Вакцина на основе вирусоподобных частиц (VLP) для профилактики COVID-19 для парентерального применения Российский патент 2025 года по МПК A61K39/215 

Область техники

Группа изобретений относится к области к биотехнологии, иммунологии и вирусологии и касается вакцины для внутримышечного введения на основе вирусоподобных частиц, состоящая из смеси вирусоподобных частиц, адъюванта и фармацевтически приемлемого буфера, где вирусоподобные частицы состоят из четырёх структурных белков S, M, N, E SARS-CoV-2, где S белок выбран из вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2.

Уровень техники

Ситуация с COVID-19 к концу 2023 года, почти через четыре года после начала пандемии, существенно изменилась, что позволило снять режим международной чрезвычайной ситуации и объявить о завершении пандемии. Во всем мире иммунитет на уровне населения значительно возрос благодаря значительному и растущему использованию вакцинопрофилактики наряду с иммунитетом, вызванным инфекцией, или их комбинацией (гибридный иммунитет). Однако, SARS-CoV-2 продолжает циркулировать

Учитывая высокий уровень иммунитета у населения, который, по оценкам, превышает 90% в большинстве стран из-за увеличения уровня охвата вакцинацией и иммунитета, вызванного ранее приобретенной инфекцией [Arora RK, Joseph A, Van Wyk J, Rocco S, Atmaja A, May E et al. SeroTracker: a global SARS-CoV-2 seroprevalence dashboard. The Lancet Infectious Diseases. 2021;21:e75-e6. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30631-9], количество госпитализаций и смертей во всем мире снизилось. В соответствии с этим, стратегия была обновлена, чтобы сосредоточить внимание на двух целях:

- улучшить здоровье, социально-экономическую защиту и защиту систем здравоохранения;

- разработать вакцины против COVID-19 с улучшенными характеристиками, включая продолжительность защиты, защиту от передачи и снижение риска появления новых штаммов, а также мутировать, образуя новые варианты.

ВОЗ по-прежнему приветствует разработку новых вакцин, которые могут повысить уровень защиты от инфекции и снизить показатели передачи SARS-CoV-2. Также может быть рассмотрено применение не моновалентных препаратов, а вакцин другого состава и/или на основе других платформ, если они формируют надежный иммунный ответ нейтрализующих антител в отношении циркулирующих в настоящее время вариантов вируса. Вакцинация лиц из группы, которые подвергаются наибольшему риску тяжелого заболевания, госпитализации и смерти, как первоначальными сериями, так и ревакцинацией, будет иметь наибольшее воздействие на общественное здравоохранение.

С учетом рекомендаций ВОЗ, Министерство Здравоохранения РФ рекомендует вакцинацию групп риска (пациенты с иммунодефицитом; онкологические больные, получающие лучевую терапию, химиотерапию, таргетную терапию или иммунотерапию; пациенты, принимающие лекарства, ослабляющие иммунитет; люди, перенесшие трансплантации костного мозга или органов; пациенты с ожирением, сердечно-сосудистыми и хроническими заболеваниями легких и почек, а также с сахарным диабетом; медицинские работники), поскольку вероятность возникновения тяжелого течения заболевания и неблагоприятных исходов у них наиболее высокая. Люди, не относящиеся к группам риска, также могут пройти повторную вакцинацию для повышения иммунитета к возбудителю новой коронавирусной инфекции.

Таким образом, разработка новых рекомбинантных вакцин для вакцинации и ревакцинации населения остается приоритетной задачей.

В качестве ближайшего аналога можно рассмотреть документ US10953089B1, опуб. 23.03.2021, в котором раскрывается иммуногенная композиция основанная на наночастицах, образованных пептидами S белка коронавируса (например, гликопротеин BV2373 Spike), фармацевтически приемлемый буфер и сапониновый адъювант (например, MATRIX-M™). Показана иммуногенность полученной вакцины на модели яванского макака с инфекцией SARS-CoV-2. Недостатком решения является то, что данные наночастицы не имитируют вирион SARS-CoV-2, а также то, что в отличии от приведенного аналога, в заявленном техническом решении присутствуют 4 белка коронавируса - М, N, Е и S, поэтому спектр антител, после иммунизации данной вакциной значительно шире.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании новой удобной в применении вакцины, способной обеспечить защиту от инфекций, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача заявленной группы изобретений заключается в разработке вакцины против COVID-19, которая обладает иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19.

Технический результат заключается в создании вакцины обладающей иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19, способностью индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, стимулировать защитный иммунитет слизистых оболочек. Также технический результат заключается в том, что создана вакцина, которая обладает иммуногенностью против различных штаммов SARS-CoV-2.

Технический результат достигается тем, что создана вакцина на основе вирусоподобных частиц для профилактики COVID-19, состоящая из смеси рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащие на поверхности S белок, вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии - не менее 80 мкг; калия дигидрофосфата - 0,29 мг; динатрия гидрофосфата - 0,30 мг; натрия хлорида - 1,84 мг; калия хлорида - 0,04 мг; кальция хлорида - 0,02 мг; - трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг; - адъюванта на основе сквалена - 0,25 мл; - тиомерсала - 4,00 мкг; воды для инъекций - до 0,5 мл.

В частном случае выполнения количество антигена в вакцине на дозу выбрано из 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 мкг.

Также технический результат достигается тем, что разработан способ профилактики COVID-19, включающий введение разработанной вакцины внутримышечно дважды с интервалом между введениями 21 день.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены результаты РБТЛ на 10 день после 2-й иммунизации с учетом 4-х контролей.

На фиг. 2 представлены результаты оценки клеточного иммунного ответа в динамике. Соотношение CD4+/CD8+ мононуклеаров периферической крови.

На фиг. 3 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа в ИФА в динамике. Показатель уровень сероконверсии в реакции ИФА на различных сроках исследования; по оси абсцисс - визиты; по оси ординат - доля добровольцев с уровнем сероконверсии (титр специфических антител ≥4 раза), %. После V1 - 21 сутки после однократной вакцинации, После V1 - 21 сутки после однократной вакцинации. После V1- 21 сутки после двукратной вакцинации, После V2 - 21 сутки после двукратной вакцинации.

На фиг. 4 представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа в реакции нейтрализации (РН) в динамике. Показатель уровень сероконверсии в реакции нейтрализации на различных сроках исследования; по оси абсцисс - визиты; по оси ординат - доля добровольцев с уровнем сероконверсии (титр специфических антител ≥4 раза), %. После V1 - 21 сутки после однократной вакцинации, После V1 - 21 сутки после однократной вакцинации. После V1- 21 сутки после двукратной вакцинации, После V2 - 21 сутки после двукратной вакцинации.

На фиг. 5 представлены процент добровольцев с нежелательными явлениями по классам органов.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение VLP с использованием рекомбинантных бакуловирусов и получение состава вакцины.

Активным компонентом разработанной вакцины является рекомбинантные вирусоподобные частицы (VLP), которые состоят из четырёх структурных белков S, M, N, E SARS-CoV-2, где S белок выбран из вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, содержащие нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7. Указанные частицы синтезированы в бакуловирусной системе экспрессии, как это указано в примерах в публикации RU 2769223 С1.

pFastBac донорная плазмида содержит экспрессионную кассету, в которой помимо клонированных генов находится фланкирующие последовательности транспозона Tn7. Рекомбинантная трансферная плазмида используется для трансформации клеток DH10Bac E.coli, которые содержат модифицированный бакуловирусный геном в виде большой плазмиды (бакмиды) и вектор-помощник, кодирующий фермент транспозазу. В трансформированных клетках DH10Bac транспозаза осуществляет сайт-специфический перенос экспрессионной кассеты из трансферного вектора в модифицированный бакуловирусный геном. Отбор рекомбинатных клонов DH10Bac осуществляется методом цветного теста, в выбранных колониях белого цвета перенос экспрессионной кассеты в бакуловирусный геном подтверждается методом ПЦР с праймерами, один из которых специфичен к клонированной последовательности, а другой - к геному бакуловируса.

Для дальнейшей работы отбирали клон, из которых выделили бакмиды. Выделенные рекомбинантные бакмиды смешивают с липосомным агентом Cellfectin для трансфекции клеток насекомых Sf-9 или Sf-21. Проникшая в клетку кольцевая молекула бакмидной ДНК инфекционна и запускает жизненный цикл бакуловируса в клетке. Таким образом, получаются рекомбинантные бакуловирусы. Трансфекцию перевиваемой линии клеток Spodoptera frugiperda Sf-21 проводили очищенными препаратами бакмидной ДНК, содержащей оптимизированные гены коронавируса,с использованием катионного липосомного агента Cellfectin (Invitrogen, США), для каждой конструкции использовали по два клона (посевная концентрация клеток 5х105/мл, 10 мкл бакмиды).После трансфекции проводили еще два пассажа на клетках Sf-9 или Sf-21. Таким образом, получили рекомбинантные бакуловирусы.

Концентрацию белка в растворах определяли с использованием коммерческого набора “Micro BCA Protein Assay Kit” (Thermo, США). Анализ структурных белков Sars-CoV-2 проводили методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ-ДСН) по методу Laemmli (1970) Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля размером 70 х 100 х 0,75 на приборе Mini-PROTEAN II (Bio-Rad, США) в восстанавливающих условиях при по-стоянном напряжении 200 V. Разделяющий гель содержал 12% акриламида, 0,5% N,N-метилен-бис-акриламида, 0,375 М трис-HCl pH 8,8 и 0,1% ДСН. Фокусирующий гель содержал 4% акриламида, 10% N,N-метилен- бисакриламида в 0,125 М трис-HCl буфере pH 6,8. Для полимеризации в оба геля вносили по 0,025% персульфата аммония и 0,075% TEMED. Электродный буфер содержал 0,025 М трис-HCl, 0,192 М глицина, pH 8,3 и 0,1% ДСН. Все испытуемые пробы содержали лизирующий буфер с восстановителем (0,125 М трис-HCl, pH 6,8, 5% ДСН, 0,5% β - меркаптоэтанола, 10,8% глицерина, 0,01% бромфенолового синего) и были прогреты в течение 5 минут при 100°C. Заливку геля и подготовку аппарата для электрофореза к работе проводили согласно рекомендациямизготовителя. Белки в гелях окрашивали в течение 1 часа 0,1% раствором Кумасси ярко-голубого (CBB R-350) в водном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 30% метанола. Избыток красителя отмывали 10% раствором уксусной кислотой такое же время с несколькими его сменами. В качестве белков-маркеров молекулярной массы использовали β-галактозидазу- 116 кД; фосфорилазу В - 94 кД, БСА- 66 кД, овальбумин- 45 кД, карбонат ангидразу-30 кД, ингибитор трипсина- 20,1 кД. Для определения антигенной активности структурных белков SARS-CoV-2 использовали сэндвич-ИФАвестерн-блот.

Таким образом, было определено, что были получены структурные белки коронавируса M, E, N и S.

VLP получали методом коинфекции, то есть одновременного заражения перевиваемой линии клеток насекомых T.ni различными сочетаниями рекомбинантных бакуловирусов. Перевиваемую культуру клеток насекомых Trichoplusia ni, культивировали в течение 4 суток после заражения. Был использован 2 пассаж рекомбинантных бакуловирусов.

Культуральную жидкость, содержащую вирус или вирусоподобные частицы, подвергали низкоскоростному центрифугированию, освобождаясь от клеток и клеточного дебриса при 1000 об/мин в течение 5 минут и при 6000 об/мин в течение 20 минут соответственно (+4°С, ротор Sorval® SS34). Распределение SARS-VLP в процессе предварительной очистки представлено на фиг. 5. Фракция 5 использовалась для выделения и очистки SARS-VLP методом ультрацентрифугирования. Полученные осветлённые суспензии наслаивали на 6 мл 25% или 35% (w/v) сахарозы, приготовленной на буфере TNC (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2 рН 7.4). Центрифугировали в течение 2 часов при 28 000 об/мин (центрифуга Optima XE-100, ротор SW 32Ti, Beckman Coulter, +4°С). Полученные осадки ресуспендировали в буфере TNC, и хранили при температуре +4°С.

Таким образом, был получен препарат, содержащий очищенные VLP.

Лекарственный препарат представляет собой комплект рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащие на поверхности S белок, вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии - не менее 80 мкг; калия дигидрофосфат - 0,29 мг; динатрия гидрофосфат - 0,30 мг; натрия хлорид - 1,84 мг; калия хлорид - 0,04 мг; кальция хлорид - 0,02 мг; трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг; адъювант на основе сквалена - 0,25 мл; тиомерсал - 4,00 мкг; вода для инъекций - до 0,5 мл.

Используемый в вакцине адъювант представляет собой эмульсию масло-в-воде, приготовленный из биоразлагаемых/биосовместимых масел, таких как сквален.

Активный компонент (вирусоподобные частицы) в буфере TNC (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2 рН 7.4) ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе (0,01М КН2РО4, 0,01М Na2HPO4; 0,137М NaCl; 0,0027М KCl, рН 7,4) до необходимой концентрации, и затем с адъювантом перемешивают в течение 30 минут при скорости вращения 250-300 оборотов в минуту.

Вакцина разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре 2-8°С.

Пример 2. Определение оптимального количества антигена на дозу вакцины при внутримышечном введении на модели золотистых хомячков.

Пол животных, возраст: половозрелые, без определения пола. Животные были иммунизированы вакциной, с различным содержанием антигена в.дозе вакцины

Количество групп - 5 (в группах по 5 гол):

Введение: внутримышечное введение (трехкратно) с интервалом 21 день.

1 группа - вакцина, антиген (VLP) 20 мг/дозу с адъювантом, в/м введение 0,2 мл.

2 группа - вакцина антиген (VLP) 40 мг/дозу с адъювантом, в/м введение 0,2 мл.

3 группа - вакцина антиген (VLP) 80 мг/дозу с адъювантом, в/м введение 0,2 мл.

4 группа - вакцина антиген (VLP) 160 мг/дозу с адъювантом, в/м введение 0,2 мл.

5 группа - контроль, буферный раствор с адъювантом

Определение Т-клеточного ответа после 2-х кратной иммунизации.

На 10 сутки после 2-й иммунизации животные были отобраны для проверки Т-клеточного ответа методом реакции бластотрансформации лимфоцитов. РБТЛ (фигура 1).

Суспензию клеток селезенки стерильно отбирали, центрифугировали на одноступенчатом градиенте плотности фиколл-пака (HistoPaque-1077, «Sigma», США), выделяли фракцию мононуклеарных клеток и отмывали дважды в чистой среде RPMI-1640 и помещали в 96-луночные культуральные панели с концентрацией 105 клеток в 100 мкл в лунку. Антигены-стимуляторы добавлялись по 100 мкл в лунку к клеткам до конечных концентраций. В качестве положительного контроля служили спленоциты, активированные конковалином А (КонА, 12,5 мг, ПанЭко, Россия). В качестве отрицательных контролей использовали: клеточные культуры из селезенок неиммунизированных мышей; нестимулированные клеточные культуры из селезенок мышей; культуры, стимулированные неспецифическим антигеном - антиген ККГЛ. Клетки культивировали в полноростовой среде RPMI-1640, с 20% ЭТС, 2 мМ глутамина, 4.5 г/л глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 0.2 ед/мл инсулина при 37°С в атмосфере 5% СО2.

Пролиферацию спленоцитов оценивали в реакции бласттрансформации через 4-5 суток с помощью инвертированного микроскопа (увеличение x400). Результаты РБТЛ выражали в виде индекса стимуляции пролиферации (ИСП) - отношения среднего количества бластов в присутствии стимуляторов к среднему количеству бластов в отсутствие стимуляторов. Положительным считали результат, если ИСП превышает 2.

Полученные результаты свидетельствуют о специфическом Т-клеточном ответе у всех исследуемых иммунизированных хомяков в ответ на стимуляцию VLP SARS-CoV-2, кроме хомяка контрольной группы. Наиболее активная пролиферация лимфоцитов отмечалась в группах 1, 2 и 3 (ИСП 10,7±0,7; 8,9±0,9 и 13±1,4 соответственно), значения ИСП в этих группах не отличаются статистически значимо (p<0,05), что говорит об отсутствии дозозависимого эффекта между используемыми концентрациями VLP SARS-CoV-2 (20, 40 и 80 мкг/животное) и формированием клеточного ответа. В тоже время, у животного 4 группы, которое иммунизировали максимальной из используемых концентраций VLP SARS-CoV-2 (160 мкг/животное) отмечалось что ИСП был статистически значимо ниже по сравнению с группами 1-3 и составил 4,9±1,0 (p<0,05).

Определение гуморального иммунитета.

После 3-й иммунизации определяли наличие специфических IgG к SARS-CoV-2, а также титр нейтрализации.

Белок RBD сорбировали в лунках микропланшета в 0,1 М карбонатном буфере, рН=9,5 в концентрации 5 мкг/мл по 100 мкл в лунку в течение ночи при 4°С. После 4-кратной отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл сыворотки хомяков в разведении 1/100. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл пероксидазного конъюгата антител к IgG хомяка. Инкубировали планшет 1 час при +37°С. После промывания планшета вносили по 0.1 мл субстратного раствора с тетраметилбензидином. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте и добавляли 0.1 мл 1 М H₂SO₄ для остановки реакции. Оптическую плотность при 450 нм (А₄₅₀) измеряли на спектрофотометре с вертикальным лучом Multiscan ЕХ (Thermo, США).

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты наличия IgG и нейтрализующих антител в сыворотках золотистых хомячков, иммунизированных внутримышечно вакциной с разными дозами антигена после 3-й иммунизации.

№ № Титр в нейтрализации Результаты ИФА Средний титр в ИФА по группам 20 мг/дозу с адъювантом 1 2 иммунизация 20 0,364(+) 12800 2 2 иммунизация 640 1,337(+) 3 3 иммунизация 1280 1,764 (+) 4 3 иммунизация 1280 1,358(+) 5 3 иммунизация 80 1,431(+) 40 мг/дозу с адъювантом, 6 2 иммунизация 40 0,651(+) 12800 7 2 иммунизация 640 1,536(+) 8 3 иммунизация 1280 1,623(+) 9 3 иммунизация 1280 1,602(+) 10 3 иммунизация 320 Не исследовалось 11 контроль, буфер с адъювантом, 3 иммунизация 0 0,062(-) (- контроль) 80 мг/дозу с адъювантом, 12 2 иммунизация 640 1,536(+) 12800 13 2 иммунизация 1280 1,475(+) 14 3 иммунизация 320 1,268(+) 15 3 иммунизация 640 1,011(+) 16 3 иммунизация 2560 1,545(+) (+ контроль) 160 мг/дозу с адъювантом, 17 2 иммунизация 80 1,372(+) 12800 18 2 иммунизация 320 1,501(+) 19 3 иммунизация 320 1,374(+) 20 3 иммунизация 320 1,215(+) 21 3 иммунизация 2560 1,425(+)

Подбор количества антигена в дозе вакцины для внутримышечного введения показал, что при введении 20, 40 и 80 мкг/животное после 2 иммунизации наблюдался выраженный Т-клеточный ответ (ИСП 10,7±0,7; 8,9±0,9 и 13±1,4 соответственно), тогда как при иммунизации 160 мкг/животное - ИСП был статистически значимо ниже и составил 4,9±1,0 (p<0,05). Специфические и вируснейтрализующие антитела вырабатывались как после первой, так и после второй иммунизации. Средний титр специфических IgG к RBD домену S белка SARS-CoV-2 по группам был одинаковым и составлял 12800. По совокупности всех результатов, наиболее перспективными оказалось содержание антигена в дозе вакцины 40 и 80 мкг/животное, соответственно.

Пример 3. Стимуляция Т-клеточного иммунитета у здоровых добровольцев 18-55 лет.

180 добровольцев были иммунизированы двукратно:

Группа 1 - 60 добровольцев иммунизированы вакциной с содержанием антигена 40 мкг на дозу, двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Группа 2 - 60 добровольцев иммунизированы вакциной с содержанием антигена 80 мкг на дозу двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Группа 3 - 60 добровольцев получили плацебо, двукратно с интервалом 21 сут. Внутримышечно.

Т-клеточный иммунитет играет центральную роль в борьбе с COVID-19. Антиген-специфические CD4+ и CD8+ Т-клетки и нейтрализующие антитела играют защитную роль против SARS-CoV-2, в то время как нарушение адаптивного иммунного ответа, такое как нехватка наивных Т-клеток, может привести к неблагоприятным исходам заболевания.

Влияние иммунизации на Т-клеточный ответ изучалось на основании соотношения CD4+/CD8+, а также данных ИСП (Индекса стимуляции пролиферации) в реакции бласттрансформации (РБТЛ). Измерение проводилось исходно, а также на 10 сутки после каждой вакцинации.

Оценка клеточного иммунитета показала, что вакцина Гам-VLP-мультивак может быть индуктором клеточно-опосредованного иммунного ответа с продукцией цитокинов. При этом не развиваются иммунопатологические состояния, связанные с избыточной продукцией исследуемых провоспалительных цитокинов. Клеточный ответ является защитными, что подтверждается высоким ИСП в реакции РБТЛ после иммунизации вакциной. (фигура 2)

Пример 4. Стимуляция гуморального иммунитета (выявление IgG) у здоровых добровольцев 18-55 лет.

400 добровольцев были иммунизированы двукратно.:

Группа 1 - 200 добровольцев иммунизированы вакциной с содержанием антигена 80 мкг на дозу двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Группа 2 - 200 добровольцев получили плацебо, двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Влияние иммунизации на образование иммуноглобулинов класса G проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) проводили на 21 день после каждой вакцинации.

Постановка ИФА проводилась набором реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи).

Результаты оценки гуморального иммунного ответа в ИФА в динамике. представлены на фигуре 3. Сероконверсией считали увеличение титра специфических IgG ≥4 раза.

Необходимо отметить, что в группе вакцинированных добровольцев наблюдалось статистически значимое увеличение специфических иммуноглобулинов класса G к рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS-CoV-2.

Как видно большинство добровольцев до вакцинации уже имели специфические IgG к белку S SARS-CoV-2 в ИФА и вируснейтрализующие антитела. Поэтому добровольцы были разделены на группы. Показатели иммуногенности значительно превосходят у тех добровольцев, у которых изначально отмечались низкие титры (ИФА - титр ≤ 1/800).

Пример 5. Стимуляция гуморального иммунитета (образование вируснейтрализующих антител) у здоровых добровольцев 18-55 лет.

400 добровольцев были иммунизированы двукратно.:

Группа 1 - 200 добровольцев иммунизированы вакциной с содержанием антигена 80 мкг на дозу двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Группа 2 - 200 добровольцев получили плацебо, двукратно с интервалом 21 сут внутримышечно.

Антитела, нейтрализующие вирусы Уханьский, Дельта и Омикрон выявляли в реакции нейтрализации. Использовали вирусы, выделенные из клинических образцов и депонированные в государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» МЗ РФ. Результаты оценки гуморального иммунного ответа в реакции нейтрализации (РН) в динамике представлены на фигуре 4. Сероконверсией считали увеличение титра нейтрализующих антител к различным штаммам Sars-Cov-2 ≥4 раза.

После иммунизации вакциной зафиксировано образование нейтрализующих антител к вирусам Ухань, Дельта и Омикрон, циркулирующих в 2022-2023 г. г. в РФ.

Как видно большинство добровольцев до вакцинации уже имели специфические IgG к белку S SARS-CoV-2 в ИФА и вируснейтрализующие антитела. Поэтому добровольцы были разделены на группы. Показатели иммуногенности значительно превосходят у тех добровольцев, у которых изначально отмечались низкие титры (в РН - титр ≤ 1/80)

Пример 6. Оценка безопасности вакцины Гам-VLP-мультивак у здоровых добровольцев 18-55 лет.

400 добровольцев были иммунизированы двукратно:

Группа 1 - 200 добровольцев иммунизированы вакциной с содержанием антигена 80 мкг на дозу двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Группа 2 - 200 добровольцев получили плацебо, двукратно с интервалом 21 сут. внутримышечно;

Выявляли Острые нежелательные явления (НЯ) [Временной интервал: 30 минут]., Местные и системные нежелательные явления (НЯ) (для выявления которых участникам задавались соответствующие вопросы), [Временные рамки: в течение 10 дней после каждой вакцинации]. Спонтанные нежелательные явления (НЯ) [Временные рамки: в течение 21 дня после каждой вакцинации]. Фиксировали процент, интенсивность и взаимосвязь нежелательных явлений (НЯ).

Также выявляли серьезные нежелательные явления (СНЯ), нежелательные явления (НЯ), приводящие к отмене, нежелательные явления, представляющие особый интерес (НЯОС) (включая болезнь, усиленную вакцинами), и летальные исходы [Временные рамки: в течение 21 дня после каждой вакцинации].

Фиксировали процент, интенсивность и взаимосвязь серьезных нежелательных явлений (НЯ). На фигуре 5 представлены нежелательные явления по классам органов.

В 98,9 % случаев данные НЯ разрешались в течение 5 дней. По интенсивности 59,4 % клинически значимых отклонений отнесены к легкой степени тяжести, 30,5 % - к средней степени тяжести. Изменения показателей клинического и биохимического анализов крови, общего анализа мочи, регистрируемые в динамике наблюдения, расценены в большинстве случаев как клинически незначимые и независящие от вакцинации, что свидетельствует о безопасности вакцины. Большинство НЯ относились к ожидаемым побочным проявлениям после иммунизации на действие вакцинного препарата. Летальных исходов, прочих серьезных нежелательных явлений и других значимых нежелательных явлений, которые были расценены как имеющие особый интерес вследствие их клинической значимости, не зарегистрировано. Представляющие особый интерес НЯ, связанные с вакцинацией от COVID-19 (синдром Гийена-Барре, генерализованные судороги, анафилаксия, тромбоцитопения, коагулопатия и др.), не регистировались ни у одного добровольца

Таким образом, вакцина Гам-VLP-мультивак, имеет благоприятный профиль безопасности у вакцинированных добровольцев в возрасте от 18 до 55 лет. Вакцина Гам-VLP-мультивак, вызывает стимуляцию Т-клеточного и гуморального иммунного ответа, поскольку вызывает образования антител как в ИФА так и в РН,а также повышением индекса специфической пролиферации (ИСП) в группах добровольцев, привитых вакциной, относительно группы добровольцев, получивших плацебо. Максимальные показатели иммуногенности в ИФА и РН отмечались уже на 21 сутки после первой вакцинации, за исключением штамма Омикрон. Для актуального в настоящее время штамма двукратная вакцинация показала более высокую иммунологическую эффективность. Вакцина может быть использована для вакцинации и ревакцинации.

Изобретение относится к биотехнологии. Описана вакцина на основе вирусоподобных частиц для профилактики COVID-19, включающая: смесь рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащих на поверхности S белок, вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии, - 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 мкг; калия дигидрофосфат - 0,29 мг; динатрия гидрофосфат - 0,30 мг; натрия хлорид - 1,84 мг; калия хлорид - 0,04 мг; кальция хлорид - 0,02 мг; трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг; адъювант на основе сквалена – 0,25 мл; тиомерсал - 4,00 мкг; вода для инъекций - до 0,5 мл. Также описан способ профилактики COVID-19, включающий введение указанной вакцины внутримышечно дважды с интервалом между введениями 21 день. Группа изобретений обеспечивает создание вакцины, обладающей иммуногенностью, достаточной для формирования иммунного ответа против COVID-19, способностью индуцировать гуморальный и клеточный иммунный ответ, стимулировать защитный иммунитет слизистых оболочек. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Вакцина на основе вирусоподобных частиц для профилактики COVID-19, состоящая из:

- смеси рекомбинантных вирусоподобных частиц, содержащие на поверхности S белок, вариантов 19А, Альфа, Дельта, Омикрон SARS-CoV-2, синтезированных в бакуловирусной системе экспрессии, - 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 мкг;

- калия дигидрофосфат - 0,29 мг;

- динатрия гидрофосфат - 0,30 мг;

- натрия хлорид - 1,84 мг;

- калия хлорид - 0,04 мг;

- кальция хлорид - 0,02 мг;

- трис(гидроксиметил)аминометан-HCl - 0,03 мг;

- адъювант на основе сквалена – 0,25 мл;

- тиомерсал - 4,00 мкг;

- вода для инъекций - до 0,5 мл.

2. Способ профилактики COVID-19, включающий введение вакцины по п.1 внутримышечно дважды с интервалом между введениями 21 день.