcgctgttactttgagtaaattagagtgttcaaagcaggcctacgctct

gaatacattagcatggaataacacgataggactctggcctatcctgttggtctgtaggaccggagtaatg

attaagagggacagtcgggggcattcgtatttcattgtcagaggtgaaattcttggatttatgaaagacg

aactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagttgggggctcgaagacga

ttagataccgtcctagtctcaaccataaacgatgccgactagggatcggcggatgtttcttcgatgactc

cgccggcaccttatgagaaatcaaagtttttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaa

aggaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaactta

ccaggtccagacatagtgaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatgg

ccgttcttagttggtgggttgccttgtcaggttgattccggtaacgaacgagacctcagcctgctaaata

gtcacggttggttctccagccggcggacttcttagagggactattggcgactagccaatggaagcatgag

gcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgatgcattcaacgag

cctagccttggccgagaggcccgggtaatctttgaaactgcatcgtgatggggatagattattgcaatta

ttaatcttcaacgaggaatgcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttg

tacacaccgcccgtcgctcctaccgattgggtgtgctggtgaagtgttcggattggcgaccgggtgcggt

ctccgctctcggccgccgagaagttcattaaaccctcccacctaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>18s-F_primer</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>18s-F_праймер</NonEnglishQualifier_v

alue>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgacttctggaagggacgta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>18s-R_primer</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>18s-R_

праймер</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

<NonEnglishQualifier_value>Синтетическая

конструкция</NonEnglishQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctaggtgggagggtttaatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа КСТС14659 ВР, композицию для стимулирования роста растений, содержащую любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанных культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата и лизата указанного высушенного материала, удобрение для растений, содержащее композицию для стимулирования роста растений, способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, включающий культивирование штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР, в присутствии газа, выделяемого при ферментировании, способ стимулирования роста растений, включающий получение композиции для стимулирования роста растений, содержащей любое одно или более чем одно, выбранное из группы, состоящей из штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659 ВР; культуры или культурального супернатанта указанного штамма; концентрата указанных культуры или культурального супернатанта; высушенного материала указанных культуры, культурального супернатанта или концентрата и лизата указанного высушенного материала; и приведение указанной композиции для стимулирования роста растений в контакт с растением. Благодаря стимулирующему действию на рост растений при их использовании в отношении растений культура штамма или супернатант такой культуры могут быть использованы в качестве удобрения для растений и, таким образом, могут быть успешно использованы в качестве новой технологии уменьшения уровня углерода. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа КСТС14659ВР.

2. Композиция для стимулирования роста растений, содержащая (1) штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа КСТС14659ВР; или (2) культуру или культуральный супернатант указанного штамма; и эксципиент.

3. Удобрение для растений, содержащее композицию для стимулирования роста растений по п. 2.

4. Способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, включающий культивирование штамма Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающего стимулирующим действием на рост растений, депонированного под номером доступа КСТС14659ВР, в присутствии газа, выделяемого при ферментировании.

5. Способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 по п. 4, где газ, выделяемый при ферментировании, содержит от 0,5 до 20% (об./об.) диоксида углерода.

6. Способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 по п. 4, где газ, выделяемый при ферментировании, образуется посредством микробного ферментирования.

7. Способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 по п. 4, где культивирование осуществляют при 20-40°С.

8. Способ культивирования штамма Chlorella vulgaris CD02-3002 по п. 4, где культивирование осуществляют в течение 30 суток или менее.

9. Способ стимулирования роста растений, включающий

получение композиции для стимулирования роста растений, содержащей (1) штамм Chlorella vulgaris CD02-3002, обладающий стимулирующим действием на рост растений, депонированный под номером доступа КСТС14659ВР; или (2) культуру или культуральный супернатант указанного штамма; и эксципиент; и

приведение указанной композиции для стимулирования роста растений в контакт с растением.

10. Способ по п. 9, где приведение в контакт осуществляют методом обработки композицией для стимулирования роста растений почвы, растения или семени растения.