ПРОИЗВОДНЫЕ ЦИТИДИНА И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИТИДИНА Российский патент 2024 года по МПК C07H19/06 C07H19/73 A61K31/7068 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к органическим соединениям, например, к производным нуклеозидов. Настоящее изобретение относится также к способам получения органических соединений, например, производных нуклеозидов. В некоторых аспектах производные нуклеозидов являются производными цитидина. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к органическим соединениям, например, к производным гемцитабина (2',2'-дифтор-2'-дезоксицитидин) или любых из его стереоизомеров. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам получения производных гемцитабина (2',2'-дифтор-2'-дезоксицитидин) или любого из его стереоизомеров.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Гемцитабин (2',2'-дифтор-2'-дезоксицитидин) представляет собой химиотерапевтический препарат, используемый, среди прочего, для лечения ряда различных видов злокачественного новообразования. Эти виды злокачественного новообразования включают рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря. Гемцитабин относится к классу антиметаболитов и представляет собой нуклеозидное производное цитидина.

Хотя гемцитабин обладает относительно высокой цитотоксичностью, существует множество факторов, ограничивающих его терапевтический профиль. Основными ограничивающими факторами являются его метаболическое дезаминирование в 4-(N)-положении ферментом цитидиндезаминазой (CDA) в его неактивный уридиновый метаболит дифтор-дезокси-уридин (dFdU) и отсутствие селективности между злокачественными и здоровыми клетками. Чтобы преодолеть эти препятствия при стандартном клиническом применении гемцитабин вводят в относительно высоких дозах, что приводит к серьезным побочным эффектам.

Пролекарства гемцитабина были синтезированы для «защиты» 4-(N)-участка молекулы от дезаминирования, и два из них прошли клинические испытания: LY2334737, перорально доступный эфир вальпроевой кислоты гемцитабина; и Sq-гемцитабин (SQdFdC), где сквален (промежуточный продукт в синтезе холестерина) конъюгирован также в 4-(N)-положении.

Синтез пролекарств, в которых 4-(N)-положение гемцитабина химически модифицировано селективными группами, требует многостадийной реакции (обычно 4 стадии, как показано в US 20170107245 A1 и WO 2004041203 A2, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки) с низкими выходами, большим объемом стоков и высокой стоимостью.

Существует необходимость в получении производных цитидина, например, производных гемцитабина, в которых положение 4-(N) (необязательно только положение 4-(N)) защищено и/или дериватизировано. Существует потребность в обеспечении более эффективных способов получения производных цитидина, например, производных гемцитабина, в которых положение 4-(N) (необязательно только положение 4-(N)) защищено и/или дериватизировано.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Характерные признаки настоящего изобретения изложены в следующих разделах, которые являются самостоятельными или могут быть объединены в любой комбинации с одним или несколькими признаками, описанными в тексте и/или показанными на чертежах описания.

1. Способ получения 4-(N)-замещенных производных соединений формулы (IB) или их фармацевтически приемлемых солей, где способ включает:

взаимодействие соединения формулы (IB):

с ацилхлоридом формулы (II):

с получением соединения формулы (IIIB):

где:

R₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами;

R_2B выбран из группы, включающей: замещенное или незамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами углерода, замещенное или незамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами углерода, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный α пиранозный сахарид, замещенный или незамещенный β пиранозный сахарид, замещенный или незамещенный α фуранозный сахарид, или замещенный или незамещенный β фуранозный сахарид;

R_3B выбран из группы, включающей: водород, монозамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, монозамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный алкоксиалкан, карбонил, галоген, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино или серу; и

R_4B выбран из группы, включающей: водород, монозамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, монозамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный алкоксиалкан, карбонил, галоген, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино или серу.

2. Способ получения 4-(N)-замещенных производных соединений формулы (IB) или их фармацевтически приемлемых солей, где способ включает:

взаимодействие соединения формулы (IB):

с фосфорилхлоридом формулы (IIP):

с получением соединения формулы (IIIBP):

где

R₃ и R₄, оба представляют собой H, R₃ представляет собой H и R₄ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, или R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

X представляет собой O или S, в частности, O;

каждый Y, независимо. представляет собой O или S, и, в частности, каждый Y представляет собой O;

R_2B выбран из группы, включающей: замещенное или незамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами углерода, замещенное или незамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами углерода, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный α пиранозный сахарид, замещенный или незамещенный β пиранозный сахарид, замещенный или незамещенный α фуранозный сахарид, или замещенный или незамещенный β фуранозный сахарид;

R_3B выбран из группы, включающей: водород, монозамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, монозамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный алкоксиалкан, карбонил, галоген, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино или серу; и

R_4B выбран из группы, включающей: водород, монозамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, монозамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 5 атомами, дизамещенное ароматическое кольцо с 6 атомами, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный алкоксиалкан, карбонил, галоген, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино или серу.

3. Способ по п. 1 или 2, где R_2B выбран из группы, включающей:

где:

волнистая линия в каждом случае показывает точку присоединения R_2B;

R₇ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₈ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₉ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₁₀ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₁₁ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₁₂ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₁₃ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

R₁₄ выбран из группы, включающей: алкоксиалкан, карбонил, галоген, водород, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, азид, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, гидроксил, амино, серу или замещенный или незамещенный арил;

X, независимо, представляет собой галоген;

Y, независимо, представляет собой водород, гидроксил, амино или серу;

Z, независимо, представляет собой гидроксил, амино или серу.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где R_3B и R_4B, оба представляют собой водород.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где галоген в каждом случае независимо представляет собой F, Cl, Br или I.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где R_3B представляет собой водород, R_4B представляет собой водород и R_2B представляет собой .

7. Способ по п. 6, где Y представляет собой водород, R₁₁ представляет собой галоген, R₁₂ представляет собой галоген, R₉ представляет собой водород, R₁₃ представляет собой гидроксил (-OH), R₁₀ представляет собой водород, R₇ представляет собой водород, R₈ представляет собой водород и R₁₄ представляет собой гидроксил (-OH).

8. Способ получения 4-(N)-замещенных производных гемцитабина или их фармацевтически приемлемых солей, или способ по любому из пп. 1 или 3-7, где способ включает:

взаимодействие гемцитабина (I):

с ацилхлоридом формулы (II):

с получением соединения формулы (III):

где R₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами.

9. Способ по любому из пп. 1- 5, где R_3B представляет собой галоген, R_4B представляет собой водород, R₁ представляет собой -(CH₂)₄CH₃ и R_2B представляет собой .

10. Способ по п. 9, где R_3B представляет собой F.

11. Способ по п. 9 или 10, где Y представляет собой водород, R₁₁ представляет собой водород, R₁₂ представляет собой гидроксил (-OH), R₉ представляет собой водород, R₁₃ представляет собой гидроксил (-OH), R₁₀ представляет собой водород, R₇ представляет собой водород, R₈ представляет собой водород и R₁₄ представляет собой водород.

12. Способ получения 4-(N)-замещенных производных гемцитабина или их фармацевтически приемлемых солей, или способ по любому из пп. 2-7 или 9-11, где способ включает:

взаимодействие гемцитабина (I):

с фосфорилхлоридом формулы (IIP):

с получением соединения формулы (IIIP):

где

R₃ и R₄, оба представляют собой H; R₃ представляет собой H и R₄ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил; или R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

X представляет собой O или S, в частности, O; и

каждый Y независимо представляет собой O или S, и, в частности, каждый Y представляет собой O.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где способ осуществляют в одном сосуде; необязательно, где способ осуществляют в одну стадию без выделения промежуточного продукта.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где ацилхлорид формулы (II) или фосфорилхлорид формулы (IIP) представлен в способе в количестве от 0,3 до 0,7 эквивалентов (по молям).

15. Способ по любому из пп. 1-14, где ацилхлорид формулы (II) или фосфорилхлорид формулы (IIP) представлен в способе в количестве 0,5 эквивалентов (по молям).

16. Способ по любому из пп. 1-15, где взаимодействие соединения формулы (IB), необязательно, гемцитабина (I), с ацилхлоридом формулы (II) или фосфорилхлоридом формулы (IIP) осуществляют в растворителе этилацетате, ацетилцианиде или смеси этилацетата и ацетилцианида.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где взаимодействие соединения формулы (IB), необязательно, гемцитабина (I), с ацилхлоридом формулы (II) или фосфорилхлоридом формулы (IIP) осуществляют при кипячении с обратным холодильником в течение 1-4 часов; необязательно, 3 часов; необязательно, где кипячение проводят при температуре от 70°C до 90°C или при температуре 80°C.

18. Способ по любому из пп. 1-17, где R₁ выбран из группы, включающей:

i. -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂, -(CH₂)₄CH(CH₃)₂;

ii. -CH₂Cl, -(CH₂)₂Cl, -(CH₂)₃Cl, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₅Cl, -(CH₂)₆Cl, -CH₂Br, -(CH₂)₂Br, -(CH₂)₃Br, -(CH₂)₄Br, -(CH₂)₅Br, -(CH₂)₆Br, -CH₂I, -(CH₂)₂I, -(CH₂)₃I, -(CH₂)₄I, -(CH₂)₅I, -(CH₂)₆I;

iii. -CH₂CCH, -(CH₂)₂CCH, -(CH₂)₃CCH, -(CH₂)₄CCH, -(CH₂)₅CCH, -(CH₂)₆CCH,

iv. -CH₂N₃, -(CH₂)₂N₃, -(CH₂)₃N₃, -(CH₂)₄N₃, -(CH₂)₅N₃, -(CH₂)₆N₃,

v. -CH₂SH, -(CH₂)₂SH, -(CH₂)₃SH, -(CH₂)₄SH, -(CH₂)₅SH, -(CH₂)₆SH,

vi. -CH₂COOH, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₃COOH, -(CH₂)₄COOH, -(CH₂)₅COOH, -(CH₂)₆COOH, -CH₂COOR₂, -(CH₂)₂COOR₂, -(CH₂)₃COOR₂, -(CH₂)₄COOR₂, -(CH₂)₅COOR₂, -(CH₂)₆COOR₂;

vii. -CH₂Ar, -(CH₂)₂Ar, -(CH₂)₃Ar, -(CH₂)₄Ar, -(CH₂)₅Ar, -(CH₂)₆Ar, -CH₂CHArCH₃, -CH₂CHArCH₂CH₃;

viii. -CH₂Tr, -(CH₂)₂Tr, -(CH₂)₃Tr, -(CH₂)₄Tr, -(CH₂)₅Tr, -(CH₂)₆Tr, -CH₂CHTrCH₃ или -CH₂CHTrCH₂CH₃;

где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

где Ar представляет собой

где A₁, A₂, A₃, A₄ и A₅, каждый, независимо, представляют собой H, NO₂, OH, O-алкил или O-метил; необязательно, где A₁ представляет собой NO₂ и A₂, A₃, A₄ и A₅ представляют собой H; или где A₁ представляет собой NO₂, A₃ и A₄ представляют собой O-метил и A₂ и A₅ представляют собой H; и/или,

где Tr представляет собой

где B представляет собой замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, алкил, замещенный одной или несколькими бензильными или замещенными бензильными группами или .

Необязательно, R₁ не является таким, как указано в каком-либо одном или нескольких пунктах 18.i., 18.ii., 18.iii., 18.iv., 18.v., 18.vi., 18.vii. или 18.viii.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где R₁ содержит заместитель, взаимодействующий с атомом H на 4-(N), например, где R₁ представляет собой хлоралкил, и способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III):

в растворителе, например, N, N-диизопропилэтиламине, в подходящих условиях, например, при кипячении, с образованием соединения формулы (IV):

где n обозначает 0, 1 или 2.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III) или (IIIP) с OH-реакционно преобразующим агентом с образованием 3'- и/или 5'- замещенного производного соединения (III) или (IIIP);

необязательно, где способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III) с уксусным ангидридом с образованием соединения формулы (V):

или

формулы(VP):

где Ac представляет собой -COCH₃.

21. Соединение, которое можно получить или полученное способом по любому из пп. 1-20.

22. Соединение формулы (III), или его 3'- и/или 5'- замещенное производное, например, соединение формулы (VA) или (V):

или

где по меньшей мере один из R₂₀ и R₂₁ не представляет собой H, и

R₂₀ представляет собой H или -COR₂₀₁, где R₂₀₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами; и,

R₂₁ представляет собой H или -COR₂₀₂, где R₂₀₂ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами; или

где Ac представляет собой -COCH₃;

где R₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами;

или его фармацевтически приемлемая соль.

23. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂ или -(CH₂)₄CH(CH₃)₂.

24. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Cl, -(CH₂)₂Cl, -(CH₂)₃Cl, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₅Cl, -(CH₂)₆Cl, -CH₂Br, -(CH₂)₂Br, -(CH₂)₃Br, -(CH₂)₄Br, -(CH₂)₅Br, -(CH₂)₆Br, -CH₂I, -(CH₂)₂I, -(CH₂)₃I, -(CH₂)₄I, -(CH₂)₅I или -(CH₂)₆I.

25. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂CCH, -(CH₂)₂CCH, -(CH₂)₃CCH, -(CH₂)₄CCH, -(CH₂)₅CCH или -(CH₂)₆CCH.

26. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂N₃, -(CH₂)₂N₃, -(CH₂)₃N₃, -(CH₂)₄N₃, -(CH₂)₅N₃ или -(CH₂)₆N₃.

27. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂SH, -(CH₂)₂SH, -(CH₂)₃SH, -(CH₂)₄SH, -(CH₂)₅SH или -(CH₂)₆SH.

28. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂COOH, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₃COOH, -(CH₂)₄COOH, -(CH₂)₅COOH, -(CH₂)₆COOH, -CH₂COOR₂, -(CH₂)₂COOR₂, -(CH₂)₃COOR₂, -(CH₂)₄COOR₂, -(CH₂)₅COOR₂ или -(CH₂)₆COOR₂;

где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил.

29. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Ar, -(CH₂)₂Ar, -(CH₂)₃Ar, -(CH₂)₄Ar, -(CH₂)₅Ar, -(CH₂)₆Ar, -CH₂CHArCH₃ или -CH₂CHArCH₂CH₃;

где Ar представляет собой

где A₁, A₂, A₃, A₄ и A₅, каждый, независимо, представляют собой H, NO₂, OH, O-алкил или O-метил; необязательно, где A₁ представляет собой NO₂ и A₂, A₃, A₄ и A₅ представляют собой H; или где A₁ представляет собой NO₂, A₃ и A₄ представляют собой O-метил и A₂ и A₅ представляют собой H.

30. Соединение по п. 22, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Tr, -(CH₂)₂Tr, -(CH₂)₃Tr, -(CH₂)₄Tr, -(CH₂)₅Tr, -(CH₂)₆Tr, -CH₂CHTrCH₃ или -CH₂CHTrCH₂CH₃;

где Tr представляет собой ,

где B представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ галогеналкил, например, хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкенил, замещенный или незамещенный C₂-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими бензильными или замещенными бензильными группами, или .

Необязательно, R₁ не является таким, как указано в каком-либо одном или нескольких пп. 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.

31. Соединение по любому из пп. 22-30, где соединение выбрано из группы, включающей:

, , , , , , , , , , , , , или .

32. Соединение по любому из пп. 22-30, где соединение не выбрано из группы, включающей:

, , , , , , , , , , , , , или .

33. Соединение формулы (IIIP) или его 3'- и/или 5'- замещенное производное:

(IIIP),

где R₃ и R₄ оба представляют собой H, R₃ представляет собой H и R₄ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, или R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

X представляет собой O или S, в частности, O; и

каждый Y независимо представляет собой O или S, и, в частности, каждый Y представляет собой O;

или его фармацевтически приемлемая соль.

34. Соединение в соответствии с п. 33 формулы (VI) или его 3'- и/или 5'- замещенное производное:

(VI),

где:

R₃ и R₄, оба представляют собой H;

R₃ представляет собой H и R₄ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил; или

R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

или его фармацевтически приемлемая соль.

35. Соединение по п. 33 или 34, где один или оба из R₃ и R₄ выбраны из группы, включающей: -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂ или -(CH₂)₄CH(CH₃)₂.

36. Соединение формулы (IV):

(IV),

где n обозначает 0, 1 или 2;

или его фармацевтически приемлемая соль.

37. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение в соответствии с любым из пп. 21-36 и фармацевтически приемлемый носитель.

38. Соединение в соответствии с любым из пп. 21-36 или фармацевтическая композиция в соответствии с п. 37 для применения в терапии.

39. Соединение в соответствии с любым из пп. 21-36 или фармацевтическая композиция в соответствии с п. 37 для применения при лечении злокачественного новообразования.

40. Соединение или фармацевтическая композиция для применения в соответствии с п. 39, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

41. Способ лечения пациента, необязательно пациента-человека, страдающего злокачественным новообразованием, где способ включает введение пациенту эффективного количества соединения в соответствии с любым из пп. 21-36 или фармацевтической композиции в соответствии с п. 37.

42. Способ по п. 41, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

Некоторые дополнительные аспекты настоящего изобретения описаны со ссылкой на следующие пункты (пункты «А»), которые являются самостоятельными или могут быть объединены в любой комбинации с одним или несколькими признаками, раскрытыми в тексте и/или на чертежах описания.

1A. Способ получения 4-(N)-замещенных производных гемцитабина или их фармацевтически приемлемых солей, где способ включает:

взаимодействие гемцитабина (I):

с ацилхлоридом формулы (II):

(II)

с получением соединения формулы (III):

(III),

где R₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами.

2A. Способ по п. 1A, где способ осуществляют в одном сосуде.

3A. Способ по п. 1A или 2A, где ацилхлорид формулы (II):

(II)

представлен в способе в количестве от 0,3 до 0,7 эквивалентов (по молям).

4A. Способ по любому из пп. 1A-3A, где ацилхлорид формулы (II):

(II)

представлен в способе в количестве 0,5 эквивалентов (по молям).

5A. Способ по любому из пп. от 1A до 4A, где взаимодействие гемцитабина (I) с ацилхлоридом формулы (II) осуществляют в растворителе этилацетате, ацетилцианиде или смеси этилацетата и ацетилцианида.

6A. Способ по любому из пп. от 1A до 5A, где взаимодействие гемцитабина (I) с ацилхлоридом формулы (II) осуществляют при кипячении с обратным холодильником в течение 1-4 часов; необязательно, 3 часов; необязательно, где кипячение проводят при температуре от 70°C до 90°C или при температуре 80°C.

7A. Способ по любому из пп. 1A-6A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂, -(CH₂)₄CH(CH₃)₂, -CH₂Cl, -(CH₂)₂Cl, -(CH₂)₃Cl, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₅Cl, -(CH₂)₆Cl, -CH₂Br, -(CH₂)₂Br, -(CH₂)₃Br, -(CH₂)₄Br, -(CH₂)₅Br, -(CH₂)₆Br, -CH₂I, -(CH₂)₂I, -(CH₂)₃I, -(CH₂)₄I, -(CH₂)₅I, -(CH₂)₆I, -CH₂CCH, -(CH₂)₂CCH, -(CH₂)₃CCH, -(CH₂)₄CCH, -(CH₂)₅CCH, -(CH₂)₆CCH, -CH₂N₃, -(CH₂)₂N₃, -(CH₂)₃N₃, -(CH₂)₄N₃, -(CH₂)₅N₃, -(CH₂)₆N₃, -CH₂SH, -(CH₂)₂SH, -(CH₂)₃SH, -(CH₂)₄SH, -(CH₂)₅SH, -(CH₂)₆SH, -CH₂COOH, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₃COOH, -(CH₂)₄COOH, -(CH₂)₅COOH, -(CH₂)₆COOH, -CH₂COOR₂, -(CH₂)₂COOR₂, -(CH₂)₃COOR₂, -(CH₂)₄COOR₂, -(CH₂)₅COOR₂, -(CH₂)₆COOR₂, -CH₂Ar, -(CH₂)₂Ar, -(CH₂)₃Ar, -(CH₂)₄Ar, -(CH₂)₅Ar, -(CH₂)₆Ar, -CH₂CHArCH₃, -CH₂CHArCH₂CH₃, -CH₂Tr, -(CH₂)₂Tr, -(CH₂)₃Tr, -(CH₂)₄Tr, -(CH₂)₅Tr, -(CH₂)₆Tr, -CH₂CHTrCH₃ или -CH₂CHTrCH₂CH₃;

где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

где Ar представляет собой ,

где A₁, A₂, A₃, A₄ и A₅, каждый, независимо, представляют собой H, NO₂, OH, O-алкил или O-метил; необязательно, где A₁ представляет собой NO₂ и A₂, A₃, A₄ и A₅ представляют собой H; или где A₁ представляет собой NO₂, A₃ и A₄ представляют собой OMe и A₂ и A₅ представляют собой H; или

где Tr представляет собой ,

где B представляет собой замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный алкинил, алкил, замещенный одной или несколькими бензильными или замещенными бензильными группами или .

8A. Способ по любому из пп. от 1A до 4A, где R₁ представляет собой хлоралкил и способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III):

(III)

в N, N-диизопропилэтиламине при кипячении с образованием соединения формулы (IV):

(IV),

где n обозначает 0, 1 или 2.

9A. Способ по любому из пп. от 1A до 8A, где способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III):

(III)

с уксусным ангидридом с образованием соединения формулы (V):

(V),

где Ac представляет собой -COCH₃.

10A. Соединение которое можно получить или полученное способом по любому из пп. от 1A до 9A.

11A. Соединение формулы (III) или формулы (V):

(III),

(V), где Ac представляет собой -COCH₃;

где R₁ выбран из группы, включающей: замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами;

или его фармацевтически приемлемая соль.

12A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂ или -(CH₂)₄CH(CH₃)₂.

13A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Cl, -(CH₂)₂Cl, -(CH₂)₃Cl, -(CH₂)₄Cl, -(CH₂)₅Cl, -(CH₂)₆Cl, -CH₂Br, -(CH₂)₂Br, -(CH₂)₃Br, -(CH₂)₄Br, -(CH₂)₅Br, -(CH₂)₆Br, -CH₂I, -(CH₂)₂I, -(CH₂)₃I, -(CH₂)₄I, -(CH₂)₅I или -(CH₂)₆I.

14A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂CCH, -(CH₂)₂CCH, -(CH₂)₃CCH, -(CH₂)₄CCH, -(CH₂)₅CCH или -(CH₂)₆CCH.

15A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂N₃, -(CH₂)₂N₃, -(CH₂)₃N₃, -(CH₂)₄N₃, -(CH₂)₅N₃ или -(CH₂)₆N₃.

16A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂SH, -(CH₂)₂SH, -(CH₂)₃SH, -(CH₂)₄SH, -(CH₂)₅SH или -(CH₂)₆SH.

17A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂COOH, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₃COOH, -(CH₂)₄COOH, -(CH₂)₅COOH, -(CH₂)₆COOH, -CH₂COOR₂, -(CH₂)₂COOR₂, -(CH₂)₃COOR₂, -(CH₂)₄COOR₂, -(CH₂)₅COOR₂ или -(CH₂)₆COOR₂;

где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил.

18A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Ar, -(CH₂)₂Ar, -(CH₂)₃Ar, -(CH₂)₄Ar, -(CH₂)₅Ar, -(CH₂)₆Ar, -CH₂CHArCH₃ или -CH₂CHArCH₂CH₃,

где Ar представляет собой ;

где A₁, A₂, A₃, A₄ и A₅, каждый, независимо, представляют собой H, NO₂, OH, O-алкил или O-метил; необязательно, где A₁ представляет собой NO₂ и A₂, A₃, A₄ и A₅ представляют собой H; или где A₁ представляет собой NO₂, A₃ и A₄ представляют собой OMe и A₂ и A₅ представляют собой H.

19A. Соединение по п. 11A, где R₁ выбран из группы, включающей: -CH₂Tr, -(CH₂)₂Tr, -(CH₂)₃Tr, -(CH₂)₄Tr, -(CH₂)₅Tr, -(CH₂)₆Tr, -CH₂CHTrCH₃ или -CH₂CHTrCH₂CH₃,

где Tr представляет собой ,

где B представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ хлоралкил, замещенный или незамещенный арил, замещенный или незамещенный бензил, замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкинил, C₁-C₂₆ алкил, замещенный одной или несколькими бензильными или замещенными бензильными группами, или .

Необязательно, R₁ не является таким, как указано в каком-либо одном или нескольких пп. 12A, 13A, 14A, 15A, 16A, 17A, 18A или 19A.

20A. Соединение по любому из пп. 11A-19A, где соединение выбрано из группы, включающей:

, , , , , , , , , , , , , или .

21A. Соединение по любому из пп. 11A-19A, где соединение не выбрано из группы, включающей:

, , , , , , , , , , , , , или .

22A. Соединение формулы (VI):

(VI),

где:

R₃ и R₄ оба представляют собой H;

R₃ представляет собой H и R₄ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил; или

R₃ и R₄, каждый, независимо, представляют собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил;

или его фармацевтически приемлемая соль.

23A. Соединение по п. 22A, где один или оба из R₃ и R₄ выбраны из группы, включающей: -CH₂CH₃, -(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₄CH₃, -(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₆CH₃, -CH₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₂CH(CH₃)₂, -(CH₂)₃CH(CH₃)₂ или -(CH₂)₄CH(CH₃)₂.

24A. Соединение формулы (IV):

(IV),

где n обозначает 0, 1 или 2;

или его фармацевтически приемлемая соль.

25A. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение в соответствии с любым из пп. от 11A до 24A и фармацевтически приемлемый носитель.

26A. Соединение в соответствии с любым из пп. от 11A до 24A или фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом 25A для применения в терапии.

27A. Соединение в соответствии с любым из пп. от 11A до 24A или фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом 25A для применения при лечении злокачественного новообразования.

28A. Соединение или фармацевтическая композиция для применения в соответствии с п. 27A, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

29A. Способ лечения пациента, необязательно пациента-человека, страдающего раком, где способ включает введение пациенту эффективного количества соединения согласно любому из пп. 11A-24A или фармацевтической композиции согласно п. 25A.

30A. Способ по п. 29A, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

Гемцитабин представляет собой химиотерапевтический препарат первой линии, который действует против широкого спектра солидных опухолей, таких как мелкоклеточный рак легких, мочевого пузыря, поджелудочной железы и молочной железы. Он обладает нуклеотидной структурой, которая «маскирует» соединение, улучшая его прохождение через клеточную мембрану посредством переносчиков нуклеозидов (NT). NT представляют собой группу мембранных белков, которые переносят нуклеозиды через клеточную мембрану. Как только гемцитабин попадает в клетку, он подвергается серии фосфорилирования, чтобы стать активным; Гемцитабин фосфорилируется дезоксицитидин киназой (dCK) с образованием его монофосфата (dFdCMP), а затем снова фосфорилируется пиримидинкиназами до его активных дифосфатных и трифосфатных производных, dFdCDP и dFdCTP, соответственно.

Один из путей, посредством которого гемцитабин проявляет свою цитотоксичность, заключается в его дифосфатной форме (dFdCDF), конкурентно ингибируя интеграцию дезоксицитидинтрифосфата (dCTP) в ДНК и, таким образом, он препятствует синтезу ДНК, что впоследствии приводит к апоптозу клеток (фигура 1, путь B). Другим путем, по которому гемцитабин проявляет свою цитотоксичность, является его активная форма, dFdCDP, которая ингибирует рибонуклеозиддифосфатредуктазу, фермент синтеза ДНК, который позволяет образовывать нуклеозидтрифосфаты. Это приводит к значительному снижению клеточного dCTP и изменению соотношения dCTP/dFdCTP в пользу dFdCTP. Альтернативно, инактивация гемцитабина катализируется CDA, где гемцитабин трансформируется в свой неактивный метаболит dFdU посредством дезаминирования 4-(N)-положения гемцитабина (фигура 1, путь A).

Фигура 1. Путь действия гемцитабина в случае дезаминирования (A) и включения в ДНК (B).

Чтобы преодолеть инактивацию гемцитабина из-за его дезаминирования CDA и повысить цитотоксичность гемцитабина, авторы настоящего изобретения разработали новаторский подход. Более конкретно, основная цель заключалась в защите 4-(N)-группы гемцитабина от алкилирования или ацилирования и в преобразовании ее в карбаматную или карбонатную связь или амидную или фосфорамидатную связь. Эти пролекарственные производные гемцитабина будут гидролизоваться в условиях кислого pH опухолевых клеток, и в результате будет высвобождаться нативный гемцитабин. Таким образом, стратегия авторов настоящего изобретения состоит в том, чтобы сохранить свойства гемцитабина и уменьшить потребность в высоких дозах, поскольку карбаматная связь, амидная или фосфорамидатная связь снижает цитотоксичность для здоровых клеток. Кроме того, процент преобразования dFdU будет уменьшен. Карбаматные связи и фосфорамидатные связи являются pH-лабильными и бесследными, а также они легче гидролизуются, чем амидные связи, с выделением CO₂.

Серия карбаматных или фосфатных производных 4-(N)-гемцитабина была разработана на основе нового синтетического метода, вытекающего за хлорформиатной стратегии. Новый синтетический метод может осуществляться в одном сосуде, он является быстрым и селективным по отношению к 4-(N)-положению гемцитабина. Новый синтетический метод может быть осуществлен в одну стадию без выделения промежуточного продукта. Кроме того, это количественный и качественный способ синтеза пролекарств гемцитабина, недорогой и простой, не требующий очистки. Способ синтеза в одном сосуде дает высокий выход, а также является «зеленой» химической реакцией и имеет множество применений. Например, способ синтеза в одном сосуде обеспечивает доступ к ряду производных, которые могут быть дополнительно модифицированы без необходимости защиты других участков молекулы гемцитабина.

С помощью нового способа синтеза, описанного в настоящем документе, получены новые 4-(N)замещенные производные гемцитабина, которые могут иметь свободные 3'- и/или 5'-OH-группы или которые могут иметь замещенные 3'- и/или 5'-OH-группы Типичными заместителями 3'- и/или 5'-OH-групп являются ацильные группы, например C_2-26 ацильные группы, такие как ацетильные группы. Свободные 3'- и/или 5'-OH группы можно преобразовать в замещенные группы известными способами, например, взаимодействием с OH-реакционно преобразующими агентами, например, ацилангидрадами или ацилгалогенидами или замещенным или незамещенным C₁-C₂₆ алкилом, замещенным или незамещенным C₁-C₂₆ галогеналкилом, например, хлоралкилом, замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным бензилом, замещенным или незамещенным C₂-C₂₆ алкенилом, замещенным или незамещенным C₂-C₂₆ алкинилом, C₁-C₂₆ алкилом, замещенным одной или несколькими замещенными или незамещенными бензильными группами, C₁-C₂₆ алкилом, замещенным одной или несколькими замещенными или незамещенными триазольными группами или их фармацевтически приемлемыми солями.

В некоторых аспектах настоящего изобретения новые 4-(N) замещенные производные гемцитабина имеют заместитель в 4-(N) положении, который имеет реакционноспособную группу, способную взаимодействовать с атомом H в 4-(N)-положении. Например, реакционноспособная группа может представлять собой хлор-, бром- или йод-группу. Таким образом, может происходить внутримолекулярная реакция, при которой получается циклический заместитель в положении 4-(N).

В некоторых аспектах настоящего изобретения новые 4-(N) замещенные производные гемцитабина имеют заместитель в положении 4-(N), который имеет реакционноспособную группу, которая может вступать в клик-реакцию с дополнительной группой, способной вступает в клик-реакцию. Например, реакционноспособная группа может быть азидо (N₃) группой, способной взаимодействовать с комплементарной алкиновой группой, фосфином или фосфитом (лигирование по Штаудингеру), или реакционноспособная группа может быть алкиновой группой, способной взаимодействовать с комплементарной азидогруппой или тиол (химия тиолина).

В некоторых аспектах настоящего изобретения новые 4-(N) замещенные производные гемцитабина имеют заместитель в 4-(N) положении, который включает триазольное кольцо, которое может быть образовано клик-реакцией между алкином и азидогруппой.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Варианты осуществления изобретения описаны далее со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых показано следующее:

Фигура 1. Путь действия гемцитабина в случае дезаминирования (A) и включения в ДНК (B).

Фигура 2. Применение фоторасщепляемого производного гемцитабина.

Фигура 3. Возможный механизм действия фосфорилированных производных гемцитабина.

Фигура 4. A. Клик-реакция между производным гемцитабина, содержащим алкин, и азидом кумарина. B. Спектры флуоресценции синтезированного соединения.

Фигура 5. Динамика спектра поглощения производного 7 при облучении. Стрелки вниз указывают пики, принадлежащие производному 7, а стрелки, указывающие вверх, указывают пики, созданные во время фотолиза.

Фигура 6. УФ-спектр гемцитабина в метаноле.

Фигура 7. Результаты экспериментов конфокальной микроскопии производного 11 в клетках HeLa.

Фигура 8. Результаты экспериментов конфокальной микроскопии производного 12 в клетках HeLa.

Фигура 9. Значения IC₅₀ 4-(N)-ацильных производных в четырех различных клеточных линиях.

Фигура 10. Соотношение IC₅₀ 4-(N)-ацильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях.

Фигура 11. Значения IC₅₀ ацетилированных 4-(N)-ацильных производных в четырех клеточных линиях.

Фигура 12. Соотношение IC₅₀ ацетилированных 4-(N)-ацильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях.

Фигура 13. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (5000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 24-часовой инкубации, определенной с помощью анализа МТТ.

Фигура 14. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (5000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 48-часовой инкубации, определенной с помощью анализа МТТ.

Фигура 15. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (5000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 48-часовой инкубации, определенной с помощью анализа МТТ.

Фигура 16. Цитотоксичность наиболее эффективных производных гемцитабина при различных концентрациях в линии клеток Т-24.

Фигура 17. Стабильность этил-(4-N-гемцитабин)карбамата (производное 1) in vitro после 24-часовой инкубации в плазме человека при температуре 37°C.

Фигура 18. Калибровочная кривая этил-(4-N-гемцитабин)карбамата (производное 1).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующее далее описание и примеры подробно иллюстрируют различные варианты осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники понятно, что существуют многочисленные вариации и модификации этого изобретения, которые охватываются его объемом. Соответственно, описание описанных вариантов осуществления не следует рассматривать как ограничивающее объем настоящего изобретения.

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области. Все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, на которые имеются ссылки в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки, если не указано иное. В случае наличия в настоящем документе нескольких определений для термина, преимущественную силу имеют такие, которые приведены в данном разделе, если не указано иное.

«Гемцитабин» относится к соединению 2',2'-дифтор-2'-дезоксицитидину, имеющему формулу I:

гемцитабин (формула I).

Как используется в настоящем документе, любая «R» группа(ы), такая как, без ограничений, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₁₄, R₂₀, R₂₁, R₂₀₁ и R₂₀₂ представляет собой заместители, которые могут быть присоединены к указанному атому. Группа R может быть замещенной или незамещенной. Если две группы «R» описаны как «взятые вместе», группы R и атомы, к которым они присоединены, могут образовывать циклоалкил, циклоалкенил, арил, гетероарил или гетероцикл. Например, без ограничения, если указано, что R^a и R^b группы в NR^aR^b «взяты вместе», это означает, что они ковалентно связаны друг с другом с образованием кольца:

.

Кроме того, если две группы «R» описаны как «взятые вместе» с атомом(ами), к которому они присоединены, чтобы образовать кольцо в качестве альтернативы, группы R не могут быть ограничены переменными или заместителями, определенными ранее.

Как используется в настоящем документе, термин «алкил» относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, которая включает полностью насыщенную (без двойных или тройных связей) углеводородную группу. Алкильная группа может иметь от 1 до 26 атомов углерода (всякий раз, когда она встречается в настоящем документе, числовой диапазон, такой как «от 1 до 26», относится к каждому целому числу в данном диапазоне; например, «от 1 до 26 атомов углерода» означает, что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода, 4 атомов углерода, 5 атомов углерода, 6 атомов углерода, 7 атомов углерода, 8 атомов углерода, 9 атомов углерода, 10 атомов углерода, 11 атомов углерода, 12 атомов углерода, 13 атомов углерода, 14 атомов углерода, 15 атомов углерода, 16 атомов углерода, 17 атомов углерода, 18 атомов углерода, 19 атомов углерода, 20 атомов углерода, 21 атомов углерода, 22 атомов углерода, 23 атомов углерода, 24 атомов углерода, 25 атомов углерода или 26 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает использование термина «алкил», где не указан числовой диапазон). Алкильная группа также может быть алкилом среднего размера, имеющим от 1 до 10 атомов углерода Алкильная группа также может быть низшей алкильной группой, имеющей 1-6 атомов углерода. Алкильная группа соединений может быть обозначена как «C₁-C₆ алкил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C₁-C₆ алкил» указывает на то, что в алкильной цепи имеется от одного до шести атомов углерода, то есть алкильная цепь выбрана из метила, этила, пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила, пентила (прямого и разветвленного) и гексила (прямого и разветвленного). Типичные алкильные группы включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, третичный бутил, пентил (прямой и разветвленный) и гексил (прямой и разветвленный). Алкильная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно, галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, «галогеналкил», например, «хлоралкил», относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, которая включает полностью насыщенную (без двойных или тройных связей) углеводородную группу и по меньшей мере один атом галогена, например, атом хлора в случае из «хлоралкила» (необязательно, один, два, три, четыре, пять или шесть или более атомов галогена, например атомы хлора). Термин «галогеналкил» включает фторалкил, хлоралкил, бромалкил и йодалкил. Галогеналкильная группа, например хлоралкильная группа, может иметь от 1 до 26 атомов углерода (всякий раз, когда она встречается здесь, числовой диапазон, такой как «от 1 до 26», относится к каждому целому числу в данном диапазоне; например, «от 1 до 26 атомов углерода» означает что алкильная группа может состоять из 1 атома углерода, 2 атомов углерода, 3 атомов углерода, 4 атомов углерода, 5 атомов углерода, 6 атомов углерода, 7 атомов углерода, 8 атомов углерода, 9 атомов углерода, 10 атомов углерода, 11 атомов углерода, 12 атомов углерода, 13 атомов углерода, 14 атомов углерода, 15 атомов углерода, 16 атомов углерода, 17 атомов углерода, 18 атомов углерода, 19 атомов углерода, 20 атомов углерода, 21 атомов углерода, 22 атомов углерода, 23 атомов углерода, 24 атомов углерода, 25 атомов углерода или 26 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает использование термина «алкил», где не указан числовой диапазон). Хлоралкильная группа также может представлять собой хлоралкил среднего размера, имеющий от 1 до 10 атомов углерода. Хлоралкильная группа также может быть низшим хлоралкилом, имеющим от 1 до 6 атомов углерода. Хлоралкильная группа соединений может быть обозначена как «C₁-C₆ хлоралкил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C₁-C₆ хлоралкил» указывает на то, что в алкильной цепи имеется от одного до шести атомов углерода, то есть алкильная цепь выбрана из группы, каждая из которых имеет по крайней мере один атом хлора, хлорметил, хлорэтил, хлорпропил, хлор- изопропил, хлор-н-бутил, хлор-изобутил, хлор-втор-бутил и хлор-трет-бутил, хлорпентил (прямой и разветвленный) и хлоргексил (прямой и разветвленный). Типичные хлоралкильные группы включают, но не ограничиваются ими, хлорметил, хлорэтил, хлорпропил, хлоризопропил, хлорбутил, хлоризобутил, хлор-трет-бутил, хлорпентил (прямой и разветвленный) и хлоргексил (прямой и разветвленный). Аналогично соответствующие фторалкильные, бромалкильные или йодоалкильные группы включены в это определение галогеналкила. Галогеналкильная группа, например, хлоралкильная группа, может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «циклоалкил» относится к полностью насыщенной (без двойных или тройных связей) моно- или полициклической углеводородной кольцевой системе. Когда кольца состоят из двух или более колец, они могут быть соединены вместе конденсированным образом. Циклоалкильные группы могут содержать от 3 до 10 атомов в кольце(ах) или от 3 до 8 атомов в кольце(ах). Циклоалкильная группа может быть незамещенной или замещенной. Типичные циклоалкильные группы включают, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и циклооктил. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «арил» относится к карбоциклической (полностью углеродной) моноциклической или полициклической ароматической кольцевой системе (включая конденсированные кольцевые системы, в которых два карбоциклических кольца имеют общую химическую связь), которая имеет полностью делокализованную пи-электронную систему на всем протяжении кольца. Число атомов углерода в арильной группе может варьироваться. Например, арильная группа может быть C₆-C₁₄ арильной группой, C₆-C₁₀ арильной группой или C₆ арильной группой. Примеры арильных групп включают, но не ограничиваются ими, бензол, нафталин и азулен. Арильная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «алканоил» относится к «карбонилу», замещенному «алкильной» группой, «алканоильная» группа ковалентно связана с исходной молекулой через углерод карбонильной группы.

Как используется в настоящем документе, термин «циклоалканоил» относится к «карбонилу», замещенному «циклоалкильной» группой, «алканоильная» группа ковалентно связана с исходной молекулой через углерод карбонильной группы.

Как используется в настоящем документе, термин «алкеноил» относится к «карбонилу», замещенному «алкенильной» группой, «алкеноильная» группа ковалентно связана с исходной молекулой через углерод карбонильной группы.

Как используется в настоящем документе, термин «алкиноил» относится к «карбонилу», замещенному «алкинильной» группой, «алкиноильная» группа ковалентно связана с исходной молекулой через углерод карбонильной группы.

Как используется в настоящем документе, термин «алкенил» относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или несколько двойных связей. Алкенильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает использование термина «алкенил», где числовой диапазон не указан. Алкенильная группа также может быть алкенилом среднего размера, имеющим от 2 до 9 атомов углерода. Алкенильная группа также может быть низшим алкенилом, имеющим от 2 до 4 атомов углерода. Алкенильная группа может быть обозначена как «C_2-4 алкенил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C_2-4 алкенил» указывает на то, что в алкенильной цепи содержится от двух до четырех атомов углерода, то есть алкенильная цепь выбрана из группы, состоящей из этенила, пропен-1-ила, пропен-2-ила, пропен-3-ила, бутен-1-ила, бутен-2-ила, бутен-3-ила, бутен-4-ила, 1-метил-пропен-1-ила, 2-метил-пропен-1-ила, 1-этил-этен-1-ила, 2-метил-пропен-3-ила, бута-1,3-диенила, бута-1,2-диенила и бута-1,2-диен-4-ила. Типичные алкенильные группы включают, но не ограничиваются ими, этенил, пропенил, бутенил, пентенил и гексенил и тому подобное. Алкенильная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «алкинил» относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей одну или несколько тройных связей. Алкинильная группа может иметь от 2 до 20 атомов углерода, хотя настоящее определение также охватывает использование термина «алкинил», где числовой диапазон не указан. Алкинильная группа также может быть алкинилом среднего размера, имеющим от 2 до 9 атомов углерода. Алкинильная группа также может быть низшим алкинилом, имеющим от 2 до 4 атомов углерода. Алкинильная группа может быть обозначена как «C_2-4 алкинил» или аналогичными обозначениями. Только в качестве примера, «C_2-4 алкинил» указывает на то, что в алкинильной цепи содержится от двух до четырех атомов углерода, то есть алкинильная цепь выбрана из группы, состоящей из этинила, пропин-1-ила, пропин-2-ила, бутин-1-ила, бутин-3-ила, бутин-4-ила и 2-бутинила. Типичные алкинильные группы включают, но не ограничиваются ими, этинил, пропинил, бутинил, пентинил и гексинил и тому подобное. Алкинильная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «пиранозный сахарид» относится к сахариду, имеющему шестичленное кольцо, состоящее из пяти атомов углерода и одного атома кислорода. За пределами кольца могут быть другие атомы углерода. Одним неограничивающим примером пиранозного сахарида является α-D-глюкопираноза: . Пиранозная сахаридная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Как используется в настоящем документе, термин «фуранозный сахарид» относится к сахариду, имеющему пятичленное кольцо, состоящее из четырех атомов углерода и одного атома кислорода. За пределами кольца могут быть другие атомы углерода. Одним неограничивающим примером фуранозного сахарида является β-D-фруктофураноза: . Фуранозная сахаридная группа может быть моно- или полизамещенной или незамещенной. Типичные заместители могут быть выбраны из -OH, -O-C_1-6 (необязательно галоген, например, -F, -Cl, -Br или -I)алкила, -SH, -S-C_1-6 алкила, -N₃, -NO₂, -галогена (например, -F, -Cl, -Br или -I), -COOH и/или -COOR₂ (где R₂ представляет собой замещенный или незамещенный C₁-C₂₆ алкил).

Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к соли соединения, которая не вызывает значительного раздражения организма, которому ее вводят, и не отменяет биологической активности и свойств соединения. В некоторых вариантах осуществления соль представляет собой кислотно-аддитивную соль соединения. Фармацевтические соли могут быть получены взаимодействием соединения с неорганическими кислотами, такими как галогенводородная кислота (например, хлористоводородная кислота или бромистоводородная кислота), серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота. Фармацевтические соли также могут быть получены путем взаимодействия соединения с органической кислотой, такой как алифатические или ароматические карбоновые или сульфоновые кислоты, например, муравьиная, уксусная, янтарная, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, никотиновая, метансульфоновая, этансульфоновая, п- толуолсульфоновая, салициловая или нафталинсульфоновая кислота. Фармацевтические соли также могут быть получены путем взаимодействия соединения с основанием с образованием соли, такой как соль аммония, соль щелочного металла, такая как соль натрия или калия, соль щелочноземельного металла, такого как кальций или магний, соль органических оснований, таких как дициклогексиламин, N-метил-D-глюкамин, трис(гидроксиметил)метиламин, C₁-C₇ алкиламин, циклогексиламин, триэтаноламин, этилендиамин, и соли с аминокислотами, такими как аргинин и лизин.

Понятно, что в любом описанном в настоящем документе соединении, имеющем один или несколько хиральных центров, если абсолютная стереохимия явно не указана, каждый центр может независимо иметь R-конфигурацию или S-конфигурацию или их смесь. Таким образом, соединения, представленные в настоящем документе, могут быть энантиомерно чистыми, энантиомерно обогащенными, рацемическими смесями, диастереомерно чистыми, диастереомерно обогащенными или стереоизомерными смесями. Кроме того, понятно, что в любом описанном в настоящем документе соединении, имеющем одну или несколько двойных связей, образующих геометрические изомеры, которые могут быть определены как E или Z, каждая двойная связь может независимо быть E или Z их смесью.

Если описанные в настоящем документе соединения имеют по меньшей мере один хиральный центр, они могут существовать как отдельные энантиомеры и диастереомеры или как смеси таких изомеров, включая рацематы. Разделение индивидуальных изомеров или селективный синтез индивидуальных изомеров достигается применением различных методов, которые хорошо известны практикующим специалистам в данной области. Если не указано иное, все такие изомеры и их смеси включены в объем соединений, описанных в настоящем документе. Кроме того, описанные в настоящем документе соединения могут существовать в одной или нескольких кристаллических или аморфных формах. Если не указано иное, все такие формы включены в объем описанных в настоящем документе соединений, включая любые полиморфные формы. Кроме того, некоторые из описанных в настоящем документе соединений могут образовывать сольваты с водой (то есть гидраты) или обычными органическими растворителями. Если не указано иное, такие сольваты включены в объем соединений, описанных в настоящем документе.

Следует понимать, что, если соединения, описанные в настоящем документе, имеют незаполненные валентности, тогда валентности должны быть заполнены атомами водорода или их изотопами, например водород-1 (протий) и водород-2 (дейтерий).

Понятно, что описанные в настоящем документе соединения могут быть мечены изотопами. Замена изотопами, такими как дейтерий, может дать определенные терапевтические преимущества, обусловленные большей метаболической стабильностью, такими как, например, увеличение периода полужизни in vivo или снижение требований к дозировке. Каждый химический элемент, представленный в структуре соединения, может включать любой изотоп указанного элемента. Например, в структуре соединения атом водорода может быть явно раскрыт или предположительно присутствует в соединении. В любом положении соединения, в котором может присутствовать атом водорода, атом водорода может быть любым изотопом водорода, включая, помимо прочего, водород-1 (протий) и водород-2 (дейтерий). Таким образом, ссылка в настоящем документе на соединение охватывает все потенциальные изотопные формы, если контекст явно не диктует иное.

Как используется в настоящем документе, термин «пролекарство» обычно относится к соединению, которое является фармацевтически приемлемым и при введении преобразуется в желаемое активное соединение, в данном случае гемцитабин. В некоторых вариантах осуществления пролекарство может быть терапевтически неактивным до тех пор, пока не будет расщеплено с высвобождением активного соединения. Пролекарство будет содержать «активный» компонент, в данном случае гемцитабин, и фрагмент (например, защитную группу), присоединенный к 4-(N)-положению гемцитабина. Удаление части или всего фрагмента преобразует пролекарство из неактивной формы в активное лекарственное средство. Это происходит в организме в результате химической или биологической реакции.

В зависимости от фрагмента (например, защитной группы), присоединенного к 4-(N)-положению гемцитабина, по меньшей мере одно образованное пролекарство может быть либо нейтральным (незаряженным), свободной кислотой, свободным основанием, либо фармацевтически приемлемой анионной или катионной солевой формой или смесью солей с любым соотношением положительных и отрицательных компонентов. Такие формы анионных солей могут включать, но не ограничиваются ими, например, ацетат, l-аспартат, безилат, бикарбонат, карбонат, d-камсилат, l-камсилат, цитрат, эдисилат, формиат, фумарат, глюконат, гидробромид/бромид, гидрохлорид/хлорид, d-лактат, l-лактат, d, l-лактат, d, l-малат, l-малат, мезилат, памоат, фосфат, сукцинат, сульфат, бисульфат, d-тартрат, l-тартрат, d, l-тартрат, мезо-тартрат, бензоат, глюцепат, d-глюкуронат, гибензат, изетионат, малонат, метилсуфат, 2-напсилат, никотинат, нитрат, оротат, стеарат, тозилат, тиоцианат, ацефиллинат, ацетурат, аминосалицилат, аскорбонат, камфорат, камфокарбонат, деканоат, гексаноат, холат, ципионат, дихлорацетат, эдентат, этилсульфат, фурат, фузидат, галактарат (мукат), галактуронат, галлат, гентизат, глутамат, глутамат, глутарат, глицерофосфат (гидроксиобензоат, гидроксиионт-гептанофосфат), йодид, ксинафоат, лактобионат, лаурат, малеат, манделат, метансульфонат, миристат, нападисилат, олеат, оксалат, пальмитат, пикрат, пивалат, пропионат, пирофосфат, салицилат, салицилсульфат, сульфосалицилат, таннат, терефталат, тиосалицилат, триброфенат, валерат, вальпроат, адипат, 4-ацетамидобензоат, камсилат, октаноат, эстоленгликольат, ундициленгликат, эзилат. Катионные солевые формы могут включать, но не ограничиваются ими, например, натриевую, калиевую, кальциевую, магниевую, цинковую, алюминиевую, литиевую, холинат, лизинат, аммониевую или трометаминовую.

Термин «фармацевтически приемлемые носители» включает, но не ограничивается этим, 0,01-0,1 М и, предпочтительно, 0,05 М фосфатный буфер или, в другом варианте осуществления изобретения, 0,8% физиологический раствор. Кроме того, такие фармацевтически приемлемые носители могут быть в другом варианте осуществления изобретения водными или неводными растворами, суспензиями и эмульсиями. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения носитель может представлять собой а) 10% ПЭГ (полиэтиленгликоль) 400 (об./об.)+30% (об./об.) HPβCD (гидроксипропил β-циклодекстрин), 50% мас/об.+60% (об./об.) стерильную воду для инъекций или b) 0,1% (об./об.) Tween 80+0,5% (мас/об.) карбоксиметилцеллюлозы в воде.

Термин «субъект» относится к млекопитающим, таким как люди, домашние животные, такие как кошки или собаки, сельскохозяйственные животные, такие как, но не ограничиваясь ими, коровы, лошади, козы, овцы и свиньи, дикие животные (будь то в дикой природе или в зоологическом саду), лабораторные животные, такие как мыши, крысы, кролики, козы, овцы, свиньи, собаки и кошки, виды птиц, такие как куры, индейки и певчие птицы. Субъектом может быть, например, ребенок, такой как подросток, или взрослый.

Термин «лечение» относится к любому лечению патологического состояния у субъекта, такого как млекопитающее, в частности, человека, и включает: (i) предотвращение и/или снижение риска возникновения патологического состояния у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого еще не диагностировано это состояние, и, соответственно, лечение представляет собой профилактическое лечение болезненного состояния; (ii) ингибирование и/или снижение скорости развития патологического состояния, например, остановка его развития; (iii) облегчение патологического состояния, например, вызывание регресса патологического состояния; или (iv) облегчение состояний, опосредованных патологическим состоянием и/или симптомами патологического состояния. В настоящем документе предполагается лечение субъектов, которые ранее и/или в настоящее время получают терапию рака и/или собираются получать терапию рака.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству соединения по изобретению, которое достаточно для осуществления лечения, при введении субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Терапевтически эффективное количество будет варьироваться в зависимости от субъекта и болезненного состояния, которое лечат, веса и возраста субъекта, тяжести болезненного состояния, способа введения и тому подобного, что может легко определить специалист в данной области.

Не ограничиваясь следующей теорией, некоторые из вариантов осуществления пролекарств/конъюгатов, представленных в настоящем документе, подвергаются ферментативному гидролизу карбаматной связи in vivo, что впоследствии приводит к получению гемцитабина и соответствующих его метаболитов и/или производных и/или их компонентов. Блокирующие фрагменты, то есть фрагменты, присоединенные к гемцитабину через карбаматную связь, по настоящему изобретению являются нетоксичными или имеют очень низкую токсичность при заданных уровнях доз и, предпочтительно, представляют собой известные лекарственные средства, природные продукты, метаболиты или соединения GRAS (обычно признанные безопасными) (например, консерванты, красители, ароматизаторы и т. д.) или нетоксичные миметики или их производные.

Понятно, что способы и комбинации, описанные в настоящем документе, включают кристаллические формы (также известные как полиморфы, которые включают различные конфигурации упаковки кристаллов одного и того же элементного состава соединения), аморфные фазы, соли, сольваты и гидраты. В некоторых вариантах осуществления соединения, описанные в настоящем документе, существуют в сольватированных формах с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол или тому подобное. В других вариантах осуществления описанные в настоящем документе соединения существуют в несольватированной форме. Сольваты содержат стехиометрические или нестехиометрические количества растворителя и могут образовываться в процессе кристаллизации с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол или тому подобное. Гидраты образуются, когда растворителем является вода, или алкоголяты образуются, когда растворителем является спирт. Кроме того, предлагаемые в настоящем документе соединения могут существовать как в несольватированной, так и в сольватированной формах. Обычно сольватированные формы считаются эквивалентными несольватированным формам для целей соединений и способов, представленных в настоящем документе.

Если предоставляется диапазон значений, следует понимать, что верхний и нижний предел и каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом диапазона охватываются вариантами осуществления изобретения.

Соединения

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены производные гемцитабина. Конкретные описанные в настоящем документе производные гемцитабина представлены в таблице 1 ниже. Номер, указанный для каждого производного гемцитабина, показанного в таблице 1, используется в данном описании для обозначения одного и того же соединения.

Таблица 1: Производные гемцитабина

Номер производного гемцитабина Структура 1
Этил-(4-N-гемцитабин)карбамат 2
н-Бутил-(4-N-гемцитабин)карбамат 3A
2-Хлорэтил-(4-N-гемцитабин)карбамат 3B
2-оксазолидин-(4-N-гемцитабин)карбамат 4
2-Хлорметил-(4-N-гемцитабин)карбамат 5
Пропаргил-(4-N-гемцитабин)карбамат 6
2-(2-нитрофенил)пропил-(4-N-гемцитабин)карбамат 7
(4,5-диметокси)-2-нитробензил-(4-N-гемцитабин)карбамат 8
(н-изобутил)-(4-N-гемцитабин)карбамат 9
4-N-(диэтоксифосфат)гемцитабин 10
4-N-(фосфат)гемцитабин 11
(1-(7-гидрокси-2-оксо-4a,8a-дигидро-2H-хромен-3-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)метил-4-N-гемцитабин карбамат 12
3',5'-диацетил (1-(7-ацетил-2-оксо-4a,8a-дигидро-2H-хромен-3-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил) метил-4-N-гемцитабин карбамат 13
3',5'-диацетил-(этил-4-N-гемцитабин)карбамат 14
3',5'-диацетил-(н-бутил-4-N-гемцитабин)карбамат 15
3',5'-диацетил-(хлорэтил-4-N-гемцитабин)карбамат 16
3',5'-диацетил-(оксазолидин-4-N-гемцитабин)карбамат 17
3',5'-диацетил-(хлорметил-4-N-гемцитабин)карбамат 18
3',5'-диацетил-(пропаргил-4-N-гемцитабин)карбамат 19
3',5'-диацетил-(2-(2-нитрофенил)пропил-4-N-гемцитабин)карбамат 20
3',5'-диацетил-((4,5-диметокси)-2-нитробензил-4-N-гемцитабин))карбамат 21
3',5'-диацетил-(н-изобутил-4-N-гемцитабин)карбамат 22
3',5',4-N-триацетил гемцитабин

Способы синтеза

A. Общий метод синтеза для получения производных гемцитабина 1-11: В атмосфере азота гемцитабин (30 мг, 0,114 ммоль) смешивали с 15 мл раствора смеси этилацетат/ацетонитрил (2:1, об./об.) при кипячении с обратным холодильником в течение 1 ч (наблюдение: гемцитабин становится растворимым, и реакционная смесь становится почти прозрачной). В смесь добавляли этилхлорформиат (при образовании производного 1) (5,440 мкл, 0,057 ммоль) и продолжали нагревание с обратным холодильником. За ходом реакции следили с помощью ТСХ (ДХМ/ацетон/этанол, 5/5/0,5, об./об.). Через 2 часа реакционную смесь центрифугировали, маточный раствор концентрировали и сушили в высоком вакууме, получая 14,6 мг (98,31%) твердого вещества белого цвета. (Подобная реакция была предпринята с использованием первичного алкилбромида, а не этилхлорформиата - реакция была неудачной). Диапазон количеств этилхлорформиата, присутствующего в реакции, необязательно составлял от 0,3 до 0,7 эквивалента (по молям); необязательно 0,5 эквивалента (по молям). Более 0,7 моль и 3'- и/или 5'-OH-групп гемцитабина были частично защищены; менее 0,3 моль и 4-(N)-положение гемцитабина не были должным образом защищены).

Для других соединений 1-11 использовали тот же общий метод синтеза (в тех же молярных количествах для соответствующего ацилхлорида или фосфорилхлорида) с дополнительными условиями, указанными в таблице 2 ниже. Соединение 10 может быть получено из соединения 9 после отщепления этильных групп триметилсилилйодидом (TMSI).

Таблица 2: Получение производных гемцитабина 1-11

Получение производного Исходное хлорформиатное соединение для встраивания в 4-N гемцитабина Время реакции (ч) Выход/% 1 3 98,3 2 3 98,2 3A 3 76,4 3A=100% 12 84,9 3A=74,55% 3B=25,45% 48 84,9 3A=8% 3B=92% 3B 2 ч 100 3B=100% 4 3 91,4 5 3 97,7 6 3 95,8 7 3 71,2 8 3 88,1 9 8 66,5 10
Соединение 10 получают из соединения 9 после отщепления этильных групп триметилсилилйодидом (TMSI) 4 84,2% 11
Соединение 11 получают из соединения 5 после клик реакции с 7-гидрокси-3-азидокумарином 8 70,5%

A. Общий метод клик-реакции (для получения производного 11): пропаргил-(4-N-гемцитабин)карбамат (10 мг, 0,02898 ммоль), азид кумарина (5,88 мг, 0,02898 ммоль), триэтиламин 10%, CuI 1% и THPTA (0,1%) (катализатор) растворяли в 1 мл раствора метанол/H₂O (2:1 об./об.) в течение ночи при комнатной температуре. ТСХ-анализ конечного продукта проводили в смеси ацетон/ДХМ (дихлорметан) 1:1 об./об., и результаты показали, что все исходные материалы были израсходованы и имело место образование нового пятна (флуоресцентная активность при 365 нм). Растворитель реакции упаривали досуха на роторном испарителе и остаток несколько раз промывали раствором диэтилового эфира. На основании данных анализа ТСХ примеси были удалены в растворе диэтилового эфира, и конечный продукт представлял собой твердое вещество коричневого цвета (выход 70,5%).

B. Общий метод ацетилирования для получения производных гемцитабина 12-22: В атмосфере азота к раствору исходного хлорформиата (1 эквивалент) в пиридине (2 мл) и DMAP (4-(диметиламино)пиридин; каталитическое количество) добавляли уксусный ангидрид (n эквивалентов, n=количество -OH групп) и реакционную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Прозрачный раствор концентрировали перегонкой. Неочищенную смесь растворяли в EtOAc и промывали насыщенным NaHCO₃ и насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого соединения. За реакцией следили, используя ТСХ ацетон/ДХМ 1:1 об./об., и наблюдали трансформацию исходного материала.

Для производных гемцитабина 12-22 применялся тот же общий метод с дополнительными условиями, указанными в таблице 3 ниже.

Таблица 3: Получение производных гемцитабина 12-22

Соединение Ацетилированные хлорформиаты Время реакции Очистка Выход 12 3 ч
Кипячение при 120°C ВЭЖХ 78,3% 13 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 86,3% 14 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 90% 15 2 ч
комнатная температура (увеличение времени реакции приводит к циклическому побочному продукту) Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃), насыщенным солевым раствором и затем ВЭЖХ. 65,8% 16 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 81,9% 17 1 ч
комнатная температура (увеличение времени реакции приводит к триацетилированному производному.) Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃), насыщенным солевым раствором и затем ВЭЖХ. 46% 18 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 88,5% 19 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 79,1% 20 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором (NaCl). 70,4% 21 3 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 87% 22 2 ч
комнатная температура Экстракция насыщенным раствором (CuSO₄), насыщенным раствором (NaHCO₃) и насыщенным солевым раствором. 93,3%

Промежуточные соединения

Хотя биологические данные в настоящей заявке показывают биологическую активность многих из этих соединений, некоторые из соединений действуют так же как полезные промежуточные соединения при образовании дополнительных версий производных гемцитабина, например, конъюгатов гемцитабина. Описанный в настоящем документе синтез производных 4-(N)-защищенного гемцитабина в одном сосуде обеспечивает путь синтеза соединений, конъюгированных с 4-(N)-гемцитабином.

Гемцитабин с фотолабильной временной защитой

Фотохимия обеспечивает механизм активного контроля высвобождения лекарственного средства избирательно в месте злокачественного новообразования с целью адресной доставки лекарственного средства. Соединение 7 может быть обнаружено по высвобождению гемцитабина при облучении с использованием стратегии фоторазлагаемого связывания. Термин непрозрачный относится к временной инактивации биологически активной молекулы с использованием защитной фоторазлагаемой группы. В качестве фоторазлагаемой связывающей группы авторы настоящего изобретения использовали орто-нитробензильную (CNB) группу с селективной модификацией первичного амина гемцитабина.

После ультрафиолетового облучения при определенной длине волны фоторазлагаемой группы в диапазоне от 350 до 500 нм (или более 700 нм при использовании двухфотонного возбуждения) активная форма инкапсулированной молекулы необратимо высвобождается. Фото-включение часто выполнялось in vitro для пространственно-временного контроля биологических процессов и высвобождения индуцированной светом полезной нагрузки. Этот подход с двойным высвобождением лекарственного средства (нацеливание на клетки и фото-контролируемое высвобождение) может быть более эффективным для повышения терапевтического индекса противоопухолевого лекарственного средства, чем любой из этих механизмов по отдельности. Авторы настоящего изобретения считают, что эта двойная стратегия имеет большое значение для терапевтических применений, поскольку требует неинвазивной и пространственно-временной активации лекарства. Чтобы продемонстрировать этот двойной механизм высвобождения лекарственного средства, авторы настоящего изобретения провели эксперименты по фотолизу (фигура 2).

Фигура 2. Применение фоторазлагаемого производного гемцитабина (производное 7).

Активация ферментов и высвобождение лекарств.

Другой механизм, при котором может происходить избирательное высвобождение активного лекарственного средства, находится под действием определенных ферментов, сверхэкспрессируемых в раковых клетках и обнаруживаемых внутриклеточно или внеклеточно. Дизайн пролекарств основан на том факте, что эти ферменты распознают определенные субстраты. Типичным классом этих ферментов является щелочная фосфатаза (ALP). ALP является членом семейства металлопротеиназ, которые катализируют реакции гидролиза сложного эфира фосфорной кислоты. Повышенный уровень ALP напрямую связан с появлением различных видов злокачественного новообразования, особенно рака молочной железы. Основываясь на механизме действия ALP, было разработано несколько пролекарств, которые проявляют повышенную растворимость в воде при попадании в раковые клетки по сравнению с их исходными соединениями (фигура 3).

Фигура 3. Возможный механизм действия фосфорилированных производных гемцитабина (например, производных 9 и 10).

Механизм, проиллюстрированный на фигуре 3, относится к производным фосфата, так как фосфатная группа (в производных фосфата) распознается щелочной фосфатазой. Авторы настоящего изобретения могут использовать тот же механизм для установки различных хемотипов в качестве стимула для других ферментов, включая, но не ограничиваясь ими, нитроредуктазу и β-галактозидазу. Помимо ферментов, в качестве триггеров можно использовать другие молекулы, включая, помимо прочего, глутатион или H₂O₂, с использованием тиоловой простой или сложноэфирной группы или боронового сложного эфира, соответственно.

Клеточная визуализация и локализация

Разработка пролекарств гемцитабина с использованием сложных эфиров хлорформиата вдохновила авторов настоящего изобретения на создание молекулы для мониторинга гемцитабина in vivo, в то время как она снабжена флюорофорным агентом, кумарином. Конъюгация происходила с помощью химической клик реакции между алкином (производное 5 в таблице 1) и азидом (7-гидрокси-3-азидокумарин) с образованием соединения 11 (фигура 4).

Фигура 4. A. Клик-реакция между производным гемцитабина, содержащим алкин, и азидом кумарина. B. Спектры флуоресценции синтезированного соединения (производное 11).

Использование производного 11 и родственных производных либо отдельно, либо в комбинации с гемцитабином и/или другими производными гемцитабина предоставляет соединение с определенным спектром флуоресценции (фигура 4B). Этот спектр можно контролировать in vivo или in vitro, чтобы проверить наличие и/или действие пролекарств гемцитабина и гемцитабина. Это особенно полезно в исследованиях in vitro. Применение in vivo может быть менее полезным из-за низкой длины волны излучения кумарина в качестве красителя. Для применений in vitro предпочтительны красители, излучающие в ближнем инфракрасном диапазоне, поскольку они могут использоваться для визуализации in vivo из-за глубокого проникновения в ткани ближнего инфракрасного диапазона.

Характеристические данные

Следующие характеристические данные были получены для производных гемцитабина, представленных в таблице 1, которые были получены с помощью методов синтеза, описанных выше.

Спектры ядерного магнитного резонанса (ЯМР) записывали на ЯМР-спектрометре Bruker AV500, AV400 и AV250 (Bruker, Германия) в растворе дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-d₆), а химические сдвиги определяли относительно пика остаточного растворителя (δH2,50 для ДМСО). Для обозначения множественности сигнала использовали следующие сокращения: с, синглет; д, дублет; т, триплет; кв, квартет; м, мультиплет; дд, дуплет дублетов. Масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI-MS) проводили на приборе Agilent 1100 Series LC/MSD и тройном квадрупольном масс-спектрометре EVOQ Elite ER (Bruker Daltonics, Германия).

Производное 1

¹H-ЯМР производного 1: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,86 (с, 1 H, 7 NH), 8,25 (д, J=7,5 Гц, 1 H, 6-H), 7,14 (д, J=7,5 Гц, 1 H, 5-H), 6,34 (д, J=6,5 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,19 (т, J=7,5 Гц, 1 H, 1'-H), 5,32 (т, J=4,5 Гц, 1 H, 5'-OH), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 4,20 (кв, J=7,1 Гц, 7,0 Гц, 2 H, 10-H), 2,92 (м,1 H, 4'-H), 2,83 (д, J=12,3 Гц, 1 H, 5'a-H), 2,68 (м, 1 H, 5'b-H) 1,26 (т, J=7,0Гц, 3 H, 11-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 1:(500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,3 (C4), 154,99 (C2), 154,04 (C8), 145,19 (C6), 122,86 (C2'), 95,63 (C5), 84,86 (C1'), 81,73 (C4'), 69,14 (C3'), 62,22 (C10), 59,6 (C5'), 15,01 (C11) м.д.

MS (ESI+) m/z: [M+H]+ для C₁₂H₁₅F₂N₃O₆: вычисл. 335,09; найдено 336,51, [M+Na]+ для C₁₂H₁₅F₂N₃O₆Na: вычисл. 357,49; найдено 358,49, [M+K]+ для C₁₂H₁₅F₂N₃O₆K: вычисл. 373,09; найдено 374,51.

Производное 2

¹H-ЯМР производного 2: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,85 (с, 1 H, 7-NH), 8,25 (д, J=7,65 Гц, 1 H, 6-H), 7,13 (д, J=7,65 Гц, 1 H, 5-H), 6,34 (д, J=6,50 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,19 (т, J=7,50 Гц, 1 H, 1'-H), 5,32 (т, J=5,50 Гц, 1 H, 5'-OH), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 4,15 (т, J=6,60 Гц, 2 H, 10-H), 2,91 (м, 1 H, 4'-H), 2,83 (м, 1 H, 5'a-H), 2,68 (м, 1 H, 5'b-H) 1,62 (м, 2 H, 11-H), 1,39 (м, 2H, 12-H), 0,94 (т, J=7,35 Гц, 3 H, 13-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 2: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,38 (C4), 154,88 (C2), 154,18 (C8), 145,33 (C6), 122,9 (C2'), 95,55 (C5), 84,76 (C1'), 81,65 (C4'), 69,09 (C3'), 65,75 (C10), 59,48 (C5'), 30,94 (C11), 19,14 (C12), 14,16 (C13) м.д.

Производное 3A

¹H-ЯМР производного 3A: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,03 (с, 1 H, 7-NH), 8,27 (д, J=7,70 Гц, 1 H, 6-H), 7,11 (д, J=7,70 Гц, 1 H, 5-H), 6,20 (т, J=7,60 Гц, 1 H, 1'-H), 4,43 (т, J=5,30 Гц, 2 H, 10-H), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 2,92 (м, 1 H, 4'-H), 2,89 (т, J=5,30 Гц, 2 H, 11-H), 2,84 (м, 1 H, 5'a-H), 2,69 (м, 1 H, 5'b-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 3A: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,3 (C4), 154,82 (C2), 152,68 (C8), 145,5 (C6), 129,89 (C2'), 95,64 (C5), 84,79 (C1'), 81,68 (C4'), 69,03 (C3'), 65,93 (C10), 59,45 (C5'), 42,16 (C11) м.д.

Производное 3B

¹H-ЯМР производного 3B: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=8,29 (д, J=7,70 Гц, 1 H, 6-H), 7,36 (д, J=7,70 Гц, 1 H, 5-H), 6,22 (т, J=7,60 Гц, 1 H, 1'-H), 4,48 (т, J=8,0 Гц, 2 H, 10-H), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 4,10 (м, 2 H, 11-H), 2,92 (м, 1 H, 4'-H), 2,84 (м, 1 H, 5'a-H), 2,69 (м, 1 H, 5'bH) м.д.

¹³C-ЯМР производного 3B: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=162,0 (C4), 155,03 (C8), 154,82 (C2), 144,45 (C6), 122,89 (C2'), 95,64 (C5), 84,79 (C1'), 81,68 (C4'), 69,03 (C3'), 62,37 (C10), 59,45 (C5'), 42,20 (C11) м.д.

Производное 4

¹H-ЯМР производного 4: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,37 (с, 1 H, 7 NH), 8,28 (д, J=7,6 Гц, 1 H, 6-H), 7,06 (д, J=7,5 Гц, 1 H, 5-H), 6,34 (шир. с, 1 H, 3'-OH), 6,16 (т, J=7,4 Гц, 1 H, 1'-H), 5,94 (с, 2H, 10-H), 5,32 (широкий, 1 H, 5'-ОH), 4,19 (м, 1H, 3'-H), 2,89 (м,1 H, 4'-H), 2,81 (д, J=12,3 Гц, 1 H, 5'a-H), 2,64 (м, 1 H, 5'b-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 4: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,3 (C4), 154,82 (C2), 152,68 (C8), 146,1 (C6), 129,89 (C2'), 96 (C5), 84,8 (C1'),71,8 (C10), 68,9 (C3'), 81,9 (C4'), 59,6 (C5') м.д.

Производное 5

¹H-ЯМР производного 5: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,10 (с, 1 H, 7-NH), 8,28 (д, J=7,6 Гц, 1 H, 6-H), 7,11 (д, J=7,6 Гц, 1 H, 5-H), 6,20 (т, J=7,4 Гц, 1 H, 1'-H), 4,83 (д, J=2,35 Гц, 2 H, 10-H), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 2,92 (м, 1 H, 4'-H), 2,84 (м, 1 H, 5'a-H), 2,69 (м, 1 H, 5'bH) 2,65 (т, J=2,35 Гц, 1 H, 12-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 5: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,20 (C4), 154,81 (C2), 152,31 (C8), 145,95 (C6), 122,93 (C2'), 95,53 (C5), 84,83 (C1'), 81,68 (C4'), 79,17 (C11), 78,91 (C12), 69,05 (C3'), 59,45 (C5') м.д.

Производное 6

¹H-ЯМР производного 6: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,89 (с, 1 H, 7-NH), 8,23 (д, J=7,65 Гц, 1 H, 6-H), 7,87 (д, J=7,75 Гц, 1 H, 15-H), 7,81 (д, J=7,75 Гц, 1 H, 18-H), 7,72 (т, J=7,75 Гц, 1 H, 17-H), 7,52 (т, J=7,75 Гц, 1 H, 16-H), 7,03 (м, 1 H, 5-H), 6,19 (т, J=7,50 Гц, 1 H, 1'-H), 4,36 (м, 2 H, 10-H), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 2,91 (м, 1 H, 4'-H), 2,83 (м, 1 H, 5'a-H), 2,68 (м, 1 H, 5'b-H) 2,54 (м, 1 H, 11- ), 1,35 (д, J=7,0 Гц, 3 H, 12-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 6: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,17 (C4), 154,78 (C2), 152,86 (C8), 150 (C18), 145,33 (C6), 137,31 (C13), 132,71 (C15), 129,75 (C17), 128,61 (C16), 124,46 (C14), 122,74 (C2'), 95,53 (C5), 84,80 (C1'), 81,68 (C4'), 69,47 (C10), 69,05 (C3'), 59,47 (C5'), 32,61 (C11), 18,49 (C12) м.д.

Производное 7

¹H-ЯМР производного 7: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,30 (с, 1 H, 7-NH), 8,30 (д, J=7,55 Гц, 1 H, 6-H), 7,78 (с, 1 H, 13-H), 7,44 (с, 1 H, 16-H), 7,17 (д, J=7,55 Гц, 1 H, 5-H), 6,35 (д, J=6,32 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,21 (т, J=7,50 Гц, 1 H, 1'-H), 5,55 (с, 2 H, 10-H), 5,33 (т, J=5 Гц, 1 H, 5'-OH), 4,23 (м, 1 H, 3'-H), 2,99 (с, 3 H, 18-H), 2,93 (м, 1 H, 4'-H), 2,92 (с, 3 H, 17-H), 2,84 (м, 1 H, 5'a-H), 2,69 (м, 1 H, 5'b-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 7: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,26 (C4), 154,8 (C2), 154,52 (C15), 152,42 (C8), 148,64 (C14), 145,51 (C6), 139,84 (C12), 127,52 (C11), 122,9 (C2'), 111,04 (C16), 108,78 (C13), 95,42 (C5), 84,77 (C1'), 81,68 (C4'), 69,06 (C3'), 64,55 (C10), 59,45 (C5'), 57,18 (C18), 56,75 (C17) м.д.

Спектры производного 7 (10 мкМ) и гемцитабина (5 мкМ) записывали на спектрометре Perkin Elmer Lambda 25 при комнатной температуре. Образцы солюбилизировали в метаноле для ВЭЖХ и облучали УФ-лампой при 366 нм в течение 240 минут. Результаты показаны на фигуре 5. Авторы настоящего изобретения заметили, что в диапазоне 280-290 нм и 320-330 нм наблюдается уменьшение интенсивности поглощения и в то же время увеличение интенсивности до 250-270 нм. Не желая быть связанными теорией, увеличение в этой области наблюдается из-за высвобождения гемцитабина. Эта теория подтверждается увеличением полосы, соответствующей гемцитабину. Для сравнения УФ-спектр гемцитабина показан на Фигуре 6.

Фигура 6. УФ-спектр гемцитабина в метаноле.

Производное 8

1H-ЯМР производного 8: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,84 (с, 1 H, 7-NH), 8,20 (д, J=7,65 Гц, 1 H, 6-H), 7,08 (д, J=7,65 Гц, 1 H, 5-H), 6,29 (д, J=6,50 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,16 (т, J=7,54 Гц, 1 H, 1'-H), 5,27 (т, J=5,32 Гц, 1 H, 5'-OH), 4,18 (м, 1 H, 3'-H), 2,90 (д, J=6,64 Гц, 2 H, 10-H), 2,88 (м, 1 H, 4'-H), 2,80 (м, 1 H, 5'a-H), 2,65 (м, 1 H, 5'b-H) 1,90 (м, 1 H, 11-H), 0,90 (д, J=6,68 Гц, 6 H, 12,13-H) м.д.

Производное 9

¹H-ЯМР производного 9: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=δ=11,84 (с, 1 H, 7-NH), 8,25 (д, J=7,68 Гц, 1 H, 6-H), 7,33 (д, J=7,68 Гц, 1 H, 5-H), 6,32 (д, J=6,52 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,18 (т, J=7,46 Гц, 1 H, 1'-H), 5,30 (т, J=5,40 Гц, 1 H, 5'-OH), 4,19 (м, 1 H, 3'-H), 4,06 (м, 4H, 10,13-H), 2,90 (м, 1 H, 4'-H), 2,81 (м, 1 H, 5'a-H), 2,66 (м, 1 H, 5'b-H), 1,24 (т, J=12,91 Гц, 6H, 11,14-H)

Масс-спектр производного 9: MS (ESI+) m/z: [M+H⁺] для C₁₃H₂₀F₂N₃O₇P: вычислено 399,1 найдено 400, [M+Na⁺] для C₁₃H₂₀F₂N₃O₇PNa: вычислено 422,08; найдено 422,1, [M+K⁺] для C₁₃H₂₀F₂N₃O₇PK: вычислено 438,06 найдено 437,9.

Производное 10

¹H-ЯМР производного 10: (500 МГц, ДМСО-d6, 25°C): δ=8,75 (с, 1 H, 7-NH), 8,13 (с, 2 H, 9,10-H), 7,94 (д, J=7,63 Гц, 1 H, 5-H), 6,34 (широкий, 1 H, 3'-OH), 6,10 (т, J=15,19 Гц, 1 H, 1'-H), 5,99 (д, J=7,66 Гц, 1 H, 6-H), 4,15 (м, 1 H, 3'-H), 2,91 (м, 1 H, 4'-H), 2,86 (м, 1 H, 5'a-H), 2,77 (м, 1 H, 5'b-H).

Производное 11

¹H-ЯМР производного 11: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,03 (с, 1 H, 7-NH), 8,68 (с, 1 H, 12-H), 8,65 (с, 1 H, 19-H), 8,28 (д, J=7,60 Гц, 1 H, 6-H), 7,78 (д, J=8,50 Гц, 1 H, 23-H), 7,15 (д, J=7,60 Гц, 1 H, 5-H), 6,94 (дд, J=8,50, 2,20 Гц, 1 H, 22-H), 6,88 (д, J=2,20 Гц, 1 H, 20- H), 6,35 (д, J=6,50 Гц, 1 H, 3'-OH), 6,19 (т, J=7,50 Гц, 1 H, 1'-H), 5,39 (с, 2 H, 10-H), 5,34 (т, J=5,50 Гц, 5'-OH), 4,22 (м, 1 H, 3'-H), 2,92 (м, 1 H, 4'-H), 2,84 (м, 1 H, 5'a-H), 2,69 (м, 1 H, 5'b-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 11: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=164,30 (C4), 162,58 (C2'), 156,77 (C15), 155,61 (C17), 154,76 (C2), 152,71 (C8), 145,51 (C6), 142,68 (C11), 137,29 (C19), 131,76 (C23), 126,85 (C12), 120,12 (C14), 115,1 (C22), 111,17 (C18), 102,91 (C20), 95,65 (C5), 84,81 (C1'), 81,69 (C4'), 69,07 (C3'), 59,49 (C5'), 58,91 (C10) м.д.

Фигура 7. Результаты экспериментов конфокальной микроскопии производного 11 в клетках HeLa. На фигуре 7 показано, что производное 11 не проникает в клетки из-за его высокополярного характера. Затем авторы изобретения ацетилировали производное 11, чтобы усилить его липофильный характер. Такой же эксперимент был проведен с ацетилированной формой. Результаты показаны на фигуре 8.

Производное 12

¹H-ЯМР производного 12: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,07 (с, 1H, 7-NH), 8,75 (с, 1H, 12-H), 8,67 (с, 1H, 19-H), 8,09 (д, J=7,70 Гц, 1 H, 6-H), 7,99 (д, J=8,50 Гц, 1 H, 23-H), 7,30 (д, J=7,60 Гц, 1H, 5-H), 7,30 (д, J=8,55 Гц, 1 H, 22-H), 6,32 (т, J=8,55 Гц, 1H, 1'-H), 5,46 (м, 1H, 3'-H), 5,26 (с, 2H, 10-H), 3,41 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,35 (м, 1H, 5'b-H), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,12 (с, 3H, 26-H), 2,07 (с, 3H, 8'-H) м.д.

¹³C-ЯМР производного 12: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,30 (C4), 163,58 (C2'), 156,77 (C15), 155,61 (C17), 153,76 (C2), 153,71 (C8),135,6 (C12), 126,9 (C19), 147,2(C6), 131,5 (C23), 120,7 (C5), 97,1 (C22), 86,2 (C1'), 71,6 (C3'), 57,8 (C10), 76,7 (C4'), 63,1 (C5'), 21,1 (C11'), 25,2 (C26), 21,6 (C8') м.д.

Фигура 8. Результаты экспериментов конфокальной микроскопии производного 12 в клетках HeLa. На фигуре 8 оказан сигнал флуоресценции внутри клеток. Это означает, что ацетилирование производного 11 увеличивает его способность проникать в клетки и одновременно расщепляются ацетильные группы. Не желая быть связанными теорией, деацетилирование осуществляли ферментами эстеразы, которые обычно обнаруживаются в более высоких уровнях в раковых клетках (по сравнению с нераковыми клетками). Авторы настоящего изобретения считают, что производное 12 имеет терапевтический характер (терапия и диагностика). Флуоресценция при ацетилировании фенольной гидроксильной группы гасится из-за нарушения механизма ICT (Internal Charge Transfer). После расщепления ферментами эстеразы флуоресценция восстанавливается, что подтверждается конфокальными экспериментами.

Производное 13

¹H-ЯМР производного 13: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,88 (с, 1H, 7-NH), 8,06 (д, J=7,84 Гц, 1H, 6-H), 7,15 (д, J=7,51 Гц, 1H, 5-H), 6,30 (т, J=16,14 Гц, 1H, 1'-H), 5,44(м, 1H, 3'-H), 3,45(м, 1H, 4'-H), 3,37(м, 1H, 5'a-H), 3,34(м, 1H, 5'b-H), 3,16 (кв, J=21,2Гц, 2H, 10-H), 2,16(с, 3H, 11'), 2,05(с, 3H, 8'), 1,23 (с, 3H, 11-H).

¹³C-ЯМР производного 13: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,3 (C4), 153,99 (C2), 153,04 (C8), 145,19 (C2'), 147,5 (C6), 96,5 (C5), 85,9 (C1'), 71,6 (C3'), 76,7(C4'), 62,9(C5'), 62,12 (C10), 20,9 (C11'), 21,25 (C8'), 15(C11).

Масс-спектр производного 13: MS (ESI-) m/z: [M-H]- для C₁₆H₁₉F₂N₃O₈: вычислено 419,34 найдено 418,11, [M+Cl-] C₁₆H₁₉F₂N₃O₈Cl: вычислено 453,30 найдено 452,07.

Производное 14

1H-ЯМР производного 14: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,89 (с, 1H, 7-NH), 8,05 (д, J=7,71 Гц, 1H, 6-H), 7,14 (д, J=7,35 Гц, 1H, 5-H), 6,30 (т, J=15,96 Гц, 1H, 1'-H), 5,45 (м, 1H, 3'-H), 3,43 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,33(м, 1H, 5'b-H), 3,12 (т, J=13,27 Гц, 2H, 10-H), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,06 (с, 3H, 8'-H), 1,59 (м, 2H, 11-H), 1,35 (м, 2H, 12-H), 0,9 (т, J=13,34 Гц, 3H, 13-H).

¹³C-ЯМР производного 14: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,38 (C4), 153,88 (C2), 153,18 (C8) 123,9 (C2'), 146,5 (C6), 95,6 (C5), 85,8 (C1'), 71,3 (C3'), 76,2 (C4'), 63,0 (C5'), 65,6 (C10), 21,1 (C11'), 21,3 (C8'), 30,9 (C11), 19,14 (C12), 13,19 (C13).

Масс-спектр производного 14: MS (ESI+) m/z: [M+H+] для C₁₈H₂₃F₂N₃O₈: вычислено 447,39 найдено 448,8, [M+Na+] для C₁₈H₂₃F₂N₃O₈Na: вычислено 470,37 найдено 470,7, [M+K+] для C₁₈H₂₃F₂N₃O₈K: вычислено 486,35 найдено 486,8.

Производное 15

1H-ЯМР производного 15: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,14 (с, 1H, 7-NH), 8,14 (д, J=7,37 Гц, 1H, 6-H), 7,18 (д, J=7,55 Гц, 1H, 5-H), 6,38 (т, J=16,8 Гц, 1H, 1'-H), 5,50 (м, 1H, 3'-H), 3,44 (м, 1H, 4'-H), 3,41 (м, 1H, 5'a-H), 3,36 (м, 1H, 5'b-H), 3,39 (м, 2H, 10-H), 3,85 (т, J=10,25 Гц, 11-H), 2,17 (с, 3H, 11'-H), 2,08 (с, 3H, 8'-H).

¹³C-ЯМР производного 15: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,3 (C4), 153,82 (C2), 153,68 (C8), 129,89 (C2'146,5 (C6), 96,3 (C5), 85,9 (C1'), 71 (C3'), 77 (C4'), 63,2(C5'), 66 (C10), 42,9 (C11), 20,9 (C11'), 21,4 (C8').

Масс-спектр производного 15: MS (ESI-) m/z: [M-H-] для C₁₆H₁₈ClF₂N₃O₈: вычислено 452,08 найдено 452,07, [M+Cl-] для C₁₆H₁₈ClF₂N₃O₈Cl: вычислено 488,04 найдено 488,04.

Производное 16

¹H-ЯМР производного 16: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=8,09 (д, J=7,92 Гц, 1H, 6-H), 7,38 (д, J=7,65 Гц, 1H, 5-H), 6,35 (т, J=16,67 Гц, 1H, 1'-H), 5,44 (м, 1H, 3'), 3,45 (м, 2H, 11-H), 3,41 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,34 (м, 1H, 5'b-H), 3,07 (т, J=15,08 Гц, 2H, 10-H), 2,17 (с, 3H, 11'-H), 2,07 (с, 3H, 8'-H).

¹³C-ЯМР производного 16: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=162,0 (C4), 155,03 (C8), 153,82 (C2), 123,89 (C2') 145,9 (C6), 93,9 (C5), 85,4 (C1'), 71 (C3'), 62,6 (C11), 76,4 (C4'), 62,3 (C5'), 43,1 (C10), 20,9 (C11'), 20,2 (C8').

Масс-спектр производного 16: MS (ESI+) m/z: [M+Na⁺] для C₁₆H₁₇F₂N₃O₈Na: вычислено 440,3 найдено 440,08, [2M+Na⁺] для [2C₁₆H₁₇F₂N₃O₈] Na: вычислено 857,62 найдено 857,18.

Производное 17

1H-ЯМР производного 17: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,46 (с, 1H, 7NH), 8,13 (д, J=7,60 Гц, 1H, 6-H), 7,12 (д, J=7. 47 Гц, 1H, 5-H), 6,32 (т, J=17,36 Гц, 1H, 1'-H), 5, 96 (с, 2H, 10-H), 5,44 (м, 1H, 3'H), 3,45 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,36 (м, 1H, 5'b-H), 2,17 (с, 3H, 11'-H), 2,07 (с, 3H, 8'-H) м.д.

Производное 18

¹H-ЯМР производного 18: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,12 (с, 1H, 7-NH), 8,08 (д, J=7,65 Гц, 1H, 6-H), 7,12 (д, J=7,21 Гц, 1H, 5-H), 6,30 (т, J=16,62 Гц, 1H, 1'H), 5,43 (м, 1H, 3'-H), 3,79 (д, J=2,65 Гц, 2H, 10-H), 3,45 (м, 1H, 4'), 3,41 (м, 1H, 5'a-H), 3,34 (м, 1H, 5'b-H), 3,6 (т, J=3,70 Гц), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,06 (с, 3H, 8'-H).

¹³C-ЯМР производного 18: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,20 (C4), 153,81 (C2), 153,31 (C8), 123,93 (C2'), 79,17 (C11), 149,9 (C6), 96,8 (C5), 86,6 (C1'), 71,4 (C3'), 54 (C10), 76,6 (C4'), 63,4 (C5'), 78,9 (C12), 20,7 (C11'), 20,8 (C8').

Масс-спектр производного 18: MS (ESI+) m/z: [M+H+] для C₁₇H₁₇F₂N₃O₈: вычислено 430,33 найдено 430,8, [M+Na+] для C₁₇H₁₇F₂N₃O₈Na: вычислено 452,3 найдено 452,6.

Производное 19

¹H-ЯМР производного 19: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,93 (с, 1H, 7-NH), 8,04 (д, J=7,88 Гц, 1H, 6-H), 7,84 (д, J=7,94 Гц, 1H, 15-H), 7,77 (д, J=7,44 Гц, 1H, 18-H), 7,69 (т, J=15,37 Гц, 1H, 16-H), 7,48 (т, J=13,38 Гц, 1H, 17-H), 7,06 (д, J=7,89 Гц, 5-H), 6,31 (т, J=15,72 Гц, 1'-H), 5,43 (м, 1H, 3'H), 3,45 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,33 (м, 1H, 5'b-H), 3,32 (м, 2H, 10-H), 3,51 (кв, J=17,64 Гц, 1H, 11-H), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,06 (с, 3H, 8'-H), 1,31 (д, J=7,3 Гц, 1H, 12-H).

¹³C-ЯМР производного 19: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,17 (C4), 153,78 (C2), 153,86 (C8) 137,31 (C13), 123,46 (C14), 123,74 (C2'), 146,8 (C6), 123,51 (C15), 129,43 (C18), 133,65 (C16), 128,38 (C17), 95,7 (C5), 85,2 (C1'), 71,3 (C3'), 76,3 (C4'), 63,2 (C5'), 33,3 (C11), 21,1 (C11'), 21,5 (C8'), 18,5 (C12).

Производное 20

¹H-ЯМР производного 20: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,33 (с, 1H, 7-NH), 8,11 (д, J=7,91, 1H, 6-H), 7,74 (с, 1H, 13-H), 7,40 (с, 1H, 16-H), 7,16 (д, J-7,19 Гц, 1H, 5-H), 6,33 (т, J=16,41 Гц, 1H, 1'-H), 5,53 (с, 2H, 10-H), 5,45 (м, 1H, 3'-H), 3,45 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,34 (м, 1H, 5'b-H), 3,96 (с, 3H, 18-H), 3,88 (с, 3H, 20-H), 2,17 (с, 3H, 11'-H), 2,07 (с, 3H, 8'-H).

¹³C-ЯМР производного 20: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=163,26 (C4), 153,8 (C2), 153,52 (C15), 153,42 (C8), 148,64 (C14) 139,84 (C12), 127,52 (C11), 123,9 (C2'), 147,3 (C6), 109,1 (C13), 111,3 (C16), 95,9 (C5), 85,7 (C1'), 63,2 (C10), 71,5 (C3'), 76,6 (C4'), 63,1 (C5'), 57,1 (C18), 56,8 (C20), 20,8 (C11'), 21,23 (C8').

Масс-спектр производного 20: MS (ESI+) m/z: [M+H+] для C₂₃H₂₄F₂N₄O₁₂: вычислено 587,46 найдено 587,14, [2M+H+] для 2[C₂₃H₂₄F₂N₄O₁₂]: вычислено 1173,92 найдено 1173,28 [2M+K+] для 2[C₂₃H₂₄F₂N₄O₁₂] K: вычислено 1211,88 найдено 1211,23.

Производное 21

¹H-ЯМР производного 21: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=10,92 (с, 1H, 7-NH), 8,06 (д, J=7,31 Гц, 6-H), 7,14 (д, J=7,76 Гц, 1H, 5-H), 6,30 (т, J=16,44 Гц, 1H, 1'-H), 5,44 (м, 1H, 3'-H), 3,44 (м, 1H, 4'-H), 3,40 (м, 1H, 5'a-H), 3,34 (м, 1H, 5'b-H), 3,91 (д, J=6,85 Гц, 2H, 10-H), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,06 (с, 3H, 8'-H), 1,90 (м, 1H, 11-H), 0,91 (д, J=6,6 Гц, 6H, 12,13-H).

Производное 22

¹H-ЯМР производного 22: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=11,05 (с, 1H, 7-NH), 8,03 (д, J=7,74 Гц, 1H, 6-H), 7,32 (д, J=7,75 Гц, 1H, 5-H), 6,31 (т, J=16,59 Гц, 1H, 1'-H), 5,45 (м, 1H, 3'), 3,44 (м, 1H, 4'-H), 3,4 (м, 1H, 5'a-H), 3,34 (м, 1H, 5'b-H), 2,16 (с, 3H, 11'-H), 2,12 (с, 3H, 9-H), 2,06 (с, 3H, 8'-H).

¹³C-ЯМР производного 22: (500 МГц, ДМСО-d₆, 25°C): δ=146,7 (C6), 96,8 (C5), 85,7 (C1'), 71,1 (C3'), 76,5 (C4'), 63,1 (C5'), 25,2(C9), 21,2 (C11'), 21,4 (C8').

Оценка биологической активности

Биологическую активность производного гемцитабина (которое можно назвать аналогами), описанного выше, оценивали в двух анализах:

1. Анализ роста клеток с использованием анализа SRB в клеточных линиях A549/WT, SW1573/WT, PANC-01 и BXPC-3.

2. Анализ МТТ в клеточной линии рака мочевого пузыря человека Т-24.

1. Анализ клеточного роста

Были исследованы следующие клеточные линии:

A549/WT - клеточная линия дикого типа аденокарциномы легкого человека (1),

SW1573/WT - клеточная линия дикого типа немелкоклеточного рака легких человека (2),

PANC-01 - клеточная линия рака поджелудочной железы человека (3),

BXPC-3 - эпителиальные клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека (4).

Фигура 9. Значения IC₅₀ 4-(N)-ацильных и 4-N-фосфорильных производных в четырех различных клеточных линиях.

Таблица 4: Значения IC₅₀ некоторых производных 4-N-ацила и 4-N-фосфорила гемцитабина в четырех различных клеточных линиях

IC₅₀ (мкМ) Производное A549/WT SW 1573/WT PANC-01 BXPC-3 Гемцитабин 0,018 0,011 0,052 0,009 3A 0,95 0,61 3 0,5 4 0,1 0,1 0,045 0,1 6 0,5 0,43 1,6 0,34 2 0,7 0,46 2,45 0,34 1 1,6 1,15 3,9 0,86 7 0,46 0,44 1,5 0,23 11 0,43 0,42 1,6 0,2 3B 0,16 0,1 0,38 0,1 9 0,4 0,24 0,82 0,19 5 0,45 0,38 1,85 0,24 8 0,24 0,17 0,48 0,15 10 0,016 0,014 0,055 0,014

Дипиридамол подавляет захват аденозина тромбоцитами и эндотелиальными клетками эритроцитов in vitro и in vivo. Таким образом, авторы настоящего изобретения использовали дипиридамол в качестве ингибитора переносчиков нуклеозидов опухолевых клеток для наблюдения за поведением описанных в настоящее время производных гемцитабина.

Из IC₅₀ каждого соединения в присутствии дипиридамола путем деления его на IC₅₀ каждого соединения в отсутствие дипиридамола авторы настоящего изобретения рассчитали соотношение, которое сравнивает эффективность аналогичного присутствия дипиридамола.

Соотношение=IC₅₀ в присутствии дипиридамола/IC₅₀ в отсутствие дипиридамола

Фигура 10. Соотношение IC₅₀ 4-N-ацильных и 4-N-фосфорильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях.

Таблица 5: Значения соотношения IC₅₀ 4-N-ацильных и 4-N-фосфорильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях

Производное A549/WT SW 1573/WT PANC-01 BXPC-3 Гемцитабин 15 22,7 3,4 26,6 3A 10,5 40,9 0,6 27 4 6,3 10 22 4,5 6 11 11 4 13,1 2 3,4 8 2,4 3,7 1 16,2 21 4,1 23,2 7 14,2 11 3,3 13,9 11 11 11,9 4,6 25 3B 18,1 25 23 24 9 6,2 10 3 13 5 11,1 13 2,7 23 8 10,4 14 4,2 25 10 41 50 123 50

Фигура 11. Значения IC₅₀ ацетилированных 4-N-ацильных производных в четырех клеточных линиях.

Таблица 6: Значения IC₅₀ (мкМ) ацетилированных 4-N-ацильных производных в четырех клеточных линиях

Производное A549/WT SW 1573/WT PANC-01 BXPC-3 Гемцитабин 0,015 0,0096 0,031 0,013 22 0,4 0,26 3,7 0,45 12 0,22 0,16 0,9 0,13 18 0,9 0,61 6,6 0,72 14 3,1 2,8 6,5 1,35 17 2 0,14 0,7 0,095 13 6,3 6,8 25 5 20 0,62 0,57 3,9 0,6 19 1,6 1,15 8 0,77 15 3,7 4 10 3 21 8 4,3 25 3,2 16 6,2 4,2 25 5

Фигура 12. Соотношение IC₅₀ ацетилированных 4-N-ацильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях.

Таблица 7: Значения соотношения IC₅₀ ацетилированных 4-N-ацильных производных в присутствии дипиридамола по сравнению с его отсутствием в четырех клеточных линиях

Производное A549/WT SW 1573/WT PANC-01 BXPC-3 Гемцитабин 18 1 7,4 24,3 22 4 13,4 1,6 4,1 12 2,2 3,75 1,6 3,1 18 6,5 12,7 3,1 10,8 14 0,83 1,4 0,9 1,77 17 2,4 3,9 1,8 3,5 13 2,85 3,6 1 2,8 20 7,5 17,54 4 4,6 19 15 3,5 1,1 8 15 3,7 4,5 2,5 3,3 21 2,6 3,7 1 2,8 16 2,7 3,8 1 3,4

Чем ниже значение IC₅₀, тем сильнее цитотоксическое производное. Более того, чем ниже соотношение для дипиридамола, тем меньше зависимость захвата производного в клетку от переносчиков нуклеозидов (NT).

Для линии клеток A549/WT три более мощных цитотоксических неацетилированных производных составляют 10>4>3B со значениями IC₅₀ 0,016, 0,1 и 0,16, соответственно. В этой конкретной клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,018.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 2<9<4 со значениями соотношений 3,4, 6,2 и 6,3, соответственно. Значение соотношения для гемцитабина составляет 15.

Для линии клеток SW 1573/WT три более мощных цитотоксических неацетилированных производных составляют 10>4≥3B со значениями IC₅₀ 0,014, 0,1 и 0,1, соответственно. В этой конкретной клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,011.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 2<4,9<6,7 со значениями соотношений 8, 10 и 11, соответственно. Значение соотношения для гемцитабина составляет 22,7.

Для линии клеток PANC-01 три наиболее мощных цитотоксических неацетилированных производных составляют 4>10>>3B со значениями IC₅₀ 0,045, 0,055 и 0,38, соответственно. В этой конкретной клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,052.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 3A<2<5 со значениями 0,6, 2,4 и 2,7, соответственно. Значение для гемцитабина составляет 3,4.

Для линии клеток BXPC-3 три наиболее мощных цитотоксических неацетилированных производных составляют 10>4≥3B со значениями IC₅₀ 0,014, 0,1 и 0,1, соответственно. В этой клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,009.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 2<4<9 со значениями 3,7, 4,5 и 13, соответственно. Значение для гемцитабина составляет 26,6.

Для линии клеток A549/WT три более мощных цитотоксических ацетилированных производных составляют 12>22>20 со значениями IC₅₀ 0,22, 0,4 и 0,62, соответственно. В конкретной клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,015.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 14<12<17<21 со значениями соотношений 0,83, 2,2, 2,4 и 2,6, соответственно. Значение для гемцитабина составляет 18.

Для линии клеток SW 1573/WT три наиболее мощных цитотоксических ацетилированных производных составляют 17>12>22 со значениями IC₅₀ 0,14, 0,16 и 0,26, соответственно. В конкретной клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,0096.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 14<19<17 со значениями соотношений 1,4, 3,5, и 3,6, соответственно. Значение соотношения для гемцитабина составляет 1.

Для линии клеток PANC-01 три наиболее мощных цитотоксических ацетилированных производных составляют 17>12>22 со значениями IC₅₀ 0,7, 0,9 и 3,7, соответственно. В этой клеточной линии значение IC₅₀ для гемцитабина составляет 0,031.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 14 <13,16,21<19 со значениями соотношений 0,9, 1 и 1,1, соответственно. Значение соотношения для гемцитабина составляет 7,4.

Для линии клеток BXPC-3 три наиболее мощных цитотоксических ацетилированных производных составляют 17>12>22 со значениями IC₅₀ 0,095, 0,13 и 0,45, соответственно. В этой клеточной линии значение IC₅₀ гемцитабина составляет 0,013.

Кроме того, нижняя зависимость от NT показала производные 14<13,21<12 со значениями 1,77, 2,8 и 3,1, соответственно. Значение соотношения для гемцитабина составляет 24,3.

2. MTT анализ

Жизнеспособность клеток рака мочевого пузыря Т-24 после лечения производными гемцитабина оценивали с помощью анализа МТТ. Раковые клетки T24 культивировали в среде DMEM (Gibco) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при температуре 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO₂.

Для анализа МТТ 5000 или 10000 клеток высевали в трех экземплярах в 96-луночные планшеты. Исходные растворы каждого производного готовили в ДМСО/EtOH (1:1 об./об.). Затем клетки обрабатывали и инкубировали со 100 мкМ каждого соединения в течение 24 или 48 часов. После завершения времени инкубирования в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора МТТ (5 мг/мл в буфере PBS) и инкубировали в течение 4 часов. Наконец, чтобы остановить реакцию, из каждой лунки удаляли супернатант и добавляли 100 мкл раствора стоп-смеси (20% SDS в 50% диметилформамиде в воде). Планшет оставляли в темноте в течение 2 часов, и оптическую плотность измеряли при 540 нм с помощью микропланшетного ридера ELISA (Awareness Technology Inc.) со ссылкой на 630 нм. % Жизнеспособности клеток для каждого соединения рассчитывали относительно поглощения необработанных клеток (контроль).

Фигура 13. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (5000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 24-часового инкубирования, определенной с помощью анализа МТТ.

Фигура 14. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (5000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 48-часового инкубирования, определенной с помощью анализа МТТ.

Проводили две серии экспериментов при концентрациях 100 мкМ, и абсорбцию формазана измеряли через 24 и 48 часов.

Для концентрации 100 мкМ через 24 часа авторы настоящего изобретения наблюдали значительное ингибирование роста клеток с большей эффективностью, чем исходным лекарственным средством гемцитабином, порядок производных был 4>11>17. Для той же концентрации через 48 часов очевидный порядок эффективности был 17>4>11, а затем гемцитабин.

Фигура 15. График, показывающий жизнеспособность (%) клеток Т-24 (10000 клеток/лунку), обработанных 100 мкМ производных гемцитабина, после 48-часового инкубирования, определенной с помощью анализа МТТ.

Другой эксперимент был проведен с анализом МТТ, где соединения инкубировали в течение 48 часов при концентрации производного 100 мкМ, при этом количество клеток, засеянных на лунку, составляло 10000. Было обнаружено, что наиболее эффективными производными являются 14, 4 и 11.

Концентрационно-зависимые эффекты выбранных производных

Наконец, после выбора наиболее эффективных производных авторы настоящего изобретения дополнительно исследовали влияние концентрации на жизнеспособность клеток в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкМ. Клетки инкубировали с производными в течение 48 ч. Выбранными производными были 4, 17 и 11.

Фигура 16. Цитотоксичность наиболее эффективных производных гемцитабина при различных концентрациях в линии клеток Т-24.

Стабильность 4-N-этилкарбамата в плазме крови человека

Экспериментальные заметки:

1. Конечная концентрация 4-N-этилкарбамата гемцитабина в плазме человека составляла 0,1 мкМ.

2. Каждый образец исследовали в трех экземплярах.

3. Временные точки во время инкубирования, в которых авторы настоящего изобретения оценивали концентрацию производного, были: 0, 1, 2, 4, 18 и 24 часа (фигура 16). Производное было стабильным после 24 часов инкубирования (оставалось 96%).

4. Калибровочная кривая была построена для количественного определения концентрации производного в плазме человека (фигура 17). Использовали пять калибраторов в диапазоне концентраций 0,01, 0,05, 0,1, 0,2 и 0,4 мкМ. Коэффициент детерминации (r²) был рассчитан как 0,999418.

5. Точность с точки зрения правильности и прецизионности оценивалась путем анализа трех повторов при трех уровнях концентрации (низкий: 0,025 мкМ, средний: 0,08 мкМ и высокий: 0,3 мкМ). Правильность выражали как процентную разницу между расчетными концентрациями и теоретически приготовленными концентрациями, а точность выражали как CV%.

6. LOQ был определен при 0,01 мкМ с правильностью и точностью 8,49% и 9,66%, соответственно, и в допустимых пределах для LOQ (<20%).

7. Внутридневная и межсуточная достоверность и точность оказались ≤10,2 и ≤12,7 и находились в допустимых пределах (<15%).

Фигура 17. Стабильность этил-(4-N-гемцитабин)карбамата (производное 1) in vitro после 24-часового инкубирования в плазме человека при температуре 37°C.

Фигура 18. Калибровочная кривая этил-(4-N-гемцитабин)карбамата (производное 1).

Выводы

Из приведенных выше данных можно сделать некоторые выводы, а также корреляцию структуры активности для пролекарств 4-(N)-ацил и 4-N-фосфорил гемцитабина и их 3',5'-ацетильных производных.

Производные 10 и 4 в отличие от неацетилированных производных показали значительную цитотоксическую активность со значениями IC₅₀ ниже, чем у гемцитабина, в присутствии ингибитора захвата аденозина, дипиридамола. Таким образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что присутствие фосфатной и хлорметилкарбаматной группы в 4-N положении гемцитабина усиливает действие лекарственного средства при его проникновении в клетки.

Авторы настоящего изобретения по соотношению цитотоксичности обнаружили, что в присутствии дипиридамола профиль активности производных значительно изменяется. Об этом свидетельствует, по крайней мере, различие в активности производного 10. Значение отношения для производного 10 продемонстрировало действие, аналогичное действию производного 2, которое несет н-бутильную группу, увеличивая липофильный характер соединения. Стабильную активность давали производные, имеющие более липофильный характер, и это демонстрируется во всех испытанных клеточных линиях эффектами соединения 9, которое является предшественником относительно гидрофобного производного молекулы 10. Производное 4 не имело такого высокого коэффициента. С производным 4 был показан хороший ответ на суспензию переносчика нуклеозидов; это предполагает, что присутствие атома хлора может играть роль в сочетании с небольшой углеродной цепью, которой он обладает.

На основании тех же данных экспериментов с описанными в настоящем документе ацетилированными производными авторы настоящего изобретения полагают, что повышение липофильности помогает улучшить профиль пролекарств гемцитабина. Значения IC₅₀ ацетилированных бифункциональных пролекарств сопоставимы с гемцитабином. Авторы настоящего изобретения наблюдали значительное повышение активности в присутствии дипиридамола, что подтверждает вышеупомянутую точку зрения об увеличении липофильности и действия молекулы.

Эксперименты с МТТ при различных концентрациях и времени воздействия подтвердили вышеуказанные результаты о корреляции активности 4-N-ацильных пролекарств с:

a) наличием короткой углеродной цепи в участке 4-N;

b) наличием атома хлора; и,

c) регулируемым и не чрезмерным повышением липофильности.

Авторы настоящего изобретения не наблюдали такого же поведения у терапевтической вещества (производного 12) в этой клеточной линии.

При использовании в настоящем описании и формуле изобретения термины «содержит» и «содержащий» и их варианты означают, что указанные функции, стадии или целые числа включены. Термины не должны толковаться как исключающие наличие других функций, стадий или компонентов.

Описанные в настоящем документе результаты в отношении производных гемцитабина применимы также к другим производным нуклеозидов, например производным цитидина, соответствующим формулам (IIIB) и (IIIBP).

Признаки, описанные в предшествующем описании, или в следующей формуле изобретения, или показанные на прилагаемым чертежах, выраженные в их конкретных формах или в терминах средств для выполнения описанной функции, или способа или процесса для достижения описанного результата, в зависимости от обстоятельств, по отдельности или в любой комбинации таких признаков могут быть использованы для осуществления изобретения в его различных формах.

Хотя были описаны некоторые примеры вариантов осуществления изобретения, объем прилагаемой формулы изобретения не предназначен для ограничения только этими вариантами осуществления. Формула изобретения должна толковаться буквально, целенаправленно и/или включать эквиваленты.

Изобретение относится к способу получения 4(N)-замещенных производных соединений формулы (IB), где способ включает взаимодействие соединения формулы (IB) с хлорформиатом формулы (II) с получением соединения формулы (IIIB), где R₁ выбран из структур, указанных в формуле изобретения; R_2B представляет собой фрагменты, указанные в формуле изобретения; R_3B представляет собой водород или галоген; и R_4B представляет собой водород; где хлорформиат формулы (II) представлен в способе в количестве от 0,3 до 0,7 эквивалентов (по молям). Также изобретение относится к способу получения соединения формулы (III), где способ включает взаимодействие гемцитабина (I) с хлорформиатом формулы (II) с получением соединения формулы (III), где R₁ выбран из радикалов, указанных выше. Также изобретение относится к соединению формулы (IV) и способу его получения, где n обозначает 0,1 или 2, где способ включает получение соединения (III) с последующей стадией взаимодействия соединения (III) в N,N-диизопропилэтиламине с образованием соединения формулы (IV). Также изобретение относится к фармацевтической композиции на основе соединения формулы (IV) и применению соединения формулы (IV) или фармацевтической композиции для лечения злокачественных новообразований. Технический результат - лечение злокачественных новообразований, которые включают рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 табл., 18 ил.

1. Способ получения 4-(N)-замещенных производных соединений формулы (IB) или их фармацевтически приемлемых солей, где способ включает:

взаимодействие соединения формулы (IB):

с хлорформиатом формулы (II):

с получением соединения формулы (IIIB):

где:

R₁ выбран из группы, состоящей из: C₁-C₆ алкила, C₁-C₆ галогеналкила, C₂-C₆ алкинила, и

R_2B представляет собой , или

R_3B представляет собой водород или галоген; и

R_4B представляет собой водород;

где хлорформиат формулы (II) представлен в способе в количестве от 0,3 до 0,7 эквивалентов (по молям).

2. Способ по п.1, где галоген в каждом случае представляет собой Cl.

3. Способ получения 4-(N)-замещенных производных гемцитабина или их фармацевтически приемлемых солей, где способ включает:

взаимодействие гемцитабина (I):

с хлорформиатом формулы (II):

с получением соединения формулы (III):

где R₁ выбран из группы, состоящей из: C₁-C₆ алкила, C₁-C₆ галогеналкила, C₂-C₆ алкинила, , , .

4. Способ по любому из пп.1 или 2, где R_3B представляет собой галоген, R_4B представляет собой водород, R₁ представляет собой -(CH₂)₄CH₃ и R_2B представляет собой

Y представляет собой водород, R₁₁ представляет собой водород, R₁₂ представляет собой гидроксил (-OH), R₉ представляет собой водород, R₁₃ представляет собой гидроксил (-OH), R₁₀ представляет собой водород, R₇ представляет собой водород, R₈ представляет собой водород и R₁₄ представляет собой водород.

5. Способ по п.4, где R_3B представляет собой F.

6. Способ по любому из пп.1-5, где способ осуществляют в одном сосуде; необязательно, где способ осуществляют в одну стадию без выделения промежуточного продукта.

7. Способ по любому из пп.1-6, где хлорформиат формулы (II) представлен в способе в количестве 0,5 эквивалентов (по молям).

8. Способ по любому из пп.1-7, где:

взаимодействие соединения формулы (IB), необязательно, гемцитабина (I), с хлорформиатом формулы (II) осуществляют в растворителе этилацетате, ацетилцианиде или смеси этилацетата и ацетилцианида; и/или

взаимодействие соединения формулы (IB), необязательно, гемцитабина (I), с хлорформиатом формулы (II) осуществляют при кипячении с обратным холодильником в течение 1-4 часов; необязательно, 3 часов; необязательно, где кипячение проводят при температуре от 70°С до 90°С или при температуре 80°С.

9. Способ получения соединения формулы (IV)

где n обозначает 0, 1 или 2,

включающий получение соединения (III):

где R₁ представляет собой хлоралкил, способом по любому из пп.1-8, и

с последующей стадией взаимодействия соединения формулы (III) в растворителе, представляющем собой N,N-диизопропилэтиламин, при кипячении, с образованием соединения формулы (IV).

10. Способ по любому из пп.1-8, где способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III) с OH-реакционно преобразующим агентом с образованием 3ʼ- и/или 5ʼ- замещенного производного соединения (III);

где способ дополнительно включает стадию взаимодействия соединения формулы (III) с уксусным ангидридом с образованием соединения формулы (V):

где Ac представляет собой -COCH₃.

11. Соединение формулы (IV):

где n обозначает 0, 1 или 2,

или его фармацевтически приемлемая соль.

12. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по п.11 и фармацевтически приемлемый носитель,

где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

13. Применение соединения по п.11 или фармацевтической композиции по п.12 в терапии при лечении злокачественного новообразования,

где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей: рак молочной железы, рак яичников, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.