СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСТОЩЕНИЯ TCRαβ КЛЕТОК Российский патент 2024 года по МПК A61K35/17 C12N5/783 A61K48/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США №62/821768, поданной 21 марта 2019 г., содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к способам истощения клеток, экспрессирующих эндогенный Т-клеточный рецептор (TCR) (например, TCRαβ), из популяции модифицированных иммунных клеток, включая клетки, содержащие химерные антигенные рецепторы (CAR).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[1] Адоптивный перенос иммунных клеток, генетически модифицированных

для распознавания антигенов, ассоциированных со злокачественными новообразованиями, является новым перспективным подходом к лечению рака (см. например, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). Иммунные клетки могут быть генетически модифицированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR) (см., например, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), и Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009), включенные в данный документ посредством ссылки). Иммунные клетки, которые содержат CAR, например, CAR-T-клетки (CAR-T), модифицированы, чтобы придать им специфичность в отношении антигена, сохраняя или повышая при этом их способность распознавать и уничтожать клетку-мишень, такую как раковая клетка. Однако возможность развития болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD) или болезни «хозяин против трансплантата» (HvGD) представляет собой существенное препятствие для безопасности или эффективности широкого применения модифицированных аллогенных CAR-T-клеток в терапии рака. Таким образом, существует потребность в разработке эффективных способов уменьшения риска GvHD и HvGD, в частности, для разных видов аллогенной терапии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[2] В данном документе описаны улучшенные способы истощения TCR⁺ клеток

(TCRαβ⁺) из популяции иммунных клеток, способы получения популяции иммунных клеток, истощенной по TCR⁺клеткам, наборы, содержащие реагенты для указанных способов, популяции TCR^- (TCRαβ^-) клеток высокой чистоты и способы лечения с применением популяций клеток, полученных с применением раскрытых способов. Например, в данном документе описаны способы, которые особенно подходят для истощения TCR⁺ клеток, которые можно применять для получения клеток, пригодных для разных видов терапии аллогенными клетками за счет уменьшения риска GvHD, и которые можно использовать в разных видах терапии, в которых применяются химерные антигенные рецепторы (например, терапия аллогенными CAR-T-клетками).

[3] Согласно одному аспекту предложен способ получения популяции иммунных клеток, истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, и согласно одному варианту реализации способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, от популяции иммунных клеток. Способ может дополнительно включать мечение популяции иммунных клеток антителом к CD52; и истощение иммунных клеток, меченных антителом к CD52, из популяции иммунных клеток. Кроме того, способ может дополнительно включать мечение популяции иммунных клеток антителом к CD52; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от немеченых иммунных клеток.

[4] Согласно другому аспекту предложен способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, и согласно одному варианту реализации способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3; отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, от немеченых иммунных клеток; и сбор немеченых иммунных клеток с получением посредством этого популяции иммунных клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

[5] Согласно дополнительному аспекту предложен способ получения популяции иммунных клеток, истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, и согласно одному варианту реализации способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD52; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от популяции иммунных клеток.

[6] Согласно еще одному дополнительному аспекту предложен способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, и согласно одному варианту реализации способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD52; отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от немеченых иммунных клеток; и сбор немеченых иммунных клеток с получением посредством этого популяции иммунных клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

[7] Согласно вариантам реализации антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано с биотином, и способ может дополнительно включать приведение меченых клеток в контакт с агентом, который специфично распознает биотин. Агент, который специфично распознает биотин, может быть выбран из группы, состоящей из антитела к биотину, авидина и стрептавидина, и может быть конъюгирован с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной. Согласно другим вариантам реализации антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 непосредственно конъюгировано с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной.

[8] В способах, в которых применяется отделение, указанное отделение может быть достигнуто с использованием одного из магнитного отделения или отделения с помощью акустической волны.

[9] Согласно вариантам реализации иммунные клетки согласно раскрытым способам представляют собой аллогенные иммунные клетки, и иммунные клетки могут быть генетически модифицированы для уменьшения или устранения экспрессии эндогенного TCR, эндогенного CD52 или как эндогенного TCR, так и эндогенного CD52, причем уменьшение или устранение экспрессии эндогенного TCR или эндогенного CD52 или как эндогенного TCR, так и эндогенного CD52 достигается с использованием TALEN, CRISPR/Cas9, нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), MegaTAL, мегануклеазы, Cpf1, гомологичной рекомбинации или одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (ssODN).

[10] Иммунные клетки согласно раскрытым способам могут представлять собой сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор.

[11] Согласно некоторым вариантам реализации популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит не более 1,0% TCR⁺ клеток, не более 0,9% TCR⁺ клеток, не более 0,8% TCR⁺ клеток, не более 0,7% TCR⁺ клеток, не более 0,6% TCR⁺ клеток, не более 0,5% TCR⁺ клеток, не более 0,4% TCR⁺ клеток, не более 0,3% TCR⁺ клеток, не более 0,2% TCR⁺ клеток или не более 0,1% TCR⁺ клеток. Согласно некоторым вариантам реализации популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит 0,01-0,001% TCR⁺ клеток непосредственно после истощения. Согласно некоторым вариантам реализации популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит 0,1-0,01% TCR⁺ клеток через 1-10 дней культивирования после истощения; согласно некоторым вариантам реализации популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит менее 0,1-1,0% TCR⁺ клеток через 1 день культивирования после истощения. Согласно некоторым вариантам реализации популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит менее 0,1-1,0% TCR⁺ клеток через 10 дней культивирования после истощения.

[12] Согласно вариантам реализации раскрытых способов иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

[13] Согласно другому аспекту предложена популяция иммунных клеток, которая истощена по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, полученная с помощью раскрытого способа.

[14] Согласно одному аспекту предложена популяция сконструированных Т-клеток, содержащая по меньшей мере 99% TCR^- клеток, предложена популяция сконструированных Т-клеток, содержащая по меньшей мере 99,9% TCR^- клеток, предложена популяция сконструированных Т-клеток, содержащая по меньшей мере 99,99% TCR^- клеток, и предложена популяция сконструированных Т-клеток, содержащая по меньшей мере 99,999% TCR^- клеток. Согласно вариантам реализации популяция Т-клеток экспрессирует химерный антигенный рецептор.

[15] Согласно другому аспекту предложен набор для истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, содержащий антитело к TCR и антитело к CD3. Набор может дополнительно содержать антитело к CD52. Согласно другому аспекту предложен набор для истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, содержащий антитело к TCR и антитело к CD52. В раскрытых наборах антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано с агентом, который специфично распознает биотин; указанный агент, который специфично распознает биотин, может быть выбран из группы, состоящей из антитела к биотину, стрептавидина и авидина. Согласно вариантам реализации агент может быть конъюгирован с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной.

[16] В раскрытых наборах антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано непосредственно с подложкой, и указанная подложка может представлять собой одно из магнитной гранулы, гранулы агарозы, направляемой акустической волной частицы, пластикового луночного планшета, стеклянного луночного планшета, керамического луночного планшета, колонки, пакета для культивирования клеток или мембраны.

[17] Кроме того, предложен способ лечения солидного или гематологического рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтического количества популяции иммунных клеток, истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, полученной с применением раскрытых способов, или популяции сконструированных Т-клеток, полученной с применением раскрытых способов.

[18] Способы, предложенные в данном документе, представляют собой значительное достижение в аллогенной терапии. Таким образом, также предложен способ лечения солидного или гематологического рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту популяции иммунных клеток, истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, полученной с применением любого из раскрытых способов, предложенных в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[19] На ФИГ. 1 изображено схематическое представление способов изготовления аллогенных CAR Τ с различными планами отдельных операций.

[20] На ФИГ. 2А изображены частоты остаточных TCR⁺ клеток в истощенных популяциях клеток в различные дни после истощения, стрелки указывают кратные изменения TCR⁺ (%) различных способов истощения (с применением различных комбинаций антител) по сравнению с контрольным способом (с применением только антитела к TCR) на День 2 после истощения по сравнению с Днем 0 после истощения.

[21] На ФИГ. 2В изображены частоты остаточных TCR⁺ клеток в истощенных популяциях клеток, стрелки указывают кратные изменения TCR⁺ (%) на день 9 после истощения по сравнению с Днем 0 после истощения между различными способами истощения по сравнению с контрольным способом.

[22] На ФИГ. 3А изображены графики проточной цитометрии для эффективности истощения TCR⁺ клеток с использованием различных антител в День 0 и День 1 после истощения, измеренной с помощью окрашивания антителом к TCR.

[23] На ФИГ. 3В изображены частоты остаточных TCR⁺ клеток в истощенных популяциях клеток в день 0 и день 1 после истощения, представленные в виде числовых столбиков.

[24] На ФИГ. 4 изображены графики проточной цитометрии, демонстрирующие частоты остаточных TCR⁺ и CD3⁺ в истощенных популяциях, детектированные с помощью одиночного или двойного окрашивания антителами к TCR и/или к CD3 в день О и день 1 после истощения.

[25] На ФИГ. 5А изображены графики проточной цитометрии частот TCR⁺, CD3⁺, CD3⁺/TCR^- и CD3/TCR⁺ в истощенных популяциях клеток, измеренных с помощью одиночного или двойного окрашивания антителами к TCR и/или к CD3 в День 1 после истощения до и после замораживания.

[26] На ФИГ. 5В изображены частоты TCR⁺ клеток в истощенных популяциях клеток, измеренные с помощью окрашивания антителом к TCR в День 1 после истощения до и после замораживания, представленные в виде числовых столбиков.

[27] На ФИГ. 5С изображены частоты CD3⁺ клеток в истощенных популяциях клеток, измеренные с помощью окрашивания антителом к CD3 в День 1 после истощения до и после замораживания, представленные в виде числовых столбиков.

[28] На ФИГ. 5D изображены частоты CD3⁺/TCR^- клеток в истощенных популяциях клеток, измеренные с помощью двойного окрашивания антителом к TCR и антителом к CD3 в День 1 после истощения до и после замораживания, представленные в виде числовых столбиков.

[29] На ФИГ. 5Е изображены частоты CD3⁺/TCR⁺ клеток в истощенных популяциях клеток, измеренные с помощью двойного окрашивания антителом к TCR и антителом к CD3 в День 1 после истощения до и после замораживания, представленные в виде числовых столбиков.

[30] На ФИГ. 6 изображены графики проточной цитометрии для частоты TCR⁺, полученные с использованием окрашивания антителом к TCR в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[31] На ФИГ. 7 изображены графики проточной цитометрии для частоты CD3⁺, полученные с использованием окрашивания антителом к CD3 в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[32] На ФИГ. 8 изображены графики проточной цитометрии для частоты двойных TCR⁺и CD3⁺ клеток, полученные с использованием окрашивания как антителом к TCR, так и антителом к CD3 в течение 10-дневного культивирования после истощения. На ФИГ. 9А изображена частота TCR⁺ клеток, полученная с использованием окрашивания антителом к TCR во время культивирования после истощения, представленная в виде числовых столбиков.

[33] На ФИГ. 9В изображена частота CD3⁺ клеток, полученная с использованием окрашивания антителом к CD3 во время культивирования после истощения, представленная в виде числовых столбиков.

[34] На ФИГ. 9С изображена частота CD3⁺/TCR^- клеток, полученная с использованием окрашивания как антителом к TCR, так и антителом к CD3 во время культивирования после истощения, представленная в виде числовых столбиков.

[35] На ФИГ. 9D изображена частота CD3⁺/TCR⁺ клеток, полученная с использованием окрашивания как антителом к TCR, так и антителом к CD3 во время культивирования после истощения, представленная в виде числовых столбиков.

[36] На ФИГ. 10А изображен статус размножения клеток в виде плотностижизнеспособных клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[37] На ФИГ. 10В изображен статус размножения клеток в виде жизнеспособности клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[38] На ФИГ. 10C изображен статус размножения клеток в виде диаметра клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[39] На ФИГ. 10D изображен статус размножения клеток в виде общей кратности размножения клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[40] На ФИГ. 11А изображены графики проточной цитометрии, демонстрирующие эффективность истощения CD52 с использованием различных антител в день 0 и день 1 после истощения, измеренную с помощью окрашивания антителом к CD52.

[41] На ФИГ. 11В изображены частоты остаточных CD52⁺ клеток в истощенных популяциях клеток в день 0 и день 1 после истощения, измеренные с помощью окрашивания антителом к CD52, представленные в виде числовых столбиков.

[42] На ФИГ. 12 изображены графики проточной цитометрии для частот остаточных CD52⁺ клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения, контролируемых с помощью окрашивания антителом к CD52.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[43] В данном документе предложены улучшенные способы надежного истощения TCRαβ⁺ клеток, которые могут минимизировать риск GVHD у пациентов, получающих терапию аллогенными CAR Т-клетками, и популяции клеток, полученные с применением раскрытых способов. Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложены способы повышения эффективности истощения TCR⁺ клеток для значительного уменьшения остаточных уровней TCR⁺ клеток в популяциях TCR^- клеток.

[44] В настоящей заявке артикли (соотв. «а» и «an» в исходном тексте на английском языке) используются для обозначения одного или более элементов. Например, ссылка на «клетку» или «антитело» означает «одну или более клеток» или «одно или более антител».

[45] В настоящей заявке термин «TCR-истощенный» при использовании по отношению к популяции клеток, полученной с применением способов, предложенных в настоящем раскрытии, означает популяцию клеток, которая содержит меньшее количество клеток, экспрессирующих эндогенный гетеродимер TCRα/β, чем популяция клеток, которая собрана у донора. Например, популяция TCR-истощенных клеток (TCRα/β истощенные клетки) может содержать 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее 1% клеток, экспрессирующих эндогенный комплекс TCRα/β.

[46] В настоящей заявке термин «TCR⁺» и «TCR», при использовании по отношению к клетке или популяции клеток, включая популяции, полученные с применением способов, предложенных в настоящем раскрытии, относится к клеткам, которые экспрессируют по меньшей мере эндогенный гетеродимер TCRα/β, несмотря на то, что на поверхности клетки может экспрессироваться один или более компонентов комплекса CD3, но необязательно.

[47] В настоящей заявке термин «TCR^-», при использовании по отношению к клетке или популяции клеток, включая популяции, полученные с применением способов, предложенных в настоящем раскрытии, относится к клеткам, в которых отсутствует по меньшей мере гетеродимер TCRα/β, несмотря на то, что на поверхности клетки может экспрессироваться один или более компонентов комплекса CD3, но необязательно.

[48] В настоящей заявке термины «антитело к TCR» и «анти-TCR», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, которое связывает и распознает только цепь TCRα человека, только цепь TCRβ человека или гетеродимер TCRα/β человека. Антитело к TCR может представлять собой мышиное, человеческое или гуманизированное антитело.

[49] В настоящей заявке термины «антитело к CD3» и «анти-CD3», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, которое связывает, распознает и связывает цепь CD3γ человека, цепь CD3δ человека, цепь CD3ζ, цепь CD3ε или комплекс CD3 человека, состоящий из двух или более компонентов нормального комплекса ε/ε/ζ/ζ/γ/δ CD3 человека. Антитело к CD3 может представлять собой мышиное, человеческое или гуманизированное антитело.

[50] Термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и включают субъектов-людей и субъектов-животных, не относящихся к человеку, а также тех, у кого официально диагностированы нарушения, тех, кто не имеет официально установленных нарушений, тех, кто получает медицинскую помощь, тех, кто подвержен риску развития нарушений и т.д.

[51] Термин «лечить» и «лечение» включает способы терапевтического лечения, способы профилактического лечения и приложения, в которых уменьшается риск развития у субъекта нарушения или другой фактор риска. Лечение не требует полного излечения нарушения и включает варианты реализации, в которых уменьшаются симптомы или основные факторы риска. Термин «предотвращать» не требует 100% устранения возможности явления. Скорее, он означает, что вероятность возникновения явления уменьшилась в присутствии соединения или способа.

[52] Продукты модифицированных аллогенных CAR-T на основе TCR^- клеток являются примером стратегии получения терапевтических средств CAR-T следующего поколения. Однако потенциальные иммунные ответы, такие как риск болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD) и болезни «хозяин против трансплантата» (HvGD), представляют собой одну из значительных проблем безопасности или эффективности для терапии аллогенными CAR-T клетками. GvHD обусловлена донорскими Т-клетками, распознающими несовпадение HLA за счет Т-клеточного αβ-рецептора (TCRαβ) и способными атаковать ткани пациента. GvHD и HvGD могут быть серьезными и даже летальными, даже в случае HLA-совпадающего донора, поскольку незначительные несоответствия все еще могут вызвать иммунный ответ.

[53] Существующие на данный момент способы удаления TCR⁺ клеток (истощение клеток TCRαβ⁺), такие как CliniMACS Prodigy® и набор реагентов TCR, основаны на применении только антитела к TCR для отделения TCR⁺ клеток (TCRαβ⁺ клеток) от TCR^- клеток (TCRαβ^- клетки) с использованием антитела к TCR и могут обеспечить 99% или более чистоту TCR^- клеток в готовом лекарственном продукте (см., например, Radestad et al, (2014) J Immunol Res, Vol 2014: 578741). Однако менее чем 1% остаточные уровни TCR⁺ клеток, присутствующих в TCR^- готовом лекарственном продукте, все еще могут представлять риск GvHD, ассоциированной с терапией аллогенными CAR-T-клетками, в частности, при высоких уровнях доз.

[54] Согласно настоящему раскрытию предложены способы получения популяции модифицированных иммунных клеток, истощенной по иммунными клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, причем раскрытый способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, от популяции модифицированных иммунных клеток.

[55] Согласно настоящему раскрытию также предложен способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, причем раскрытый способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3; отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, от немеченых иммунных клеток; и сбор немеченых иммунных клеток с получением посредством этого популяции иммунных клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR. Способ также может быть адаптирован для включения популяции иммунных клеток, меченных антителами к TCR и одним или более антителами, направленными к любой другой мишени (мишеням), представляющей интерес, отличной от CD3 (например, ГКГС1, ГКГС2, CD52 или PD1).

[56] Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложены способы истощения TCRαβ⁺ клеток, включающие приведение популяции иммунных клеток в контакт с антителом к TCR и антителом к CD3. Способ также может быть адаптирован для включения популяции иммунных клеток, меченных антителами к TCR и одним или более антителами, направленными к любой другой мишени (мишеням), представляющей интерес, отличной от CD3 (например, ГКГС1, ГКГС2, CD52 или PD1).

[57] Согласно настоящему раскрытию предложены способы получения популяции модифицированных иммунных клеток, истощенной по иммунными клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, причем раскрытый способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD52; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от популяции модифицированных иммунных клеток.

[58] Согласно настоящему раскрытию также предложен способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, причем раскрытый способ включает мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD52; отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от немеченых иммунных клеток; и сбор немеченых иммунных клеток с получением посредством этого популяции иммунных клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

[59] Согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ истощения TCRαβ⁺ клеток, включающий приведение популяции иммунных клеток в контакт с антителом к TCR и антителом к CD52. Эффективность этих способов, которая продемонстрирована в Примерах, была неожиданной на основании того факта, что CD52 и TCR физически не ассоциируются друг с другом в клетках человека, и, не ограничиваясь какой-либо теорией, следует понимать, что CD52 и TCR не связаны напрямую биологически. Соответственно, согласно другому аспекту настоящего раскрытия, раскрытые способы могут включать применение антитела к TCR и другого антитела, направленного к представляющей интерес мишени, которая обычно не ассоциирована с TCR.

[60] Согласно еще одному аспекту настоящего раскрытия предложен способ истощения TCRαβ⁺ клеток, включающий приведение популяции иммунных клеток в контакт с антителом к TCR, антителом к CD3 и антителом к CD52.

[61] В способах, описанных в данном документе, антитело к TCR и антитело к CD3 совместно применяют для истощения TCRαβ⁺ клеток, что находит особое применение для получения продукта модифицированных аллогенных CAR Τ на основе TCRαβ^- клеток. До настоящего раскрытия в клинических масштабах истощение TCR⁺ клеток в модифицированных Т-клетках (не продукт немодифицированных Т-клеток) до уровня чистоты 99,9%-99,99% TCR^- клеток, в результате которого остается 0,1%-0,01% остаточных TCR⁺ клеток, было чрезвычайно сложным и представляло проблему для разработки разных видов аллогенной терапии. Согласно настоящему раскрытию предложено решение этой проблемы.

[62] Достижение такого низкого уровня остаточных TCR⁺ клеток (например, в диапазоне 0,1%-0,01% TCR⁺ клеток, измеренных через 1 день после истощения) представляет собой значительное улучшение продуктов модифицированных аллогенных CAR Τ (например, TCRα/β^- CAR Т-клеток) и обеспечивает улучшенный клинический результат у пациентов за счет снижения вероятности GvHD.

[63] Эффективные способы уменьшения риска GvHD (и HvGD), а также повышения противоопухолевой активности могут быть особенно подходящими для изготовления эффективных, безопасных и чистых модифицированных аллогенных иммунных клеток (например, аллогенных CAR-T-клеток, экспрессирующих CAR, нацеленный на антиген рака). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего раскрытия предложены способы получения аллогенных CAR-T-клеток и продуктов, которые уменьшают риск или предотвращают развитие GvHD и/или HvGD. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные аллогенные CAR-T клетки обладают повышенной противоопухолевой активностью против солидных опухолей или разных видов гематологического рака. Согласно некоторым вариантам реализации CAR-Т-клетки содержат популяцию клеток, которые модифицированы для уменьшения или устранения экспрессии одного или более из экспрессии эндогенных генов TCR, CD52, ГКГС1, ГКГС2 или PD1. Таким образом, в некоторых вариантах реализации, CAR-T клетки содержат популяцию, которая истощена по клеткам, которые представляют собой TCR⁺, CD52⁺, ГКГС1⁺, ГКГС2⁺ и/или PD1⁺.

[64] В данном документе предложены способы истощения популяций клеток, экспрессирующих один или более из эндогенно экспрессируемых TCR, CD3, CD52, ГКГС1, ГКГС2 или PD1 (например, клеток, которые являются TCR⁺, CD3⁺, CD52⁺, ГКГС1⁺, ГКГС2⁺ и/или PD1⁺), из популяции модифицированных иммунных клеток, а также наборы, содержащие антитела-реагенты для указанных способов.

Передача сигналов 1 клеточным рецептором

[65] Комплекс Т-клеточного рецептора (TCR, как описано в данном документе) представляет собой молекулу рецептора антигена на поверхности Т-клеток, отвечающую за распознавание антигена, презентированного Т-клеткам молекулами ГКГС, что может привести к активации Т-клетки и иммунному ответу на антиген. Т-клеточный рецептор человека представляет собой гетеродимер, состоящий из двух трансмембранных гетеродимерных цепей гликопротеинов, цепей α и β (также имеется небольшая доля цепей γδ), каждая из которых имеет два домена, которые связаны дисульфидной связью. Из-за короткого цитоплазматического хвоста TCR он не может напрямую передавать сигналы при связывании с комплексом пептид-ГКГС. Вместо этого TCR ассоциирован с группой сигнальных молекул, в совокупности называемых CD3, которые передают внутриклеточный сигнал при связывании TCR с комплексом пептид-ГКГС.

[66] CD3 состоит из одной молекулы γ и δ и двух молекул ε, внеклеточные домены каждой из которых имеют некоторую ограниченную гомологию последовательности с доменом иммуноглобулина. Эти молекулы имеют небольшие цитоплазматические домены и трансмембранные домены с отрицательно заряженными остатками. В мембране эти отрицательно заряженные остатки образуют солевые мостики с положительно заряженными остатками в трансмембранной области TCR. Рецепторный комплекс TCR-CD3 дополняется двумя другими инвариантными белками ζ и η, которые образуют димеры, связанные дисульфидными связями. Таким образом, на поверхности Т-клеток комплекс TCR-CD3 экспрессируется как гетеродимер αβ (или γδ) в ассоциации с димерами CD3γε и CD3δε с внутриклеточными гомодимерами ζζ или гетеродимером ζη.

[67] Не ограничиваясь какой-либо теорией, некоторые исследователи полагают, что при нарушении экспрессии TCR, поверхностная экспрессия CD3 также может быть устранена. Однако, как описано в данном документе, неожиданно было обнаружено, что остаточная поверхностная экспрессия CD3 все еще может указывать на остаточные TCR⁺ клетки, и эффективность истощения TCR⁺ может быть улучшена путем использования антитела к CD3 в комбинации с антителом к TCR.

Способы сортировки и истощения иммунных клеток

[68] Как описано в данном документе, согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный димер TCRα/β, из популяции иммунных клеток, причем указанный способ включает мечение популяции клеток антителом к TCR и антителом к CD3 (это мечение может быть выполнено последовательно или одновременно за одну операцию), отделение клеток, меченных антителом к TCR и антителом к CD3, от немеченых клеток и сбор немеченых клеток с получением посредством этого популяции клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

[69] Первоначально модифицированные иммунные клетки, модифицированные так, чтобы быть дефицитными по гену эндогенного TCRα или TCRβ, подвергают воздействию реагента для истощения TCR. Согласно некоторым вариантам реализации реагент для истощения TCR содержит антитело, нацеленное на полипептид TCRα, полипептид TCRβ или гетеродимер TCRα/β, эндогенно экспрессируемые на поверхности иммунных клеток. Как описано в данном документе, истощение TCR с использованием антитела к TCR в комбинации с антителом к CD3 (и/или необязательно с антителом к CD52) неожиданно повышает эффективность истощения TCR⁺ по сравнению с истощениями, выполняемыми с использованием только антитела к TCR.

[70] Антитело к TCR, антитело к CD3 или антитело к CD52 (или любое другое антитело, направленное к мишени, представляющей интерес для операции истощения TCR), может быть конъюгировано с биотином для облегчения дальнейшего мечения и/или отделения с использованием вторичного антитела (например, антитела к биотину), прямо или опосредованно конъюгированного с магнитным реагентом для истощения, таким как магнитный агент для истощения, такой как магнитные микрогранулы (наночастицы, которые обычно, но не обязательно, имеют диаметр примерно 50 нм), или любой другой поверхностью, такой как гранула агарозы, направляемая акустической волной частица, пластиковый луночный планшет, стеклянный луночный планшет, керамический луночный планшет, колонка, пакет для культивирования клеток или мембрана. При использовании магнитных микрогранул такие микрогранулы облегчают отделение TCR⁺ клеток от TCR клеток; при контакте с магнитной колонкой TCR⁺ клетки могут удерживаться на колонке, в то время как немеченые TCR^- клетки проходят в сборный мешок. Направляемые акустической волной частицы могут облегчать отделение TCR⁺ от TCR^- клеток при воздействии акустической волны. Несмотря на то, что в контексте раскрытого способа предложено антитело к биотину, во всех способах, предложенных в данном документе, вместо антитела к биотину можно применять других связывающих биотин партнеров, таких как стрептавидин, авидин и другие белки, которые распознают биотин.

[71] Согласно некоторым вариантам реализации предложенные клетки необязательно могут быть отсортированы по другим маркерам клеточной поверхности. Например, подгруппа из популяции иммунных клеток может содержать модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие антигенспецифичный CAR, который сам по себе содержит один или более эпитопов, специфичных в отношении одного или более моноклональных антител (МАТ) (например, примерные последовательности мимотопа; см., например, WO 2016/120216, включенный в данный документ посредством ссылки). Способ включает приведение популяции иммунных клеток в контакт с моноклональным антителом, специфичным в отношении эпитопов, и отбор иммунных клеток, которые связываются с моноклональным антителом, с получением популяции клеток, обогащенной модифицированными иммунными клетками, экспрессирующими антигенспецифичный CAR.

[72] Согласно некоторым вариантам реализации указанное моноклональное антитело, специфичное в отношении указанного эпитопа, необязательно конъюгировано с флуорофором. Согласно данному варианту реализации этап отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, можно выполнять с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).

[73] Согласно некоторым вариантам реализации указанное моноклональное антитело, специфичное в отношении указанного эпитопа, необязательно конъюгировано с магнитной частицей. Согласно этому варианту реализации этап отбора клеток, которые связываются с моноклональным антителом, можно выполнять с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS).

[74] Согласно некоторым вариантам реализации моноклональное антитело, используемое в способе сортировки иммунных клеток, экспрессирующих CAR, выбрано из алемтузумаба, ибритумомаба тиуксетана, муромонаба-CD3, тозитумомаба, абциксимаба, базиликсимаба, брентуксимаба ведотина, цетуксимаба, инфликсимаба, ритуксимаба, бевацизумаба, цертолизумаба пегола, даклизумаба, экулизумаба, эфализумаба, гемтузумаба, натализумаба, омализумаба, паливизумаба, ранибизумаба, тоцилизумаба, трастузумаба, ведолизумаба, адалимумаба, белимумаба, канакинумаба, деносумаба, голимумаба, ипилимумаба, офатумумаба, панитумумаба, QBEND-10 и/или устекинумаба. Согласно некоторым вариантам реализации указанное МАТ представляет собой ритуксимаб. Согласно другому варианту реализации указанное МАТ представляет собой QBEND-10.

[75] Для количественной оценки конкретных типов клеток в популяции клеток можно использовать проточную цитометрию. В общих чертах, проточная цитометрия представляет собой метод количественной оценки компонентов или структурных признаков клеток, в первую очередь с помощью оптических средств. Поскольку различные типы клеток можно различить путем количественной оценки структурных признаков, проточную цитометрию и сортировку клеток можно использовать для подсчета и сортировки клеток разных фенотипов в смеси.

[76] Анализ методом проточной цитометрии включает два основных этапа: 1) мечение выбранных типов клеток одним или более детектируемыми маркерами, и 2) определение количества меченых клеток по отношению к общему количеству клеток в популяции. Согласно некоторым вариантам реализации способ мечения типов клеток включает связывание меченых антител с маркерами, экспрессируемыми конкретным типом клеток. Антитела могут быть либо непосредственно помечены флуоресцентным соединением, либо опосредовано помечены с использованием, например, второго антитела с флуоресцентной меткой, которое распознает первое антитело.

[77] Согласно некоторым вариантам реализации раскрытых способов сортировку или отделение TCR⁺ клеток, необязательно экспрессирующих CAR, от TCR^- клеток можно осуществлять с использованием магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) представляет собой метод разделения различных популяций клеток в зависимости от их поверхностных антигенов (молекул CD) с использованием суперпарамагнитных наночастиц и колонок. MACS можно использовать для получения очень чистой популяции клеток. Клетки в суспензии отдельных клеток можно магнитно пометить с использованием микрогранул. Образец вносят в колонку, состоящую из ферромагнитного материала, который покрыт покрытием, не разрушающим клетки, что обеспечивает быстрое и осторожное разделение клеток. Немеченые клетки проходят через колонку, в то время как клетки с магнитной меткой удерживаются в колонке. Проточную фракцию можно собрать в виде фракции немеченых клеток. После этапа промывки колонку удаляют из сепаратора, и клетки с магнитной меткой элюируют из колонки.

[78] Подробный протокол очистки конкретной популяции клеток, такой как Т-клетки, можно найти в Basil S et al. (2010). (Basil S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS), J. Vis. Exp.(41): 1546).

[79] Согласно некоторым вариантам реализации раскрытых способов сортировку или отделение TCR⁺ клеток, необязательно экспрессирующих CAR, от TCR^- клеток можно осуществлять с использованием отделения с помощью акустической волны вместо магнитных способов отделения. Не ограничиваясь какой-либо теорией, следует понимать, что отделение с помощью акустической волны основано на трехмерной стоячей волне для разделения компонентов смеси. Применительно к раскрытым способам антитело, такое как антитело к TCR, антитело к CD52 или антитело к CD3, может быть конъюгировано с поверхностью, такой как направляемая акустической волной частица. Направляемая акустической волной частица может представлять собой гранулу. Согласно варианту реализации клетки подвергают воздействию направляемых акустической волной частиц, несущих одно или более из антитела к TCR, антитела к CD52 или антитела к CD3, ассоциирующих направляемую акустической волной частицу с любыми клетками, экспрессирующими представляющую интерес мишень. Затем клетки помещают в акустическую камеру и подвергают воздействию акустической волны. Учитывая различные свойства ассоциированных с гранулами клеток и клеток, которые не были помечены частицами гранула-антитело, акустическая волна разделяет меченые и немеченые клетки, которые могут быть собраны, в то время как меченые клетки (например, TCR⁺ или CD52⁺ клетки) могут быть отведены от меченых клеток.

Иммунные клетки

[80] Клетки, подходящие для способов истощения TCR⁺ клеток, описанных в данном документе, включают иммунные клетки.

[81] Перед in vitro манипуляцией или генетической модификацией (например, как описано в данном документе) клетки для применения в способах, описанных в данном документе (например, иммунные клетки), могут быть получены от субъекта. Клетки могут быть получены из ряда неограничивающих источников от субъектов, включая мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из очага инфекции, асциты, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации можно использовать любое количество линий Т-клеток, доступных и известных специалистам в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут происходить от здорового донора или от пациента, у которого диагностирован рак. Согласно некоторым вариантам реализации клетки могут быть частью смешанной популяции клеток, которые обладают разными фенотипическими характеристиками.

[82] Согласно вариантам реализации иммунные клетки получают от субъекта, который в конечном итоге получит модифицированные иммунные клетки (т.е. аутологичную терапию). Согласно вариантам реализации иммунные клетки получают от донора, который представляет собой индивидуума, отличного от субъекта, который получит модифицированные иммунные клетки (т.е. аллогенную терапию).

[83] Клетки могут быть получены из циркулирующей крови индивидуума с помощью афереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. Согласно определенным вариантам реализации клетки, собранные с помощью афереза, могут быть промыты для удаления плазматической фракции и помещены в соответствующий буфер или среды для последующей обработки.

[84] МКПК можно использовать непосредственно для генетической модификации, чтобы получить модифицированные иммунные клетки (такие как CAR или TCR) с использованием способов, описанных в данном документе. Согласно определенным вариантам реализации после выделения МКПК Т-лимфоциты необязательно могут быть впоследствии выделены, чтобы получить популяцию, содержащую только Т-клетки, и как цитотоксические, так и хелперные Т-лимфоциты могут быть далее отсортированы на субпопуляции наивных Т-клеток, Т-клеток памяти и эффекторных Т-клеток либо до, либо после генетической модификации и/или размножения.

[85] Согласно определенным вариантам реализации Т-клетки могут быть выделены из МКПК путем лизирования эритроцитов и истощения моноцитов, например, с помощью центрифугирования в градиенте PERCOLL^®. Конкретные субпопуляции Т-клеток, такие как CD28⁺, CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD25⁺, CD62L⁺, CD5⁺, CD45RA^-, CCR7⁺, CD95⁺, IL2Rβ⁺ и CD45RO⁺ Т-клетки, можно дополнительно выделить с помощью методик положительного или отрицательного отбора, известных в данной области техники. Например, обогащение популяции Т-клеток путем отрицательного отбора можно осуществлять с помощью комбинации антител, направленных к поверхностным маркерам, уникальным для отрицательно отобранных клеток. Одним из способов, предусмотренных для применения в данном документе, является сортировка и/или отбор клеток за счет отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, в которых используется смесь моноклональных антител, направленных к маркерам клеточной поверхности, присутствующим на отрицательно отобранных клетках. Например, для обогащения CD4⁺ клеток с помощью отрицательного отбора смесь моноклональных антител, как правило, включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. Проточную цитометрию и сортировку клеток также можно использовать для выделения представляющих интерес популяций клеток для применения в настоящем раскрытии.

[86] Согласно некоторым вариантам реализации популяцию Т-клеток обогащают CD8⁺ клетками либо до, либо после применения способов истощения, предложенных в данном документе.

[87] Согласно некоторым вариантам реализации популяцию Т-клеток обогащают CD4⁺ клетками либо до, либо после применения способов истощения, предложенных в данном документе.

[88] Согласно некоторым вариантам реализации популяции или CD4⁺ и/или CD8⁺ клетки могут быть дополнительно отсортированы на наивные клетки, стволовые клетки памяти, клетки центральной памяти, клетки эффекторной памяти и эффекторные клетки путем идентификации поверхностных клеточных антигенов, которые ассоциированы с каждым из этих типов клеток. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия фенотипических маркеров для наивных Т-клеток включает CD45RA⁺, CD95^-, IL2Rβ^-, CCR7⁺ и CD62L⁺. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия фенотипических маркеров для стволовых Т-клеток памяти включает CD45RA⁺, CD95⁺, IL2Rβ⁺, CCR7⁺ и CD62L⁺. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия фенотипических маркеров для Т-клеток центральной памяти включает CD45RO⁺, CD95⁺, IL2Rβ⁺, CCR7⁺ и CD62L⁺. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия фенотипических маркеров для Т-клеток эффекторной памяти включает CD45RO⁺, CD95⁺, IL2Rβ⁺, CCR7^- и CD62L^-. Согласно некоторым вариантам реализации экспрессия фенотипических маркеров для эффекторных Т-клеток включает CD45RA⁺, CD95⁺, IL2Rβ⁺, CCR7^- и CD62L^-. Таким образом, CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-хелперные клетки могут быть отсортированы на наивные Т-клетки, стволовые Т-клетки памяти, Т-клетки центральной памяти, Т-клетки эффекторной памяти и эффекторные Т-клетки путем идентификации популяций клеток, которые имеют поверхностные клеточные антигены. Согласно конкретным вариантам реализации раскрытые способы можно применять для усиления истощения одной или более из этих подгрупп Т-клеток.

[89] Следует понимать, что МКПК могут дополнительно включать другие цитотоксические лимфоциты, такие как NK-клетки или NKT-клетки. Вектор экспрессии, несущий кодирующую последовательность химерного рецептора, раскрытого в данном документе, может быть введен в популяцию донорских Т-клеток, NK-клеток или NKT-клеток человека. Можно использовать стандартные процедуры криоконсервации Т-клеток, экспрессирующих CAR, для хранения и/или подготовки для применения у субъекта-человека. Согласно одному варианту реализации трансдукцию, культивирование и/или размножение Т-клеток in vitro выполняют в отсутствие продуктов, полученных от животного, отличного от человека, таких как фетальная телячья сыворотка и фетальная бычья сыворотка. Согласно различным вариантам реализации среды для криоконсервации могут содержать, например, CryoStor® CS2, CS5 или CS10 или другую среду, содержащую ДМСО, или среду, которая не содержит ДМСО.

Модифицированные иммунные клетки

[90] Способы истощения TCR⁺ клеток, описанные в данном документе, могут быть особенно пригодными в изготовлении разных видов терапии на основе иммунных клеток для лечения рака, включая виды терапии, содержащие модифицированные иммунные клетки (например, CAR-T-клетки).

[91] Модифицированные иммунные клетки могут быть аллогенными или

аутологичными, и раскрытые способы можно применять как в аутологичной, так и в аллогенной терапии.

[92] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка (или их популяция) представляет собой или содержит Т-клетку (например, воспалительный Т-лимфоцит, цитотоксический Т-лимфоцит, регуляторный Т-лимфоцит, хелперный Т-лимфоцит, лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL)), NK-клетку, NKT-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллера, тучную клетку или макрофаг. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка может происходить из группы, состоящей из CD4⁺ Т-лимфоцитов и CD8⁺ Т-лимфоцитов или их комбинации. Согласно некоторым примерным вариантам реализации модифицированная иммунная клетка представляет собой Т-клетку. Т-клетки также могут представлять собой γ/δ Т-клетки.

[93] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка может происходить, например, но не ограничиваясь этим, из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки взрослого организма, эмбриональные стволовые клетки нечеловеческого происхождения, более конкретно стволовые клетки нечеловеческого происхождения, стволовые клетки пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), тотипотентные стволовые клетки или гемопоэтические стволовые клетки. Стволовые клетки могут быть CD34⁺ или CD34^-.

[94] Согласно некоторым вариантам реализации клетка получена или приготовлена из периферической крови. Согласно некоторым вариантам реализации клетка получена или приготовлена из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Согласно некоторым вариантам реализации клетка получена или приготовлена из костного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации клетка представляет собой клетку человека. Согласно некоторым вариантам реализации клетка трансфицирована или трансдуцирована вектором нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из вирусной (лентивирусной или гамма-ретровирусной) трансдукции, электропорации, сонопорации, биолистики (например, Gene Gun), липидной трансфекции, полимерной трансфекции, наночастиц или полиплексов. Согласно некоторым вариантам реализации клетка представляет собой Т-клетку, которая была перепрограммирована из клетки, не являющейся Т-клеткой. Согласно некоторым вариантам реализации клетка представляет собой Т-клетку, которая была перепрограммирована из Т-клетки.

Связывающие агенты (включая антитела и их фрагменты)

[95] Согласно вариантам реализации раскрытые способы включают применение антитела или антигенсвязывающего агента (например, содержащего антигенсвязывающий домен или содержащего антитело или его фрагмент). Как обсуждается ниже, в различных вариантах реализации модифицированные иммунные клетки также могут содержать связывающий агент.

[96] В настоящей заявке термин «антитело» относится к полипептиду, который включает элементы канонической последовательности иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфичного связывания с конкретным антигеном-мишенью. Как известно в данной области техники, интактные антитела, продуцируемые в природе, представляют собой тетрамерные агенты с массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи (приблизительно 50 кДа каждый) и двух идентичных полипептидов легкой цепи (приблизительно 25 кДа каждый), которые ассоциированы друг с другом с образованием структуры, обычно называемой «Υ-образной». Каждая тяжелая цепь состоит по меньшей мере из четырех доменов (каждый длиной примерно 110 аминокислот) - амино-концевого вариабельного (VH) домена (расположенного на концах Y-структуры), за которым следуют три константных домена: CH1, СН2 и карбокси-концевой СН3 (расположенный в основании стебля Y). Короткая область, известная как «переключатель», соединяет вариабельную и константную области тяжелой цепи. «Шарнир» соединяет домены СН2 и СН3 с остальной частью антитела. Две дисульфидные связи в этой шарнирной области соединяют два полипептида тяжелой цепи друг с другом в интактном антителе. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов - амино-концевого вариабельного (VL) домена, за которым следует карбокси-концевой константный (CL) домен. Специалисты в данной области техники хорошо знакомы со структурой и элементами последовательности антитела, распознают «вариабельные» и «константные» области в предложенных последовательностях и понимают, что может существовать некоторая гибкость в определении «границы» между такими доменами так, что разные представления одной и той же последовательности цепи антитела могут, например, указывать такую границу в месте, которое сдвинуто на один или несколько остатков относительно другого представления той же последовательности цепи антитела.

[97] Интактные тетрамеры антител состоят из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, в которых тяжелая и легкая цепи связаны друг с другом одной дисульфидной связью; две другие дисульфидные связи соединяют шарнирные области тяжелой цепи друг с другом так, что димеры соединены друг с другом и образуется тетрамер. Антитела, продуцируемые естественным путем, также гликозилированы, как правило, по домену СН2. Каждый домен в природном антителе имеет структуру, характеризующуюся «иммуноглобулиновой укладкой цепи», образованной из двух бета-листов (например, 3-, 4- или 5-цепочечными листами), упакованных друг против друга в уплотненный антипараллельный бета-цилиндр. Каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные петли, известные как «определяющие комплементарность области» (CDR1, CDR2 и CDR3), и четыре инвариантные в некоторой степени «каркасные» области (FR1, FR2, FR3 и FR4). При укладке природных антител области FR образуют бета-листы, которые обеспечивают структурный каркас для доменов, а области петель CDR как тяжелой, так и легкой цепей объединяются в трехмерном пространстве так, что они создают один гипервариабельный антигенсвязывающий сайт, расположенный на конце Y-структуры. Область Fc природных антител связывается с элементами системы комплемента, а также с рецепторами на эффекторных клетках, включая, например, эффекторные клетки, которые опосредуют цитотоксичность. Как известно в данной области техники, аффинность и/или другие характеристики связывания областей Fc с рецепторами Fc можно модулировать посредством гликозилирования или другой модификации. Согласно некоторым вариантам реализации антитела, продуцируемые и/или применяемые в соответствии с настоящим изобретением, включают гликозилированные домены Fc, включая домены Fc с модифицированным или сконструированным гликозилированием.

[98] Для целей настоящего раскрытия, в определенных вариантах реализации, любой полипептид или комплекс полипептидов, который включает достаточные последовательности иммуноглобулиновых доменов, которые обнаруживаются в природных антителах, можно быть назван и/или использован как «антитело», независимо от того, продуцируется ли такой полипептид в естественных условиях (например, вырабатывается организмом, реагирующим на антиген) или получен с помощью рекомбинантной инженерии, химического синтеза или другой искусственной системы или методологии. Согласно некоторым вариантам реализации антитело является поликлональным; согласно некоторым вариантам реализации антитело является моноклональным. Согласно некоторым вариантам реализации антитело имеет последовательности константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, примата или человека. Согласно некоторым вариантам реализации элементы последовательности антитела являются гуманизированными, приматизированными, химерными и т.д., как известно в данной области техники.

[99] Более того, в настоящей заявке термин «антитело» может относиться к любой из известных в данной области техники или разработанных конструкций или форматов для применения структурных и функциональных особенностей антитела в альтернативном представлении. Например, согласно некоторым вариантам реализации, антитело, применяемое в способах согласно настоящему раскрытию, имеет формат, выбранный из, но не ограничиваясь перечисленными, интактных антител IgA, IgG, IgE или IgM; би- или полиспецифичных антител (например, Zybodies® и т.д.); фрагментов антитела, таких как фрагменты Fab, фрагменты Fab, фрагменты F(ab)₂, фрагменты Fd и выделенные CDR или их наборы; одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFV); слияний полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или его фрагменты); антител верблюдовых (также называемых в данном документе нанотелами или VHH); антител акулы, замаскированных антител (например, Probodies®); иммунофармацевтических средств на основе модульного белка малого размера (SMIP™); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb®); VHH; антикалинов®; минител Nanobodies®; BiTE®; белков с анкириновыми повторами или DARPIN®; авимеров®; DART; TCR-подобных антител; аднектинов®; аффилинов®; транстел®; аффител®; TrimerX®; микробелков; финомеров®, центиринов®; и KALBITOR®. Согласно некоторым вариантам реализации в антителе может отсутствовать ковалентная модификация (например, присоединение гликана), которую оно имело бы при продуцировании естественным путем. Согласно некоторым вариантам реализации антитело может содержать ковалентную модификацию (например, присоединение гликана, целевого груза (например, детектируемой группы, терапевтической группы, каталитической группы и т.д.) или другую боковую группу (например, полиэтиленгликоль и т.д.).

[100] В настоящей заявке термин «антитело-агент» обычно относится к агенту, который специфично связывается с конкретным антигеном. Согласно некоторым вариантам реализации термин включает любой полипептид или полипептидный комплекс, который включает структурные элементы иммуноглобулина, достаточные для обеспечения специфичного связывания. Примерные антитела-агенты включают, но не ограничиваются ими, моноклональные антитела или поликлональные антитела. Согласно некоторым вариантам реализации антитело-агент может включать одну или более последовательностей константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, примата или человека. Согласно некоторым вариантам реализации антитело-агент может включать один или более элементов последовательности, являющихся гуманизированными, приматизированными, химерными и т.д., как известно в данной области техники. Согласно многим вариантам реализации термин «антитело-агент» используется для обозначения одной или более известных в данной области техники или разработанных конструкций или форматов для применения структурных и функциональных характеристик антитела в альтернативном представлении. Например, антитело-агент, применяемое в соответствии с настоящим раскрытием, имеет формат, выбранный из, но не ограничиваясь перечисленными, интактных антител IgA, IgG, IgE или IgM; би- или полиспецифичных антител (например, Zybodies® и т.д.); фрагментов антитела, таких как фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')₂, фрагменты Fd и выделенные CDR или их наборы; одноцепочечных Fv; слияний полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или его фрагменты); антител верблюдовых; замаскированных антител (например, Probodies®); иммунофармацевтических средств на основе модульного белка малого размера (SMIP™); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb®); VHH; антикалинов®; минител Nanobodies®; BiTE®; белков с анкириновыми повторами или DARPIN®; авимеров®; DART; TCR-подобных антител; аднектинов®; аффилинов®; транстел®; аффител®; TrimerX®; микробелков; финомеров®, центиринов®; и KALBITOR®.

[101] Антитело или антитело-агент, используемое при выполнении способов согласно настоящему раскрытию, может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Согласно некоторым вариантам реализации антитело или антигенсвязывающая молекула являются одноцепочечными. Согласно определенным вариантам реализации антигенсвязывающая молекула выбрана из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')₂, dAb и любой их комбинации.

[102] Антитела и антитела-агенты включают фрагменты антитела. Фрагмент антитела содержит часть интактного антитела, такую как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Фрагменты антитела включают, но не ограничиваются перечисленными, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv, диатело, линейные антитела, мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антитела и фрагментов scFv, а также другие фрагменты. Антитела также включают, но не ограничиваются перечисленными, поликлональные, моноклональные, химерные dAb (доменные антитела), одноцепочечные фрагменты, Fab, Fa, F(ab')₂ и scFv. Антитело может представлять собой целое антитело или иммуноглобулин, или фрагмент антитела. Фрагменты антитела могут быть получены с помощью различных методик, включая, но не ограничиваясь перечисленными, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также продукцию рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli, клетками яичника китайского хомяка (СНО) или фагом), как известно в данной области техники.

[103] Согласно некоторым вариантам реализации антитело или антитело-агент может представлять собой химерное антитело (см., например, патент США №4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерное антитело может представлять собой антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или вида. В одном примере химерное антитело может содержать вариабельную область из вида, отличного от человека (например, вариабельную область, происходящую от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, отличного от человека, такого как обезьяна) и константную область человека. В дополнительном примере химерное антитело может представлять собой антитело «переключенного класса», в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с исходным антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.

[104] Согласно некоторым вариантам реализации химерное антитело может

представлять собой гуманизированное антитело (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патенты США №№5821337, 7527791, 6982321, и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005); Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498 (1991); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005); Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005); и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)). Гуманизированное антитело представляет собой химерное антитело, содержащее аминокислотные остатки из гипервариабельных областей из вида, отличного от человека, и аминокислотные остатки из FR человека. Согласно определенным вариантам реализации гуманизированное антитело будет содержать по существу все или по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные области (например, CDR) соответствуют таковым антитела из вида, отличного от человека, и все или по существу все каркасные области (FR) соответствуют таковым из антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из антитела человека.

[105] Согласно некоторым вариантам реализации антитело или антитело-агент, предложенное в данном документе, представляет собой антитело человека. Антитела человека могут быть получены с использованием различных методик, известных в данной области техники (см., например, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001); и Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459 (2008)). Антитело человека может представлять собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует таковой антитела, продуцируемого человеком или клеткой человека, или происходящего из источника, отличного от человека, в котором используется репертуар антител человека или другие последовательности, кодирующие антитела человека. Это определение антитела человека конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки из вида, отличного от человека. Антитела человека могут быть получены с использованием методов, хорошо известных в данной области техники.

Химерные антигенные рецепторы (CAR)

[106] Как описано в данном документе, раскрытые способы можно применять для истощения TCR⁺ клеток из популяции иммунных клеток. Иммунные клетки могут представлять собой CAR⁺ клетки и могут быть модифицированы для применения в терапевтических приложениях, таких как аллогенная терапия. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка содержит CAR, содержащий внеклеточный антигенсвязывающий домен. В настоящей заявке химерные антигенные рецепторы (CAR) содержат белки, которые специфично распознают антигены-мишени (например, антигены-мишени на раковых клетках; раковые антигены). При связывании с антигеном-мишенью CAR может активировать иммунную клетку для атаки и разрушения клетки, несущей указанный антиген (например, раковой клетки). CAR также могут включать костимулирующие домены, содержащие весь белок или его часть, например, 4-1 ВВ, CD28 или ОХ 40, и/или сигнальный домен, такой как CD3-дзета, для увеличения их активности. См. Krause et al., J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619 626); Finney et al., Journal of Immunology, 1998, 161: 2791 2797, Song et al., Blood 119:696-706 (2012); Kalos et al., Sci. Transl. Med. 3:95 (2011); Porter et al., N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011), и Gross et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016); патенты США №№7741465 и 6319494.

[107] Химерные антигенные рецепторы, описанные в данном документе, содержат внеклеточный домен, трансмембранный домен, необязательно шарнирный домен, соединяющий внеклеточный домен с трансмембранным доменом, и внутриклеточный домен, причем указанный внеклеточный домен содержит антигенсвязывающий домен, который специфично связывается с мишенью.

[108] Согласно некоторым вариантам реализации антигенспецифичные CAR дополнительно содержат «защитные переключатели» (safety switch) и/или эпитоп, специфичный в отношении моноклонального антитела. Согласно некоторым вариантам реализации антигенселективный CAR содержит лидерный или сигнальный пептид.

Антигенсвязывающие домены CAR

Как обсуждалось выше, CAR, описанные в данном документе, содержат антигенсвязывающий домен. В настоящей заявке «антигенсвязывающий домен» означает любой полипептид, который связывает указанный антиген-мишень. Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающий домен представляет собой scFv. Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающий домен связывается с антигеном на опухолевой клетке. Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающий домен связывается с антигеном на клетке, вовлеченной в гиперпролиферативное заболевание (например, неходжкинскую лимфому, множественную миелому или другой солидный или гематологический рак). Раскрытые способы можно применять для истощения TCR⁺ клеток, которые также являются CAR⁺клетками, обеспечивая посредством этого популяцию CAR⁺/TCR^- клеток.

[109] Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающий домен CAR содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи и/или один или более CDR, описанных в данном документе. Согласно некоторым вариантам реализации антигенсвязывающий домен представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи.

[110] Считается, что антигенсвязывающий домен является «селективным», когда он связывается с одной мишенью прочнее, чем со второй мишенью.

[111] Антигенсвязывающий домен CAR селективно нацелен на раковый антиген. Согласно некоторым вариантам реализации раковый антиген выбран из EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудина-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 или CD34. Согласно некоторым вариантам реализации CAR содержит антигенсвязывающий домен, который нацелен на EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудин-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 или CD34.

[112] Согласно некоторым вариантам реализации раковый антиген выбран из группы, состоящей из карбоангидразы ГХ (CALX), карциноэмбрионального антигена (СЕА), CDS, CD7, CDIO, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, антигена клетки, инфицированной цитомегаловирусом (CMV) (например, поверхностного клеточного антигена), эпителиального гликопротеина (EGP 2), эпителиального гликопротеина-40 (EGP-40), эпителиальной молекулы клеточной адгезии (ЕрСАМ), рецепторных тирозиновых протеинкиназ erb-B2,3,4, связывающего фолат белка (FBP), фетального ацетилхолинового рецептора (AChR), рецепторов фолата, ганглиозида G2 (GD2), ганглиозида G3 (GD3), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER-2), обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT), альфа-субъединицы рецептора интерлейкина-13 2 (IL-13Ra2), κ-легкой цепи, рецептора со встроенным киназным доменом (KDR), Lewis А (СА19.9), молекулы адгезии клеток LI (LICAM), семейства антигенов меланомы А, 1 (MAGE-ΑΙ), муцина 16 (Muc-16), муцина 1 (Muc-1), мезотелина (MSLN), лигандов NKG2D, раково-тестикулярного антигена NY-ESO-1, онкофетального антигена (h5T4), антигена стволовых клеток простаты (PSCA), простатоспецифического мембранного антигена (PSMA), ассоциированного с опухолью гликопротеина 72 (TAG-72), рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGF-R2) и белка опухоли Вильмса (WT-1).

[113] Согласно другим вариантам реализации настоящее раскрытие относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим любой из антигеневязывающих доменов, описанных в данном документе. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее раскрытие относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим CAR. В данном документе также предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, и способы их получения.

[114] Согласно некоторым вариантам реализации CAR-иммунная клетка (например, CAR-Т-клетка), которая может являться компонентом популяции клеток, полученной при реализации способов согласно настоящему раскрытию, содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид «защитного выключателя», такой как, например, RQR8. См., например, WO 2013153391 A, содержание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки. В CAR-иммунной клетке (например, CAR-T-клетке), содержащей полинуклеотид, полипептид «защитного выключателя» может экспрессироваться на поверхности CAR-иммунной клетки (например, CAR-T-клетки).

Шарнирные домены CAR

[115] Внеклеточный домен CAR согласно настоящему раскрытию может содержать «шарнирный» домен (или шарнирную область). Термин обычно относится к любому полипептиду, функция которого заключается в связывании транс мембранного домена в CAR с внеклеточным антигенсвязывающим доменом в CAR. В частности, шарнирные домены можно использовать для обеспечения большей гибкости и доступности внеклеточного антигенсвязывающего домена.

[116] Шарнирный домен может содержать до 300 аминокислот, в некоторых вариантах реализации от 10 до 100 аминокислот или в некоторых вариантах реализации от 25 до 50 аминокислот.Шарнирный домен может происходить из полных природных молекул или их частей, например, из полной или части внеклеточной области CD8, CD4, CD28, 4-1 ВВ или IgG (в частности, шарнирной области IgG; следует понимать, что шарнирная область может содержать часть или полную область члена семейства иммуноглобулинов, такого как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM или их фрагмент), или из полной или части константной области тяжелой цепи антитела. В качестве альтернативы, шарнирный домен может представлять собой синтетическую последовательность, которая соответствует природной последовательности, или может представлять собой полностью синтетическую шарнирную последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации указанный шарнирный домен является частью цепи CD8a человека (например, NP 001139345.1). Согласно другому конкретному варианту реализации указанный шарнирный и трансмембранный домены содержат часть цепи CD8a человека. Согласно некоторым вариантам реализации шарнирный домен CAR, описанный в настоящем документе, содержит подпоследовательность CD8a, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα, в частности, шарнирную область любого из CD8a, IgG1, IgG4, PD-1 или FcγRIIIα. Согласно некоторым вариантам реализации шарнирный домен содержит шарнир CD8a человека, шарнир IgG1 человека, шарнир IgG4 человека, шарнир PD-1 человека или шарнир FcγRIIIα человека. Согласно некоторым вариантам реализации CAR, раскрытые в данном документе, содержат scFv, шарнирный и трансмембранный домены CD8a человека, сигнальный домен CD3ζ, и сигнальный домен 4-1 ВВ.

Трансмембранные домены CAR

[117] CAR, предложенные в данном документе, сконструированы с транс мембранным доменом, который слит с внеклеточным доменом CAR. Аналогичным образом, он может быть слит с внутриклеточным доменом CAR. В некоторых случаях транс мембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены так, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков, чтобы минимизировать взаимодействия с другими членами рецепторного комплекса. Согласно некоторым вариантам реализации короткие линкеры могут образовывать связи между любыми или некоторыми из внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного доменов CAR.

[118] Трансмембранные области могут быть синтетическими (не встречающимися в природе) или могут происходить (содержат или соответствуют фрагменту) из CD28, ОХ-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка запрограммированной смерти 1 (PD-1), индуцируемого костимулятора Т-клеток (ICOS), антигена-1, ассоциированного с функцией лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, гамма-рецептора Fc, молекулы ГКГС класса 1, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белков SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецепторов лиганда Toll, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, С08-альфа, CD8-бета, IL-2R-бета, IL-2R-гамма, IL-7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 Id, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 1a, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфично связывается с CD83, или любой их комбинации.

[119] Согласно некоторым вариантам реализации трансмембранный домен в CAR согласно настоящему раскрытию представляет собой трансмембранный домен CD8α.

[120] Согласно некоторым вариантам реализации трансмембранный домен в CAR согласно настоящему раскрытию представляет собой трансмембранный домен CD28.

Внутриклеточные домены CAR

[121] Внутриклеточный (цитоплазматический) домен CAR может обеспечивать активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, содержащей CAR. Эффекторная функция Т-клетки, например, может относиться к цитолитической активности или вспомогательной активности, включая секрецию цитокинов.

[122] Следует понимать, что подходящие (например, активирующие) внутриклеточные домены включают, но не ограничиваются перечисленными, сигнальные домены, которые происходят (содержат или соответствуют полной молекуле или ее фрагменту) из CD28, ОХ-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка запрограммированной смерти 1 (PD-1), индуцируемого костимулятора Т-клеток (ICOS), антигена-1, ассоциированного с функцией лимфоцитов (LFA-1, CD1-1a/CD18), CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT, (TNFSF14), NKG2C, Ig альфа (CD79a), DAP-10, гамма-рецептора Fc, молекулы ГКГС класса 1, белков рецептора TNF, белка иммуноглобулина, рецептора цитокина, интегринов, сигнальных молекул активации лимфоцитов (белков SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, рецепторов лиганда Toll, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, B7-H3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8-альфа, CD8-бета, IL-2R-бета, IL-2R-гамма, Шд-7К--альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD1 1d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD1 la, LFA-1, ITGAM, CD1 1b, ITGAX, CD1 1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфично связывается с CD83, или любой их комбинации.

[123] Согласно некоторым вариантам реализации внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован так, чтобы содержать домен 41BB/CD137 по отдельности или в комбинации с любым другим целевым внутриклеточным доменом (доменами), который можно применять в случае CAR. Полная нативная аминокислотная последовательность 41BB/CD137 описана в референсной последовательности NCBI: NP_001552.2. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты 41BB/CD137 описана в референсной последовательности NCBI: NM_001561.5.

[124] Согласно некоторым вариантам реализации внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован так, чтобы содержать домен CD28 по отдельности или в комбинации с любым другим целевым внутриклеточным доменом (доменами), который можно применять в случае CAR согласно настоящему раскрытию. Полная нативная аминокислотная последовательность CD28 описана в референсной последовательности NCBI: NP_006130.1. Полная нативная последовательность нуклеиновой кислоты CD28 описана в референсной последовательности NCBI: NM_006139.1.

[125] Согласно некоторым вариантам реализации внутриклеточный/цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован так, чтобы содержать полный домен дзета-CD3 или его фрагмент по отдельности или в комбинации с любым другим целевым внутриклеточным доменом (доменами), который можно применять в случае CAR.

[126] Согласно некоторым вариантам реализации внутриклеточный сигнальный домен CAR содержит домен костимулирующей молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации внутриклеточный сигнальный домен CAR содержит часть костимулирующей молекулы, выбранной из группы, состоящей из фрагмента 41 ВВ (GenBank: ААА53133.) и CD28 (NP_006130.1).

Модифицированные иммунные клетки, содержащие CAR

[127] В данном документе предложены модифицированные иммунные клетки и популяции модифицированных иммунных клеток, экспрессирующих CAR (например, CAR-T-клеток или CAR⁺ клеток), которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

[128] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка содержит CAR Т-клетку, каждая CAR Т-клетка содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен и имеет уменьшенную или устраненную экспрессию эндогенного TCR. Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит популяцию CAR Т-клеток, каждая CAR Т-клетка содержит два или более различных внеклеточных антигенсвязывающих доменов и имеет уменьшенную или устраненную экспрессию эндогенного TCR. Согласно некоторым вариантам реализации иммунная клетка содержит популяцию CAR, каждая CAR Т-клетка содержит одинаковые внеклеточные антигенсвязывающие домены и имеет уменьшенную или устраненную экспрессию эндогенного TCR.

[129] Модифицированные иммунные клетки могут быть аллогенными или аутологичными.

[130] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка или популяция модифицированных иммунных клеток представляет собой Т-клетку (например, воспалительный Т-лимфоцит, цитотоксический Т-лимфоцит, регуляторный Т-лимфоцит, хелперный Т-лимфоцит, лимфоцит, инфильтрирующий опухоль (TIL)), NK-клетку, NKT-клетку, TCR-экспрессирующую клетку, дендритную клетку, дендритную клетку-киллера, тучную клетку или В-клетку и экспрессирует CAR. Согласно некоторым вариантам реализации Т-клетка может происходить из группы, состоящей из CD4⁺ Т-лимфоцитов, CD8⁺ Т-лимфоцитов или популяции, содержащей комбинацию CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток.

[131] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка или популяция модифицированных иммунных клеток, которые получены с применением раскрытых способов, могут происходить, например, без ограничения, из стволовой клетки. Стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки взрослого организма, эмбриональные стволовые клетки нечеловеческого происхождения, более конкретно стволовые клетки нечеловеческого происхождения, стволовые клетки пуповинной крови, клетки-предшественники, стволовые клетки костного мозга, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, тотипотентные стволовые клетки или гемопоэтические стволовые клетки.

[132] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированную иммунную клетку или популяцию иммунных клеток, которые получены с применением раскрытых способов, получают или готовят из периферической крови. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированную иммунную клетку получают или готовят из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированную иммунную клетку получают или готовят из костного мозга. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированную иммунную клетку получают или готовят из пуповинной крови. Согласно некоторым вариантам реализации клетка представляет собой клетку человека. Согласно некоторым вариантам реализации клетку трансфицируют или трансдуцируют вектором нуклеиновой кислоты с использованием метода, выбранного из группы, состоящей из электропорации, сонопорации, биолистики (например, Gene Gun), липидной трансфекции, полимерной трансфекции, наночастиц, вирусной трансфекции (например, ретровируса, лентивируса, ААВ) или полиплексов.

[133] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти более 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.

[134] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR согласно настоящему раскрытию, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти от примерно 10% до примерно 100%, от примерно 10% до примерно 90%, от примерно 10% до примерно 80%, от примерно 10% до примерно 70%, от примерно 10% до примерно 60%, от примерно 10% до примерно 50%, от примерно 10% до примерно 40%, от примерно 10% до примерно 30%, от примерно 10% до примерно 20%, от примерно 15% до примерно 100%, от примерно 15% до примерно 90%, от примерно 15% до примерно 80%, от примерно 15% до примерно 70%, от примерно 15% до примерно 60%, от примерно 15% до примерно 50%, от примерно 15% до примерно 40%, от примерно 15% до примерно 30%, от примерно 20% до примерно 100%, от примерно 20% до примерно 90%, от примерно 20% до примерно 80%, от примерно 20% до примерно 70%, от примерно 20% до примерно 60%, от примерно 20% до примерно 50%, от примерно 20% до примерно 40%, от примерно 20% до примерно 30%, от примерно 30% до примерно 100%, от примерно 30% до примерно 90%, от примерно 30% до примерно 80%, от примерно 30% до примерно 70%, от примерно 30% до примерно 60%, от примерно 30% до примерно 50%, от примерно 30% до примерно 40%, от примерно 40% до примерно 100%, от примерно 40% до примерно 90%, от примерно 40% до примерно 80%, от примерно 40% до примерно 70%, от примерно 40% до примерно 60%, от примерно 40% до примерно 50%, от примерно 50% до примерно 100%, от примерно 50% до примерно 90%, от примерно 50% до примерно 80%, от примерно 50% до примерно 70%, от примерно 50% до примерно 60%, от примерно 60% до примерно 100%, от примерно 60% до примерно 90%, от примерно 60% до примерно 80%, от примерно 60% до примерно 70%, от примерно 70% до примерно 90%, от примерно 70% до примерно 80%, от примерно 80% до примерно 100%, от примерно 80% до примерно 90%, от примерно 90% до примерно 100%, от примерно 25% до примерно 50%, от примерно 75% до примерно 100% или от примерно 50% до примерно 75%.

[135] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти более 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или 60%.

[136] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, содержат процентную долю стволовых клеток памяти и клеток центральной памяти от примерно 10% до примерно 60%, от примерно 10% до примерно 50%, от примерно 10% до примерно 40%, от примерно 15% до примерно 50%, от примерно 15% до примерно 40%, от примерно 20% до примерно 60% или от примерно 20% до примерно 70%.

[137] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, обогащены T_CM и/или T_SCM клетками так, что модифицированные иммунные клетки содержат по меньшей мере примерно 60%, 65%, 70%, 75% или 80% объединенной популяции T_CM и T_SCM клеток. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, обогащены T_CM и/или T_SCM клетками так, что модифицированные иммунные клетки содержат по меньшей мере примерно 70% объединенной популяции T_CM и T_SCM клеток. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR, обогащены T_CM и/или T_SCM клетками так, что модифицированные иммунные клетки содержат по меньшей мере примерно 75% объединенной популяции T_CM и T_SCM клеток.

[138] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR согласно настоящему раскрытию, обогащены T_CM и/или T_SCM клетками так, что модифицированные иммунные клетки содержат по меньшей мере примерно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% или 60% T_SCM клеток. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки, экспрессирующие на своей клеточной поверхностной мембране антигенспецифичный CAR согласно настоящему раскрытию, обогащены T_CM и/или T_SCM клетками так, что модифицированные иммунные клетки содержат по меньшей мере примерно 30%, 35%, 40% или 45% T_SCM клеток.

[139] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка представляет собой воспалительный Т-лимфоцит, который экспрессирует CAR. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка представляет собой цитотоксический Т-лимфоцит, который экспрессирует CAR. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка представляет собой регуляторный Т-лимфоцит, который экспрессирует CAR. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка представляет собой хелперный Т-лимфоцит, который экспрессирует CAR.

[140] Согласно некоторым вариантам реализации модифицированная иммунная клетка согласно настоящему раскрытию может содержать один или более поврежденных или инактивированных генов. Согласно некоторым вариантам реализации ген антигена-мишени (например, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудина-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3 или CD34, CD70) может быть подавлен, чтобы ввести CAR, нацеленный на тот же антиген (например, EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудин-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3 или CD34, CD70 CAR), чтобы избежать индуцированной активации CAR. Как описано в данном документе, согласно некоторым вариантам реализации, модифицированная иммунная клетка согласно настоящему раскрытию содержит один разрушенный или инактивированный ген, выбранный из группы, состоящей из ГКГС1 (β2М), ГКГС2 (СИТА), EGFRvIII, Flt3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудина-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3 или CD34, CD70, TCRα и TCRβ, и/или экспрессирует CAR или многоцепочечный CAR. Согласно некоторым вариантам реализации клетка содержит многоцепочечный CAR. Согласно некоторым вариантам реализации выделенная клетка содержит два разрушенных или инактивированных гена, выбранных из группы, состоящей из: CD52 и TCRα, CDR52 и TCRβ, PD-1 и TCRα, PD-1 и TCRβ, ГКГС-1 и TCRα, ГКГС-1 и TCRβ, ГКГС2 и TCRα, ГКГС2 и TCRβ, и/или экспрессирует CAR или многоцепочечный CAR.

[141] Согласно некоторым вариантам реализации способ включает разрушение или инактивацию одного или более генов путем введения в клетки эндонуклеазы, способной селективно инактивировать ген путем селективного расщепления ДНК. Согласно некоторым вариантам реализации эндонуклеаза может представлять собой, например, нуклеазу с цинковым пальцем (ZFN), нуклеазу megaTAL, мегануклеазу, нуклеазу на основе эффектора, подобного активатору транскрипции (TALE-нуклеазу или TALEN®) или эндонуклеазу CRISPR (например, Cas9 или Cas12).

[142] Согласно некоторым вариантам реализации TCR⁺ клетку или их популяцию делают нефункциональной среди клеток путем разрушения или инактивации эндогенного гена TCRα и/или гена (ов) TCRβ.Способы истощения согласно настоящему раскрытию являются особенно подходящими для удаления любых оставшихся TCR⁺ Т-клеток из популяции клеток после инактивации гена TRCα. Модифицированные иммунные клетки, полученные с применением способов, раскрытых в данном документе, можно применять в лечении пациентов, нуждающихся в этом, путем предотвращения или уменьшения отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD); таким образом, в объем настоящего раскрытия включен способ лечения пациентов, нуждающихся в этом, путем предотвращения или уменьшения отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), включающий лечение указанного пациента путем введения указанному пациенту эффективного количества модифицированных иммунных клеток, содержащих разрушенные или инактивированные гены TCRα и/или TCRβ.

[143] Согласно настоящему раскрытию предложены способы повышения чистоты популяции модифицированных иммунных клеток, в которых отсутствует или уменьшена экспрессия эндогенного TCR. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки содержат менее 1,0% TCR⁺ клеток, менее 0,9% TCR⁺ клеток, менее 0,8% TCR⁺ клеток, менее 0,7% TCR⁺ клеток, менее 0,6% TCR⁺ клеток, менее 0,5% TCR⁺ клеток, менее 0,4% TCR⁺ клеток, менее 0,3% TCR⁺ клеток, менее 0,2% TCR⁺ клеток или менее 0,1% TCR⁺ клеток. Такая популяция может представлять собой продукт раскрытых способов.

[144] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит менее 0,1% TCR⁺ клеток. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки содержат менее 0,09% TCR⁺ клеток, менее 0,08% TCR⁺ клеток, менее 0,07% TCR⁺ клеток, менее 0,06% TCR⁺ клеток, менее 0,05% TCR⁺ клеток, менее 0,04% TCR⁺ клеток, менее 0,03% TCR⁺ клеток, менее 0,02% TCR⁺ клеток, менее 0,01% TCR⁺ клеток. Такая популяция может представлять собой продукт раскрытых способов.

[145] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит примерно 0,01-0,001% TCR⁺ клеток. Такая популяция может представлять собой продукт раскрытых способов.

[146] Согласно настоящему раскрытию также предложены модифицированные иммунные клетки, содержащие любой из CAR, описанных в данном документе, которые также могут отличаться уменьшенной или устраненной экспрессией одного или более эндогенных генов. Согласно некоторым вариантам реализации CAR может быть введен в иммунную клетку в виде трансгена за счет плазмидного вектора. Согласно некоторым вариантам реализации плазмидный вектор также может содержать, например, селективный маркер, который обеспечивает идентификацию и/или отбор клеток, которые получили указанный вектор.

Изготовление TCR^- модифицированных иммунных клеток и популяций TCR^-модифицированных иммунных клеток (включая CAR Т-клетки)

[147] В данном документе предложены способы истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток (включая модифицированные иммунные клетки, такие как CAR⁺ клетки). Как описано в данном документе, мечение популяции клеток антителом к TCR и антителом к CD3, отделение клеток, меченных антителом к TCR и антителом к CD3, от немеченых клеток, и сбор немеченых клеток облегчает получение популяции клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR. Согласно различным вариантам реализации отделение обычно может быть достигнуто с использованием магнитных гранул, направляемых акустической волной частиц, мембран (которые все могут быть конъюгированы с группой, которая распознается мечеными клетками), FACS и других известных методов разделения. Клетки, полученные с применением этого способа, также составляют аспект настоящего раскрытия.

[148] В данном документе предложены способы истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток (включая модифицированные иммунные клетки, такие как CAR⁺ клетки). Как описано в данном документе, мечение популяции клеток антителом к TCR и антителом к CD52, отделение клеток, меченных антителом к TCR и антителом к CD52, от немеченых клеток, и сбор немеченых клеток облегчает получение популяции клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR. Согласно различным вариантам реализации отделение обычно может быть достигнуто с использованием магнитных гранул, направляемых акустической волной частиц, мембран (которые все могут быть конъюгированы с группой, которая распознается мечеными клетками), FACS и других известных методов разделения. Клетки, полученные с применением этого способа, также составляют аспект настоящего раскрытия.

[149] В данном документе также предложены способы истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток (включая модифицированные иммунные клетки, такие как CAR⁺ клетки). Как описано в данном документе, мечение популяции клеток антителом к TCR, антителом к CD3 и антителом к CD52, отделение клеток, меченных антителом к TCR, антителом к CD3 и антителом к CD52, от немеченых клеток, и сбор немеченых клеток облегчает получение популяции клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR. Согласно различным вариантам реализации отделение обычно может быть достигнуто с использованием магнитных гранул, направляемых акустической волной частиц, мембран (которые все могут быть конъюгированы с группой, которая распознается мечеными клетками), FACS и других известных методов разделения. Клетки, полученные с применением этого способа, также составляют аспект настоящего раскрытия.

[150] Перед in vitro манипуляцией или генетической модификацией модифицированных иммунных клеток, описанных в данном документе, клетки могут быть получены от субъекта. Популяция клеток, экспрессирующих CAR, может быть получена с помощью аллогенного или аутологичного способа, как описано в данном документе, и может быть истощена по эндогенному TCR, как описано в данном документе.

Генетическая модификация выделенных иммунных клеток

[151] Как описано в данном документе, иммунные клетки, такие как Т-клетки, могут быть генетически модифицированы перед выполнением способов, предложенных в данном документе, с использованием известных методов, или иммунные клетки могут быть активированы и размножены (или дифференцированы в случае iPSC или клеток-предшественников) in vitro перед генетической модификацией. Согласно некоторым вариантам реализации иммунные клетки генетически модифицируют для уменьшения или устранения экспрессии эндогенного TCR (TRAC), ГКГС1 (β2Μ), ГКГС2, PD1 и/или CD52. Согласно некоторым вариантам реализации может быть уменьшена или устранена экспрессия двух или более эндогенных белков. Например, может быть уменьшена или устранена экспрессия TRAC и CD52. В другом примере может быть уменьшена или устранена экспрессия TRAC и белка, который является мишенью трансдуцированного CAR. Согласно некоторым вариантам реализации клетки генетически модифицируют с использованием технологии редактирования генов (например, CRISPR/Cas9, нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), TALEN®, MegaTAL, мегануклеазы) для уменьшения или устранения экспрессии одного или более эндогенных белков (например, TCRα, ГКГС1, ГКГС2, PD1, CD52). Согласно другому варианту реализации иммунные клетки, такие как Т-клетки, генетически модифицируют с применением описанных в данном документе химерных антигенных рецепторов (например, трансдуцируют вирусным вектором, содержащим одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих CAR, или с использованием невирусных средств), а затем активируют и/или размножают in vitro.

[152] Некоторые способы получения конструкций и модифицированных иммунных клеток согласно настоящему раскрытию описаны в РСТ заявке WO 2015/120096 (PCT/US 15/14520), содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

[153] Согласно одному варианту реализации настоящего раскрытия предложен способ хранения генетически модифицированных клеток, экспрессирующих CAR. Указанный способ включает криоконсервацию иммунных клеток таким образом, чтобы клетки оставались жизнеспособными после размораживания. Фракция иммунных клеток, экспрессирующих CAR, может быть криоконсервирована с помощью методов, известных в данной области техники, чтобы обеспечить постоянный источник таких клеток для будущего лечения пациентов, страдающих злокачественным новообразованием. При необходимости криоконсервированные трансформированные иммунные клетки могут быть разморожены, культивированы и размножены для получения большего количества таких клеток. Как продемонстрировано в Примерах и на Чертежах, популяции клеток, полученные с применением способов истощения, предложенных в данном документе, могут быть криоконсервированы, а затем разморожены для терапевтических приложений.

Аллогенные CAR Т-клетки

[154] Способ изготовления аллогенной CAR Τ терапии, или AlloCAR™, включает сбор здоровых, отобранных, проверенных и протестированных Т-клеток от здоровых доноров. Затем Т-клетки модифицируют для экспрессии CAR, которые распознают определенные белки клеточной поверхности (например, антигены-мишени, такие как EGFRvIII, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD33, CD133, ГКГС-WT1, TSPAN10, ГКГС-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKGD2D, CS1, CD44v6, ROR1, клаудин-18.2, Muc17, FAP альфа, Ly6G6D, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25, CD19, BCMA, FLT3, CD70, DLL3, CD52 или CD34), которые экспрессируются в гематологических или солидных опухолях. Аллогенные Т-клетки подвергают редактированию генов с использованием инструментов редактирования генов, таких как TALEN®, цинковый палец, CRISPR или другие технологии редактирования генов, чтобы уменьшить риск болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD) и предотвратить аллогенное отторжение (HvGD) при введении пациенту, который не является донором.

[155] Экспрессия эндогенного гена Т-клеточного рецептора (например, TCRα, TCRβ) может быть уменьшена или устранена, чтобы избежать GvHD. Экспрессия эндогенного ГКГС1 (β2М), ГКГС2 и/или PD1 также может быть уменьшена или устранена, чтобы избежать HvGD, путем предотвращения распознавания иммунными клетками хозяина ГКГС1 и ГКГС2 на привитых клетках как чужеродных антигенов. Эндогенная экспрессия гена CD52 (кластер дифференцировки 52) также может быть уменьшена или устранена, чтобы придать продукту CAR Τ устойчивость к обработке антителом к CD52. Таким образом, лимфодеплецию путем обработки антителом к CD52 можно применять для подавления иммунной системы хозяина, что позволяет CAR Τ оставаться приживленными для достижения их полного терапевтического влияния. Как описано в данном документе, модифицированная иммунная клетка или их популяция для применения в аллогенной терапии может содержать несколько подавленных генов, по меньшей мере для целей, приведенных в качестве примеров выше.

[156] Согласно некоторым вариантам реализации эндогенная экспрессия гена, кодирующего белок запрограммированной смерти клеток 1 (PD1), также известный как CD279, может быть уменьшена или устранена для повышения противоопухолевой активности.

Аутологичные CAR Т-клетки

[157] Терапия аутологичными Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR) включает сбор собственных клеток пациента (например, лейкоцитов, включая Т-клетки) и генетическую модификацию Т-клеток для экспрессии CAR, которые распознают антигены-мишени, экспрессируемые на клеточной поверхности одной или более специфических раковых клеток, и уничтожения раковых клеток. Затем модифицированные клетки криоконсервируют и впоследствии вводят пациенту.

Фармацевтические композиции и терапия

[158] Фармацевтические композиции, содержащие популяцию клеток, полученную с применением раскрытых способов, можно применять для лечения пациента, страдающего раком. Требуемое для лечения количество модифицированных клеток из популяции, полученной с применением способов, предложенных в данном документе, обычно составляет по меньшей мере 2 клетки (например, подгруппу из по меньшей мере 1 CD8⁺ Т-клетки центральной памяти или по меньшей мере 1 CD4⁺ хелперной Т-клетки или по одной из CD8⁺ клетки и СВ4⁺ клетки) или, как правило, более 10² клеток и до 10⁶, до 10⁸ или 10⁹ клеток включительно и может составлять более 10¹⁰ клеток. Количество клеток будет зависеть от целевого применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Плотность целевых клеток, как правило, превышает 10⁶ клеток/мл и обычно превышает 10⁷ клеток/мл, обычно 10⁸ клеток/мл или более. Клинически значимое количество иммунных клеток можно разделить на несколько инфузий, которые в совокупности равны или превышают 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток. В некоторых приложениях популяции клеток, полученной с применением способов согласно настоящему раскрытию, в частности, поскольку все введенные путем инфузий клетки будут перенаправлены к конкретному антигену-мишени, может быть введено меньшее количество клеток, в диапазоне 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). Препараты CAR можно вводить несколько раз в дозировках в пределах указанных диапазонов. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными для пациента, проходящего терапию.

[159] Как описано в данном документе, популяция модифицированных иммунных клеток может быть истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR (например, клетки представляют собой TCR и/или содержит остаточные уровни TCR⁺ клеток). Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки содержат менее 1,0% TCR⁺ клеток, менее 0,9% TCR⁺ клеток, менее 0,8% TCR⁺ клеток, менее 0,7% TCR⁺ клеток, менее 0,6% TCR⁺ клеток, менее 0,5% TCR⁺ клеток, менее 0,4% TCR⁺ клеток, менее 0,3% TCR⁺ клеток, менее 0,2% TCR⁺ клеток или менее 0,1% TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[160] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит менее 0,09% TCR⁺ клеток, менее 0,08% TCR⁺ клеток, менее 0,07% TCR⁺ клеток, менее 0,06% TCR⁺ клеток, менее 0,05% TCR⁺ клеток, менее 0,04% TCR⁺ клеток, менее 0,03% TCR⁺ клеток, менее 0,02% TCR⁺ клеток, менее 0,01% TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[161] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит примерно 0,01-0,001% TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[162] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит недетектируемые уровни TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[163] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит более 99% TCR^- клеток, более 99,9% TCR^- клеток, более 99,91% TCR^- клеток, более 99,92% TCR^- клеток, более 99,93% TCR^- клеток, более 99,94% TCR^- клеток, более 99,95% TCR^- клеток, более 99,96% TCR^- клеток, более 99,97% TCR^- клеток или более 99,98% TCR^- клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR^- клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[164] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит примерно 99,99-99,999% TCR^- клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR^- клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в настоящем документе.

[165] TCR-истощенные популяции клеток, экспрессирующих CAR, полученные с применением способов согласно настоящему раскрытию, могут быть введены либо отдельно, либо в комбинации с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток. Фармацевтические композиции согласно настоящему раскрытию могут содержать популяцию TCR^- клеток, экспрессирующих CAR, таких как модифицированные Т-клетки, описанные в данном документе. Композиции согласно настоящему раскрытию предпочтительно изготавливают для инфузий или внутривенного введения.

Способы лечения

[166] Согласно настоящему раскрытию предложены способы лечения или предотвращения заболевания (например, рака) у пациента, включающие введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества популяции модифицированных иммунных клеток (например, клеток, полученных не от пациента, а от здорового донора), содержащих CAR, причем указанная популяция модифицированных иммунных клеток истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR (например, клетки представляют собой TCR^- и/или содержат остаточные уровни TCR⁺ клеток).

[167] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит менее 1,0% TCR⁺ клеток, менее 0,9% TCR⁺ клеток, менее 0,8% TCR⁺ клеток, менее 0,7% TCR⁺ клеток, менее 0,6% TCR⁺ клеток, менее 0,5% TCR⁺ клеток, менее 0,4% TCR⁺ клеток, менее 0,3% TCR⁺ клеток, менее 0,2% TCR⁺ клеток или менее 0,1% TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[168] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит менее 0,09% TCR⁺ клеток, менее 0,08% TCR⁺ клеток, менее 0,07% TCR⁺ клеток, менее 0,06% TCR⁺ клеток, менее 0,05% TCR⁺ клеток, менее 0,04% TCR⁺ клеток, менее 0,03% TCR⁺ клеток, менее 0,02% TCR⁺ клеток, менее 0,01% TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[169] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит примерно 0,01-0,001% TCR⁺ клеток. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные иммунные клетки содержат недетектируемые уровни TCR⁺ клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[170] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит более 99% TCR^- клеток, более 99,9% TCR^- клеток, более 99,91% TCR^- клеток, более 99,92% TCR^- клеток, более 99,93% TCR^- клеток, более 99,94% TCR^- клеток, более 99,95% TCR^- клеток, более 99,96% TCR^- клеток, более 99,97% TCR^-клеток или более 99,98% TCR^- клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[171] Согласно некоторым вариантам реализации популяция модифицированных иммунных клеток содержит примерно 99,99-99,999% TCR^- клеток. Популяции клеток, имеющие указанные выше уровни TCR⁺ клеток, могут быть получены с применением способов, раскрытых в данном документе.

[172] В данном документе предложены способы лечения заболеваний или нарушений, включая рак. Указанные способы уменьшают вероятность того, что при лечении аллогенной терапией у пациента разовьется GvHD. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее раскрытие относится к введению субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества популяции TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, полученной с применением способов согласно настоящему раскрытию. Согласно некоторым вариантам реализации опосредуемый Т-клетками иммунный ответ направлен против клетки-мишени или клеток, экспрессирующих раковый антиген. Согласно некоторым вариантам реализации популяция TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток содержит клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR). Согласно некоторым вариантам реализации клетка-мишень представляет собой клетку солидной опухоли или клетку гематологической опухоли. Согласно некоторым аспектам настоящее раскрытие включает способ лечения или предотвращения злокачественного новообразования, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества популяции TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, полученной с применением способов согласно настоящему раскрытию. Согласно некоторым аспектам настоящее раскрытие включает способ лечения или предотвращения злокачественного новообразования, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества популяции TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, полученной с применением способов, предложенных в данном документе, при этом указанная популяция TCR-истощенных иммунных клеток содержит по меньшей мере один химерный антигенный рецептор и/или выделенный антигенсвязывающий домен, описанные в данном документе. Согласно некоторым вариантам реализации популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, содержащих CAR, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, можно применять для лечения гематологических злокачественных новообразований или солидных опухолей.

[173] Согласно некоторым вариантам реализации популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, содержащих CAR, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, можно применять для лечения мелкоклеточного рака легких, меланомы, глиом низкой степени злокачественности, глиобластомы, медуллярного рака щитовидной железы, нейроэндокринных опухолей, дисперсных нейроэндокринных опухолей в поджелудочной железе, рака мочевого пузыря и рака простаты, рака яичек и аденокарцином легких с нейроэндокринными признаками. Согласно некоторым вариантам реализации популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, содержащих CAR, например, CAR-T-клеток, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, можно применять для лечения солидных раковых опухолей. Согласно некоторым вариантам реализации популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, содержащих CAR, например, CAR-T-клеток, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, применяют для лечения неходжкинской лимфомы (NHL), почечно-клеточной карциномы (RCC), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), множественной миеломы (ММ) или острого миелоидного лейкоза (ОМЛ).

[174] Также предложены способы уменьшения размера опухоли у субъекта, включающие введение указанному субъекту популяции TCR-истощенных модифицированных клеток, полученной с применением способов согласно настоящему раскрытию, причем указанная клетка содержит химерный антигенный рецептор, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывается с антигеном на опухоли.

[175] Согласно некоторым вариантам реализации субъект имеет солидную опухоль или злокачественное новообразование крови, такое как лимфома или лейкоз (гематологический рак). Согласно некоторым вариантам реализации популяцию TCR-истощенных модифицированных клеток, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, доставляют в ложе опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации рак присутствует в костном мозге субъекта, и популяцию клеток, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, доставляют в костный мозг. Согласно некоторым вариантам реализации рак присутствует в иммунных клетках или клетках крови пациента, и популяцию клеток, полученную с применением способов согласно настоящему раскрытию, доставляют к указанным клеткам. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные клетки представляют собой аутологичные иммунные клетки, например, аутологичные Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации модифицированные клетки представляют собой аллогенные иммунные клетки, например, аллогенные Т-клетки, для которых применение раскрытых способов будет особенно полезным.

[176] «Терапевтически эффективное количество», «эффективная доза», «эффективное количество» или «терапевтически эффективная дозировка» терапевтического агента, например, популяции TCR-истощенных модифицированных CAR Т-клеток, полученной с применением способов согласно настоящему раскрытию, представляет собой любое количество, которое при использовании по отдельности или в комбинации с другим терапевтическим агентом защищает субъекта от начала заболевания или способствует регрессу заболевания, о чем свидетельствует уменьшение степени тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности периодов без симптомов заболевания, или предотвращение ухудшения или инвалидности из-за поражения заболеванием. Способность терапевтического агента способствовать регрессу заболевания можно оценить с использованием различных методов, известных квалифицированному практикующему специалисту, например, у субъектов-людей во время клинических исследований, в модельных системах на животных, которые позволяют прогнозировать эффективность у человека, или путем анализа активности агента в анализах in vitro.

[177] Требуемое для лечения количество TCR-истощенных модифицированных клеток в композиции составляет по меньшей мере 2 клетки (например, подгруппу из по меньшей мере одной CD8⁺ Т-клетки центральной памяти и по меньшей мере одной CD4⁺ хелперной Т-клетки, или по меньшей мере 2 CD4⁺ клетки или по меньшей мере 2 CD8⁺ клетки) или более типично более 10² клеток и до 10⁶, до 10⁸ или 10⁹ клеток включительно и может превышать 10¹⁰ клеток. Количество клеток будет зависеть от целевого применения, для которого предназначена композиция, и типа клеток, включенных в нее. Следует отметить, что способы, предложенные в данном документе, можно применять для получения популяций TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, которые содержат только CD4⁺ клетки, только CD8⁺ клетки или как CD4⁺ клетки, так и CD8⁺ клетки. Плотность целевых клеток, как правило, превышает 10⁶ клеток/мл и обычно превышает 10⁷ клеток/мл, обычно 10⁸ клеток/мл или более. Клинически значимое количество иммунных клеток можно разделить на несколько инфузий, которые в совокупности равны или превышают 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² клеток. Согласно некоторым аспектам настоящего раскрытия, в частности, поскольку все введенные путем инфузий клетки будут перенаправлены к конкретному антигену-мишени, может быть введено меньшее количество клеток, в диапазоне 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). Препараты CAR можно вводить несколько раз в дозировках в пределах указанных диапазонов. Клетки могут быть аутологичными, аллогенными или гетерологичными для пациента, проходящего терапию.

[178] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтически эффективное количество TCR-истощенных CAR Т-клеток, полученных с применением способов согласно настоящему раскрытию, составляет примерно 1×10⁵ клеток/кг, примерно 2×10⁵ клеток/кг, примерно 3×10⁵ клеток/кг, примерно 4×10⁵ клеток/кг, примерно 5×10⁵ клеток/кг, примерно 6×10⁵ клеток/кг, примерно 7×10⁵ клеток/кг, примерно 8×10⁵ клеток/кг, примерно 9×10⁵ клеток/кг, 2×10⁶ клеток/кг, примерно 3×10⁶ клеток/кг, примерно 4×10⁶ клеток/кг, примерно 5×10⁶ клеток/кг, примерно 6×10⁶ клеток/кг, примерно 7×10⁶ клеток/кг, примерно 8×10⁶ клеток/кг, примерно 9×10⁶ клеток/кг, примерно 1×10⁷ клеток/кг, примерно 2×10⁷ клеток/кг, примерно 3×10⁷ клеток/кг, примерно 4×10⁷ клеток/кг, примерно 5×10⁷ клеток/кг, примерно 6×10⁷ клеток/кг, примерно 7×10⁷ клеток/кг, примерно 8×10⁷ клеток/кг или примерно 9×10⁷ клеток/кг.

[179] Согласно некоторым вариантам реализации целевые дозы CAR⁺/TCR^- Т-клеток варьируются от 1×10⁶ до 2×10⁸ клеток/кг, например, 2×10⁶ клеток/кг. Следует понимать, что дозы, которые выше и ниже этого диапазона, могут быть подходящими для определенных субъектов, и подходящие уровни доз могут быть определены поставщиком медицинских услуг по мере необходимости. Кроме того, в соответствии с настоящим раскрытием могут быть предложены многократные дозы клеток.

[180] Согласно некоторым вариантам реализации популяция TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, экспрессирующих на их клеточной поверхности любой из антигенспецифичных CAR, описанных в данном документе, полученная с применением способов согласно настоящему раскрытию, при введении пациенту может уменьшать количество, уничтожать или лизировать эндогенные антиген-экспрессирующие клетки пациента. Согласно одному варианту реализации процентная доля уменьшения количества или лизиса антиген-экспрессирующих эндогенных клеток или клеток из линии клеток, экспрессирующей антиген, модифицированными иммунными клетками, экспрессирующими любой из антигенспецифичных CAR, описанных в данном документе, составляет по меньшей мере примерно или более 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%. Согласно одному варианту реализации процентная доля уменьшения количества или лизиса антиген-экспрессирующих эндогенных клеток или клеток из линии клеток, экспрессирующей антиген, модифицированными иммунными клетками, экспрессирующими антигенспецифичные CAR, составляет от примерно 5% до примерно 95%, от примерно 10% до примерно 95%, от примерно 10% до примерно 90%, от примерно 10% до примерно 80%, от примерно 10% до примерно 70%, от примерно 10% до примерно 60%, от примерно 10% до примерно 50%, от примерно 10% до примерно 40%, от примерно 20% до примерно 90%, от примерно 20% до примерно 80%, от примерно 20% до примерно 70%, от примерно 20% до примерно 60%, от примерно 20% до примерно 50%, от примерно 25% до примерно 75% или от примерно 25% до примерно 60%. Согласно одному варианту реализации эндогенные антиген-экспрессирующие клетки представляют собой эндогенные антиген-экспрессирующие клетки костного мозга.

[181] В сочетании с композициями, описанными в данном документе, можно использовать множество дополнительных терапевтических агентов. Например, потенциально пригодные дополнительные терапевтические агенты включают ингибиторы PD-1, такие как ниволумаб (Opdivo®), пембролизумаб (Keytruda®), пембролизумаб, пидилизумаб и атезолизумаб; эти соединения могут быть введены до, одновременно или после введения популяции TCR-истощенных модифицированных иммунных клеток, полученной с применением способов, предложенных в данном документе.

[182] Согласно некоторым вариантам реализации композиция, содержащая популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, экспрессирующих CAR, полученную с применением способов, предложенных в данном документе, может быть введена до, одновременно или после терапевтической схемы, разработанной для предотвращения или лечения синдрома высвобождения цитокинов (CRS) или нейротоксичности, такой как антитело к IL6.

[183] Согласно определенным вариантам реализации композиции, содержащие популяцию TCR-истощенных иммунных клеток, содержащих CAR, полученную с применением способов, предложенных в данном документе, могут быть введены субъекту в сочетании с цитокином. Примерами цитокинов являются лимфокины, монокины и обычные полипептидные гормоны. В число цитокинов входят гормоны роста, такие как гормон роста человека, N-метионил-гормон роста человека и гормон роста крупного рогатого скота; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ); фактор роста печени (HGF); фактор роста фибробластов (FGF); пролактин; плацентарный лактоген; ингибирующее вещество Мюллера; пептид, ассоциированный с гонадотропином мыши; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов; интегрин; тромбопоэтин (ТПО); факторы роста нервов (NGF), такие как NGF-бета; фактор роста тромбоцитов; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (ЭПО); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (КСФ), такие как макрофагальный-КСФ (М-КСФ); гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ); и гранулоцитарный КСФ (Г-КСФ); интерлейкины (IL), такие как IL-1, 1L-1альфа, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-21, фактор некроза опухоли, такой как TNF-альфа или TNF-бета; и другие полипептидные факторы, включая LIF и лиганд KIT (KL). В настоящей заявке термин «цитокин» включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток, а также биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью.

Наборы и готовые изделия

[184] Согласно настоящему раскрытию предложены наборы, содержащие реагенты для истощения TCR, содержащие одно или более из антитела к TCR, антитела к CD3 и антитела к CD52. Наборы можно применять в способах истощения, предложенных в данном документе.

[185] Согласно одному варианту реализации набор, предложенный в данном документе, содержит антитело к TCR и антитело к CD3. В наборе одно или оба из антитела к TCR и/или антитела к CD3 необязательно могут быть конъюгированы с биотином. Согласно конкретному варианту реализации как антитело к TCR, так и антитело к CD3 конъюгированы с биотином.

[186] Согласно одному варианту реализации набор, предложенный в данном документе, содержит антитело к TCR и антитело к CD52. В наборе одно или оба из антитела к TCR и/или антитела к CD52 необязательно могут быть конъюгированы с биотином. Согласно конкретному варианту реализации как антитело к TCR, так и антитело к CD52 конъюгированы с биотином.

[187] Согласно одному варианту реализации набор, предложенный в данном документе, содержит антитело к TCR, антитело к CD3 и антитело к CD52. В наборе одно или все из антитела к TCR и/или антитела к CD3 и/или антитела к CD52 необязательно могут быть конъюгированы с биотином. Согласно конкретному варианту реализации антитело к TCR, антитело к CD3 и антитело к CD52 все конъюгированы с биотином.

[188] Согласно другому аспекту набор, предложенный в данном документе, может дополнительно содержать антитело к биотину, которое конъюгировано с наноматриксом, несущим магнитные микрогранулы, гранулами размером с клетку или другой подложкой, такой как мембрана, направляемая акустической волной частица или гранула, пластиковый планшет или колонка. Антитело к биотину может быть предложено в конъюгированной форме или необязательно предложено в виде незащищенного антитела вместе с материалами, полезными для прикрепления антитела к наноматриксу, несущему магнитные микрогранулы, гранулам размером с клетку или другой подложке.

[189] Согласно конкретному варианту реализации набор, предложенный в данном документе, содержит антитело к TCR и антитело к CD3. В наборе одно или оба из антитела к TCR и/или антитела к CD3 необязательно могут быть конъюгированы непосредственно с магнитной гранулой, мембраной, направляемой акустической волной частицей, пластиковым планшетом или колонкой.

[190] Согласно конкретному варианту реализации набор, предложенный в данном документе, содержит антитело к TCR, антитело к CD3 и антитело к CD52. В наборе одно или оба из антитела к TCR и/или антитела к CD3 и/или антитела к CD52 необязательно могут быть конъюгированы непосредственно с магнитной гранулой, мембраной, направляемой акустической волной частицей, пластиковым планшетом или колонкой.

[191] Следует отметить, что, несмотря на то, что применение антител к биотину составляет один вариант реализации способов, раскрытых в данном документе, можно применять и другие средства захвата меченых биотином групп. Например, в раскрытых способах вместо антител к биотину можно использовать стрептавидин, авидин и другие связывающие биотин группы.

[192] Согласно настоящему раскрытию также предложены готовые изделия, содержащие любые из терапевтических композиций и наборов, описанных в данном документе. Примеры готового изделия включают сосуды (например, запечатанные флаконы), содержащие терапевтическое средство (например, популяцию TCR-истощенных клеток, которые могут дополнительно содержать CAR, полученную с применением способов, раскрытых в данном документе).

ПРИМЕРЫ

[193] Как показано в следующих примерах, раскрытый комбинированный подход с использованием антител привел к значительному улучшению эффективности истощения TCR⁺ клеток, что неожиданно уменьшило остаточный уровень TCR⁺ (%) с 0,1-1% до 0,1-0,01% по сравнению с использованием только антитела к TCR (измеренный в День 1 после истощения). Эти примеры демонстрируют значительные преимущества, которые обеспечивают раскрытые способы истощения по сравнению с существующими подходами к истощению TCR⁺ клеток. Эти преимущества могут принести пользу пациентам, получающим аллогенную терапию, в виде снижения вероятности того, что у пациента разовьется GvHD.

Пример 1. Комбинация антитела к TCR и антитела к CD3 повышает эффективность истощения TCR⁺ клеток

[194] Используя CAR-модифицированные иммунные клетки, экспрессию эндогенных генов TCR и CD52 подавляли с помощью электропорации TALEN®, направленной к генам TRAC и CD52. Затем клетки с подавленными генами TCR и CD52 подвергали воздействию реагентов для истощения TCR. Клетки приводили в контакт с первичным антителом к TCR, конъюгированным с биотином, по отдельности или в комбинации с антителом к CD3 или антителом к CD52, как показано в Таблице 1.

Затем к клеткам, меченным первичным антителом, также добавляли вторичное антитело к биотину, конъюгированное с магнитными микрогранулами (наночастицы диаметром примерно 50 нм), чтобы связать магнитные микрогранулы с любыми остаточными TCR⁺клетками за счет биотиновой группы на первичном антителе к TCR. Затем меченые клетки вносили в магнитную колонку с использованием прибора CliniMACS Prodigy®. TCR⁺клетки удерживались внутри магнитной колонки, в то время как немеченые TCR^- клетки проходили в пакет для сбора продукта. Затем TCR⁺клетки высвобождали из колонки в пакет для отходов. Эффективность истощения TCR⁺ клеток исследовали с использованием различных способов истощения, предложенных в настоящем раскрытии, и остаточные TCR⁺ клетки, присутствующие во фракции популяции TCR^- клеток, отслеживали в различные дни после истощения с использованием антитела к TCRα, антитела к TCRβ и/или антитела к CD3. На Фигуре 1 схематически представлены способы изготовления аллогенных CAR Τ с различными планами отдельных операций.

[195] Как показано на Фигуре 2А, процентная доля TCR⁺ клеток, присутствующих в продукте TCR^- истощенной популяции, полученной с применением различных способов истощения, существенно ниже 1% или меньше. На Фигуре 2А показано неожиданное снижение в 204 раза частоты TCR⁺ клеток при совместном применении антитела к TCR и антитела к CD3 в способе истощения, детектированное на день 2 после истощения, по сравнению с контрольным способом истощения с использованием низкой 1х концентрации антитела к TCR; эквивалентное снижение также наблюдали при обработке клеток антителами к TCR, к CD3 и к CD52. На Фигуре 2А также показано, что использование антитела к TCR и антитела к CD52, а также 3х концентрации антитела к TCR, было менее эффективным, чем обработка комбинацией антитела к TCR и антитела к CD3 при 3х концентрации антитела к TCR, которая привела к уменьшению в 6,2 раза, в то время как комбинация антитела к TCR и антитела к CD52 привела к уменьшению в 2,7 раза. Интересно отметить, что на Фигуре 2А продемонстрировано, что истощение с использованием антитела к CD52 и антитела к TCR было более эффективным, чем использование только антитела к TCR. Этот результат был неожиданным поскольку, как отмечено в данном документе, CD52 не имеет биологической ассоциации с TCR или комплексом TCR, и поэтому было неожиданным, что способы истощения с совместным применением этих двух антител были более эффективны в истощении TCR⁺ клеток, чем использование только антител к TCR. Результаты, показанные на Фигуре 2А, также неожиданно демонстрируют, что простое увеличение концентрации антитела к TCR не дает заметно лучших результатов, чем использование более низких концентраций антитела к TCR в комбинации с антителом к CD3.

[196] Истощенные популяции также исследовали на день 9 после истощения, и результаты показаны на Фигуре 2В. На Фигуре 2В показано снижение в 8 раз частоты TCR⁺ клеток при использовании в способе истощения антитела к TCR и антитела к CD3; эквивалентное снижение также наблюдали при обработке клеток антителом к TCR, антителом к CD3 и антителом к CD52. На Фигуре 2В также показано, что использование антитела к TCR и антитела к CD52, а также 3х концентрации антитела к TCR, было менее эффективным, чем обработка комбинацией антитела к TCR и антитела к CD3 при 3х концентрации антитела к TCR, которая привела к уменьшению в 5 раз, в то время как комбинация антитела к TCR и антитела к CD52 привела к уменьшению в 2 раза. Эти результаты демонстрируют, что простое увеличение концентрации антител к TCR не дает заметно лучших результатов, чем использование более низких концентраций антитела к TCR в комбинации с антителом к CD3.

[197] Графики FACS на Фигуре 3А визуализировали минимальное присутствие TCR⁺ клеток, когда метод истощения выполняли с использованием антитела к TCR и антитела к CD3, по сравнению с антителом к TCR по отдельности или в комбинации с антителом к CD3 и/или антителом к CD52, или с повышенной (3х) концентрацией антитела к TCR. Данные собирали в День 0 и День 1 после истощения и сравнивали с образцами клеток до истощения. Эти результаты также демонстрируют, что простое увеличение концентрации антител к TCR не дает заметно лучших результатов, чем использование более низких концентраций антитела к TCR в комбинации с антителом к CD3 на протяжении исследованных дней.

[198] Числовая гистограмма на Фигуре 3В показывает снижение в 151- и 23-32 раза частоты TCR⁺ клеток, когда антитело к TCR и антитело к CD3 использовали в способе истощения в День 0 и День 1 после истощения по сравнению с контрольным способом истощения с использованием низкой 1х концентрации антитела к TCR; эквивалентное снижение в 70 раз также наблюдали при обработке клеток антителом к TCR, антителом к CD3 и антителом к CD52. Следует отметить, что в имеющихся в настоящий момент операциях по истощению TCR используется только стандартная 1х концентрация антитела к TCR, что представляет собой различие между раскрытыми способами и понимается как современный уровень техники. На Фигуре ЗВ также показано, что использование антитела к TCR и антитела к CD52, а также 3х концентрации антитела к TCR, было менее эффективным, чем обработка комбинацией антитела к TCR и антитела к CD3 при 3х концентрации антитела к TCR, которая привела к снижению в 19 и 7 раз, в то время как комбинация антитела к TCR и антитела к CD52 привела к снижению в 2,7 и 1,6 раза. Эти результаты также демонстрируют, что простое увеличение концентрации антител к TCR не дает заметно лучших результатов, чем использование более низких концентраций антитела к TCR в комбинации с антителом к CD3 на протяжении исследованных дней.

[199] На Фигуре 4 представлен график FACS данных, собранных в День 0 и День 1 после истощения, и дополнительно продемонстрировано, что комбинация антитела к TCR и антитела к CD3 обеспечивает более высокий уровень истощения TCR, чем использование только антитела к TCR в высокой (3х) или низкой (1х) концентрации, а также использование антитела к TCR в комбинации с антителом к CD52. Остаточные TCR⁺ клетки после истощения визуализировали с помощью одиночного окрашивания антителом к TCR, антителом к CD3 или двойного окрашивания антителами к TCR/CD3, и, как ожидается, они будут положительно окрашены по TCR⁺, CD3⁺или CD3⁺/TCR⁺. Небольшая популяция клеток, окрашенных как CD3⁺/TCR^-, отражает оставшиеся TCRγδ Т-клетки, присутствующие в истощенной TCR^- популяции клеток, поскольку TCRγδ Т-клетки, как ожидается, будут удалены с помощью антитела к CD3.

Пример 2. Культивирование после истощения

[200] Этот пример демонстрирует, что популяции истощенных иммунных клеток сохраняли такие же низкие остаточные уровни TCR⁺ во время культивирования после истощения. В День 1 после истощения истощенные клетки замораживали, а затем размораживали для культивирования после истощения. Уровни экспрессии TCR и CD3 детектировали до замораживания и сразу после размораживания. Как показано на Фигурах 5А-5Е, отсутствовало значительное различие частоты TCR и CD3 из-за цикла замораживания-размораживания; на Фигуре 5А показана частота TCR⁺, CD3⁺, CD3⁺/TCR^-и CD3⁺/TCR⁺ клеток до замораживания и после размораживания, представленная как график FACS, полученный с использованием одиночного окрашивания антителом к TCR, антителом к CD3 или двойного окрашивания антителами к TCR/CD3, на Фигуре 5В в числовом виде изображена частота TCR⁺ клеток перед замораживанием и после размораживания, полученная с использованием антитела к TCR, на Фигуре 5С в числовом виде изображена частота CD3⁺ клеток перед замораживанием и после размораживания, полученная с использованием антитела к CD3⁺, на Фигуре 5D в числовом виде изображена частота CD3⁺/TCR^- клеток перед замораживанием и после размораживания, полученная с использованием антител к TCR/CD3, а на Фигуре 5Е в числовом виде изображена частота CD3⁺/TCR⁺ клеток перед замораживанием и после размораживания, полученная с использованием антител к TCR/CD3.

[201] Чтобы определить, будет ли увеличиваться частота остаточных TCR⁺ клеток в истощенной TCR^- популяции клеток со временем культивирования, истощенные клетки культивировали в течение 10 дней после истощения. Частоты TCR и CD3 клеток детектировали с использованием одиночного окрашивания антителом к TCR (Фигура 6) и антителом к CD3 (Фигура 7) или двойного окрашивания антителами к TCR/CD3 (Фигура 8) каждые 2-3 дня в течение всего процесса культивирования. В частности, графики FACS на Фигуре 6, 7 и 8 показывают, что, несмотря на тенденцию постепенного увеличения частоты TCR⁺, CD3⁺ или CD3⁺/TCR⁺ клеток с последующим достижением пика примерно через 5-7 дней во время культивирования после истощения для всех способов истощения, культуры, истощенные с использованием комбинации антитела к TCR, антитела к CD3 и/или антитела к CD52, сохраняли одинаковую более низкую частоту TCR⁺ или CD3⁺ клеток с течением времени, по сравнению с культурами, обработанными только антителом к TCR в низкой или высокой концентрации или антителом к TCR в комбинации с антителом к CD52.

[202] Далее, гистограммы на Фигуре 9А, 9В, 9С и 9D в числовом виде изображают частоту TCR⁺, CD3⁺, CD3⁺/TCR^- или CD3⁺/TCR⁺ во время культивирования после истощения.

[203] Кроме того, в период культивирования после истощения также контролировали статус размножения клеток, включая плотность жизнеспособных клеток (Фигура 10А), жизнеспособность (Фигура 10В), диаметр клеток (Фигура 10С) при каждом пассаже и общую кратность размножения (Фигура 10D). В целом для всех исследованных способов истощения наблюдали сопоставимые характеристики размножения клеток.

[204] Также исследовали эффективность истощения CD52 с использованием различных комбинаций антител, раскрытых в данном документе. В частности, антитело к CD52 по отдельности или в комбинации с другими антителами использовали для истощения CD52, также исследовали влияние антитела к TCR и/или антитела к CD3, используемых для истощения TCR⁺ клеток, на удаление CD52⁺ клеток. Графики FACS на Фигуре 11А показывают частоту остаточных CD52⁺ клеток после истощения в День 0 и День 1 после истощения. Гистограмма на Фигуре 11В показывает в числовом виде частоту остаточных CD52⁺ клеток. Наконец, графики FACS на Фигуре 12 показывают частоту остаточных CD52⁺ клеток в течение 10-дневного культивирования после истощения.

[205] Подытоживая, данные из Примера 2 продемонстрировали, что использование как антитела к TCR, так и антитела к CD3 повышает эффективность истощения TCR⁺ клеток. Использование антитела к CD3 в дополнение к антителу к TCR удаляло CD3⁺/TCR⁺ клетки в большей степени, чем использование только антитела к TCR. Этот механизм истощения обеспечивает повышенную эффективность истощения TCR⁺ клеток и может представлять собой значительное преимущество для терапевтических аллогенных приложений. Клетки после истощения показали сходное размножение для всех условий во время культивирования после истощения, это указывает на то, что способы истощения не влияли на жизнеспособность и размножение клеток.

Группа изобретений относится к клеточной биологии. Предложены улучшенные способы надежного истощения TCR⁺ клеток и получения популяций TCR^- клеток, которые могут быть подходящими для минимизации риска отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD) у пациентов, получающих терапию аллогенными CAR Т-клетками. Способы предусматривают мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3 и выделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, из указанной популяции иммунных клеток. Также предложены набор для истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, и популяции клеток. Полученная популяция иммунных клеток содержит по меньшей мере 99,99% TCR^- клеток. 6 н. и 28 з.п. ф-лы, 12 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ получения популяции иммунных клеток, истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, причем указанный способ включает:

(a) мечение популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3; и

(b) выделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, из указанной популяции иммунных клеток.

2. Способ истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, из популяции иммунных клеток, включающий:

(a) мечение указанной популяции иммунных клеток антителом к TCR и антителом к CD3;

(b) отделение иммунных клеток, меченных антителом к TCR, и иммунных клеток, меченных антителом к CD3, от немеченых иммунных клеток; и

(c) сбор указанных немеченых иммунных клеток,

с получением посредством этого популяции иммунных клеток, которые истощены по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR.

3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий мечение популяции иммунных клеток антителом к CD52; и истощение или отделение иммунных клеток, меченных антителом к CD52, из популяции иммунных клеток.

4. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий: мечение популяции иммунных клеток антителом к CD52; и истощение иммунных клеток, меченных антителом к CD52, из указанной популяции иммунных клеток.

5. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий: мечение популяции иммунных клеток антителом к CD52; и отделение иммунных клеток, меченных антителом к CD52, от немеченых иммунных клеток.

6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано с биотином.

7. Способ по п. 6, дополнительно включающий приведение указанных меченых клеток в контакт с агентом, который специфично распознает биотин.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанный агент, который специфично распознает биотин, выбран из группы, состоящей из антитела к биотину, авидина и стрептавидина.

9. Способ по п. 7 или 8, отличающийся тем, что указанный агент конъюгирован с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной.

10. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 непосредственно конъюгировано с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной.

11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанное отделение достигается с использованием одного из магнитного отделения или отделения с помощью акустической волны.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные иммунные клетки представляют собой аллогенные иммунные клетки.

13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанные иммунные клетки генетически модифицированы, чтобы быть дефицитными по гену эндогенного TCRα или TCRβ, для уменьшения или устранения экспрессии эндогенного TCR.

14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что указанные иммунные клетки генетически модифицированы, чтобы быть дефицитными по гену эндогенного CD52, для уменьшения или устранения экспрессии эндогенного CD52.

15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что указанные иммунные клетки генетически модифицированы для уменьшения или устранения экспрессии одного или более из эндогенного TCRα, TCRβ и эндогенного CD52.

16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что указанное уменьшение или устранение экспрессии эндогенного TCR или эндогенного CD52 или как эндогенного TCR, так и эндогенного CD52 достигается с использованием TALEN, CRISPR/Cas9, нуклеазы с цинковым пальцем (ZFN), MegaTAL, мегануклеазы, Cpfl, гомологичной рекомбинации или одноцепочечного олигодезоксинуклеотида (ssODN).

17. Способ по любому из пп. 1-16, отличающийся тем, что указанные иммунные клетки представляют собой сконструированные иммунные клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор.

18. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит не более 1,0% TCR⁺ клеток, не более 0,9% TCR⁺ клеток, не более 0,8% TCR⁺ клеток, не более 0,7% TCR⁺ клеток, не более 0,6% TCR⁺ клеток, не более 0,5% TCR⁺ клеток, не более 0,4% TCR⁺ клеток, не более 0,3% TCR⁺ клеток, не более 0,2% TCR⁺ клеток или не более 0,1% TCR⁺ клеток.

19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит 0,01-0,001% TCR⁺ клеток непосредственно после истощения.

20. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит 0,1-0,01% TCR⁺ клеток через 1-10 дней культивирования после истощения.

21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит менее 0,1-1,0% TCR⁺ клеток через 1 день культивирования после истощения.

22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанная популяция клеток, которая истощена по клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, содержит менее 0,1-1,0% TCR⁺ клеток через 10 дней культивирования после истощения.

23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная иммунная клетка представляет собой Т-клетку.

24. Популяция иммунных клеток для предотвращения или снижения отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), причем популяция является истощенной по иммунным клеткам, экспрессирующим эндогенный TCR, и получена с помощью способа по любому из пп. 1-23, причем популяция содержит не более чем 0,01% TCR⁺ клеток.

25. Популяция сконструированных Т-клеток для предотвращения или снижения отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), причем популяция содержит по меньшей мере 99,99% TCR^- клеток, и получена способом по любому из пп. 1, 2.

26. Популяция сконструированных Т-клеток для предотвращения или снижения отторжения «хозяин против трансплантата» (HvGD) и болезни «трансплантат против хозяина» (GvHD), причем популяция содержит по меньшей мере 99,999% TCR^- клеток, и получена способом по любому из пп. 1, 2.

27. Популяция сконструированных Т-клеток по любому из пп. 25, 26, отличающаяся тем, что указанная популяция Т-клеток экспрессирует химерный антигенный рецептор.

28. Набор для истощения клеток, экспрессирующих эндогенный TCR, способом по любому из пп. 1, 2 из популяции иммунных клеток, содержащий антитело к TCR и антитело к CD3.

29. Набор по п. 28, дополнительно содержащий антитело к CD52.

30. Набор по любому из пп. 28, 29, отличающийся тем, что указанное антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано с агентом, который специфично распознает биотин.

31. Набор по п. 30, отличающийся тем, что указанный агент, который специфично распознает биотин, выбран из группы, состоящей из антитела к биотину, стрептавидина и авидина.

32. Набор по п. 30 или 31, отличающийся тем, что указанный агент конъюгирован с магнитной гранулой, гранулой агарозы, направляемой акустической волной частицей, пластиковым луночным планшетом, стеклянным луночным планшетом, керамическим луночным планшетом, колонкой, пакетом для культивирования клеток или мембраной.

33. Набор по любому из пп. 28-31, отличающийся тем, что указанное антитело к TCR, антитело к CD3 и/или антитело к CD52 конъюгировано непосредственно с подложкой.

34. Набор по п. 33, отличающийся тем, что указанная подложка представляет собой одно из магнитной гранулы, гранулы агарозы, направляемой акустической волной частицы, пластикового луночного планшета, стеклянного луночного планшета, керамического луночного планшета, колонки, пакета для культивирования клеток или мембраны.