Штамм дрожжей Komagataella phaffii с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков Российский патент 2023 года по МПК C12N1/19 C12N15/63 

Область техники

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения ауксотрофного штамма-реципиента метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii, пригодного для конструирования на его основе безмаркерных штаммов-продуцентов, способных синтезировать гетерологичные белки.

Уровень техники

В настоящее время метилотрофные дрожжи Komagataella phaffii (Pichia pastoris) широко используются в качестве экспрессионной системы для получения гетерологичных белков. Активное использование дрожжей K. phaffii в современных биотехнологических производствах связано с их преимуществами по сравнению с другими прокариотическими и эукариотическими системами экспрессии, к которым относятся: высокая скорость роста при ферментации с высокой плотностью клеток (что позволяет получить более высокий уровень продукции целевого белка), эффективная секреция белка, простота питательных сред и условий культивирования, возможность применения различных генетических манипуляций, способность осуществлять посттрансляционные модификации гетерологичных белков [Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98, 5301-5317].

Конструирование дрожжевых безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков является необходимым условием их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве. Для получения штаммов-продуцентов гетерологичных белков в настоящее время применяется стратегия мультикопийной интеграции экспрессионных кассет в геном K. phaffii. Для интеграции нескольких копий целевого гена применяют отбор трансформантов на средах, содержащих высокие концентрации антибиотиков.

Необходимость создания безмаркерных штаммов-продуцентов обусловлена определенными запретами на использование маркеров антибиотикорезистентности в крупных микробиологических производствах по соображениям их возможного нежелательного распространения среди микроорганизмов окружающей среды. Кроме того, обычно, продуценты конструируются с помощью последовательных хромосомных модификаций, при которых требуется проведение многократных интеграций генетического материала в хромосому, что вызывает ряд проблем, связанных с ограниченным набором селективных маркеров и законодательным ограничением на их применение. Поэтому конструирование штаммов-реципиентов, на основе которых возможно создавать безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков, является актуальным и практически значимым.

Активно используемыми в биотехнологии, а также применяющимися в качестве моделей для изучения метилотрофных дрожжей рода Komagataella, являются штаммы K. phaffii GS115 (his4) (Invitrogen, США), K. phaffii Х-33 (Invitrogen, США), K. phaffii KM71 (Invitrogen, США) и др.

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения рассмотрим штамм метилотрофных дрожжей K. phaffii M12. Данный штамм обладает фенотипом Leu", что позволяет отбирать трансформанты на минимальной среде без добавления лейцина [Microb Cell Fact, 2017, 16:99].

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является получение высокопродуктивных безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков, таких как белки, обладающие ферментативной активностью, флуоресцентные белки, белки-гормоны и др.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма-реципиента, который даст возможность получать высокопродуктивные безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков.

Он достигается путем получения ауксотрофного по лейцину штамма дрожжей Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 - реципиента для конструирования безмаркерных штаммов-продуцентов гетерологичных белков.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 Экспрессионная плазмида pGAP-sgRNA2_leu2-pPFK300-Cas9-Km

Фиг. 2 Экспрессионная кассета 1

Фиг. 3 Экспрессионная кассета 2

Фиг. 4 Экспрессионная кассета 3

Осуществление изобретения

Получение заявляемого штамма осуществляется путем инактивации в штамме дикого типа Komagataella phaffii ВКПМ Y-4287 нативного гена LEU2, кодирующего фермент (3-изопропилмалатдегидрогеназу (IMDH), который участвует в биосинтезе лейцина. Инактивация может быть осуществлена с использованием любой из известных генно-инженерных методик.

Штамм-реципиент депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) как Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014.

Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма

При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP следующего состава (мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют. Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией. При росте в жидкой среде YP следующего состава (мас. %: пептон - 2, дрожжевой экстракт - 1, вода -остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм-реципиент способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.

Пример 1. Получение штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 с инактивированным геном LEU2

Заявленный штамм получают на основе штамма дикого типа K. phaffii ВКПМ Y-4287 путем инактивации гена LEU2, кодирующего β-изопропилмалатдегидрогеназу.

Инактивацию проводят с использованием системы геномного редактирования CRISPR-Cas9 [FEMS Yeast Research, 2017, 17(5)].

Методом Гиббсона [Nat Methods. 2009, 6(5), 343-345] конструируют плазмиду pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km (фиг. 1), содержащую следующие генетические элементы:

1. Последовательность НН - sgRNA2_leu2 - HDV, содержащая рибозим типа Hammerhead (НН) [Nature, 1994, 372(6501), 68-74] на 5'- конце, sgRNA2_leu2, которая нацелена на ген LEU2, и рибозим вируса гепатита дельта (HDV) [Nature, 1998, 395(6702), 567-574] на 3'- конце, под контролем дрожжевого GAP промотора.

2. Оптимизированную последовательность гена cas9, встроенную в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнала ядерной локализации большого Т-антигена SV40 [Cell Commun Signal, 2021, 19(60), 1-10], под контролем дрожжевого PFK300 промотора и CYC1 терминатора;

3. Дрожжевой селективный маркер kanR под контролем дрожжевого TEF промотора, обуславливающий у дрожжей K. phaffii устойчивость к антибиотику генетицину (G418);

4. Последовательность CEN/ARS, обеспечивающая сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма.

Полученную автономно реплицируемую плазмиду трансформируют в штамм K. phaffii ВКПМ Y-4287 методом электропорации.

Штамм K. phaffii ВКПМ Y-4287 предварительно выращивают в жидкой питательной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, глюкоза - 2, вода - остальное) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотреитола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут.Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После электропорации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 600 мкг/мл.

Для инактивации гена LEU2 отобранные трансформанты пересевают 2 раза на среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) и антибиотика G418 в количестве 600 мкг/мл.

Селекцию трансформантов с инактивированным геном LEU2 проводят по способности к росту на минимальной среде М9 с добавлением и без добавления в среду лейцина в количестве 50 мкг/мл. Состав среды М9 (мас. %): Na₂HPO₄ - 0,6; KH₂PO₄ - 0,3; NaCl - 0,05; NH₄Cl - 0,1; MgSO₄ 7H₂O -0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl₂ - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р- аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO₄ 0,004; KJ -0,01; FeCl₃ - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO₄ - 0,04, вода - остальное. Отбирают трансформант, обладающий фенотипом His^-, не способный расти на среде М9 без содержания лейцина.

Выщепление репликативной плазмиды pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km из клеток трансформанта проводят путем его ферментации в течение 48 ч в жидкой питательной среде YP с добавлением 2% глюкозы. Далее клетки высевают на агаризованную питательную среду YP с добавлением глюкозы (2 мас. %). Инкубируют в течение 48 ч при 30°С. Полученные колонии реплицируют на чашку с агаризованной средой YP и 2% глюкозой без антибиотика G418 и аналогичную чашку с антибиотиком G418. Клон, потерявший плазмиду pGAP-sgRNA2_LEU2-pPFK300-Cas9-Km, отбирают по неспособности к росту на среде, содержащей антибиотик G418. Получают штамм с инактивированным геном LEU2.

Полученный штамм депонирован Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) как Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014.

В приведенных примерах получения трансформантов на основе штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, в качестве репортерных гетерологичных белков были использованы ферменты, легко детектируемые в культуральной жидкости путем измерения их активности.

Пример 2. Получение трансформантов штамма дрожжей K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующих фитазу Citrobacter gillenii

Трансформанты штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующие фитазу С.gillenii, получают трансформацией клеток этого штамма интегративной экспрессионной кассетой 1.

При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 1 используют синтезированный ранее ген phyCg-op [FEMS Microbiology letters, 2021, 368, fnaa217], кодирующий фитазу С.gillenii [Genbank, №МТ157261].

Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют кассету 1 (фиг. 2), в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Ген phyCg-op, кодирующий фитазу С.gillenii, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;

3. Дрожжевой селективный маркер PpLEU2, комплементирующий у дрожжей K. phaffii мутацию в гене LEU2;

4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1.

Указанную интегративную экспрессионную кассету 1 трансформируют в штамм K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт -1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1 М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1 М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25 uF. После электропорации добавляют 1 мл ледяного раствора 1 М сорбитола.

Селекцию трансформантов ведут в течение 5 суток при температуре 30°С на минимальной агаризованной среде без содержания лейцина следующего состава (мас. %): Na₂HPO₄ - 0,6; KH₂PO₄ - 0,3; NaCl - 0,05; NH₄Cl - 0,1; MgSO₄ 7H₂O - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl₂ - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин -0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO₄ - 0,004; KJ - 0,01; FeCl₃ - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO₄ - 0,04, вода -остальное. Отбирают произвольно по 10 трансформантов.

Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров

PhyCg-op-F и PhyCg-op-R

PhyCg-op-F 5'- gacgaacaatctggtatgcaatt -3',

PhyCg-op-R 5'- ttacttttcagcacattcgct -3'.

Режим реакции ПЦР: 95°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 95°С - 30 с, 56°С - 30 с, 72°С - 80 с; 72°С - 5 мин. - 1 цикл.

Наличие ПЦР-фрагмента размером 1233 п. н. подтверждает присутствие целевого гена в составе хромосомы полученных трансформантов.

Для сравнения продуктивности получают трансформанты штамма K. phaffii Y-4287, продуцирующие фитазу С.gillenii.

Трансформанты штамма K. phaffii Y-4287, продуцирующие фитазу С.gillenii, получают трансформацией клеток штамма K. phaffii Y-4287 интегративной экспрессионной кассетой, содержащей в своем составе ген phyCg-op, кодирующий фитазу С.gillenii, полученной аналогично и трансформированной как описано ранее [Биотехнология, 2021, 37(4), 5-13].

Для сравнения уровней продукции фитазы в штаммах K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 проводят ферментацию десяти отобранных трансформантов каждого штамма, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii. Ферментацию проводят при следующих условиях:

- Посевную культуру каждого трансформанта выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.

- Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением 2% метанола в течение 2 суток.

Продуктивность трансформантов, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii, оценивают по уровню активности фитазы в культуральной жидкости. Для этого по окончании ферментации клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а в отделенном супернатанте определяют фитазную активность модифицированным методом Фиске-Субарроу [JMicrobiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.].

В табл. 1 представлены продуктивности трансформантов штаммов K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий фитазу С.gillenii, среднее значение продуктивности, рассчитанное для 10 трансформантов каждого штамма, и относительная продуктивность трансформантов.

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что среднее значение продуктивности трансформантов K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 превышает таковое для трансформантов K. phaffii ВКПМ Y-4287 более чем на 13%.

Пример 3. Получение трансформантов штамма дрожжей K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующих амилазу Bacillus licheniformis

Трансформанты штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, продуцирующие амилазу В. licheniformis, получают трансформацией клеток этого штамма интегративной экспрессионной кассетой 2.

При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 2 в качестве источника гена amyS [Genbank, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/CP093290.1 ?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=2&RID=B3RY153T013], кодирующего амилазу В. licheniformis, используют тотальную геномную ДНК В. licheniformis ВКПМ В-10958.

Синтезируют ДНК гена amyS методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R

AmyS-F 5'- gcaaatcttaatgggacgct -3',

AmyS-R 5'- tctttgaacataaattgaaa -3'.

Режим реакции ПЦР: 95°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 95°С - 30 с, 57°С - 30 с, 72°С - 90 с; 72°С - 5 мин. - 1 цикл.

Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют экспрессионную кассету 2 (фиг. 3), в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Ген amyS, кодирующий амилазу В. licheniformis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;

3. Дрожжевой селективный маркер PpLEU2, комплементирующий у дрожжей K. phaffii мутацию в гене LEU2;

4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1

Интегративную экспрессионную кассету 2 трансформируют в штамм K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014. Трансформацию экспрессионной кассеты 2 и селекцию трансформантов осуществляют, как описано в примере 1.

Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R, описанных выше.

Для получения трансформантов контрольного штамма K. phaffii ВКПМ Y-4287, продуцирующих амилазу В. licheniformis, конструируют экспрессионную кассету 3.

При конструировании интегративной экспрессионной кассеты 3 используют последовательность гена amyS.

Методом "фьюжн-пцр" [Gene., 1989, 15, 77(1), 61-68.] синтезируют экспрессионную кассету 3 (фиг. 4), в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Ген amyS, кодирующий амилазу В. licheniformis, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора;

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1;

3. Дрожжевой селективный маркер kanR, под контролем дрожжевого TEF промотора, обуславливающий у дрожжей K. phaffii устойчивость к антибиотику генетицину (G418);

4. Область интеграции - 3' фрагмент нуклеотидной последовательности гена АОХ1

Интегративную экспрессионную кассету 3 трансформируют в штамм K. phaffii Y-4287. Трансформацию экспрессионной кассеты 3 и селекцию трансформантов осуществляют, как описано ранее [Биотехнология, 2021, 37(4), 5-13].

Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием праймеров AmyS-F и AmyS-R, описанных выше.

Для сравнения уровней продукции амилазы В. licheniformis в штаммах K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 проводят ферментацию десяти отобранных трансформантов каждого штамма с генами, кодирующими амилазу В. licheniformis. Ферментацию проводят, как описано в примере 1.

Определение активности амилазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом: в каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата крахмала в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.

В табл. 2 представлены продуктивности трансформантов штаммов K. phaffii ВКПМ Y-4287 и K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, несущих в составе хромосомы ген, кодирующий амилазу В. licheniformis, среднее значение продуктивности, рассчитанное для 10 трансформантов каждого штамма, и относительная продуктивность трансформантов.

Из данных, приведенных в таблице 2, следует, что среднее значение продуктивности трансформантов K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 превышает таковое для трансформантов K. phaffii ВКПМ Y-4287 более чем на 17%.

Таким образом, полученные результаты показывают, что использование заявляемого штамма-реципиента приводит к получению безмаркерных штаммов с продуктивностью гетерологичных белков, значительно повышенной относительно родительского штамма K. phaffii ВКПМ Y-4287.

Отсутствие генов антибиотикорезистентности и повышенная продуктивность штаммов, получаемых на основе заявленного штамма K. phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014, расширяют возможность их дальнейшего использования в современном биотехнологическом производстве.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Komagataella phaffii YLM9 с инактивированным геном LEU2, являющийся реципиентом для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков. Указанный штамм депонирован под номером ВКПМ Y-5014. Изобретение обеспечивает получение штамма-реципиента, который позволяет получать высокопродуктивные безмаркерные штаммы-продуценты гетерологичных белков. 4 ил., 2 табл., 3 пр.

Штамм дрожжей Komagataella phaffii YLM9 ВКПМ Y-5014 с инактивированным геном LEU2 - реципиент для конструирования штаммов-продуцентов гетерологичных белков.