Способ обнаружения генетического материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и вирусологии и позволяет обнаруживать генетический материал норовируса GI в образцах биологического материала от пациентов. Предназначено для обнаружения генетического материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с использованием праймеров и флуоресцентно-меченого зонда (Taqman) следующего состава: прямой праймер Nq1F (5 - CCATGTTYCGCTGGATGC - 3', впервые описан авторами изобретения), обратный праймер NVGI-R1 (5'- CCTTAGACGCCATCATCATTTAC - 3', описан ранее, патент CN103146846A, SEQ ID NO.5), флуоресцентно-меченый зонд (Taqman) Nq1P (5' - FAM - TGTGGRCAGGAGAYCGCRATCT - BHQ1 - 3', впервые описан авторами изобретения), в котором 5-я и 16-я позиции содержат модификацию (замкнутая нуклеиновая кислота).

Уровень техники

Норовирусы являются основной причиной небактериального гастроэнтерита во всех возрастных группах по всему миру, и представляют угрозу для общественного здоровья, вызывая вспышки в медицинских организациях и различных организованных коллективах [1]. Норовирусы относятся к РНК-содержащим вирусам, характеризуются значительным генетическим разнообразием и быстро эволюционируют. Геном возбудителя разделен на три открытые рамки считывания (ОРС), где ОРС1 кодирует неструктурные вирусные белки, включая РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), а ОРС2 и ОРС3 кодируют структурные белки. Генетически норовирусы можно разделить на 10 геногрупп (GI - GX), из которых основными возбудителями норовирусной инфекции (НВИ) у людей являются геногруппы GI и GII [2].

Эпидемиологическими особенностями НВИ являются длительное выделение возбудителя из организма больных, реализация различных путей передачи (пищевого, водного, контактно-бытового), высокая контагиозность [3]. В сочетании со сложностями культивирования норовирусов, затрудняющими создание эффективной вакцины, эти обстоятельства обусловливают важность разработки мер неспецифической профилактики норовирусной инфекции (НВИ), а также совершенствования системы эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики норовирусов [4].

На сегодняшний день золотым стандартом для обнаружения РНК норовируса в клинических образцах стала полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Наиболее консервативной областью генома норовируса является участок на стыке ОРС 1 и 2, который и является основной мишенью для подбора специфичных праймеров и зондов. Несмотря на достигнутые успехи в данной области, отдельную сложность представляет разработка метода обнаружения норовируса GI, связанная с высокой генетической изменчивостью возбудителя, в связи с чем существует рекомендация проводить повторный подбор олигонуклеотидов по мере накопления мутаций в соответствующей части генома [5].

Известен способ обнаружения генетического материала норовируса GI в биологических образцах, включающий в себя следующие олигонуклеотиды (EP2780477B1 [6]): прямой праймер Cog1F (5'-CGYTGGATGCGITTYCATGA-3'), обратный праймер Cog1R (5'-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3'), флуоресцентно-меченый зонд Ring 1E (5'-TGGACAGGRGAYCGC-3'). Описанные праймеры и зонды используются в концентрации 400 нМ и 200 нМ на реакцию соответственно. Недостатком описанного способа является низкая температура плавления зонда, вследствие чего требуется особая усложненная технология синтеза с использованием гасителя MGB.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является способ обнаружения генетического материала норовируса GI с использованием следующей комбинации олигонуклеотидов (CN103146846A [7]): прямой праймер NVG I-F1 (5'-TGGATGCGBTTCCATGA-3'), обратный праймер NVGI-R1 (5'-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3'), флуоресцентно-меченый зонд Nq1P (5'-HEX-CAGGAGATCGCAATCTCCTGCCCGA-BHQ1-3'). Недостатком данного способа в отличие от заявляемого является меньшее соответствие прямого праймера и зонда последовательностям геномов норовируса GI (согласно данным, представленным в базе генетических данных GenBank), в то время как последовательности прямого праймера и зонда для предлагаемого способа смещены к более консервативной области генетической последовательности искомого возбудителя. Кроме того, в предлагаемом способе длина последовательности зонда меньше, чем в существующем способе, при этом необходимая температура плавления зонда в предлагаемом способе достигнута за счет модификации нуклеотидов в 5-й и 16-й позициях (замкнутая нуклеиновая кислота).

Раскрытие сущности изобретения

Задачей изобретения является создание способа обнаружения генетического материала норовируса GI в различных видах клинического материала от пациентов путем амплификации специфического фрагмента генома возбудителя с помощью праймеров и флуоресцентно-меченого зонда.

Технический результат заявляемого изобретения: способ позволяет обнаружить генетический материал норовируса GI путем амплификации фрагмента генома, кодирующего фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу и поверхностный белок норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

В ходе реакции происходит гибридизационно-флуоресцентная детекция накопления продукта амплификации в режиме реального времени с применением не охарактеризованного ранее прямого праймера и флуоресцентно-меченого зонда.

Заявляется способ обнаружения генетического материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, заключающийся в том, что выделяют нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл методом переосаждения, с полученными образцами нуклеиновых кислот ставят реакцию обратной транскрипции с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл. Полученный образец кДНК исследуют с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,4 мкМ праймера Nq1F, 0,4 мкМ праймера NVGI-R1, 0,6 мкМ флуоресцентно-меченого зонда Nq1P, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляют 5 мкл исследуемой кДНК, реакцию проводят в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 60°C в течение 40 секунд.

Указанный технический результат достигается использованием впервые описанных прямого олигонуклеотидного праймера и флуоресцентно-меченого зонда, а также ранее описанного обратного праймера (патент CN103146846A, SEQ ID NO.5), позволяющих специфично обнаруживать генетический материал норовируса GI.

Праймеры:

Nq1F (прямой праймер): 5'- CCATGTTYCGCTGGATGC - 3';

NVGI-R1 (обратный праймер): 5'- CCTTAGACGCCATCATCATTTAC - 3';

Зонд:

Nq1P: 5'- FAM - TGTGGRCAGGAGAYCGCRATCT - BHQ1 - 3',

где FAM - флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин с длиной волны флуоресценции 520 нм, BHQ-1 (Black Hole Quencher® 1) - гаситель флуоресценции со спектром поглощения 480-580 нм, 5-я и 16-я позиции содержат модификацию (замкнутая нуклеиновая кислота).

Краткое описание иллюстраций

Изобретение поясняется фигурами иллюстраций.

На Фиг.1 представлены последовательности рассматриваемых праймеров и флуоресцентно-меченых зондов (Taqman) (EP2780477B1, CN103146846A, предлагаемый способ) относительно множественного выравнивания последовательностей фрагментов генома норовируса GI, опубликованных в базе данных GenBank в 2019-2023 гг. (n=1188) и их консенсусной последовательности. Вариабельные участки обозначены светлой заливкой.

На Фиг.2 представлена диаграмма амплификации образцов, содержащих генетический материал норовируса GI, в ПЦР-РВ с использованием предлагаемого способа. Во всех шести образцах, содержащих генетический материал норовируса GI, обнаружено нарастание флуоресцентного сигнала, соответствующего амплификации генетического материала норовируса GI

На Фиг.3 представлена диаграмма амплификации образцов, содержащих генетический материал норовируса GI (образцы № 235, 236, 238, 239, 241, 242, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250), а также отрицательный контрольный образец (ОКО) и образец, содержащий генетический материал норовируса GI. Во всех 13 образцах, содержащих генетический материал норовируса GI, обнаружено нарастание флуоресцентного сигнала, соответствующего амплификации генетического материала норовируса GI. В отрицательном контрольном образце и образце норовируса GII нарастания флуоресцентного сигнала не обнаруживается, что указывает на отсутствие амплификации.

Осуществление изобретения

Обнаружение генетического материала норовируса GI с использованием предлагаемого способа.

Исследуемым клиническим материалом были образцы фекалий (n=6), в которых норовирус GI был обнаружен методов ПЦР с последующим секвенированием согласно ранее описанной методике [8]. Нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл выделяли методом переосаждения с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. С полученными образцами нуклеиновых кислот ставили реакцию обратной транскрипции с использованием набора РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл.

Полученный образец кДНК исследовали предлагаемым способом с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,4 мкМ праймера Nq1F, 0,4 мкМ праймера NVGI-R1, 0,6 мкМ флуоресцентно-меченого зонда Nq1P, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляли 5 мкл исследуемой кДНК. Концентрация ионов магния в готовой смеси составила 3мМ, каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов - 0,12 мМ. Реакция ставилась в конечном объеме 25 мкл.

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 60°C в течение 40 секунд. Для проведения исследования использовался прибор StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems™, США). Детекцию флуоресцентного сигнала проводили в конце каждого цикла амплификации по каналу FAM. Во всех исследованных образцах была обнаружена флуоресценция, соответствующая амплификации генетического материала норовируса GI (Фиг.2).

Разработанные праймеры и флуоресцентно-меченый зонд направлены на типоспецифическое обнаружение фрагмента генома норовируса GI. Праймеры и флуоресцентно-меченый зонд являются комплементарными амплифицируемой последовательности кДНК. Прямой и обратный праймеры фланкируют вышеуказанный фрагмент и обеспечивают возможность синтеза дочерней цепи ДНК. При этом происходит активация флуоресцентной метки зонда и нарастание уровня флуоресценции по мере накопления продукта амплификации в режиме реального времени, что позволяет обнаруживать в исследуемом образце нуклеиновую кислоту норовируса GI. Длина получаемого ампликона составляет 94 нуклеотида.

Пример 1. Обнаружение генетического материала норовируса GI с использованием предлагаемого способа

Исследуемым клиническим материалом были образцы фекалий (n=13), в которых методом ПЦР с последующим секвенированием согласно ранее описанной методике [8] был обнаружен генетический материал норовируса GI. Также исследовался отрицательный контрольный образец и образец, содержащий генетический материал норовируса GII. Нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл выделяли методом переосаждения с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. С полученными образцами нуклеиновых кислот ставили реакцию обратной транскрипции с использованием набора РЕВЕРТА-L (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл.

Полученный образец кДНК исследовали предлагаемым способом с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,4 мкМ праймера Nq1F, 0,4 мкМ праймера NVGI-R1, 0,6 мкМ флуоресцентно-меченого зонда Nq1P, 13 мкл воды. Для постановки реакции к полученной смеси добавляли 5 мкл исследуемой кДНК. Концентрация ионов магния в готовой смеси составила 3мМ, каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов - 0,12 мМ. Реакция ставилась в конечном объеме 25 мкл.

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительная денатурация при 95°C в течение 5 минут, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95°C в течение 15 секунд и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 60°C в течение 40 секунд. Для проведения исследования использовался прибор StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems™, США). Детекцию флуоресцентного сигнала проводили в конце каждого цикла амплификации по каналу FAM. В 13 образцах, заведомо содержащих генетический материал норовируса GI, было обнаружено нарастание флуоресцентного сигнала, соответствующее амплификации генетического материала норовируса GI В отрицательном контрольном образце и образце норовируса GII флуоресценция не обнаруживалась, что соответствует отрицательному результату (Фиг.3).

Список литературы

1. Farahmand M., Moghoofei M., Dorost A., et al. Global prevalence and genotype distribution of norovirus infection in children with gastroenteritis: A meta-analysis on 6 years of research from 2015 to 2020 // Reviews in Medical Virology. - 2021. - Vol. 32, № 1. - P. e2237.

2. Chhabra P., Browne H., Huynh T., и др. Single-step RT-PCR assay for dual genotyping of GI and GII norovirus strains // Journal of Clinical Virology. - 2021. - Т. 134.- С. 104689.

3. Хохлова Н.И., Капустин Д.В., Краснова Е.И., et al. Норовирусная инфекция (обзор литературы): 1 // Журнал инфектологии. - 2018. - Vol. 10, № 1. - P. 5-14.

4. А.А. Косова, В.И. Чалапа, Т.М. Итани, и др. Эпидемиологическая характеристика норовирусной инфекции: 3 // Уральский медицинский журнал. - Россия, Екатеринбург: Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования «Уральский государственный медицинский университет», 2022. - Т. 21, № 3. - С. 114-128.

5. Vinjé J. Advances in Laboratory Methods for Detection and Typing of Norovirus // Journal of Clinical Microbiology. - American Society for Microbiology (ASM), 2015. - Vol. 53, № 2. - P. 373.

6. Vinje J., GREGORICUS N., CHHABRA P., et al. Selective detection of norovirus: pat. EP 2780477 B1 USA. - 2018.

7. pat. CN103146846A USA. - 2013.

Таблица 1. Последовательности праймеров и флуоресцентно-меченого зонда (Taqman) для обнаружения генетического материала норовируса GI (позиции последовательностей праймеров и зондов определены относительно изолята Shimizu, NCBI Reference Sequence: NC_039897.1). Полужирным выделением с нижним подчеркиванием обозначена модификация - замкнутая нуклеиновая кислота.

8. Cannon J.L., Barclay L., Collins N.R., et al. Genetic and Epidemiologic Trends of Norovirus Outbreaks in the United States from 2013 to 2016 Demonstrated Emergence of Novel GII.4 Recombinant Viruses // Journal of Clinical Microbiology. - American Society for Microbiology, 2017. - Vol. 55, № 7. - P. 2208-2221.

Таблица 1. Последовательности праймеров и флуоресцентно-меченого зонда (Taqman) для обнаружения генетического материала норовируса GI (позиции последовательностей праймеров и зондов определены относительно изолята Shimizu, NCBI Reference Sequence: NC_039897.1). Полужирным выделением с нижним подчеркиванием обозначена модификация - замкнутая нуклеиновая кислота.

№ п/п Обозначение праймера / флуоресцентно-меченого зонда Краситель Последовательность
(5'-3') Гаситель Длина последовательности Позиция последовательности относительно генома искомого возбудителя 1 Nq1F - CCATGTTYCGCTGGATGC - 18 5313-5330 2 Nq1P FAM TGTGGRCAGGAGAYCGCRATCT BHQ1 22 5349-5370 3 NVGI-R1 - CCTTAGACGCCATCATCATTTAC - 23 5384-5406

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-06-19"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ

обнаружения генетического материала норовируса GI методом

полимеразной цепной реакции в реальном времени.xml"

dtdVersion="V1_3">

<ApplicantFileReference>937</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>937</ApplicationNumberText>

<FilingDate/>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ФНИИВИ "Виром"

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBIS FSRIVI "Virome"

Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Чалапа Владислав

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Chalapa Vladislav Igorevich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ обнаружения генетического

материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в

реальном времени</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccatgttycgctggatgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccttagacgccatcatcatttac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtggrcaggagaycgcratct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ обнаружения генетического материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с применением разработанных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда. Вывод о наличии генетического материала норовируса GI делается при нарастании уровня флуоресценции по каналу FAM. Технический результат заявляемого изобретения заключается в возможности обнаружить генетический материал норовируса GI путем амплификации фрагмента генома, кодирующего фермент РНК-зависимую РНК-полимеразу и поверхностный белок норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ обнаружения генетического материала норовируса GI методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, заключающийся в том, что выделяют нуклеиновые кислоты из образцов объемом 100 мкл методом переосаждения, с полученными образцами нуклеиновых кислот ставят реакцию обратной транскрипции с получением раствора комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) объемом 40 мкл, полученный образец кДНК исследуют с использованием реакционной смеси следующего состава: 5 мкл готовой реакционной смеси, предназначенной для пятикратного разведения, 0,4 мкМ праймера 5'-CCATGTTYCGCTGGATGC-3', 0,4 мкМ праймера 5'-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3', 0,6 мкМ флуоресцентно-меченого зонда FAM-5'-TGTGGRCAGGAGAYCGCRATCT-3'-BHQ1, 13 мкл воды, для постановки реакции к полученной смеси добавляют 5 мкл исследуемой кДНК, реакцию проводят в следующих условиях: предварительная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, далее 45 циклов реакции, включающих денатурацию при 95 °C в течение 15 с и отжиг праймеров и зонда с элонгацией при 60 °C в течение 40 с, в конце каждого цикла проводят детекцию флуоресцентного сигнала, где вывод о наличии генетического материала норовируса GI делается при нарастании уровня флуоресценции по каналу FAM.