КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕДОСТАТКА ВИТАМИНА В12 Российский патент 2020 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к областям получения витамина В12 и профилактики и/или лечения недостатка витамина В12, кишечной микробиоты, барьера слизистой оболочки кишечника и фармацевтических, пищевых или кормовых, или пробиотических композиций, содержащих продуцирующие псевдовитамин В12 бактерии Eubacterium hallii (Е. hallii) и/или Intestinimonas butyriciproducens (I. butyriciproducens) и, возможно, одну или несколько пропионат-продуцирующих и/или муцин-деградирующих бактерий, таких как Akkermansia muciniphila (A. muciniphila). Также предложены способы и применение бактерий E. hallii и/или I. butyriciproducens, а также композиции, содержащие Е. hallii и/или I. butyriproducens и, возможно, пропионат-продуцирующие и/или муцин-деградирующие бактерии, такие как A. muciniphila: 1) для профилактики и/или лечения недостатка витамина В12 у субъекта, 2) для стимуляции и/или увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта и/или 3) для стимулирования и/или увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Корриноиды представляют собой кобальт-содержащие молекулы, которые функционируют как кофакторы ферментов у самых разнообразных организмов. Конкретные корриноиды различают по структуре их аксиальных лигандов. Низший аксиальный лиганд корриноида может представлять собой бензимидазол, пурин или фенольное соединение. Кофактор В12, наиболее часто встречающийся у животных и многих бактерий, содержит 5,6-диметилбензимидазол (DMB, от англ. «5,6-dimethylbenzimidazole») в качестве аксиального лиганда. Данный конкретный кофактор В12 обычно называется витамином В12.

Только прокариоты имеют ферменты, требующиеся для синтеза корриноидов. Ни грибы, ни растения, ни животные (включая человека) не способны продуцировать корриноиды, такие как витамин В12. Животные и человек полагаются на пищу, от природы богатую корриноидами, такими как витамин В12 (например, яйца, рыба, мясо и другие), или продукты, обогащенные корриноидами, такими как витамин В12, или добавку витамина В12 в качестве источников витамина В12. Кроме того, микробиота кишечника может обеспечивать животных и человека корриноидами, такими как витамин В12. Витамин В12 может производиться промышленным путем только посредством синтеза на основе бактериальной ферментации.

Витамин В12, также называемый кобаламином, представляет собой водорастворимый витамин, который, как известно, играет роль в синтезе ДНК, оптимальном кроветворении и правильном развитии мозга и неврологических функциях. Витамин В12 обычно вовлечен в метаболизм каждой клетки человеческого организма, в первую очередь оказывая влияние на синтез и регуляцию ДНК, а также в метаболизм жирных кислот и метаболизм аминокислот.

Известны кофакторы В12 с аксиальными лигандами, отличными от DMB, причем наиболее распространенным примером является псевдовитамин В12, в котором N7-связанный аденин заменяет DMB в качестве аксиального лиганда.

Витамин В12, как было описано, используется в качестве кофактора более чем в дюжине ферментативных реакций у человека и кишечных бактерий. В то время как у человека данные реакции включают реакции, катализируемые метилмалонил-КоА мутазой и В12-зависимой метионинсинтазой, у кишечных бактерий присутствует дополнительный набор ферментов, зависимых от витамина В12 (Degnan et al., 2014. Cell Metab. 20(5):769-778). He все кишечные бактерии продуцируют витамин В12. Поэтому некоторые кишечные бактерии зависят от кишечных бактерий, продуцирующих витамин В12, в отношении их снабжения витамином В12. Вследствие этого доступность витамина В12 также оказывает действие на кишечных бактерий и вносит свой вклад в структуру и функции микробных сообществ кишечника. Поскольку витамин В12 может быть лимитирующим для человека, из этого следует, что в кишечном тракте также существует недостаток витамина В12. Витамин В12 необходим для всего спектра микробных трансформаций в кишечном тракте.

К этим трансформациям относится продукция пропионата с помощью зависимой от витамина В12 метилмалонил-КоА мутазы. Пропионат и бутират входят в число наиболее важных короткоцепочечных жирных кислот (SCFA, от англ. «short chain fatty acid»), продуцируемых в кишечном тракте в результате ферментации из пищевых компонентов или компонентов хозяина. Эти SCFA имеют разные функции в человеческом организме, где бутират главным образом питает колоноциты, пропионат главным образом метаболизируется в печени (Guarner and Malagelada, 2003. The Lancet 361: 512-519). Кроме того, SCFA оказывают воздействия на морфологию и функцию толстой кишки, такие как понижение рН, повышение пролиферации клеток и объема фекального материала и изменение состава микробов. SCFA также управляют массой тела и инсулиночувствительностью (Canfora et al., 2015. Nature Reviews Endocrinology 11:577-591). Кроме того, обнаружено, что SCFA передают сигнал хозяину посредством рецепторов, связанных с G-белком (GPR41 и GPR43), что, как было показано, влияет на иммунную систему, помимо прочего, через регуляторные Т-клетки у мышей (Brown et al., 2003. J Biol Chem 278:11312-11319; Le Poul et al., 2003. J Biol Chem 278:25481-25489; Smith et al 2013. Science 341(6145):569-573). Наконец, SCFA также передают сигнал нейронным цепям посредством рецептора FFAR2 (Erny et al 2015. Nat Neurosci 18(7):965-977). Пропионат представляет собой субстрат для глюконеогенеза в печени и оказывает ингибирующие эффекты на синтез липидов и холестерина и защитное действие на воспаление и карциногенез (Hosseini et al., 2011. Nutrition Reviews 69:245-258). Вмешательства в рацион питания человека показали, что пропионат, как оказалось, также усиливает насыщение и регулирует аппетит, что приводит к поддержанию массы тела у взрослых с избыточной массой (Chambers et al., 2015. Gut 64(11):1744-1754).

Рекомендованное суточное количество (RDA, от англ. «recommended daily amount») витамина В12 зависит от возраста, пола и статуса беременности. Например, RDA витамина В12 для взрослого составляет примерно 2,4 микрограмма/сутки (как для мужчин, так и для женщин). Однако RDA витамина В12 не всегда достигается либо вследствие недостаточного потребления витамина В12 из рациона, либо из-за других состояний, приводящих к низким или недостаточным уровням витамина В12. Недостаточное или ограниченное потребление витамина В12 обычно наблюдается у субъектов со специфическими режимами питания, таких как вегетарианцы и веганы, или в результате заболеваний или медицинских состояний, включая пернициозную анемию, атрофический гастрит, хроническое воспаление поджелудочной железы, хирургическую операцию, когда удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника (включая хирургическую операцию по снижению массы тела), состояние, влияющее на тонкий кишечник (например, болезнь Крона, целиакия, бактериальный рост или паразит и тому подобное), запой, нарушения со стороны иммунной системы (например, болезнь Грейвса или волчанка), длительное применение лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценное питание, нарушения пищевого поведения (например, булимия или нервная анорексия и другие).

Другие заболевания или медицинские состояния, приводящие к низким или недостаточным уровням витамина В12, включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) / синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), лечение метформином пациентов с сахарным диабетом 2-го типа, ожирение или высокий индекс массы тела (BMI, от англ. «body mass index»), преддиабетическое состояние или ожирение, сопровождаемое преддиабетическим состоянием или инсулинорезистентностью, генетические расстройства, такие как наследственный недостаток транскобаламина I и/или II, и многие другие.

Индивид с низким или недостаточным уровнями витамина В12 вследствие или недостатков в рационе, или выраженности заболеваний, как говорилось выше, может находиться под угрозой развития недостатка витамина В12. В зависимости от тяжести, продолжительности нехватки или недостатка витамина В12 и периода развития (детство, зрелость, старость) недостаток витамина В12 может приводить к множеству заболеваний от бессимптомных до серьезных гематологических, неврологических и психиатрических проявлений и возможному риску необратимого неврологического повреждения, несмотря на лечение.

Субъект, страдающий от недостатка витамина В12, может демонстрировать один или несколько симптомов, таких как диарея или запор, усталость, недостаток энергии, головокружение при вставании, потеря аппетита, бледность кожи, проблемы концентрации, одышка (главным образом во время физической нагрузки), отек и покраснение языка или кровоточащие десна, спутанность или изменение психического состояния (например, деменция), депрессия, потеря равновесия, окоченение и покалывание в руках и ступнях и другие.

Недостаток витамина В12 обычно диагностируют у субъекта посредством измерения уровней витамина В12 в крови. Обычно уровни витамина В12 в крови ниже 120-180 пикомоль/л (170-250 пг/мл) у взрослых являются показателем недостатка витамина В12. Повышенные уровни метилмалоновой кислоты в крови (значения больше 0,4 микромоль/л) также могут указывать на недостаток витамина В12.

Лечение для того, чтобы излечить или облегчить состояния, связанные с недостатком витамина В12 у субъекта, включает потребление добавок витамина В12 или инъекцию витамина В12 и/или изменения в рационе (то есть введение пищи, богатой витамином В12). Одно из ограничений в введении добавок витамина В12 заключается в том, что эффективность такого лечения может быть ограниченной или неудовлетворительной у субъектов с нарушенной способностью всасывания витамина В12 через желудочно-кишечный тракт, таких как субъект, подвергавшийся лечению метформином или другими лекарственными средствами, вызывающими нарушенное всасывание витамина В12 или низкие уровни витамина В12 в крови.

Таким образом, существует необходимость в композициях для профилактики, лечения недостатка витамина В12 у субъекта или облегчения и/или улучшения состояния, связанного с недостатком витамина В12 у субъекта, и способах таких профилактики, лечения или облегчения и/или улучшения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Eubacterium hallii и/или Intestinimonas butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для применения при лечении и/или профилактике недостатка витамина В12 у субъекта.

В одном воплощении изобретения недостаток витамина В12 у указанного субъекта обусловлен или вызван лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела (бариатрическая хирургия), воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

Композиция для применения, раскрытая в данном документе, может дополнительно содержать пропионат-продуцирующую бактерию, такую как Akkermansia muciniphila.

Она может представлять собой фармацевтическую композицию или композицию добавки, например, быть представлена в форме, выбранной из группы, состоящей из капсулы, таблетки и порошка.

Указанные Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, указанная пропионат-продуцирующая бактерия могут быть представлены в лиофилизированной или микроинкапсулированной форме.

Указанные Е. hallii и/или I. butyriciproducens могут присутствовать в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток. Кроме того, указанная пропионат-продуцирующая бактерия, такая как A. muciniphila, может присутствовать в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток.

Композиция, раскрытая в данном документе, дополнительно может содержать агент, связывающийся со слизистой оболочкой.

Композиция, раскрытая в данном документе, дополнительно может содержать ионы кобальта, например, в форме соли кобальта, такой как хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта или нитрат кобальта.

Изобретение также относится к применению композиции, содержащей Е. hallii и/или I. butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта и/или для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

Субъект может страдать от недостатка витамина В12. Недостаток витамина В12 у указанного субъекта может быть обусловлен или вызван лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

Изобретение дополнительно направлено на Е. hallii и/или I. butyriciproducens для применения при лечении и/или профилактике недостатка витамина В12 у субъекта. Субъект может страдать от недостатка витамина В12. Недостаток витамина В12 у указанного субъекта может быть обусловлен или вызван лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

Согласно изобретению дополнительно предложены Е. hallii и/или I. butyriciproducens для увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта и/или для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта. Субъект может страдать от недостатка витамина В12. Недостаток витамина В12 у указанного субъекта может быть обусловлен или вызван лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «синтрофный» или «синтрофия» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к явлению, когда один вид живет за счет продуктов другого вида. В данной ассоциации рост одного партнера улучшается или зависит от питательных веществ, факторов роста или субстрата, обеспечиваемых другим партнером. Данный термин для пищевой взаимозависимости часто используется в микробиологии для описания этой симбиотической взаимосвязи между некоторыми видами бактерий.

Термин «Akkermansia muciniphila» или «A. muciniphila» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к анаэробным муцин-деградирующим бактериям, впервые идентифицированным г-жой Derrien (Derrien et al, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2004, 54: 1469-1476). Клетки имеют овальную форму, являются неподвижными и грамотрицательными в соответствии с окрашиванием по Граму. A. muciniphila могут также называться Akkermansia spp. или Akkermansia-подобными бактериями. Они относятся к группе Chlamydiae/Verrucomicrobia; Verrucomicrobia phylum. Если таксономия изменится, специалист будет знать, как адаптировать изменения в таксономии для установления штаммов, которые могли бы быть использованы в настоящем изобретении. Кроме того, полный геном A. muciniphila был определен van Passel et al, PLoS One 6, 2011: el6876. Общепринято, что штаммы со сходством геномов примерно 70% можно рассматривать как один и тот же вид.

Термин «муколитические бактерии», или «виды бактерий, ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника», или «слизь-деградирующие бактерии» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к бактериям, которые ассоциированы или обнаружены вблизи барьеров слизистой оболочки кишечника. «Виды бактерий, ассоциированные со слизистой оболочкой кишечника» дополнительно характеризуются тем, что они способны деградировать слизь. Неограничивающие примеры «видов бактерий, ассоциированных со слизистой оболочкой кишечника» включают A. muciniphila (АТТС ВАА-835), Faecalibacterium prausnitzii (А2-165), Lactobacillus rhamnosus (АТСС 53103) и Bifidobacterium breve (DSM-20213).

Термин «корриноиды» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к классу химически связанных соединений, содержащих биохимически редкий элемент кобальт, расположенный в центре плоского тетрапиррольного кольца, называемого корриновым кольцом. Биосинтез основной структуры витамина выполняется только бактериями и археями (которые обычно продуцируют форму гидроксокобаламин), но в организме человека может происходить превращение между разными формами витамина.

Термин «витамин В12» или «витамеры В12» обычно относится к классу химически связанных соединений, все из которых демонстрируют биологическую активность. Витамин В12 часто называют «кобаламином». Термин «кобаламин» в том виде, в котором он используется в данном документе, обычно относится ко всем формам витамина В12. Конкретнее, кобаламины состоят из группы кобальтсодержащих витамерных соединений, включая цианокобаламин, гидроксокобаламин (данная форма встречается в природе и образуется из бактериального гидроксокобаламина) и, наконец, две встречающиеся в природе кофакторные формы В12 в организме человека, которые включают 5'-дезоксиаденозилкобаламин и метилкобаламин.

Термин «псевдовитамин В12» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к Соα-[α-(7-аденил)]-Соβ-цианокобамиду. Эта молекула отличается от кобаламина α-лигандом, где она имеет аденин вместо 5,6-диметилбензимидазола, связанного α-гликозидной связью с С-1 рибозы.

Термин «недостаток витамина В12», также известный как «гипокобаламинемия», в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к недостаточным или низким уровням витамина В12 в крови, например, уровням витамина В12 ниже 120-180 пикомоль/л (170-250 пг/мл) у взрослых. Недостаток витамина В12 у субъекта обычно происходит или встречается в результате лечения метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемии, атрофического гастрита, хронического воспаления поджелудочной железы, хирургической операции, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операции по снижению массы тела, воспалительного заболевания кишечника, такого как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакии, бактериального роста, запоя, болезни Грейвса, волчанки, длительного применения лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценного питания, булимии и нервной анорексии, ВИЧ/СПИДа, ожирения, высокого индекса массы тела, преддиабетического состояния, инсулинорезистентности или рациона вегетарианца или вегана и других состояний.

Субъект, страдающий от недостатка витамина В12, может демонстрировать один или несколько симптомов, таких как диарея или запор, усталость, недостаток энергии, головокружение при вставании, потеря аппетита, бледность кожи, проблемы концентрации, одышка (главным образом во время физической нагрузки), отек и покраснение языка или кровоточащие десна, низкое содержание эритроцитов, снижение функции сердца, повреждение нерва, спутанность или изменение психического состояния (например, деменция), раздражимость, депрессия, психоз, потеря равновесия, неудовлетворительная функция мышц, окоченение и покалывание в руках и ступнях, снижение вкусовой чувствительности, сниженная фертильность и другие. У маленьких детей симптомы включают плохой рост, плохое развитие и сложности с движением. Без раннего лечения некоторые изменения могут стать необратимыми.

Термин «метформин» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к лекарственному средству для лечения сахарного диабета 2-го типа. Применение метформина связано с повышенной частотой возникновения недостатка витамина В12 и пониженными уровнями витамина В12 в сыворотке у субъектов с сахарным диабетом 2-го типа, подвергающихся лечению данным лекарственным средством. Предполагают, что метформин влияет на систему желудочно-кишечного всасывания и таким образом вызывает недостаточность всасывания витамина В12 у субъекта, подвергающегося лечению этим лекарственным средством.

Термин «барьер слизистой оболочки кишечника» в том виде, в котором о нем сообщается в данном документе, относится к природному барьеру слизистой оболочки, который действует как селективный барьер, обеспечивающий всасывание питательных веществ, электролитов и воды и предотвращающий воздействие вредных макромолекул, микроорганизмов, пищевых и микробных антигенов (например, пищевых аллергенов). Барьер слизистой оболочки кишечника по существу состоит из слоя слизи и нижележащего слоя эпителиальных клеток (называемых в данном документе «эпителиальными клетками кишечника»). Эпителиальные клетки кишечника тесно связаны друг с другом так называемыми «плотными контактами», которые по существу представляют собой «физические соединения» между мембранами двух эпителиальных клеток кишечника. Поддержание барьера слизистой оболочки кишечника, в частности, поддержание физической целостности слоя эпителиальных клеток кишечника (то есть сохранение контактов между клетками плотными) играет важнейшую роль в защите хозяина от миграции патогенных микроорганизмов, антигенов и других нежелательных агентов из кишечника в кровяное русло.

Барьер слизистой оболочки кишечника также сильно колонизирован приблизительно 10¹²-10¹⁴ микроорганизмами-комменсалами, главным образом анаэробными или микроаэрофильными бактериями, большинство из которых живут в симбиозе со своим хозяином. Данные бактерии являются полезными для своего хозяина во многих отношениях. Они обеспечивают защиту от патогенных бактерий и имеют значение для питания своего хозяина посредством синтеза витамина K и некоторых компонентов комплекса витаминов В. Кроме того, барьер слизистой оболочки кишечника развил сложную «иммунную систему слизистой оболочки кишечника» для проведения различия между комменсалом (то есть полезными бактериями) и патогенными бактериями и другими вредными агентами. Иммунная система слизистой оболочки кишечника является неотъемлемой частью барьера слизистой оболочки кишечника и содержит лимфоидные ткани и специализированные иммунные клетки (то есть лимфоциты и клетки плазмы), которые широко рассеяны по всему барьеру слизистой оболочки кишечника. Одним из микроорганизмов, который естественно колонизирует слизистую оболочку здоровых субъектов, является муцин-деградирующая A. muciniphila, которая, как было показано, усиливает барьерную функцию кишечника (Everard et al., PNAS 110 (2013) 9066-71; Reunanen et al., Appl Environ Microbiol March 20 2015).

Термин «пробиотики» или «пробиотические продукты» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к микроорганизмам, таким как кишечные бактерии, которые при введении или проглатывании в эффективных количествах приносят пользу здоровью хозяина (например, человека или млекопитающих). Предпочтительно пробиотики должны быть живыми или жизнеспособными при введении субъекту, чтобы обеспечить колонизацию пробиотиками толстой кишки хозяина. Однако в определенных условиях пробиотики при введении также могут быть мертвыми при условии, что вещества, продуцируемые пробиотиками, все еще оказывают пробиотическое, полезное действие на хозяина. Большинство пробиотиков или пробиотических продуктов состоит из молочнокислых бактерий, таких как Lactobacilli или Bifidobacteria. Специалист хорошо знаком с областью пробиотиков и знает, как выбрать молочнокислые бактерии, обладающие пробиотической активностью.

Термин «пребиотики» или «пребиотические продукты» в том виде, в котором он используется в данном документе, обычно относится к соединениям, которые стимулируют рост и/или активность микроорганизмов желудочно-кишечного тракта (ЖК), которые способствуют хорошему самочувствию своего хозяина. Пребиотики или пребиотические продукты состоят главным образом из ферментируемых волокон или неперевариваемых углеводов. Ферментация этих волокон пробиотиками стимулирует продукцию полезных конечных продуктов, таких как SCFA, в частности бутиратов. Специалист хорошо знаком с областью пребиотиков и знает, как выбрать ингредиенты, обладающие пребиотической активностью.

Термин «симбиотики» или «симбиотические продукты» в том виде, в котором он используется в данном документе, обычно относится к композициям и/или пищевым добавкам, содержащим пробиотики и одно или несколько соединений, которые стимулируют рост и/или активность микроорганизмов ЖК, такие как пребиотики, в одном продукте. Симбиотик благоприятно воздействует на хозяина посредством улучшения выживания и колонизации пробиотика в ЖК тракте за счет селективного стимулирования роста и/или за счет активации метаболизма пробиотика, улучшая тем самым благополучие хозяина. Специалист в данной области хорошо знаком с симбиотиками и знает, как выбрать ингредиенты, которые можно объединять в симбиотик.

Термин «полезный вид кишечной бактерии» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к виду бактерии, который населяет (то есть является внутренне присущим) кишечник млекопитающего (например, человека) и оказывает положительное(ые) действие(я) (например, защита от патогенных видов бактерий, продукция масляной кислоты и/или бутирата и производных и т.д.) на ЖК тракт, метаболизм и другие аспекты здоровья млекопитающего, в котором он обитает.

Неограничивающие примеры полезных видов кишечных бактерий включают молочнокислые бактерии из рода Lactobacillus и Bifidobacterium. Другие неограничивающие примеры полезных видов кишечных бактерий включают продуцирующие бутират виды бактерий, которые используют ацетил-КоА для образования масляной кислоты и/или бутирата и бутирата и его производного, как например, штаммы бактерий, раскрытые в US 2014/0242654, WO 2014/150094 или WO 2013032328 А1.

Термин «эффективное количество» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к количеству, необходимому для достижения эффекта, раскрытому в данном документе. Например, эффективное количество штамма кишечной бактерии или штамма, происходящего от него, раскрытого в данном документе, то есть Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, А. muciniphila, представляет собой количество, которое эффективно при лечении, профилактике и/или облегчении недостатка витамина В12 у субъекта. Эффективное количество может быть легко определено без неоправданного экспериментирования обычным специалистом в данной области. Например, специалист может определить, является ли количество Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, A. muciniphila эффективным при лечении, профилактике и/или облегчении недостатка витамина В12 у субъекта посредством измерения уровней витамина В12 в крови, и определить, вернулись ли уровни витамина В12 в крови к нормальным уровням (приблизительно 137-546 пикомоль/л, как сообщалось Doets et al. 2013. Ann Nutr Metab 62:311-322).

Термины «физиологически приемлемый носитель» или «в пищевом аспекте приемлемый носитель», «питательно приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемый носитель» в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к веществу физиологически приемлемого или в пищевом аспекте приемлемого носителя, или питательно приемлемого или фармацевтически приемлемого носителя, такому как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующее вещество, участвующее в предоставлении формы введения полипептида или клетки-хозяина по изобретению. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и отсутствия нанесения вреда субъекту, то есть он должен быть пригодным для потребления или быть питательно приемлемым. Термины «пригодный для потребления» или «питательно приемлемый» относятся к ингредиентам или веществам, которые обычно рассматриваются как безопасные для потребления человеком (а также другими млекопитающими). Неограничивающие примеры веществ, которые могут служить в качестве физиологически приемлемых носителей или питательно приемлемых или фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как какао-масло и суппозиторные воски; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический физиологический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатные буферные растворы; (21) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических композициях, и тому подобное. Кроме того, термины «питательно приемлемый» и «фармацевтически приемлемый» в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к тем составам или комбинациям агентов, веществ или композиций и/или их лекарственных форм, которые входят в объем обоснованного врачебного суждения, подходят для применения в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, в соответствии с разумным соотношением пользы и риска.

Термины «пригодный для потребления» или «питательно приемлемый» относятся к ингредиентам или веществам, которые обычно считаются безопасными для потребления человеком (а также другими млекопитающими).

Термин «примерно» в том виде, в котором он используется в данном документе, указывает на диапазон нормального допуска в данной области, например, в пределах 2 стандартных отклонений от среднего. Следует понимать, что термином «примерно» охватываются значения, которые отклоняются не более чем на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанной величины.

Термины «содержащий» или «содержать» и их спряжения в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к ситуации, в которой указанные термины используются в их неограничивающем смысле для обозначения того, что объекты, следующие за данным словом, включены, но объекты, конкретно не упомянутые, не исключены. Также они охватывают более ограничивающие глагольные выражения «состоять по существу из» и «состоять из».

Ссылка на элемент в единственном числе не исключает возможности того, что присутствует несколько элементов, если из контекста явно не следует, что имеется один и только один из этих элементов. Таким образом, под элементом в единственном числе обычно подразумевается «по меньшей мере один».

Термины «повышать» или «повышенный уровень» и термины «понижать» и «пониженный уровень» относятся к способности значительно повышать или значительно понижать или к значимо повышенному уровню или значимо пониженному уровню. Обычно уровень является повышенным или пониженным, когда он по меньшей мере на 5%, как например, 10%, 15%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, выше или ниже, соответственно, чем соответствующий уровень в контроле или стандарте. В качестве альтернативы, уровень в образце может быть повышенным или пониженным, когда он статистически значимо повышен или понижен по сравнению с уровнем в контроле или стандарте.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что композицию, содержащую Е. hallii и/или I. butyriciproducens и приемлемый носитель, можно использовать для лечения, профилактики и/или облегчения недостатка витамина В12 у субъекта, которому вводили эффективное количество указанной композиции. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что E. hallii и I. butyriciproducens обладают способностью продуцировать псевдовитамин В12.

Вне связи с какими-либо теориями считается, что E. hallii и I. butyriciproducens продуцируют и секретируют псевдовитамин В12 in situ, то есть в кишечнике субъекта. Затем псевдовитамин В12 может сразу же всасываться энтероцитами хозяина, где он может непосредственно использоваться в качестве кофактора для зависимых от витамина В12 ферментов или где он может превращаться в другую форму витамина В12 для использования в качестве кофактора в зависимых от витамина В12 ферментах.

Показано, что псевдовитамин В12 может действовать в качестве кофактора для трех зависимых от витамина В12 ферментов: MetH, EutBC и PduCDE в Salmonella enterica (Anderson et al. 2008. J Bacteriol 190(4):1160-1171). Был сделан вывод, что псевдовитамин В12 представляет собой природный корриноид, продуцируемый Salmonella enterica (Taga and Walker. 2008. J Bacteriol 190(4):1157-1159). Псевдовитамин B12, как было показано, является доминирующим корриноидом, продуцируемым Clostridium cohlearium, Lactobacillus reuteri, Nostoc commune, Aphanizomenon flos-aquae и Aphanothece sacrum. Кроме того, было показано, что псевдовитамин В12, продуцируемый Lactobacillus reuteri, также имеющейся в изобилии кишечной бактерией мыши, может облегчать недостаток витамина В12 у мышей (Santos et al 2007. FEBS Letters 581:4865-4870; Molina et al 2009. J Appl Microbiol 106:467-473).

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей Е. hallii и/или I butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для применения при лечении и/или профилактике недостатка дефицита витамина В12 у субъекта.

Физиологически приемлемый носитель может представлять собой любой инертный носитель. Например, неограничивающие примеры подходящих физиологически или фармацевтически приемлемых носителей включают любой из хорошо известных физиологических или фармацевтических носителей, буферов, разбавителей и эксципиентов. Следует понимать, что выбор подходящего физиологического носителя будет зависеть от предполагаемого способа введения композиции, раскрытого в данном документе (например, перорально) и предполагаемой формы композиции (например, напиток, йогурт, порошок, капсулы и тому подобное). Специалист знает, как выбрать физиологически приемлемый носитель, который подходит для или совместим с композициями для применения, раскрытыми в данном документе.

В одном воплощении изобретения недостаток витамина В12 у указанного субъекта по меньшей мере частично обусловлен или вызван лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела (бариатрическая хирургия), воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, раскрытая в данном документе, может дополнительно содержать пропионат-продуцирующие и/или муцин-деградирующие бактерии, такие как, без ограничения, A. muciniphila или Lactobacillus reuteri. Обнаружено, что Е. hallii и A. muciniphila оказывают положительное воздействие друг на друга. Не желая быть связанными какой-либо теорией, считают, что A. muciniphila предоставляет подходящий субстрат для Е. hallii, в то время как Е. hallii обеспечивает A. muciniphila источником витамина В12 с усилением ее роста и изменением ее профиля метаболитов в сторону продукции пропионата. Ожидается, что такой же полезный эффект может быть достигнут у Е. hallii и любой другой пропионат-продуцирующей бактерии или у I. butyriciproducens и любой другой пропионат-продуцирующей бактерии, включая A. muciniphila. Пропионат-продуцирующие и/или муцин-деградирующие бактерии можно вводить одновременно с Е. hallii и/или I. butyriciproducens или последовательно.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, раскрытая в данном документе, дополнительно содержит соединение кобальта, например, в форме соли кобальта, такой как хлорид кобальта, сульфат кобальта, нитрат кобальта, ацетат кобальта и другие. Присутствие добавочного кобальта может обеспечивать продукцию достаточного количества корринового кольца в качестве предшественника псевдовитамина В12, продуцируемого Е. hallii и/или I. butyriciproducens. Альтернативно такое соединение кобальта можно вводить субъекту, страдающему от или находящемуся под угрозой недостатка витамина В12 и сопутствующих заболеваний и состояний, раскрытых в данном документе, в комбинации с композицией, раскрытой в данном документе, при этом соединение кобальта можно вводить указанному субъекту одновременно или последовательно.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, как раскрыто в данном документе, может находиться в жидкой форме, например, стабилизированной суспензии Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, А. muciniphila, как раскрыто в данном документе, или в твердой форме, например, в виде порошка лиофилизированных клеток-хозяев, как раскрыто в данном документе. В том случае, когда Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, A. muciniphila лиофилизированы, можно использовать криопротектор, такой как лактоза, трегалоза или гликоген. При пероральном введении можно использовать Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, A. muciniphila в виде твердых лекарственных форм, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, А. muciniphila могут быть инкапсулированы в капсулах, таких как желатиновые капсулы, вместе с неактивными ингредиентами и порошкообразными носителями, такими как, например, глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, крахмал, целлюлоза или производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота, сахарин натрия, тальк, карбонат магния и тому подобное.

Предпочтительно, чтобы указанные Е. hallii и/или I. butyriciproducens находились в композиции, раскрытой в данном документе, в твердой, лиофилизированной или высушенной форме, например, в форме порошка или гранул. Указанные Е. hallii и/или I. butyriciproducens могут, например, присутствовать в композиции, раскрытой в данном документе, в микроинкапсулированной форме. Специалист способен лиофилизировать или микроинкапсулировать Е. hallii и/или I. butyriciproducens на основе хорошо известных методик. Поскольку Е. hallii и/или I. butyriciproducens представляют собой облигатные анаэробные бактерии, во время лиофилизации или микроинкапсуляции можно применять бескислородные условия для сохранения жизнеспособности Е. hallii и/или I. butyriciproducens.

В данной области хорошо известна методика микроинкапсуляции для сохранения пробиотических бактерий (например, как рассмотрено Serna-Cock and Vallejo-Castillo, 2013. Afr J of Microbiol Res, 7(40): 4743-4753, включенной в данный документ посредством ссылки). Например, в настоящем изобретении можно использовать любую из методик сохранения и систем сохранения, о которых сообщается Serna-Cock и Vallejo-Castillo.

Способы лиофилизации включают без ограничения медленное, постепенное замораживание до -40°С перед высушиванием, быстрое замораживание посредством помещения при -80°С перед высушиванием или сверхбыстрое замораживание посредством промывания клеток каплями криопротектора в жидком азоте перед высушиванием.

Криопротекторы часто используют для защиты пробиотических композиций во время лиофилизации и для увеличения срока годности. Без ограничения можно использовать криопротектор, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, мальтозы, мальтодекстрина, трегалозы, маннита, сорбита, инулина, глицерина, диметилсульфоксида (ДМСО), этиленгликоля, пропиленгликоля, 2-метил-2,4-пентандиола, полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиглицерина, сухого обезжиренного молока, молочного белка, сывороточного белка, ультрапастеризованного молока, бетаина, адонитола, сахарозы, глюкозы, лактозы или любой их комбинации.

Пребиотики, такие как крахмал и пшеничные отруби, можно дополнительно добавлять перед лиофилизацией для увеличения эффективности композиции Е. hallii и/или I. butyriciproducens, раскрытой в данном документе. Добавление к лиофилизированной смеси антиоксидантов, таких как рибофлавин, рибофлавин-фосфат или его физиологически приемлемая соль, глутатион, аскорбат, глутатион и цистеин, может дополнительно усиливать жизнеспособность композиции Е. hallii и/или I. butyriciproducens, раскрытой в данном документе, во время хранения, при необходимости.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, как раскрыто в данном документе, может представлять собой пищевую композицию или композицию биологически активной добавки. Такая пищевая композиция или композиция биологически активной добавки может включать молочный продукт, более предпочтительно кисломолочный продукт, предпочтительно йогурт или йогуртовый напиток.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, как раскрыто в данном документе, может представлять собой фармацевтическую композицию, например, в форме, выбранной из группы, состоящей из капсулы, таблетки и порошка.

В одном воплощении изобретения Е. hallii и/или I. butyriciproducens могут присутствовать в композиции, как раскрыто в данном документе, в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток, предпочтительно колониеобразующих единиц (КОЕ) (CFU, от англ. «colony forming units»). Например, эффективное количество клетки-хозяина может представлять собой количество, составляющее от примерно 10⁵ клеток или КОЕ до примерно 10¹⁴ клеток или КОЕ, предпочтительно от примерно 10⁶ клеток или КОЕ до примерно 10¹³ клеток или КОЕ, предпочтительно от 10⁷ клеток или КОЕ до примерно 10¹² клеток или КОЕ, более предпочтительно от примерно 10⁸ клеток или КОЕ до примерно 10¹² клеток или КОЕ.

В одном воплощении изобретения A. muciniphila, при наличии, может присутствовать в композиции, как раскрыто в данном документе, в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток, предпочтительно колониеобразующих единиц (КОЕ). Например, эффективное количество клетки-хозяина может представлять собой количество от примерно 10⁵ клеток или КОЕ до примерно 10¹⁴ клеток или КОЕ, предпочтительно от примерно 10⁶ клеток или КОЕ до примерно 10¹³ клеток или КОЕ, предпочтительно от примерно 10⁷ клеток или КОЕ до примерно 10¹² клеток или КОЕ, более предпочтительно от примерно 10⁸ клеток или КОЕ до примерно 10¹² клеток или КОЕ.

В одном воплощении изобретения композиция для применения, как раскрыто в данном документе, может дополнительно содержать агент, связывающийся со слизистой оболочкой.

Термины «агент, связывающийся со слизистой оболочкой» или «полипептид, связывающийся со слизистой оболочкой» в том виде, в котором они используются в данном документе, относятся к агенту или полипептиду, который способен прикрепляться к поверхностям слизистой оболочки кишечника барьера слизистой оболочки кишечника млекопитающего (например, человека). Множество полипептидов, связывающихся со слизистой оболочкой, описано в уровне техники. Неограничивающие примеры полипептида, связывающегося со слизистой оболочкой, включают связывающиеся с мембраной субъединицы бактериальных токсинов, включая, например, субъединицу В токсина холеры, субъединицу В термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицы S2, S3, S4 и/или S5 токсина Bordetella pertussis, В фрагмент дифтерийного токсина и связывающиеся с мембраной субъединицы шига-токсина или шигаподобных токсинов. Другие подходящие полипептиды, связывающиеся со слизистой оболочкой, включают белки фимбрий бактерий, такие как, например, K88, K99, 987Р, F41, FAIL, CFAIII ICES1, CS2 и/или CS3, CFAIIV ICS4, CS5 и/или CS6 фимбрий Е. coli, Р фимбрии или тому подобное. Другие неограничивающие примеры фимбрий включают филаментозный гемагглютинин Bordetella pertussis, токсин-корегулируемые пили холерного вибриона (TCP, от англ. «toxin-coregulate pili»), манноза-чувствительный гемагглютинин (MSHA, от англ. «mannose-sensitive hemagglutinin»), фукоза-чувствительный гемагглютинин (PSHA, от англ. «fucose-sensitive hemagglutinin») и тому подобное. Другие агенты, связывающиеся со слизистой оболочкой, включают вирусные белки, обеспечивающие прикрепление, включая гемагглютинины вируса гриппа и вируса Сендай, и животные лектины или лектин-подобные молекулы, включая молекулы иммуноглобулинов или их фрагменты, кальций-зависимые (С-тип) лектины, селектины, коллектины или гемагглютинин helix pomatia, растительные лектины с субъединицами, связывающимися со слизистой оболочкой, включают конканавалин А, агглютинин зародышей пшеницы, фитогемагглютинин, абрин, рицин и тому подобное.

В одном воплощении изобретения композиции, раскрытые в данном документе, могут содержать один или несколько ингредиентов, которые пригодны для стимулирования выживания и/или жизнеспособности и/или поддержания целостности Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, A. muciniphila во время хранения и/или во время воздействия желчи и/или во время прохождения через ЖК тракт млекопитающего (например, человека). Неограничивающие примеры таких ингредиентов включают энтеросолюбильное покрытие и средства с контролируемым высвобождением, делающие возможным прохождение через желудок. Специалист знает, как выбирать подходящие ингредиенты для обеспечения того, чтобы активный компонент (то есть Е. hallii и/или I. butyriciproducens и, возможно, A. muciniphila) достигал места предполагаемого назначения, где он осуществляет свое действие.

В одном воплощении изобретения композиции для применения, раскрытые в данном документе, могут дополнительно содержать ингредиенты, выбранные из группы, состоящей из пребиотиков, пробиотиков, углеводов, полипептидов, липидов, витаминов, минералов, лекарственных средств, консервантов, антибиотиков или любой их комбинации.

В одном воплощении изобретения композиции для применения, раскрытые в данном документе, могут дополнительно содержать один или несколько ингредиентов, дополнительно повышающих питательную ценность и/или терапевтическое значение композиций, раскрытых в данном документе. Например, может быть полезным добавлять один или несколько ингредиентов (например, питательных ингредиентов, ветеринарных или лекарственных средств и т.д.), выбранных из белков, аминокислот, ферментов, минеральных солей, витаминов (например, тиамин HCl, рибофлавин, пиридоксин HCl, ниацин, инозитол, холина хлорид, пантотенат кальция, биотин, фолиевая кислота, аскорбиновая кислота, витамин В12, п-аминобензойная кислота, ацетат витамина А, витамин K, витамин D, витамин Е и тому подобное), сахаров и сложных углеводов (например, водорастворимые и не растворимые в воде моносахариды, дисахариды и полисахариды), лекарственных средств (например, антибиотики), антиоксидантов, ингредиентов на основе микроэлементов (например, соединения кобальта, меди, марганца, железа, цинка, олова, никеля, хрома, молибдена, йода, хлора, кремния, ванадия, селена, кальция, магния, натрия и калия и тому подобное). Специалист знаком со способами и ингредиентами, которые пригодны для повышения питательной ценности и/или терапевтического/медицинского значения композиций, раскрытых в данном документе.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к Е. hallii и/или I. butyriciproducens для применения при лечении и/или профилактике недостатка витамина В12 у субъекта.

В одном воплощении Е. hallii и/или I. butyriciproducens для применения, как раскрыто в данном документе, могут быть особенно показаны для субъекта, страдающего от недостатка витамина В12, когда недостаток витамина В12 у указанного субъекта вызван условиями, упомянутыми выше.

СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЕ

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей Е. hallii и/или I. butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта.

В одном воплощении изобретения композиция, содержащая Е. hallii и/или I. Butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, может быть использована в способе увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта, причем указанный способ включает стадию введения указанному субъекту эффективного количества указанной композиции.

В одном воплощении изобретения субъект может представлять собой субъект, страдающий от недостатка витамина В12, где недостаток витамина В12 у указанного субъекта вызван условиями, упомянутыми выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей Е. hallii и/или I. butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

В одном воплощении изобретения композиция, содержащая Е. hallii и/или I. butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, может быть использована в способе увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта, причем указанный способ включает стадию введения указанному субъекту эффективного количества указанной композиции.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению Е. hallii и/или I. butyriciproducens для увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта.

В одном воплощении изобретения E. hallii и/или I. butyriciproducens можно использовать в способе увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта, причем указанный способ включает стадию введения эффективного количества указанной композиции указанному субъекту.

В одном воплощении изобретения Е. hallii и/или I. butyriciproducens могут быть использованы в способе увеличения продукции псевдовитамина В12 в кишечнике субъекта, могут быть особенно показаны субъекту, страдающему от недостатка витамина В12, где недостаток витамина В12 обусловлен или вызван любым из условий, упомянутых выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению Е. hallii и/или I. butyriciproducens для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

В одном воплощении изобретения Е. hallii и/или I. butyriciproducens могут быть использованы в способе увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта, причем указанный способ включает стадию введения указанному субъекту эффективного количества указанной композиции.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования псевдовитамина В12 in vitro, причем указанный способ включает стадии культивирования бактерий вида Е. hallii и/или I. butyriciproducens в условиях, делающих возможными продукцию псевдовитамина В12, и выделение полученного псевдовитамина В12.

Специалист хорошо осведомлен о способах выделения полученного псевдовитамина В12.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, но не ограничивается ими. На основе приведенного выше обсуждения и данных примеров, специалист в данной области может устанавливать существенные характеристики настоящего изобретения и, не выходя за рамки его раскрытия и объема, может совершать разнообразные изменения и модификации изобретения для его адаптации к разным способам использования и условиям. Таким образом, разные модификации изобретения в дополнение к тем, что показаны и описаны в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области из вышеизложенного описания. Подразумевается, что такие модификации также входят в объем притязаний в соответствии с приложенной формулой изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 иллюстрирует измерение метаболитов A. muciniphila на средах со слизью с добавлением и без добавления витаминов или витамина В12.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Условия бактериального роста

Akkermansia muciniphila

Akkermansia muciniphila MucT (ATTC BAA-835) выращивали, как описано ранее (Derrien et al., 2004; Duncan et al., 2002). Инкубации проводили в бутылях с сывороткой, герметично закрытых бутилкаучуковыми пробками, при 37°С в анаэробных условиях, обеспечиваемых газовой фазой 182 кПа (1,5 атм) N₂/CO₂ (соотношение 80/20). Рост измеряли посредством спектрофотометра как оптическую плотность при 600 нм (OD₆₀₀).

Е. hallii

Eubacterium hallii L2-7 выращивали в анаэробных условиях при 37°С в YCFA с некоторыми изменениями. Использование сахара слизи осуществлялось в минимальных средах с добавлением или без добавления 10 мМ ацетата. В случае когда эксперименты проводили с моносахарами, происходящими из слизи (манноза, фукоза, галактоза, N-ацетилгалактозамин или N-ацетилглюкозамин), эти моносахара использовали в концентрации 25 мМ. За ростом следили в течение 24 часов, и образцы регулярно отбирали для измерения OD₆₀₀ и анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Эксперименты по сокультивированию

Эксперименты по сокультивированию проводили в минимальных средах с добавлением слизи (Derrien et al., 2004). Оптимальные условия сокультивирования устанавливали, как указано ниже. A. muciniphila добавляли к средам со слизью с последующей инкубацией в течение 8 ч с достижением измеряемых концентраций ацетата и высвобождением сахаров. Затем добавляли клетки Е. hallii к инкубационным средам, содержащим A. muciniphila. Все клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS, от англ. «phosphate-buffered saline») перед добавлением к сокультуре для предотвращения переливания продуктов из прекультуры. Во время сокультивирования к средам добавляли 0,15% слизь каждые 48 часов для поддержания достаточной доступности субстрата для A. muciniphila.

Анализ продуктов ферментации, продуцируемых бактериальной сокультурой

Для анализа продуктов ферментации из сокультуры, описанной выше, использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Для анализа продуктов ферментации 1 мл бактериальной культуры центрифугировали и супернатант хранили при -20°С до анализа ВЭЖХ. Превращение субстрата и образование продуктов измеряли посредством системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Thermo Scientific Spectra, оснащенной колонкой Varian Metacarb 67Н 300×6,5 мм, поддерживаемой при 45°С и заливаемой 0,005 мМ серной кислотой в качестве элюента. Элюент имел скорость потока 0,8 мл/мин, и метаболиты выявляли посредством определения показателя преломления.

Анализ витамина В12

Для анализа витамина В12 использовали ультравысокоэффективную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (УВЭЖХ-МС) (UHPLC-MS, от англ. «ultra-high performance liquid chromatography mass spectrometry»). Вкратце, клетки Е. hallii (0,2 г) смешивали с 10 мл экстракционного буфера (8,3 мМ гидроксида натрия и 20,7 мМ уксусной кислоты, рН 4,5), содержащего 100 мкл 1% NaCN. Витамин экстрагировали в его цианоформе, нагревая смесь на кипящей водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения экстракт восстанавливали центрифугированием (6900 g в течение 10 мин; Hermle, Wehingen, Германия) и в конце очищали посредством иммуноаффинной колоночной хроматографии (Easy-Extract; R-Biopharma, Глазго, Шотландия). Восстановленный экстракт анализировали на содержание витамина с использованием колонки HSS Т3 С18 (2,1×100 мм; 1,8 мкм) на системе Waters Acquity UPLC (Милфорд, штат Массачусетс, США), оснащенной фотодиодным матричным детектором (PDA; 210-600 нм) и связанной с помощью интерфейса с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром высокого разрешения (QTOF; Synapt G2-Si, Waters). Элюент представлял собой градиентный поток (0,32 мл/мин) воды (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В), оба подкислены 0,1% муравьиной кислотой: 0-0,5 мин (95:5); 0,5-5 мин (60:40); 5-6 мин (60:40) и 6-10 мин (95:5). Колонку 22 поддерживали при 30°С, и регистрировали УФ-детектирование при 361 нм. Анализ MS осуществляли в режиме выявления положительно заряженных ионов с ионизацией электрораспылением, используя диапазон сканирования, установленный для m/z 50-1500. Исходные ионы, соответствующие пику витамина, дополнительно фрагментировали (MS/MS) и анализировали.

Результаты

Витамин В12-зависимая синтрофия между Е. hallii и A. muciniphila

В сокультуре A. muciniphila с Е. hallii отношение сукцината к пропионату было сдвинуто по сравнению с монокультурами A. muciniphila. Продукция пропионата посредством метилмалонил-КоА-синтазы, как известно, зависит от кофактора витамина В12. Поэтому эффект витаминов и витамина В12 тестировали на монокультурах A. muciniphila. Добавление смеси витаминов или только витамина В12 действительно переключало профиль сукцината на профиль пропионата А. muciniphila, таким же образом действовало присутствие Е. hallii в сокультуре (Фиг. 1). Детальный анализ посредством масс-спектроскопии показал, что Е. hallii способна синтезировать витамер В12 в монокультурах. По-видимому, структура витамера представляла собой псевдовитамин В12, так как низший лиганд содержал аденин вместо 5,6-диметилбензимидазола (DMB). Эффекта от добавления DMB, оказываемого на структуру продуцируемого витамера В12, не наблюдали (данные не показаны). В своей совокупности, это служит доказательством двухнаправленного метаболического перекрестного питания A. muciniphila и Е. hallii, где A. muciniphila предоставляет сахара для поддержания роста Е. hallii, которая, в свою очередь, обеспечивает A. muciniphila достаточными уровнями аналога витамина В12, используемого в качестве кофактора для превращения сукцината в пропионат посредством метилмалонил-КоА-синтазы. Как витамин В12, так и псевдовитамин В12 могут использоваться в качестве кофактора A. municiphila и активировать метилмалонил-КоА-синтазу. Следовательно, данное синтрофное взаимодействие, по-видимому, совместно эволюционирует в пределах кишечного тракта, так как витамер В12, продуцируемый Е. hallii, представляет собой форму псевдовитамина В12.

В случае Е. hallii наблюдали специфическое метаболическое и кофакторное синтрофное взаимодействие, так как она продуцировала псевдовитамин В12, который влиял на углеродный поток в A. muciniphila, приводя к продукции пропионата. Из исследований человека известно, что пропионат, доставляемый в толстую кишку, имеет разные полезные эффекты, включая уменьшение аппетита (Chamberset al., 2015, выше).

Факт того, что обнаружили измененный метаболический профиль для А. muciniphila в присутствии Е. hallii, дополнительно свидетельствует о мутуалистическом синтрофном взаимодействии. Синтрофные партнеры вместе продуцируют более высокое отношение пропионата к сукцинату, которое является полезным для метаболизма клетки-хозяина. Кроме того, продуцируется кофактор В12, который может быть использован хозяином для профилактики и/или лечения недостатка витамина В12.

Многие желудочно-кишечные расстройства связаны с повреждением слизистой оболочки и сниженной функцией барьера кишечника. Тот факт, что бактерии кишечника могут влиять на оба данных фактора, либо прямо, либо через специфичную иммуностимуляцию и стимуляцию метаболизма, дополнительно подчеркивает важность обладания правильными бактериями в правильном месте. Потеря целостности слизистой оболочки и ассоциированного биома слизистой оболочки могла бы служить показателем болезненных состояний и их развития. А. muciniphila положительно ассоциирована с тощим фенотипом и полезной генной регуляцией метаболизма в типах клеток человека (Everard et al., 2013; Lukovac et al., 2015). Ее наличие могло бы быть существенным для присущей слизистой оболочке сети полезных микроорганизмов, которые вместе стимулируют эти эффекты хозяина. В действительности, в исследованиях снижения массы обычно сообщается о повышенной относительной численности Verrucomicrobia (главным образом А. muciniphila), а также нескольких других видов микробов (Liouet al., 2013; Remelyet al., 2015; Wardet al., 2014). В своей совокупности, данные результаты дополнительно указывают на возможную значимость микробной сети, ассоциированной со слизистой оболочкой, и их метаболического перекрестного питания в отношении регуляции параметров, связанных со здоровьем хозяина, и профилактики заболевания.

Пример 2

Продуцирование витамина В12 Intestinimonas butyriciproducens

Intestinimonas butyriciproducens AF211 выращивали, как описано, на глюкозо-ацетатной среде (Bui et al. Nature Comm 2015, 6: 10062). Дальнейший детальный анализ посредством масс-спектроскопии показал, что I. butyriciproducens AF 211 способна синтезировать витамер В12 в монокультурах. Структура этого витамера была такой же, как и структура витамера, продуцируемого Е. hallii, и ее идентифицировали как псевдовитамин В12, так как низший лиганд содержал аденин вместо 5,6-диметилбензимидазола (DMBI). Эффекта от добавления DMB, оказываемого на структуру продуцируемого витамера В12, не наблюдали (данные не показаны).

Предложена группа изобретений, включающая композиции и способы профилактики и/или лечения недостатка витамина В12. Предложены композиции на основе бактерий Eubacterium hallii и/или Intestinimonas butyriciproducens. Композиции могут включать пропионатпродуцирующую бактерию, такую как Akkermansia muciniphyla. Данные композиции предлагается применять для введения субъектам, страдающим от недостатка витамина В12 вследствие лечения сахарного диабета 2-го типа, и субъектам, перенесшим бариатрическую хирургическую операцию. 6 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 пр., 1 ил.

1. Композиция, содержащая Eubacterium hallii и/или Intestinimonas butyriciproducens и физиологически приемлемый носитель, для применения при лечении и/или профилактике недостатка витамина B12 у субъекта.

2. Композиция по п. 1, где недостаток витамина B12 у указанного субъекта обусловлен лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела (бариатрическая хирургия), воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

3. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 2, дополнительно содержащая пропионат-продуцирующую бактерию, такую как Akkermansia muciniphila.

4. Композиция для применения по любому из пп. 1 или 2, которая представляет собой фармацевтическую композицию или композицию добавки в форме, выбранной из группы, состоящей из капсулы, таблетки и порошка.

5. Композиция для применения по любому из пп. 1-4, в которой указанные I. butyriciproducens и/или E. hallii и, при необходимости, указанная пропионат-продуцирующая бактерия находятся в лиофилизированной или микроинкапсулированной форме.

6. Композиция для применения по любому из пп. 1-5, где I. butyriciproducens и/или E. hallii находятся в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток.

7. Композиция для применения по любому из пп. 3, 5, 6, где указанная пропионат-продуцирующая бактерия, такая как A. muciniphila, находится в количестве, составляющем от примерно 10⁴ до примерно 10¹⁵ клеток.

8. Композиция для применения по любому из пп. 1-7, дополнительно содержащая агент, связывающийся со слизистой оболочкой.

9. Композиция для применения по любому из пп. 1-8, дополнительно содержащая ионы кобальта, например, в форме соли кобальта, такой как хлорид кобальта, сульфат кобальта, ацетат кобальта или нитрат кобальта.

10. Применение композиции, содержащей I. butyriciproducens и/или E. hallii и физиологически приемлемый носитель, для увеличения продукции псевдовитамина B12 в кишечнике субъекта.

11. Применение композиции, содержащей I. butyriciproducens и/или E. hallii и физиологически приемлемый носитель, для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

12. Применение по любому из пп. 10 или 11, где субъект страдает от недостатка витамина B12.

13. Применение по любому из пп. 10-12, где недостаток витамина B12 у субъекта обусловлен лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

14. Средство, содержащее I. butyriciproducens и/или E. hallii, для применения при лечении и/или профилактике недостатка витамина B12 у субъекта.

15. Средство, содержащее I. butyriciproducens и/или E. hallii, по п. 14, где недостаток витамина B12 у указанного субъекта обусловлен лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.

16. Применение средства, содержащего I. butyriciproducens и/или E. hallii, для увеличения продукции псевдовитамина B12 в кишечнике субъекта.

17. Применение средства, содержащего I. butyriciproducens и/или E. hallii, для увеличения продукции пропионата в кишечнике субъекта.

18. Применение по п. 17, где субъект страдает от недостатка витамина B12.

19. Применение по любому из пп. 17 или 18, где недостаток витамина B12 у указанного субъекта обусловлен лечением метформином сахарного диабета 2-го типа, пернициозной анемией, атрофическим гастритом, хроническим воспалением поджелудочной железы, хирургической операцией, при которой удаляют часть желудка и/или тонкого кишечника, хирургической операцией по снижению массы тела, воспалительным заболеванием кишечника, таким как болезнь Крона, язвенный колит и тому подобное, целиакией, бактериальным ростом, запоем, болезнью Грейвса, волчанкой, длительным применением лекарственных средств, снижающих кислотность, неполноценным питанием, булимией и нервной анорексией, ВИЧ/СПИДом, ожирением, высоким индексом массы тела, преддиабетическим состоянием, инсулинорезистентностью или рационом вегетарианца или вегана.