Нейроимплантат для восстановления спинного мозга Российский патент 2024 года по МПК A61F2/90 A61K47/58 A61P25/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области регенеративной медицины, а именно к нейрохирургии, и может быть использован для ускорения направленной регенерации нервной ткани при травмах спинного мозга.

Уровень техники

На сегодняшний день травма спинного мозга является наиболее сложно поддающимся лечению повреждением с высоким уровнем последующей инвалидизации. Под травмой спинного мозга понимают компрессионное сдавливание, высокоэнергетическое воздействие или даже нарушение целостности столба спинного мозга. Это повреждение приводит к временному или постоянному нарушению передачи сигналов по стволу спинного мозга ниже участка травмы и часто приводит к необратимой потере функциональности органов и парализации. Существующие методы терапии подразумевают хирургическое снятие декомпрессии и симптоматически применяемые противовоспалительные препараты, которые не обеспечивают восстановления тканей и не способны в полной мере остановить воспалительные процессы, нарушающие работу всей нервной системы. Для решения этой проблемы можно прибегнуть к использованию конструкций из искусственных гибридных материалов, которые можно комбинировать с лекарственными веществами или клеточной терапией.

Из уровня техники известны различные методы формирования скаффолдов, то есть пористых конструкций, из различных материалов, в том числе на основе поливинилового спирта (ПВС). Назначение скаффолдов - тканевая инженерия и локальная доставка лекарств (GARG Т. et al. Scaffold: A Novel Carrier for Cell and Drug Delivery. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 2012. - 29(1), 1-63. https://doi: 10.1615/critrevtherdrugcar).

Несмотря на широту применения различных методов для создания пористых структур в том числе и на основе ПВС, данный обзор не предлагает использование данного полимера для применения в регенерации нервной ткани. Авторы рассматривают их использование лишь в тканевой инженерии хрящевой и костной ткани, а также для доставки лекарств. Кроме того, методом формирования скаффолда на основе ПВС представлен только электроспиннг. Кроме того, метод рассмотрен отдельно, не показывается преимущество использования комбинации различных методов для решения конкретных задач.

Кроме того, хорошо известен процесс электроформования поливинилового спирта. Для полимера исследованы влияние концентрации раствора, подачи раствора, напряжения и расстояния от иглы до коллектора на процесс электроформования и получаемые волокна (ЛЕБЕДЕВА А.В. и др. Исследование получения нановолокон из водных растворов поливинилового спирта методом электроспиннинга. Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2022;84(2):210-220. https://doi.Org/10.20914/2310-1202-2022-2-210-220)

Однако в данной работе не представлены параметры электроформования, приводящие к получению ориентированных волокон, что важно для применения в нейрорегенеративных процессах. Кроме того, не рассматриваются методы сшивки и обеспечение стабильности волокон в водной среде и не раскрываются особенности создания слоистых систем.

В уровне техники также существуют математические модели, созданные для оптимизации процессов электроспиннинга отдельных полимеров. Такая модель известна для ПВС и подразумевает подбор оптимального режима получения волокнистого материала с меньшим разбросом диаметра волокна, в том числе применимая и для направленных волокон (ELKASABY М. et al. Modeling and optimization of electrospinning of polyvinyl alcohol. Adv Polym Technol. 2017;00:1-9. https://doi.org/10.1002/adv.21869)

Данная работа и созданная модель может служить инструментом для подбора оптимальных параметров процесса электроспиннинга ПВС, однако не показывает возможности использования модели для создания слоистых конструкций. Кроме того, авторами не представлены методы обработки полимера после процесса электроспиннинга для дальнейшего использования волокон в водной среде.

Из уровня техники также известны материаловедческие подходы по регенерации периферической нервной системы. Например, нервный кондуит, состоящий из двух слоев поликапролактона. Внешний слой представляет собой пленку, внутренний направленные волокна, покрытые биоактивными веществами. Кондуит заполнялся гидрогелем на основе ПВС и ПЭГ (US 9707000 B2 (Johns Hopkins University) 2013-11-15).

Однако в данном патенте фокус направлен на периферическую нервную систему, а в качестве основного материала выбран полимер поликапролактон, механические свойства которого значительно выше механических свойств тканей спинного мозга и периферических нервов, а способность к набуханию крайне низка, что может иметь значительное влияние на приживаемость данной системы в организме.

Также известен другой метод использования направленных волокон в восстановлении нервных тканей. Для этого создают лист из двух слоев волокон, направленных перпендикулярно друг другу. Затем, его скручивают в кондуит для последующего использования в регенерации нервных тканей (US 20190350688 A1 (Johns Hopkins University Rensselaer Polytechnic Institute) 2019-07-29).

Недостатком такой конструкции являются предлагаемые к использованию негигроскопичные синтетические полимеры, растворяемые в токсичных растворителях, обладающие высокими механическими свойствами. Кроме того, конструкция из двух волокнистых слоев не может обеспечить легкую установку в водной среде за счет слипания и сворачивания подобного материала.

Решаемой в настоящем изобретении технической проблемой является создание нейроимплантата, устраняющего недостатки аналогов.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат, обеспечиваемый настоящим изобретением при решении вышеуказанной технической проблемы, заключается в увеличении регенеративного потенциала и возможности ускорения восстановления спинного мозга при острой травме за счет создания гигроскопичной двуслойной структуры, строение которой, способствует фиксации имплантата и направленной регенерации нервной ткани.

Технический результат достигается за счет создания комбинации из направленной субмикронной волокнистой структуры для прикрепления и пролиферации клеток спинного мозга и сетчатой структуры, обеспечивающей фиксированное положение волокнистой части, также данная полимерная решетка выступает в роли скаффолда для твердой оболочки спинного мозга.

Технический результат достигается за счет следующей совокупности признаков:

Объект «Нейроимплантат для регенерации нервной ткани спинного мозга»:

нейроимплантат выполнен в виде биодеградируемой гибридной слоистой конструкции на основе водорастворимого полимера,

нейроимплантат состоит из двух слоев: первого слоя - решетчатой структуры, изготовленной для замещения соединительнотканного слоя спинного мозга и адгезии и пролиферации клеток, за счет созданных пор размером 70-130 мкм, и второго слоя -электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами,

слои выполнены соединенными друг с другом посредством когезии.

В качестве водорастворимого полимера может быть использован поливиниловый спирт. Поливиниловый спирт (ПВС) - искусственный, термопластичный, водорастворимый, биосовместимый и биодеградируемый полимер. Эти характеристики позволяют использовать данный материал в хирургии. Синтез ПВС происходит в результате реакции гидролиза, проводимой в щелочной или кислотной среде, либо путем алкоголиза поливиниловых сложных эфиров. Наличие гидроксильной группы -ОН в каждом звене цепи определяет высокую гигроскопичность поливинилового спирта.

Объект «Способ получения указанного выше нейроимплантата»: изготовление слоистой конструкции путем получения первого слоя - решетчатой структуры, путем печати на FDM-принтере, и получения второго слоя -электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами, слои соединяют друг с другом посредством когезии,

после чего полученную слоистую конструкцию обрабатывают в глутаральдегидовом сшивающем растворе,

отмывают в буферном растворе,

стерилизуют.

Слой, который при имплантации направлен на поврежденную поверхность спинного мозга, получается методом электроспиннинга. Электроспиннинг - метод формирования нано- и субмикронных волокон из растворенного полимера. Матриксы, полученные данным подходом, являются оптимальными для создания скаффолда для тканевой инженерии, так как позволяет создать ориентированную субмикронную высокопористую волокнистую структуру, которая лежит в основе внеклеточного матрикса тканей организма. Ориентация волокон является направляющей для клеточного роста нервной ткани спинного мозга, что способствует лучшему восстановлению тканей и впоследствии их функциональности.

Твердая оболочка - прочная, соединительнотканная внешняя составляющая спинного мозга, состоящая, в основном, из соединительной ткани и сосудов. Эта оболочка несет в себе защитную функцию мозга. Часть нейроимплантата, замещающая твердую оболочку спинного мозга, была получена FDM-печатью с порами 70-130 мкм.

Размер пор обусловлен оптимальным размером для прорастания соединительной ткани и сосудов. Данная составляющая имплантата замещает и является скаффолдом для восстановления твердой оболочки спинного мозга, а также обеспечивает защитную функцию. Линейные параметры сетки не ограничены, что позволяет изготавливать структуру в свободной форме под область повреждения спинного мозга как при изготовлении, так и интраоперационно.

Имплантат хорошо набухает, сохраняя морфологические характеристики. При набухании модуль упругости конструкции значительно снижается, что позволяет имплантату лучше приживаться в окружении мягких тканей. Гигроскопичность и набухание ПВС в водной среде могут быть использованы для наполнения полимерных волокон биоактивными или лекарственными препаратами (факторы роста нервной ткани, противовоспалительные или другие препараты).

Краткое описание чертежей

на фиг. 1 показана микрофотография волокнистой ориентированной структуры, полученная при помощи сканирующей электронной микроскопии;

на фиг. 2 - фотография напечатанной сетки, полученная на оптическом микроскопе;

на фиг. 3 - микрофотография конструкции нейроимплантата, полученная при помощи сканирующей электронной микроскопии;

на фиг. 4 пошагово представлен технологический процесс формирования нейроимплантата.

Осуществление изобретения

Технологический процесс создания имплантата состоит из 4 этапов (фиг. 4): 1. Имплантат для ускорения регенерации спинного мозга не является персонализированным медицинским изделием, структура изготавливается с большими линейными размерами, с возможностью последующей корректировки параметров для покрытия поврежденной области спинного мозга. Первым этапом создания имплантата является создание полотна сетки с порами размером 70-130 мкм методом 3D-печати. В качестве материала для печати используется филаментная нить биосовместимого биодеградируемого синтетического полимера - поливинилового спирта (ПВА) (ESun, Россия). Модель имплантата была построена с помощью программного обеспечения Solid Works в виде пластины необходимого размера и геометрии. Для подготовки модели к печати использовалось программное обеспечение Prusa Slicer, в котором объему модели присваивалась пористая сетчатая структура. Поры создавались с целью обеспечения адгезии и пролиферации клеток соединительных тканей, а также последующей васкуляризации напечатанной составляющей имплантата. Такая структура обеспечивает защитную функцию твердой оболочки спинного мозга, а также ровную фиксацию электроспиннингованной части имплантата на спинном мозге.

2. Вторым этапом является нанесение ориентированных волокон на полученную сетчатую структуру. Для этого порошкообразный поливиниловый спирт (Sigma Aldrich, Германия, 85-124 кДа) был растворен в концентрации 12% масс/об в дистиллированной воде. После полного растворения раствор полимера в шприце помещался в установку для электроформования (ESpin 2000, Индия). В качестве коллектора был выбран диск, на который заранее прикреплялись напечатанные сетки. К игле шприца с растворенным полимером было подведено высокое напряжение. Капля раствора, подаваемого со скоростью 1,8 мл/ч, вытягивается в волокно под действием поверхностного натяжения и электростатических сил в поле, создаваемым между иглой и коллектором. Скорость вращения коллектора составляет 700 об/мин, расстояние игла-коллектор 7-13 см, температура бокса электроспининга 22±0,5°С, напряжение, подаваемое на иглу шприца, 12-14 кВ, объем полимера, проходящего обработку 10 мл. Фиксация волокон на материал подложки (сетки) происходит за счет когезии.

3. Так как поливиниловый спирт - водорастворимый полимер, необходимо провести химическую сшивку для замедления скорости деградации. Режим данного процесса подбирался, в том числе, из условий сохранения морфологии поверхности. После чего материал проходит постобработку в сшивающем растворе при рН=2-3, состоящем из ацетона, глутарового альдегида и HCl37% в соотношении 97:2,5:0,5, соответственно. Время сшивки 3 часа, после чего пары растворителя удаляются при комнатной температуре.

4. Следующим этапом является очистка конструкции от токсичных веществ (избавления остатков диальдегида), а также для доведения рН=7,5 в Tris-HCl буферном растворе в течение 6 часов со сменой буфера каждые 1-1,5 часа.

5. Готовое медицинское изделие непосредственно перед имплантацией помещают в физиологический раствор для снижения механических параметров.

Для создания решетки, замещающей твердую оболочку спинного мозга, был использован FDM-принтер. Модель пластины была построена в программном обеспечении Solid Works, подготовка к печати осуществлялась в программном обеспечении Prusa Slicer, в котором объему модели присваивалась ячйки решетки. В качестве полимерной основы была выбрана филаментная нить ПВС (ESun, Россия). Катушка полимера предварительно была высушена с целью удаления адсорбированной влаги на материале для минимизации появления дефектов печати. После печати сетки фиксировались на дисковой коллектор в установке электроспиннинга.

Электроспиннинговую подложку получали путем подачи раствора поливинилового спирта (ПВС) из шприца объемом 10 мл на коллектор (приемную подложку). Рабочий раствор для электроспиннинга, готовили путем растворения расчетной навески (1,2±0,0001 г) мелкодисперсного порошка ПВС (Sigma Aldrich, Германия) с молекулярной массой 85-124 кДа в дистиллированной Н₂О объемом 10 мл, при перемешивании со скоростью 200-300 об/мин и температуре 50°С.

Процесс электроспиннинга происходил при напряжении 13,8 кВ, расстоянии игла-коллектор 10 см, скорость вращения дискового коллектора 700 об/мин, скорость подачи материала составила 1,8 мл/ч.

После нанесения волокон на решетки структура подвергалась процессу химической сшивки в глутаральдегидовом растворе. Для приготовления 100 мл раствора было использовано 2,5 мл глутарового альдегида (50%) (Rugao Wanli Chemical Industry Co., Ltd, Китай), 500 мкл HCl (37%), которые были добавлены в 97 мл ацетона (99,75%). Далее структуры оставлялись в растворе на 3 часа при комнатной температуре. После окончания времени сшивки структуры перекладывались в стеклянную посуду (чашку Петри) для испарения сшивающего раствора с поверхности материала. Затем, для удаления токсичных остатков сшивки и для доведения рН структуры до нормального значения (рН=7,5), был приготовлен Tris-HCl буферный раствор. В мерной колбе на 100 мл было растворено 12,11 г кристаллического порошка трис(гидрооксиметил) аминометана в 80 мл дистиллированной воды, после чего происходило доведение до рН=7,5 при помощи концентрированной соляной кислоты. Удаление токсических веществ в буферном растворе происходило при комнатной температуре с использованием лабораторного термошейкера при скорости вращения 60 об/мин. Смена буфера происходила каждые 60-90 мин в течение 6 ч.

Биологические тесты проводили после стерилизации имплантатов путем промывания в 96% этаноле при постоянном перемешивании и 3х-часовой экспозицией под УФ-излучением в стерильном ламинарном боксе. Для оценки цитоксичности имплантатов были получены суточные экстракты на среде культивирования DMEM согласно стандартному протоколу (ГОСТ ISO 10993-12-2011). Тестирование проводили с использованием модельных клеточных линий: иммортализованных мышиных фибробластов NIH3T3 и эндотелиальньгх клеток человека EA.hy926. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей, 2 мМ глутамина, раствор антибиотика-антимикотика (100 Е пенициллина, 100 мкг стрептомицина и 250 нг амфотерицина В в 1 мл), с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, при 37°С и 5% CO2. Для оценки цитотоксичности клетки помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (Corning) по 4000 клеток в 100 мкл полной ростовой среды, через 24 часа среды заменяли на экстракты, в контрольных лунках среду заменяли на свежую. Выживаемость клеток оценивали методом аламарового синего через 24, 48 и 72 ч после добавления экстрактов. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью мультифункционального планшетного анализатора Varioskan LUX (Thermo Scientific, США).

На фиг. 5 показаны результаты цитотоксического теста клеточных линий NHI3T3 и EA.hy926 через 24 и 72 ч после инкубации с экстрактами имплантатов. Через 24 и 72 ч после инкубации с экстрактами выживаемость клеток NIH3T3 составила 81 и 104% относительно контроля, а выживаемость клеток EA.hy926 - 81 и 104%, соответственно. Таким образом, было показано, что имплантаты не оказывают цитотоксического воздействия на протестированные культуры клеток.

Для оценки клеточной адгезии имплантаты помещали в 48-луночные планшеты, покрытые 2%-раствором агарозы. Заселение имплантатов клетками проводили с двух сторон: на электроспиннингованную составляющую рассаживали клетки NIH3T3, мечеными зеленым флуоресцентным белком GFP, на напечатанную сетку высевали клетки EA.hy926. Клетки культивировали в течение 7 дней Для визуализации клетки EA.hy926 окрашивали флуоресцентными мембранными красителями (Servicebio, Cat.#:G1705) и ядерным красителем DAPI (Servisbio, Cat.# G1012) и фотографировали с помощью системы визуализации EVOS М5000 на 1, 3 и 7 сутки. Результаты культивирования имплантата с клеточными культурами представлены на фиг. 6, полученные при помощи инвертированного флюоресцентного микроскопа EVOS М5000. На 1 сутки видно, что клетки NIH3T3 ошареные, прикрепляются к матриксу и начинают распластываться. На 3 сутки клетки начинают активно пролиферировать. На 7 сутки видно, что клетки распластываются вдоль волокон. Заметно, что на 7 сутки клеточная культура EA.hy926 проникает внутрь решетки, где активно делится.

Результаты культивирования имплантата с клеточными культурами представлены на фиг. 6,. На фиг. 6 представлены фотографии: i, ii, iii- культивирования EA.hy926 в течение 1,3,7 дней, соответственно; iv, v, vi - культивирования NIH3T3 в течение 1,3,7 дней, соответственно.

Полученные результаты отображают хорошую адгезию и пролиферацию клеток на структуре, что доказывает эффективность использования гигроскопичной слоистой структуры для увеличения регенеративного потенциала тканей.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к нейрохирургии, и может быть использована в качестве нейроимплантата для восстановления спинного мозга. Нейроимплантат для регенерации нервной ткани спинного мозга выполнен в виде биодеградируемой гибридной слоистой конструкции на основе водорастворимого полимера, в качестве которого используют поливиниловый спирт, состоящей из первого слоя - решетчатой структуры, изготовленной для замещения соединительнотканного слоя спинного мозга и адгезии и пролиферации клеток, за счет созданных пор размером 70-130 мкм, и второго слоя - электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами, слои выполнены соединенными друг с другом посредством когезии. Способ получения нейроимплантата включает изготовление слоистой конструкции путем получения первого слоя - решетчатой структуры, полученный печатью на FDM-принтере, и получения второго слоя - электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами. Оба слоя соединяют друг с другом посредством когезии, после чего полученную слоистую конструкцию обрабатывают в глутаральдегидовом сшивающем растворе при рН=2-3 в течение 3 часов, отмывают в буферном растворе при рН=7,5 и стерилизуют. Использование изобретений позволяет достичь увеличения регенеративного потенциала и возможности ускорения восстановления спинного мозга при острой травме путем создания гигроскопичной двуслойной структуры, строение которой способствует фиксации имплантата и направленной регенерации нервной ткани, за счет создания комбинации из направленной субмикронной волокнистой структуры для прикрепления и пролиферации клеток спинного мозга и сетчатой структуры, обеспечивающей фиксированное положение волокнистой части, а также того, что данная полимерная решетка выступает в роли скаффолда для твердой оболочки спинного мозга. 2 н.п. ф-лы, 6 ил.

1. Нейроимплантат для регенерации нервной ткани спинного мозга, выполненный в виде биодеградируемой гибридной слоистой конструкции на основе водорастворимого полимера, в качестве которого используют поливиниловый спирт, состоящей из первого слоя - решетчатой структуры, изготовленной для замещения соединительнотканного слоя спинного мозга и адгезии и пролиферации клеток, за счет созданных пор размером 70-130 мкм, и второго слоя - электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами, слои выполнены соединенными друг с другом посредством когезии.

2. Способ получения нейроимплантата по п. 1, включающий изготовление слоистой конструкции путем получения первого слоя - решетчатой структуры, полученной печатью на FDM-принтере, и получения второго слоя электроспиннингованной подложки с субмикронными направленными волокнами, оба слоя соединяют друг с другом посредством когезии, после чего полученную слоистую конструкцию обрабатывают в глутаральдегидовом сшивающем растворе при рН=2-3 в течение 3 часов, отмывают в буферном растворе при рН=7,5 и стерилизуют.